專利名稱：一種殺蟲基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲基因及其用途。
背景技術(shù)：
殺蟲毒素是一種具有重要運(yùn)用價值的蛋白質(zhì)，它可以用來改造殺蟲微生物農(nóng)藥，也可以用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物。目前轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)已經(jīng)大量商業(yè)化運(yùn)用(James C.2004 ISAAA Briefs No.32.Ithaca，NYISAAA.43 pp)，為害蟲的治理提供了一種低成本的新型技術(shù)。
目前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟，轉(zhuǎn)基因抗蟲的關(guān)鍵是獲得性能優(yōu)良的殺蟲蛋白質(zhì)。
目前殺蟲蛋白質(zhì)有多種。比較常用的是Bt晶體蛋白質(zhì)，例如Cry1Ab，Cry1C，Cry2，Cry3等(Crickmore，N.，Zeigler，D.R.，F(xiàn)eitelson，J.，Schnepf，E.，Van Rie，J.，Lereclus，D.，Baum，J.& Dean，D.H.1998Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，807-813)。現(xiàn)在已經(jīng)商業(yè)化推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物都是基于Bt晶體殺蟲蛋白質(zhì)。但是目前已發(fā)現(xiàn)多種昆蟲可以產(chǎn)生對晶體殺蟲蛋白質(zhì)的抗性。
抗性的發(fā)展影響了這些晶體毒素的抗蟲性能和可利用性(Ferre，J.& Van Rie，J.(2002)Annu.Rev.Entomol.47，501-533)。沒有交叉抗性的不同殺蟲蛋白質(zhì)共同使用或輪流使用可以有效減緩害蟲抗性的發(fā)生(Zhao J-Z，Cao J，Li YX，Collins HL，Roush RT，Earle ED & SheltonAM.2003 Nature Biotechnol.21，1493-1497)。因此，獲得新殺蟲毒素，對提高殺蟲能力和具有重要應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種新型的殺蟲基因及其應(yīng)用。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種殺蟲基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
本發(fā)明還提供了上述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
本發(fā)明還提供了一種殺蟲基因，其氨基酸序列由SEQ ID NO2的部分片斷合成。
本發(fā)明還提供了上述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為與SEQ ID NO2相比具有90％以上的相同性。
本發(fā)明還提供了上述殺蟲基因的用途。
本發(fā)明的新型殺蟲蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與目前已知的殺蟲蛋白質(zhì)不同，根據(jù)植物基因的密碼子使用頻率，上述氨基酸序列被逆翻譯為高GC含量的人工基因，用以植物轉(zhuǎn)基因抗蟲。它對主要農(nóng)業(yè)害蟲，包括粘蟲，玉米螟，甜菜夜蛾等具有高殺蟲活性。
具體實施例方式
本發(fā)明的以下實施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等編寫Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular CloningA Labortory Manual，3rd ED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說明。
實施例1、基因的克隆獲得
基因克隆獲得的步驟如下1、蘇云金芽胞桿菌分離方法取土壤樣品0.5克，置于40毫升左右的BPA(0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，3.4％醋酸鈉，PH7.2-7.4)培養(yǎng)基中，充分震蕩；再置于30℃搖床中培養(yǎng)4.0小時，取出置80℃水浴中處理30分鐘，或者培養(yǎng)箱中1.0小時；取0.5毫升轉(zhuǎn)移到BP培養(yǎng)基(0.3％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.5％氯化鈉，1.8％瓊脂，青霉素G1000u/ml，多粘菌素B3ppm，PH7.2-7.4)上，涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)24小時。
