專利名稱：編碼人癌胚抗原的合成基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及癌癥的治療。更為具體而言，本發(fā)明涉及編碼人腫瘤相關(guān)多肽癌胚抗原的合成多核苷酸，本文將其命名為hCEAopt，其中該多核苷酸為在人體細胞環(huán)境中表達進行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明也提供了包含該合成多核苷酸的重組載體和宿主。本發(fā)明也涉及攜帶有hCEAopt的腺病毒載體和質(zhì)粒，及它們在用于預(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物中的用途。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(IgSF)由眾多編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)的基因組成，其中一種功能即細胞間粘附。IgSF蛋白質(zhì)含有至少一個Ig相關(guān)區(qū)域，該區(qū)域?qū)τ诰S持正常的分子間結(jié)合作用而言是重要的。由于該相互作用對于IgSF成員的不同生物學(xué)功能而言是必須的，因此多種IgSF粘附分子的破壞或異常表達與多種人類疾病相關(guān)。
癌胚抗原(CEA)屬于由細胞表面糖蛋白組成的Ig超家族的亞家族。已知的CEA亞家族成員如CEA相關(guān)的細胞粘附分子(CEACAMs)。在最近的科學(xué)文獻中，CEA基因被重新命名為CEACAM5，雖然相應(yīng)蛋白質(zhì)的命名仍然為CEA。研究顯示CEACAMs在功能上同時作為同型和異型的分子間粘附分子(Benchimol等，Cell57327-334(1989))。除了細胞粘附，CEA還抑制由于細胞從胞外基質(zhì)解離而引起的細胞死亡，并有助于與某些原癌基因如Bcl2和C-Myc相關(guān)的細胞轉(zhuǎn)化。
在胚胎發(fā)育和成人結(jié)腸粘膜中已檢測到CEA的正常表達。CEA過量表達在三十多年前首先于人結(jié)腸癌中被檢測到(Gold和Freedman，J.Exp.Med.121439-462(1965))且之后幾乎發(fā)現(xiàn)于所有的結(jié)直腸癌中。此外，在高比例的胰腺、乳腺和肺部的腺癌中檢測到CEA的過量表達。由于CEA表達在這些腫瘤類型中普遍存在，CEA被臨床廣泛地用于這些癌癥的處理和預(yù)后中。
編碼人CEA的序列已被克隆和表征(美國專利No.5,274,087、美國專利No 5,571,710和美國專利No 5,843,761.也參見Beauchemin等，Mol.Cell.Biol.73221-3230(1987)；Zimmerman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84920-924(1987)；Thompson等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(9)2965-69(1987))。
CEA表達和轉(zhuǎn)移生長的相關(guān)性已經(jīng)導(dǎo)致將其鑒定為分子和免疫干涉的目標(biāo)，用于結(jié)直腸癌的治療。
以CEA為目標(biāo)的一種治療方法即采用抗CEA抗體(參見Chester等.，Cancer Chemother.Pharmacol.46(Suppl)S8-S 12(2000))，而另一種方法采用基于CEA的疫苗激活免疫系統(tǒng)以攻擊表達CEA的腫瘤(參見上文引用的Berinstein的綜述)。
多種疫苗的研發(fā)和商業(yè)化已受阻于與在成功轉(zhuǎn)化的宿主細胞中獲得高水平的外源基因表達相關(guān)的難題。因此，盡管編碼上述CEA蛋白質(zhì)的野生型核酸序列已被確定，還非常需要開發(fā)一種可方便更新的人CEA蛋白質(zhì)來源，該來源利用了被優(yōu)化用于在所需宿主細胞中表達的編碼CEA的核酸序列，該來源容許開發(fā)一種有效且不受自體耐受性影響的癌癥疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及引發(fā)或增強針對CEA基因表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，所述CEA基因與多種腺癌相關(guān)，包括結(jié)直腸癌。具體而言，本發(fā)明提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中為在人體細胞內(nèi)高水平表達，對該多核苷酸進行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明進一步提供了包含合成多核苷酸的基于腺病毒和質(zhì)粒的載體并公開了該載體在用于預(yù)防和/或治療CEA相關(guān)癌癥的免疫組合物和疫苗中的用途。
本發(fā)明也涉及包含編碼如SEQ ID NO.2所示人癌胚抗原(下文中表示為hCEA)的核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，其中該合成核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化(下文中表示為hCEAopt)。本文公開的核酸分子可被轉(zhuǎn)染到選定的宿主細胞中，其中該重組宿主細胞提供了顯著水平的表達功能性hCEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)的來源。
本發(fā)明進一步涉及編碼了表達人CEA蛋白質(zhì)的mRNA的合成核酸分子；該DNA分子包含如本文公開的SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明該部分的優(yōu)選方面公開在

圖1中，該圖顯示了編碼hCEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2或SEQ ID NO16)的DNA分子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達，進行了密碼子優(yōu)化。
本發(fā)明另一種優(yōu)選的DNA分子包含編碼缺失了C末端錨定區(qū)域(AD)的人CEA的核苷酸序列，該區(qū)域位于人全長CEA(SEQ ID NO2)的約第679個氨基酸到約第702個氨基酸，其中該核苷酸序列為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化。編碼錨定區(qū)域被截短的CEA變體的代表性DNA分子如SEQ ID NO15所示(如圖10A中所示)。相應(yīng)的hCEA-hAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示(如圖10B中所示)。
本發(fā)明也涉及重組載體和真核和原核的重組宿主細胞，均包含貫穿本說明書公開的核酸分子。
本發(fā)明進一步涉及用于在重組宿主細胞內(nèi)表達經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包含如SEQ ID NO1或SEQ ID NO15所示核酸分子的載體導(dǎo)入合適的宿主細胞中；并(b)在容許該經(jīng)密碼子優(yōu)化的蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞。
本發(fā)明的另一方面是一種預(yù)防和治療癌癥的方法，包括給哺乳動物施用包含合成核酸分子的疫苗載體，該合成核酸分子包含編碼如SEQ ID NO2或SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該合成核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化。
本發(fā)明進一步涉及腺病毒疫苗載體，該載體包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)的插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達盒，該表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
本發(fā)明也涉及包含質(zhì)粒部分和表達盒部分的疫苗質(zhì)粒，該表達盒部分包含(a)編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸，其中該多核苷酸為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
本發(fā)明的另一方面是保護哺乳動物免患癌癥或治療患CEA相關(guān)癌癥的哺乳動物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；(b)允許經(jīng)過一段預(yù)定時間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
貫穿本說明書及在附錄權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式″一個″″一種″和″該″如上下文未明確指出均包括復(fù)數(shù)形式。
貫穿本說明書及附錄的權(quán)利要求中所用的下列定義和縮寫適用于術(shù)語“啟動子”指DNA鏈上RNA多聚酶結(jié)合的識別位點。啟動子與RNA多聚酶形成起始復(fù)合物以起始并驅(qū)動轉(zhuǎn)錄活性。該復(fù)合物可被稱為“增強子”的激活序列或稱為“沉默子”的抑制序列所修飾。
術(shù)語“盒”指本發(fā)明中含有待表達核苷酸序列的序列。盒在概念上類似盒式錄音帶；每個盒具有本身的序列。因此通過互相交換盒，載體將表達不同的序列。由于限制位點在5’和3’末端，盒可被方便的插入，移除或用其它盒替代。
術(shù)語“載體”指可將DNA片段導(dǎo)入到宿主器官或宿主組織中一些方式。目前有多種類型的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌體和粘粒。
關(guān)于腺病毒載體所用的術(shù)語“第一代”描述了復(fù)制缺陷型的腺病毒載體。第一代腺病毒載體典型地具有缺失或失活的E1基因區(qū)，且優(yōu)選地具有缺失或失活的E3基因區(qū)。
名稱“pV1J/hCEAopt”指此處公開的質(zhì)粒構(gòu)建體，包含具內(nèi)含子A的人CMV立即早期(IE)啟動子、全長的經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA基因、牛生長激素來源的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列和最小pUC主鏈(參見實施例2)。名稱“pV 1J/hCEA”指上述構(gòu)建體，除了該構(gòu)建體包含野生型人CEA基因而不是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的人CEA基因。
名稱“MRKAdS/hCEAopt”和“MRKAdS/hCEA”指此處公開的兩種構(gòu)建體，均含有缺失了E1和E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。在“MRKAdS/hCEAopt”構(gòu)建體中，E1區(qū)被經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA基因以與E1并行的方向取代，且位于無內(nèi)含子A的人CMV啟動子控制下，之后為牛生長激素聚腺苷酸化信號?！癕RKAdS/hCEA”構(gòu)建體基本如上所述，除了Ad5基因組的E1區(qū)被野生型人CEA序列取代(參見實施例2)。
術(shù)語“有效量”指足夠的疫苗組合物被導(dǎo)入以產(chǎn)生足夠水平的多肽，從而發(fā)生免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)可該水平會發(fā)生變化。
“保守的氨基酸取代”指一個氨基酸殘基被另一個化學(xué)上類似的氨基酸殘基替代。這樣的保守取代的實例為一個疏水性氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸)被另一個疏水性氨基酸取代；一個極性氨基酸被另一個具有相同電荷的極性氨基酸取代(如精氨酸被賴氨酸取代；谷氨酸被天冬氨酸取代)。
“hCEA”和“hCEAopt”分別指人癌胚抗原和經(jīng)密碼子優(yōu)化的人癌胚抗原。
術(shù)語“hCEA-ΔAD”指缺失了C末端錨定區(qū)域(AD)的人CEA變體，該錨定區(qū)域位于人全長CEA(SEQ ID NO2)的從約第679個氨基酸到約第702個氨基酸。編碼本發(fā)明hCEA-ΔAD的核苷酸序列為在人細胞環(huán)境中高水平表達進行了密碼子優(yōu)化(此處命名為hCEAopt-ΔAD)。編碼錨定區(qū)域被截短的CEA變體的代表性DNA分子如SEQ ID NO15(如圖10A中所示)。相應(yīng)的hCEA-ΔAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16(如圖10B中所示)。編碼hCEA-ΔAD的核苷酸可用于癌癥疫苗的開發(fā)以治療和/或預(yù)防癌癥。
術(shù)語“哺乳動物”指包括人類在內(nèi)的任何哺乳動物。
縮寫“Ag”指抗原。
縮寫“Ab”和“mAb”分別指抗體和單克隆抗體。
縮寫“ORF”指基因的開放讀碼框架。
附圖簡述圖1顯示了野生型人CEA cDNA(SEQ ID NO3)和經(jīng)過密碼子優(yōu)化克隆(hCEAopt，SEQ ID NO1)的核苷酸序列。相應(yīng)推斷的氨基酸序列顯示在上方(SEQ ID NO2)。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的合成cDNA的取代核苷酸顯示在hCEA cDNA序列下方。參見實施例2。
圖2顯示了經(jīng)注射小鼠體內(nèi)的hCEA表達。10只C57BL/6小鼠組成的實驗組被在四頭肌注射不同劑量的MRKAdS-hCEA和MRKAd5-hCEAopt(圖A)或注射25或50毫克的pV1J/hCEA和pV1J/hCEAopt質(zhì)粒(圖B)。
注射后3天收集血液樣品并測定CEA水平。實心三角形代表個體小鼠的CEA測定結(jié)果。同時也顯示了幾何平均值(實心圓形)。
圖3顯示了密碼子優(yōu)化提高了針對人CEA的免疫反應(yīng)。8只C57BL/6小鼠組成的實驗組被通過四頭肌注射不同劑量的MRKAd5-hCEA和MRKAd5-hCEAopt。在第0天和第21天進行病毒注射。圖A.加強注射后兩周，利用覆蓋氨基酸569-583且包含CD8+表位的肽143在來源于個體小鼠的脾細胞上通過ELISPOT試驗測定特異性針對hCEA的分泌IFNγ的CD8+T細胞的數(shù)量(實心三角形)。實驗采用了兩種不同數(shù)量的脾細胞(2.5×105和5×105)，且每種數(shù)量的脾細胞均設(shè)兩組平行。通過扣除在不存在肽的情況下測定的背景值(通常低于10SFC/106總脾細胞)計算平均值，并將結(jié)果表示為SFC數(shù)量/106總脾細胞。個體小鼠的數(shù)值(實心三角形)及幾何平均值(實心圓形)均被顯示。圖B利用加強后10天的血清樣品測定個體小鼠血清的抗CEA抗體滴度(實心三角形)。同時也顯示了幾何平均滴度(GMT)(實心圓形)。Ad/hCEAopt與Ad/hCEA有顯著差異。
圖4。不同免疫方案的比較。用pV1J/hCEA質(zhì)粒(按50tg/劑量電注射到四頭肌)和MRKAd5/hCEA質(zhì)粒(1×109pp/劑量)的不同組合免疫C57BL/6(A)或BALB/c(B)小鼠實驗組。采用如材料和方法及圖3的圖例中描述的覆蓋氨基酸497-703(合并物D)的肽合并物測定在每只個體小鼠的脾細胞中分泌IFNγ的T細胞的數(shù)量。同時也顯示了幾何平均值(實心圓形)。在C57BL/6小鼠中D/D和D/A與Ad/Ad組有顯著差異。在BALB/c小鼠中所有3個實驗組均有顯著差異。
圖5顯示了將T細胞反應(yīng)定位到hCEA蛋白質(zhì)特定區(qū)域的結(jié)果。用50μg pV1J/hCEA質(zhì)粒免疫C57BL/6(圖A)或BALB/c(圖B)小鼠實驗組并于三周后用1×109pp的Ad/hCEA加強免疫。采用如材料和方法及圖3的圖例中描述的覆蓋整個蛋白質(zhì)的肽合并物于加強免疫后2周測定在每只個體小鼠的脾細胞中分泌IFNγ的T細胞的數(shù)量。同時也顯示了幾何平均值(實心圓形)。