2、新基因的篩選將候選的菌株在加有50微克/毫升氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基的上畫線，挑取單克隆，轉(zhuǎn)接于5毫升加有50微克/毫升氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于28℃以190r/min振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長中期；12000rpm離心一分鐘收集菌體，提取質(zhì)粒。以上述質(zhì)粒為模板DNA，用兩對篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min，再按照95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec程序擴(kuò)增35循環(huán)，在1.0％瓊脂糖凝膠電泳上檢測結(jié)果，凡泳道中僅出現(xiàn)一條帶或不出現(xiàn)條帶者為候選菌株。實驗結(jié)果表明12號Bt菌株僅出現(xiàn)了一條600bp左右條帶，回收測序，分析表明該序列與已報道的營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因存在較大變異，為一個新型的Vip3殺蟲蛋白基因。
表1篩選引物的序列和片段長度


3、新基因全長序列的獲得測序結(jié)果表明該片斷長度為580bp，序列分析表明該片斷內(nèi)含HindIII限制性消化酶位點(211)，由此在該位點5‘端和3‘端方向設(shè)計正向引物和反向引物，利用反向PCR的方法克隆到該酶切位點上游211bp片段和下游641bp片段；分析641bp片段序列表明內(nèi)含PstI限制性位點，在該位點兩側(cè)設(shè)計正向和反向引物，利用反向PCR獲得了下游1.766kb長度序列。由此獲得了該基因的全長序列，其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列見SEQ ID NO2。本步驟中使用的反向PCR引物見表2。
表2反向PCR引物

根據(jù)玉米基因的密碼子使用頻率，上述氨基酸序列被逆翻譯為高GC含量的人工基因，經(jīng)上海生工公司人工合成(如SEQ ID NO1所述)并克隆到表達(dá)載體PET28a的BamH1和Sac位點間(質(zhì)粒pET28a-LG01)。
實施例2、蛋白的制備利用通用的標(biāo)準(zhǔn)方法將含上述基因的表達(dá)載體pET28a-LG01轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21star并獲得質(zhì)粒含有pET28a-LG01的菌落。單個菌落接種到100毫升LB細(xì)菌培養(yǎng)液，在37℃下震動培養(yǎng)至OD600＝0.6，加IPTG到0.5mM，并繼續(xù)在同樣的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)液經(jīng)過5000g離心10分鐘沉淀大腸桿菌細(xì)胞，然后棄上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mM Tris-HCl緩沖液，超聲粉碎后即可用于殺蟲活性的測定。
實施例3、在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白對多種鱗翅目昆蟲有殺傷作用將實施例2所獲得的蛋白涂在昆蟲人工飼料的表面，放置2小時后，接上新生一齡幼蟲進(jìn)行殺蟲活性測定。陰性對照的準(zhǔn)備方法與實施例2相同，但質(zhì)粒為不含任何插入DNA的pET28a載體本身。在25℃條件下，7天后記錄殺蟲數(shù)目。殺蟲活性結(jié)果如下表

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表SEQ ID NO11 ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGCACA AGAGCCTTAC CAAGTTTTAT TGATTATTTT61 AATGGCATTT ATGGATTTGC CACTGGTATC AAGGACATTA TGAACATGAT TTTTAAAACG121 GATACAGGTG GTGATCTAAC CCTAGACGAA ATTTTAAAGA ATCAGCAGTT ACTAAATGAA181 ATTTCTGGTA AATTGGATGG GGTAAATGGA AGCTTAAATG ATCTTATCGC ACAGGGAAAC241 TTAAATACAG AATTATCTAA GGAAATATTA AAAATTGCAA ATGAACAAAA TCAAGTTTTA301 AATGATGTTA ATAACAAACT TGATGCGATA AATACGATGC TGCATATATA TCTACCTAAA361 ATTACCTCTA TGTTAAGTGA TGTAATGAAA CAAAATTATG CGCTAAGTCT GCAAATAGAA421 TACCTAAGTA AACAGTTGCA AGAAATTTCT GATAAATTGG ATATTATTAA CGTAAATGTA481 CTTATTAACT CTACACTTAC TGAAATTACA CCTGCGTATC AACGGATTAA ATATGTGAAC541 GAAAAATTTG AGGAATTAAC TTTTGCTACA GAAACTAATT TAAAAGTAAA AAAGGATGGC601 TCTCCTGCAG ATATTCTTGA TGAGTTAACT GAGTTAACTG AACTAGCGAA AAGTGTAACA661 AAAAATGATG TGGATGGTTT TGAATTTTAT CTTAATACAT TCCACGATGT AATGGTAGGG721 AATAATTTAT TCGGGCGTTC AGCTTTAAAA ACTGCATCGG AATTAATTAC TAAAGAAAAT781 GTGAAAACAA GTGGCAGTGA GGTCGGAAAT GTTTATAACT TCTTAATTGT ATTAACAGCT841 CTGCAAGCAA AAGCTTTTCT