圖6。hCEA免疫反應(yīng)肽的確定。通過ELISPOT試驗分析從4只經(jīng)免疫的C57BL/6(圖片A)或BALB/c(圖片B)小鼠收集的脾細胞針對每種所示肽的IFNγ分泌(參見實施例8)。
圖7顯示了在C57BL/6小鼠(圖片A)和BALB/c小鼠(圖片B)(參見實施例xx)中含表位的肽的序列。右側(cè)所列為產(chǎn)生IFNγ的CD8+(CD4+)CD3+細胞的比例。
圖8顯示了如實施例9所描述的經(jīng)免疫的CEA轉(zhuǎn)基因小鼠的IFNγ-ELISPOT試驗結(jié)果。采用每次間隔一周的4次電注射質(zhì)粒DNA，及一次腺病毒注射免疫小鼠。對每種免疫原，用三只經(jīng)注射小鼠的脾細胞收集物獲取數(shù)據(jù)。利用肽143測定CD8特異性反應(yīng)。
圖9顯示了經(jīng)免疫的CEA.tg.小鼠的IFNγ細胞內(nèi)染色結(jié)果。用每次間隔2周的2次1×1010vp腺病毒注射免疫小鼠。顯示了從三只經(jīng)注射小鼠的脾細胞收集物獲得的數(shù)據(jù)。右側(cè)所列為CD8+或CD4+細胞的比例。
圖10，圖A顯示了如SEQ ID NO15所示的代表性的編碼錨著區(qū)域被截短的CEA變體、經(jīng)過密碼子優(yōu)化的DNA分子。hCEA-ΔAD相應(yīng)的氨基酸序列如圖B(SEQ ID NO16)所示。
發(fā)明詳述癌胚抗原(CEA)通常與腺癌的發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明涉及組合物和方法，用于引發(fā)和增強針對CEA腫瘤相關(guān)抗原表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性，其中異常的CEA表達與腺癌或其發(fā)展相關(guān)聯(lián)。異常的CEA表達與癌癥的相關(guān)性并不要求CEA蛋白質(zhì)在腫瘤組織生長的全部時間點均被表達，因為異常的CEA表達可能僅存在與腫瘤初始階段且在腫瘤發(fā)展后期無法被檢測到，反之亦然。
為此目的，提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成DNA分子。
合成分子的密碼子經(jīng)過設(shè)計使其被所計劃的宿主細胞，在優(yōu)選的實施方案中為人類細胞，所首選。合成分子可用于開發(fā)重組腺病毒或基于質(zhì)粒的疫苗，以通過中和抗體或細胞介導(dǎo)的免疫性提供針對CEA相關(guān)癌癥的有效免疫預(yù)防。合成分子可被用作免疫原性組合物。本發(fā)明提供了多核苷酸，當(dāng)其被直接導(dǎo)入到包括哺乳動物如靈長類和人類在內(nèi)的脊椎動物體內(nèi)時，可誘導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的表達。
野生性人CEA核苷酸序列已被報導(dǎo)(參見，如美國專利No.5,274,087；美國專利No.5,571,710號；美國專利No.5,843,761)。本發(fā)明提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成DNA分子。本發(fā)明的合成分子包含核酸序列，其中部分核苷酸被改變以使用被哺乳動物所首選的密碼子，從而使CEA在人宿主細胞內(nèi)高水平表達。該合成分子可被用作CEA蛋白質(zhì)來源，用于癌癥疫苗以通過中和抗體和細胞介導(dǎo)的免疫性提供針對CEA相關(guān)癌癥的有效免疫預(yù)防。
四種可能核苷酸堿基的三聯(lián)體密碼可存在超過60種變體形式。
由于這些密碼子僅為20種不同氨基酸提供編碼信息(以及轉(zhuǎn)錄起始和終止)，因此部分氨基酸可被超過一個密碼子所編碼，該現(xiàn)象被稱為密碼子冗余。由于某些不完全了解的原因，可選密碼子并不均一地存在于不同類型細胞的內(nèi)源DNA中。實際上，在某些類型的細胞中對某些密碼子似乎存在可變的天然等級或偏好性。例如，亮氨酸可被包括CTA，CTC，CTG，CTT，TTA和TTG在內(nèi)的6個DNA密碼子中任一個所確定。對微生物基因組密碼子頻率的詳盡研究已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的內(nèi)源DNA大部分通常含有CTG亮氨酸指定密碼子，而酵母和粘液菌的DNA大部分通常含有TTA亮氨酸指定密碼子。考慮到這種等級性，通常認(rèn)為由大腸桿菌宿主獲得富亮氨酸多肽的高水平表達的可能性將某種程度上依賴于所用密碼子的頻率。例如，富含TTA密碼子的基因在大腸桿菌中很可能表達較差，而富含CTG基因在該宿主中很可能高水平表達。類似地，優(yōu)選的用于在酵母宿主細胞中表達的密碼子將是TTA。
密碼子偏好性現(xiàn)象對重組DNA技術(shù)的意義是顯而易見的，并且該現(xiàn)象可用于解釋很多之前的失敗以實現(xiàn)在成功轉(zhuǎn)化的宿主體內(nèi)外源基因的高水平表達-偏好性較低的密碼子可能重復(fù)存在于插入的基因中，宿主細胞的表達機制可能無法有效地發(fā)揮作用。該現(xiàn)象說明被設(shè)計用來包括所計劃的宿主細胞的偏好密碼子的合成基因可提供外源遺傳物質(zhì)用于重組DNA技術(shù)操作的優(yōu)化形式。因此，本發(fā)明的一個方面是為在人細胞內(nèi)表達而經(jīng)過密碼子優(yōu)化的人CEA基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，已發(fā)現(xiàn)采用編碼相同蛋白質(zhì)序列的可選密碼子可消除外源CEA蛋白質(zhì)在人體細胞中表達的限制。
根據(jù)本發(fā)明，人CEA基因序列被轉(zhuǎn)化為具有相同翻譯后序列但使用可選密碼子的多核苷酸序列，如Lathe在《從氨基酸序列數(shù)據(jù)推導(dǎo)的合成寡核苷酸探針理論和實踐考量》，J.Molec.Biol.1831-12(1985)中的描述，該文在此引入作為參考。該方法一般由鑒定在野生型序列中通常不與高水平表達的人類基因相關(guān)的密碼子并將它們替換為優(yōu)化用于在人體細胞中表達的密碼子組成。然后檢查新的基因序列中是否存在由于這些密碼子替換產(chǎn)生了非所需的序列(例如，”ATTTA”序列，疏忽產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識別位點，不需要的限制酶位點等)。非所需序列可通過將已存在的密碼子用編碼相同氨基酸的不同密碼子替代而得以消除。然后測試合成基因片段的改善表達情況。
上述方法被用于產(chǎn)生人CEA的合成基因序列，從而得到了包含為高效表達而優(yōu)化的密碼子的基因。盡管上述步驟概述了發(fā)明人用于設(shè)計經(jīng)密碼子優(yōu)化基因的方法，該基因用于設(shè)計癌癥疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是類似的疫苗功效或提高的基因表達可通過操作步驟的略微改變或序列的少量變化而得以實現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員同樣應(yīng)認(rèn)識到其它的DNA分子也可被構(gòu)建以在人體細胞內(nèi)提供CEA的高水平表達，其中僅一部分DNA分子的密碼子經(jīng)過了密碼子優(yōu)化。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及合成多核苷酸，該合成多核苷酸包含編碼人CEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)或編碼人CEA蛋白質(zhì)具生物學(xué)活性的片段或突變體形式的核苷酸序列，包括但不限于hCEA-ΔAD(SEQ IDNO16)，該多核苷酸序列包含經(jīng)優(yōu)化用于在人宿主內(nèi)表達的密碼子。該CEA蛋白質(zhì)的突變體形式包括但不限于保守氨基酸取代，氨基末端截短，羧基末端截短，缺失或插入，此處總稱為“變體”。任何該生物學(xué)活性片段和\或突變體將編碼特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，這些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段基本上模擬了如SEQ ID NO2所示的CEA蛋白質(zhì)的免疫學(xué)屬性。本發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達功能性人CEA蛋白質(zhì)的mRNA分子，從而可用于治療性或預(yù)防性癌癥疫苗的開發(fā)。
如上所述，本發(fā)明涉及編碼人CEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)或生物學(xué)活性片段或其突變體形式的核苷酸。為此目的，本發(fā)明提供了編碼hCEA-ΔAD(SEQ ID NO16，圖10B)的核苷酸，該蛋白包含缺失了C末端錨定序列的人CEA蛋白質(zhì)。本發(fā)明編碼hCEA-ΔAD的核酸分子為增強在人體細胞內(nèi)的表達而進行了密碼子優(yōu)化。
編碼hCEA-ΔAD的代表性核酸分子包含如SEQ ID NO15(圖10A)所示的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及包括特定核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，該核苷酸序列編碼了表達如SEQ ID NO2所示的新型hCEA蛋白質(zhì)的mRNA，其中該合成核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達而進行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明的核酸分子基本不含其它核酸。
本發(fā)明也涉及包含本說明書公開核酸分子的重組載體和真核和原核的重組宿主細胞。本發(fā)明合成核酸分子，相關(guān)載體和宿主可用于癌癥疫苗的開發(fā)。
本發(fā)明優(yōu)選的DNA分子包含如此處公開為SEQ ID NO1，如圖1所示的核苷酸序列，該序列編碼如圖2和SEQ ID NO2所示的人CEA蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進一步優(yōu)選的DNA分子包含如此處公開為SEQ ID NO15，如圖10A所示的核苷酸序列，該序列編碼缺失了C末端錨定序列的人CEA變體，如SEQ ID NO16和圖10B所示。
本發(fā)明也包括SEQ ID NO1的生物學(xué)活性片段或突變體，該序列編碼可表達人CEA蛋白質(zhì)的mRNA。任何該生物學(xué)活性片段和/或突變體將編碼至少基本模擬了hCEA蛋白質(zhì)藥理學(xué)屬性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，包括但不限于如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白質(zhì)。任意該多核苷酸包括但不限于核苷酸取代，缺失，添加，氨基末端截短和羧基末端截短。本發(fā)明突變體編碼mRNA分子，該分子在真核細胞中表達功能性hCEA蛋白質(zhì)，使其可用于開發(fā)癌癥疫苗。
本發(fā)明也涉及編碼hCEA蛋白質(zhì)、經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成DNA分子，其中該合成DNA的核苷酸序列顯著異于SEQ ID NO1的核苷酸序列，但仍編碼了如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白質(zhì)。
該合成DNA被確定屬于本發(fā)明范疇。因此，本發(fā)明公開了密碼子冗余，可導(dǎo)致多種表達相同蛋白質(zhì)的DNA分子。同樣包括在本發(fā)明范疇的是DNA序列的突變，該突變基本不改變表達蛋白質(zhì)的最終物理屬性。例如，將纈氨酸取代為亮氨酸、精氨酸取代為賴氨酸或天冬酰胺取代為谷酰胺不會引起多肽的功能性改變。
已知編碼肽的DNA序列可被改變以使其編碼的肽具有不同于天然存在肽的屬性。改變DNA序列的方法包括但不限于定點誘變。所改變屬性的實施例包括但不限于酶對底物或受體對配體親和性的改變。
本發(fā)明也涉及hCEAopt融合構(gòu)建體，包括但不限于表達連接到不同標(biāo)記的部分人CEA蛋白質(zhì)的融合構(gòu)建體，該標(biāo)記包括但決不限于GFP(綠色熒光蛋白)，MYC表位，GST和Fc。任意該融合構(gòu)建體可在感興趣的細胞系中表達并用于篩選此處公開的人CEA蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑。也考慮了被構(gòu)建用于增強對人CEA免疫反應(yīng)的融合構(gòu)建體，包括但不限于DOM和hsp70和LTB。
本發(fā)明進一步涉及包含貫穿本說明書所公開的合成核酸分子的重組載體。這些載體由DNA或RNA組成。對大多數(shù)克隆而言，優(yōu)選DNA載體。典型的載體包括質(zhì)粒、經(jīng)過修飾的病毒、桿狀病毒、噬菌體、粘粒、酵母人工染色體和其它形式的可編碼hCEA蛋白質(zhì)的游離或整合的DNA。確定適合特定基因轉(zhuǎn)移或其它用途的載體屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。
含有編碼hCEA蛋白質(zhì)、經(jīng)密碼子優(yōu)化DNA的表達載體可被用于在重組宿主體內(nèi)高水平表達hCEA。表達載體可包括但不限于克隆載體、經(jīng)修飾的克隆載體、特別設(shè)計的質(zhì)?；虿《尽Ｍ瑯?，如果需要，多種細菌表達載體可被用于在細菌細胞內(nèi)表達重組hCEA。另外，多種真菌細胞表達載體可被用于在真菌細胞中表達重組hCEA。此外，多種昆蟲細胞表達載體可被用于在昆蟲細胞內(nèi)表達重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及用包含本發(fā)明核酸分子的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。重組宿主細胞可以是真核或原核的，包括但不限于細菌如大腸桿菌，真菌細胞如酵母，哺乳動物細胞包括但不限于牛、豬、猴和嚙齒動物來源的細胞系以及昆蟲細胞包括但不限于果蠅和蠶來源的細胞系。這樣的重組宿主細胞可于合適的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生hCEA或生物學(xué)等效形式。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是人。如此處所定義的，術(shù)語“宿主細胞”不打算包括轉(zhuǎn)基因人類、轉(zhuǎn)基因胎兒或轉(zhuǎn)基因胚胎體內(nèi)的宿主細胞。
如上所述，包含hCEA蛋白質(zhì)的編碼DNA的表達載體可被用作在重組宿主體內(nèi)表達hCEA。因此，本發(fā)明另一方面是在重組宿主體內(nèi)表達人CEA蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的方法，包括(a)將包含如ID NO1或ID NO15所示核酸的載體導(dǎo)入合適的人細胞系；并(b)在容許該人CEA蛋白質(zhì)或CEA蛋白質(zhì)變體表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞。
在hCEA于宿主細胞內(nèi)表達后，hCEA蛋白質(zhì)可被回收以提供活性形式的hCEA蛋白質(zhì)。已有多種可用的hCEA蛋白質(zhì)純化步驟。重組hCEA蛋白質(zhì)可通過鹽分級、離子交換層析、尺寸排阻層析、羥基磷灰石吸附層析和疏水相互作用層析的單一或多種組合應(yīng)用而從細胞裂解液中被純化。此外，重組hCEA蛋白質(zhì)可通過使用免疫親和柱從其他細胞蛋白中被分離，該免疫親和柱用特異性針對全長hCEA蛋白質(zhì)或hCEA蛋白質(zhì)的多肽片段的單克隆或多克隆抗體制備。
本發(fā)明核酸可被組裝進表達盒，該表達盒包含被設(shè)計用來提供蛋白質(zhì)在人體細胞內(nèi)有效表達的序列。