TACTTTAACA ACATGCCGAA AATTATTAGG CTTAGCAGAT901 ATTGATTATA CTTCTATTAT GAATGAACAT TTAAATAAGG AAAAAGAGGA ATTTAGAGTA961 AACATCCTTC CTACACTTTC TAATACTTTT TCTAATCCTA ATTATATAAA AACTAAAGGA1021 AGCGATGAGG ATGCGGAAGT GATTATTCAA GCTGAACCAG GACATGCTTT GGTGGGATTT1081 GAAATGATTA ATGATCCAAG TCCAGCGTTA AAAGTGTATC AGGCTAAACT AAAACCAAAT1141 TATCAAGTTG ATAAGCAGTC ATTATCTGAA ACTGTGTATG GTGATATGGA TAAAATATTA1201 TGTCCAGATA AATCTCAACA AATGTATTAT CTGCATAATA TAACATTCCC AAATGAATAT1261 GTGATTACAG AAATTATTTT TACAAAGAAA AAGAACAGTT TAAGGTATGA GGTGATAGCA1321 AATTATTATG AGTTCTCTTC AGGAGATATC GACTTAAATA AGAAGTTAGT AAAATCAAGT1381 GAAGCAGAGT ATAGTACGTT AAGTGTTAGT AACGATGCTA TTTATATGCC GCTAGGTGTT1441 ATCAGTGAAA CATTTTTGAC CCCAATTAAA GGATTCGGAC TAACAGTTGA TGAAAGTTCA1501 AGACTGGTAA CTTTAACGTG TAAATCATAT TTAAGGGAAA TTCTGTTAGC AACAGATTTA1561 AGCAATAAAG CAACAAAATT AATTGTCCCA CCTAATGGTT TTATTAGTAA TTTGGTGGAA1621 AATGGGGATA TTGAGGCTGA CAACATAGAA CCATGGAAGG GAAATAATAA AAATGCGTAT1681 GTTGATCATA CAGGTGGGGT GAATGGAACT AAAGCTCTGT ACACTCAAGA TGATGGGGAA1741 TTTTCACAAT TTATTGGAGA TAAGTTGAAA TCGAAAACTG AGTATATAAT CCAATATACT1801 GTAAAAGGAA ATACTTCTAT TTATTTGAAA GATAAAAAAA ATGAAAATGT TATTTATGAA1861 GATAAAAATA ATAATTTAGA GGCTTTTCAA ACTATTACTA AAAGGTTTAC TACAGAATTG1921 GATTCTTCAG ATGTTTACTT AGTGTTTAAA TGCAAAAATG GCTATAAAGC TTGGGGAGAC1981 AACTTTCTAA TTACAGAAAT TAGGCCTAAG GAAGTGGTAA GCCCAGAATT GATAAAAGTA2041 GAAAATTGGA TTGGAATGGG TGGTAGTAAT CATGTAAACC CTGATTCACT TTTGCTTTTT2101 ACAGGTGGGA GGTCAATTTT AAAACAAAAT CTCCAATTAG ATAGTTATTC AACCTATAGA2161 GTAAGATTTT CTTTAATGGT AATTGGTAAG GCTAAGGTTA TTATAAGGAA TTCAAGTGAA2221 GTACTGTTTG AAAAAAGTTA TGTGAATGAT TCTGAAGGTG TTTTAGAAGG TGTTTCTGAA2281 ACTTTTACTA CAAAATCGAT TCAAGATAAC TTCTATGTAG AACTTTCTAA TGAGGGCACT
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權(quán)利要求
1.一種殺蟲基因，其特征是該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，其特征是所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
3.一種殺蟲基因，其特征是其氨基酸序列由SEQ ID NO2的部分片斷合成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，其特征是所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為與SEQ ID NO2相比具有90％以上的相同性。
5.如權(quán)利要求1或3所述殺蟲基因的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殺蟲基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明還公開了上述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQID NO2。本發(fā)明的新型殺蟲蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與目前已知的殺蟲蛋白質(zhì)不同，它對主要農(nóng)業(yè)害蟲，包括粘蟲，玉米螟，甜菜夜蛾和二化螟等，具有高殺蟲活性。
文檔編號C07K14/195GK1837363SQ200610049780
公開日2006年9月27日 申請日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者沈志成, 李春雨 申請人:浙江大學(xué)