該表達盒優(yōu)選含有全長、經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA基因，和與之可操作連接的相關(guān)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，如啟動子和終止序列。
在優(yōu)選實施方案中，啟動子是無內(nèi)含子A序列的巨細胞病毒啟動子(CMV)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到任意其它已知啟動子如強免疫球蛋白、或其它真核基因啟動子也可被采用。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長激素終止子，盡管其它已知轉(zhuǎn)錄終止子也可被采用。CMV-BGH終止子的的組合是尤其優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，hCEAopt表達盒被插入到載體中。載體優(yōu)選為腺病毒載體，雖然連接到啟動子或其它載體如腺相關(guān)病毒或修飾的牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒載體的線性DNA也可被采用。
如果所選載體為腺病毒，則優(yōu)選被稱為第一代腺病毒載體。這些腺病毒載體特征在于具有無功能E1基因區(qū)和優(yōu)選的被缺失的腺病毒E1基因區(qū)。在一些實施方案中，表達盒被插入到正常腺病毒E1區(qū)定位的位置上。此外，這些載體任選地具有無功能或被缺失的E3區(qū)。所用腺病毒基因組的E1和E3區(qū)均被缺失是優(yōu)選的(AE1AE3)。腺病毒可于表達病毒E1基因的已知細胞系，如293細胞或PERC.6細胞或來源于293或PERC.6細胞內(nèi)被擴增，這些細胞系被短暫或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達額外的蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)采用具有受控基因表達，如四環(huán)素可調(diào)節(jié)啟動子系統(tǒng)的構(gòu)建體時，細胞系可表達參與調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組分。該細胞系的一個實例是T-Rex-293；其它實例為本領(lǐng)域所知。
為腺病毒載體的操作方便性，腺病毒可以是穿梭質(zhì)粒形式。本發(fā)明也指向包含質(zhì)粒部分和腺病毒部分的穿梭質(zhì)粒載體，腺病毒部分包含具E1和可選E3缺失的腺病毒基因組，并具有包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的人hCEA的插入表達盒。在優(yōu)選實施方案中，質(zhì)粒的腺病毒部分側(cè)翼具有限制位點，使得腺病毒載體可被方便移除。該穿梭質(zhì)?？稍谠嘶蛘婧思毎麅?nèi)復(fù)制。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，表達盒被插入pMRKAd5-HVO腺病毒質(zhì)粒(參見Emini等，WO 02/22080，在此引入作為參考)。該質(zhì)粒包含缺失了E1和E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。通過將5’順式作用包裝區(qū)域延伸到E1基因區(qū)以并入對優(yōu)化病毒包裝重要的元件對pMRKAd5-HVO質(zhì)粒的設(shè)計進行改良，從而增強了病毒的復(fù)制。該加強的腺病毒載體能夠方便地在高代繁殖后維持遺傳穩(wěn)定性。
用于制備和純化DNA構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)使本發(fā)明腺病毒、穿梭質(zhì)粒和DNA免疫原得以制備。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)確定此處所述的合成cDNA分子(SEQ ID NO1)比相應(yīng)野生型序列具有更高的表達效率，該合成cDNA分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化。令人驚訝地，經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA的cDNA比野生型序列更為有效地打破了對hCEA的耐受性。此外，此處已顯示hCEAopt比hCEA免疫原性更高，且在引發(fā)細胞和體液免疫反應(yīng)方面更為有效。
因此，上述載體可被用于免疫原性組合物和疫苗，以預(yù)防與異常CEA表達相關(guān)的腺癌和\或治療現(xiàn)有癌癥。通過消除與獲得在成功轉(zhuǎn)化宿主生物體內(nèi)外源CEA高水平相關(guān)的難題，本發(fā)明載體有助于疫苗的開發(fā)和商業(yè)化。為此目的，本發(fā)明的一個方面是一種預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給哺乳動物施用包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子的疫苗載體，該經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子包含編碼了如SEQ IDNO2所示人CEA蛋白質(zhì)的核酸序列。
根據(jù)上述方法，為預(yù)防或治療任意哺乳動物體內(nèi)的癌癥，疫苗載體可被施用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，哺乳動物是人類。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可進一步選擇用于上述治療和預(yù)防方法的任意類型的載體。該載體優(yōu)選為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，該載體為腺病毒載體，包含具腺病毒E1區(qū)缺失和腺病毒E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達盒，該表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化、編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
本發(fā)明進一步涉及包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)插入的腺病毒基因組的腺病毒疫苗載體，其中該插入包含表達盒，該表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化、編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，腺病毒載體是Ad 5載體。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，腺病毒載體是Ad 6載體。
在又一優(yōu)選實施方案中，腺病毒載體是Ad 24載體。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含質(zhì)粒部分和表達盒部分的疫苗質(zhì)粒，該表達盒部分包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，此處公開的重組腺病毒疫苗與基于質(zhì)粒的多核苷酸疫苗一起被用于各種激發(fā)\加強組合中，以誘導(dǎo)增強的免疫反應(yīng)。因此，這兩種載體以“激發(fā)和加強”方案被施用。例如，第一種載體被施用后，經(jīng)過一段預(yù)定時間，例如2周、1個月、2個月、6個月或其它適當(dāng)間隔后，施用第二種載體。載體優(yōu)選地攜帶編碼相同多核苷酸或多核苷酸組合的表達盒。在也使用了質(zhì)粒DNA的實施方案中，優(yōu)選的載體含有一個或多個可被哺乳動物或昆蟲細胞識別的啟動子。在優(yōu)選實施方案中，質(zhì)粒將含有強啟動子，例如，但不限于CMV啟動子。合成的人CEA基因或其它待表達基因?qū)⒈贿B接到該啟動子。該質(zhì)粒的實例是如(J.Shiver等.在《DNA疫苗》，M.Liu等編輯，N.Y.Acad.Sci.，N.Y.，772198-208(1996)，在此引入作為參考)描述的哺乳動物表達質(zhì)粒Vains。
如上所述，腺病毒載體疫苗和質(zhì)粒疫苗可被作為單一治療方案的組成部分，施用給脊椎動物以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。為此目的，本發(fā)明涉及保護哺乳動物免患癌癥的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；(b)允許經(jīng)過一段預(yù)定時間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動物；該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；在上述保護方法的一個實施方案中，第一種載體是質(zhì)粒，第二種載體是腺病毒載體。在可選實施方案中，第一種載體是腺病毒載體，第二種載體是質(zhì)粒。
本發(fā)明進一步涉及治療患有腺癌的哺乳動物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；(b)允許經(jīng)過一段預(yù)定時間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動物；該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；在上述保護方法的一個實施方案中，第一種載體是質(zhì)粒，第二種載體是腺病毒載體。在可選實施方案中，第一種載體是腺病毒載體，第二種載體是質(zhì)粒。
待導(dǎo)入到疫苗受者的可表達DNA或轉(zhuǎn)錄RNA數(shù)量將部分依賴于所用啟動子的強度和所表達基因產(chǎn)物的免疫原性。一般而言，約1ng到100gm，優(yōu)選約10μg到300μg質(zhì)粒疫苗載體的免疫學(xué)或預(yù)防性有效劑量被直接使用到肌肉組織中。對重組腺病毒的有效劑量是約106-1012個顆粒，優(yōu)選約107-1011個顆粒。皮下注射、真皮內(nèi)導(dǎo)入、皮膚壓迫和其它給藥方式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入送遞也被考慮。同樣也考慮了提供加強接種。結(jié)合佐劑如白細胞介素12蛋白質(zhì)的非腸道給藥，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其它給藥方式與本發(fā)明疫苗的非腸道給藥同時或隨后進行也具有優(yōu)勢。
本發(fā)明的疫苗載體可以是裸露的，即不與任何對受者免疫系統(tǒng)有影響的蛋白質(zhì)、佐劑或其它藥劑結(jié)合。為此，理想的疫苗載體是在生理學(xué)可接受溶劑內(nèi)，例如，但不限于無菌生理鹽水或無菌緩沖鹽水?？蛇x地，與本發(fā)明疫苗或免疫原組合物同時施用免疫刺激劑，如佐劑、細胞因子、蛋白質(zhì)或其它載體也是有優(yōu)勢的。因此，本發(fā)明包括與本發(fā)明組合物和方法聯(lián)合應(yīng)用該免疫刺激劑。此處所用的免疫刺激劑，基本上指任何增強或加強針對外源抗原的免疫反應(yīng)(抗體和\或細胞介導(dǎo)的)的任何物質(zhì)。該免疫刺激劑可以DNA或蛋白質(zhì)形式被施用。多種免疫刺激劑的任一種均可被與本發(fā)明的疫苗和免疫原組合物聯(lián)合應(yīng)用，包括但不限于GM-CSF、IFNγ、破傷風(fēng)類毒素、IL12、B7.1、LFA-3和ICAM-1。該免疫刺激劑為本領(lǐng)域所熟知。
可輔助DNA細胞攝取的藥劑，例如但不限于鈣離子，也可被應(yīng)用。這些藥劑通常指作為轉(zhuǎn)染促進劑和藥學(xué)可接受載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定特定的免疫刺激劑或藥學(xué)可接受載體以及合適的時間和給藥模式。
為了描述和公開可能連同本發(fā)明應(yīng)用的方法和材料，此處提及的所有出版物均被引入作為參考。此處無任何內(nèi)容可以被認(rèn)為承認(rèn)本發(fā)明由于之前的發(fā)明而未被授權(quán)將本公開內(nèi)容提前。
在參考附圖描述了本發(fā)明優(yōu)選實施方案后，應(yīng)理解本發(fā)明不受限于那些準(zhǔn)確的實施方案，且在不偏離如在附錄權(quán)利要求中定義的本發(fā)明范圍和精神前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可實施各種改變和修正。
下列實施例例證了但不限制本發(fā)明。
實施例1人CEA優(yōu)化的密碼子序列完整的hCEAopt編碼序列通過BIONEXIS(Oakland，CA)合成和組裝。采用由PCR組裝的寡核苷酸構(gòu)建在5’末端攜帶有經(jīng)優(yōu)化的Kozak序列的hCEAopt cDNA。組裝的cDNA被插入到pCR-鈍端載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以產(chǎn)生pCR-hCEAopt。hCEAopt cDNA的完整性通過對兩條鏈的測序確定。
實施例2質(zhì)粒構(gòu)建體和腺病毒載體pV1J/hCEAopt用EcoRI于37℃消化pCR-hCEAopt質(zhì)粒1小時。得到的2156bp插入序列經(jīng)純化并克隆到pV1JnsB質(zhì)粒(Montgomery等，DNA Cell Biol.，12(9)777-83(1993)的EcoRI位點。
pV1J/hCEA用EcoRI消化pCI/hCEA質(zhì)粒(Song等，通過組合的基于DNA的免疫接種和非病毒細胞因子基因轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)T-輔助-1對T-輔助-2活性及增強腫瘤免疫性。Gene Therapy 7481-492(2000))。得到的2109bp插入序列被克隆到pV1JnsA質(zhì)粒(Montgomery等，如前)的EcoRI位點。
Ad5/hCEAopt用EcoRI消化pCR-hCEAopt質(zhì)粒。得到的2156bp的插入序列經(jīng)純化并克隆到polyMRK-Ad5穿梭質(zhì)粒的EcoRI(參見Emini等，WO02/22080，在此引入作為參考)。
Ad5/CEA用于產(chǎn)生Ad5載體的pMRK-hCEA穿梭質(zhì)粒獲得自采用SspI和EcoRV消化pDeltalsplB/hCEA質(zhì)粒。然后將9.52kb的片段連接到來自polyMRK質(zhì)粒、BglII-BamHI限制性、1272bp的Klenow處理產(chǎn)物上。在大腸桿菌BJ5183細胞中將來自pMRK-hCEA和pMRK-hCEAopt、包含用于hCEA的表達盒和E1側(cè)翼Ad5區(qū)域的Pacl/StuI片段與ClaI線性化的pAd5質(zhì)粒重組。得到的質(zhì)粒分別為pAdS-hCEA和pAd5-hCEAopt。兩種質(zhì)粒均用Pad酶切以釋放Ad反轉(zhuǎn)末端重復(fù)(ITRs)并轉(zhuǎn)染PerC-6細胞。采用系列傳代進行Ad5載體的擴增。通過標(biāo)準(zhǔn)CsCl梯度純化方法純化并用A105緩沖液(5mMTris-Cl pH 8.0，1mM MgCl2，75mM NaCI，5％蔗糖，0.005Tween20)充分透析MRKAdS/hCEA和MRKAdS/hCEAopt。
實施例3CEA表達和檢測采用蛋白質(zhì)印跡分析檢測由質(zhì)粒和Ad載體的hCEA表達。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Carlsbad，CA)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細胞或Perc.6細胞中。Perc.6細胞的腺病毒感染在37℃下于無血清培養(yǎng)基中進行30分鐘，然后加入新鮮培養(yǎng)基。溫育48小時后，收集全細胞裂解物和培養(yǎng)上清。通過蛋白質(zhì)印跡分析采用兔多克隆抗體檢測細胞裂解物中存在的CEA蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)被檢測為180-220kDa條帶。采用直接酶聯(lián)免疫吸附試驗CEA試劑盒(DBC-DiagnosticsBiochem Canada Inc.，Ontario，Canada)檢測在細胞上清和經(jīng)注射小鼠(注射后3天)外周血中分泌的CEA。
實施例4小鼠免疫雌性C57BL/6小鼠(H-2b)購自Charles River(Lecco，Italy)。CEA.tg小鼠(H-2b)由J.Primus(Vanderbilt University)提供并與標(biāo)準(zhǔn)條件下保存。按照以前所描述的方法(Rizzuto等，.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(11)6417-22(1999))將50μg質(zhì)粒DNA以50μl體積電注射到小鼠四頭肌中。在小鼠四頭肌中以50μl體積進行Ad注射。在指定時間分析體液和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
實施例5經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA的cDNA顯著提高hCEA的表達人CEA(hCEAopt)的合成基因被設(shè)計以并入針對每種氨基酸(下文表示為aa)殘基的人類首選密碼子。經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA被修飾以維持與原始克隆76.8％的同一性(參見圖1)。經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA被克隆到pV 1J載體中(Montgomery等，如前)，并置于Kozak優(yōu)化序列(5′-GCCGCCACC-3′，SEQ ID NO13)之前，且位于人巨細胞(CMV)/內(nèi)含子A啟動子和牛生長激素(BGH)終止信號的控制下。
該構(gòu)建體被命名為pV 1J/hCEAopt(參見實施例2)。此外，構(gòu)建了攜帶hCEAopt序列的腺病毒5型載體(Ad5/hCEAopt)，該hCEAopt序列由CMV/內(nèi)含子和BGH終止信號位于側(cè)翼。為進行比較，攜帶有野生型hCEA序列的相應(yīng)的質(zhì)粒和Ad5載體被構(gòu)建并產(chǎn)生pV1J/hCEA和Ad5/hCEA。與含有經(jīng)密碼子優(yōu)化cDNA的載體類似，這些載體攜帶有位于CMV/int A啟動子和BGH終止信號控制下的野生型基因。
對用pV1J/hCEAopt轉(zhuǎn)染的Hela細胞進行的蛋白質(zhì)印跡分析產(chǎn)生了具有較大分子量(180-200kDa)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在體積上與在pV1J/hCEA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞中所檢測的難以區(qū)別。類似地，用Ad5/hCEA或Ad5H7hCEAopt轉(zhuǎn)染的PerC-6細胞的上清液中檢測到的蛋白質(zhì)在體積上也沒有明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
為比較hCEAopt和hCEA的表達效率，用1×107到1×104pfu的不同劑量的Ad5/hCEAopt載體注射到10只C57BL/6小鼠的實驗組的四頭肌內(nèi)。注射后三天，測定CEA蛋白質(zhì)水平并與對照組的蛋白質(zhì)水平進行比較，該對照組被注射了相同劑量的Ad5/hCEA。與注射Ad5/hCEA的小鼠相比，觀察到注射1×107pfu Ad/hCEAopt(48.2μg/l)后，hCEA水平的幾何平均值提高了6倍，而注射了1×106pfu相同病毒(19.1μg/l)后蛋白質(zhì)水平提高了10倍(圖2A)。與之對照，與Ad5/hCEA相比，注射較低劑量的Ad5/hCEAopt基本未導(dǎo)致循環(huán)CEA水平的提高。相對于pV 1J/hCEA，在電注射20或50μgpV1J/hCEAopt質(zhì)粒后CEA蛋白質(zhì)水平的增加雖然程度稍低，但也很顯著(圖2B)。因此，這些結(jié)果說明，經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA與相應(yīng)的野生型序列相比具有更高的表達效率，不受所用基因轉(zhuǎn)移載體的限制。
實施例6IFN-γELISPOT分析用在無菌PBS中稀釋為2.5μg/ml的純化兔抗鼠IFN-γ((IgGl，克隆R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)按100μl/孔包被96孔MAIP平板(Millipore，Bedford，MA)。經(jīng)PBS洗滌后，用220μl/孔的R10培養(yǎng)基于37℃封閉平板2小時。
通過以無菌方式從無痛致死小鼠移除脾臟以獲得脾細胞。通過在金屬網(wǎng)上磨碎經(jīng)分割的脾臟進行脾臟粉碎。通過在細胞沉淀物中加入1ml 0.1×PBS進行滲透裂解并旋渦振蕩不超過15秒以除去紅細胞。然后加入1ml 2×PBS并用1×PBS將體積調(diào)整為4ml。
通過室溫下1200rpm離心10分鐘以沉淀細胞，并于1ml RIO培養(yǎng)基中重新懸浮沉淀物。用Turks染色計數(shù)活細胞。
脾細胞以5×105和2×105細胞/孔濃度鋪培養(yǎng)板，每個濃度設(shè)兩組平行，并與1μg/ml每種肽的懸液于37℃溫育20小時。對每只小鼠用5μg/ml的Concanavalin A(ConA)作為陽性內(nèi)參。用含0.05％Tween20的PBS洗滌后，用50μl/孔、于試驗緩沖液中按1∶2500稀釋的生物素偶聯(lián)的兔抗鼠IFN-γ(RatIgGl，clone XMG 1.2，PharMingen)于4℃溫育平板過夜。經(jīng)充分洗滌后，加入50μl/孔NBT-CIP(PierceBiotechnology Inc.，Rockford，IL)顯影平板，直到斑點顯影清晰可見為止。
通過用蒸餾水充分洗滌細胞平板以終止反應(yīng)。將平板在空氣中干燥并用自動ELISPOT讀板機計數(shù)斑點。
實施例7細胞內(nèi)細胞因子染色將1ml RPMI 10％FCS中的一到兩百萬個小鼠脾細胞或PBMC與肽合并物(每種肽終濃度為5-6μg/ml)、brefeldin A(1μg/ml，BD Pharmingen cat #555028/2300kk)和5％CO2一起于37℃溫育12-16小時。然后用FACS緩沖液(PBS 1％ FBS，0.01％ NaN3)洗滌細胞并將細胞與純化抗鼠CD16/CD32 Fc block(BD Pharmingen cat #553142)一起于4℃溫育15分鐘。接著洗滌細胞并用表面抗體CD4-PE偶聯(lián)抗鼠(BD Pharmingen，cat.# 553049)、PercP CD8偶聯(lián)抗鼠(BD Pharmingen cat# 553036)和APC偶聯(lián)抗鼠CD3e(BDPharmingen cat# 553066)，于暗處室溫對細胞進行30分鐘染色。經(jīng)洗滌后，用Cytofix-Cytoperm溶液(BD Pharmingen cat#555028/2300kk)固定化并滲透細胞。用PermWash溶液(BDPharmingen cat #555028/2300kk)洗滌細胞后，將細胞與IFNγ-FITC抗體(BD Pharmingen)溫育。然后洗滌細胞、用含1％甲醛的PBS進行固定化并于FACS-Calibur流式細胞儀上用CellQuest軟件(Becton Dickinson，San Jose，CA)進行分析。
實施例8用于CEA特異性T細胞直接計數(shù)的含表位的肽的鑒定和表征為更好的表征在小鼠內(nèi)針對CEA的遺傳接種所引發(fā)的免疫反應(yīng)，對C57BL/6和BALB/c進行ELISPOT分析以鑒定CD4+和CD8+CEA特異性表位。為此目的，比較了不同的免疫程式以產(chǎn)生高度免疫的小鼠，該小鼠可被用于鑒定對覆蓋整個蛋白質(zhì)的個體肽的反應(yīng)。考慮到最近的報導(dǎo)顯示通過采用質(zhì)粒DNA初次免疫-Ad加強免疫程式可誘導(dǎo)針對病毒和細菌抗原的高水平細胞免疫，本研究中采用了相同的免疫模式。用不同的方式肌肉內(nèi)免疫小鼠i)兩劑1×109vp的Ad/hCEA(Ad/Ad)；ii)兩劑pV1J/hCEA質(zhì)粒(DNA/DNA)和iii)一劑質(zhì)粒DNA，之后一劑Ad/hCEA(DNA/Ad)。免疫時間間隔為兩周。
在加強免疫兩周后通過ELISPOT測定由不同免疫方案引發(fā)的細胞免疫。為比較不同接種方案的免疫原性效率，采用覆蓋氨基酸497-703、重疊11個氨基酸的15mer肽合并物(合并物D)激發(fā)由脾細胞分泌的抗原特異性細胞因子。在DNA/Ad注射組的C57BL/6和BALB/c小鼠中觀察到由較高的SFC幾何平均值所顯示的最強的反應(yīng)(圖4)。因此，該方法被用于進一步分析免疫反應(yīng)。
為確定免疫反應(yīng)是否等量分布于整個CEA蛋白質(zhì)上，用完全覆蓋整個蛋白質(zhì)序列的4個15mer肽合并物中的1個于體外激發(fā)來自經(jīng)免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾細胞。每個合并物由重疊11個殘基、15個氨基酸長的肽組成。凍干的hCEA肽購自Bio-Synthesis(Lewisville，TX)并以40mg/ml重懸于DMSO中。除了合并物D以外，合并物A(氨基酸1到47)、B(氨基酸137到237)和C(氨基酸317到507)也都被用于本研究。終濃度如下合并物A＝1.2mg/ml、合并物B＝0.89mg/ml、合并物C＝0.89mg/ml、合并物D＝0.8mg/ml。肽保存于-80℃。
在C57BL/6小鼠中由DNA/Ad接種方案引發(fā)的免疫反應(yīng)明顯地偏向蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域(參見圖5A)。用肽合并物C和D獲得了顯著的SFC數(shù)值(幾何平均值分別為170和244SFC/106脾細胞)，而合并物A和B產(chǎn)生了低得多的數(shù)值(分別為10和27SFC/106脾細胞)。相反地，在BALB/c小鼠中用合并物B得到的免疫反應(yīng)最高(幾何平均值1236SFC/106脾細胞)，盡管合并物A、C和D也顯示了顯著的SFC數(shù)值(分別為93、263和344)(圖5B)。在兩組小鼠中針對無關(guān)肽合并物無顯著的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
為確定肽合并物中引發(fā)反應(yīng)的個體肽，針對每種個體肽用IFNγ-ELISPOT試驗分析4只用DNA/Ad接種方案免疫的小鼠的脾臟，這些肽包含了觀察到顯著免疫反應(yīng)的肽合并物。針對包括在合并物C和D中的肽80到173測試了來自C57BL/6小鼠的脾細胞。對包含合并物B、C和D的肽35到173測試了來自BALB/c小鼠的脾細胞。C57BL/6小鼠中的CEA特異性反應(yīng)被定位到4對具有重疊序列的15mer肽(氨基酸431到435和425到439；529到543，和533到547；565到579，和569到593；613到627和617到631)(圖6A)。在BALB/c小鼠中免疫反應(yīng)被定位到22個不同的肽，其中17個具有重疊序列(氨基酸213到227，和213到227；229到243，和233到247；409到423和413到427；421到435和425到439；565到579和569到583；573到587；613到627和617到631；和621到635和625到639；637到651和641到655)(圖6B)。
為定義所選肽中含有的表位的T細胞特異性，在來自經(jīng)注射小鼠的脾細胞上進行IFNγ細胞內(nèi)染色試驗。獲得的結(jié)果如圖7所示。數(shù)據(jù)說明已鑒定了C57BL/6和BALB/c小鼠的CD8+和CD4+特異性表位，可被用于定量T淋巴細胞的循環(huán)水平。
實施例9經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA打破了hCEA轉(zhuǎn)基因小鼠的耐受性為確定經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA增強的免疫原屬性是否會更為有效地打破對人CEA的耐受性，用攜帶有野生型或經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA序列的載體免疫hCEA轉(zhuǎn)基因小鼠。這些轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有完整的人CEA基因以及側(cè)翼序列且在盲腸和結(jié)腸表達hCEA蛋白質(zhì)。因此，該小鼠細胞系對研究針對該腫瘤自身抗原的免疫治療策略的安全性和有效性而言是有用的模型(Clarke等.人CEA轉(zhuǎn)基因小鼠作為免疫治療模型，Cancer Res.58(7)1469-77(1998))。
首先，用4次50μg質(zhì)粒DNA電注射處理5到10只轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗組，隨后終注射1×1010pp腺病毒。用IFNγ-ELISPOT實驗在收集自4只經(jīng)注射小鼠的脾細胞上分析對hCEA的免疫反應(yīng)。僅用來自hCEAopt cDNA免疫小鼠的脾細胞檢測到了對hCEA的免疫反應(yīng)(參見圖8)。用肽143和合并物D檢測到免疫反應(yīng)，說明免疫已引發(fā)了對C末端表位引發(fā)顯著的Cd8+反應(yīng)。
在用間隔兩周的兩次1×1010pp腺病毒載體注射的轉(zhuǎn)基因小鼠中也測試了經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA的增強的免疫原性。用IFNγ細胞內(nèi)染色在收集自4只經(jīng)免疫小鼠的PBMC上測定CEA特異性免疫反應(yīng)。僅在Ad/CEAopt免疫的小鼠中檢測到了對hCEA的免疫反應(yīng)(圖9)。如在DNA加Ad組中所觀察到的，用肽合并物D檢測到CD8+T細胞的誘導(dǎo)；但用肽合并物A也觀察到顯著的CD8+反應(yīng)。因此，這些結(jié)果說明經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA比野生型序列免疫原性更高且更為有效地打破對hCEA的耐受性。
實施例10抗體檢測和滴定用于抗體滴定的血清獲得自后眼眶取血。用稀釋于包被緩沖液(50mM NaHCO3，pH 9.4)中的CEA蛋白質(zhì)(高純CEA；FitzgeraldIndustries International Inc.，Concord MA)按100ng/孔包被ELISA平板((Nunc maxisorpTM)并于4℃溫育過夜。然后用含有5％BSA的PBS于37℃封閉平板1小時。于5％BSA的PBS中稀釋小鼠血清(稀釋50倍以評估血清轉(zhuǎn)化率；稀釋度從1∶10到1∶31，2150以評估滴度)。免疫前血清用作背景。稀釋的血清于4℃溫育過夜。
用含1％BSA、0.05％Tween 20的PBS進行洗滌。二級抗體(羊抗鼠，IgG過氧化物酶，Sigma)于含5％BSA的PBS中稀釋2000倍并于室溫下在搖床上溫育2-3小時。洗滌后，將平板用TMB底物(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)按100μl/孔顯影。用25μl/孔的1M H2SO4溶液終止反應(yīng)并于450nm/620nm讀板?？笴EA血清滴度被計算為血清極限稀釋度的倒數(shù)，在該極限稀釋度下血清產(chǎn)生的吸光度比相同稀釋度自體免疫前血清的吸光度至少大3倍。
實施例11提高的hCEAopt免疫原性為檢測由野生型和經(jīng)密碼子優(yōu)化CEA表達載體誘導(dǎo)的體內(nèi)免疫反應(yīng)，用1×105到1×103pfu范圍內(nèi)不同劑量的Ad5/hCEAopt肌肉內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。作為比較，用1×106到1×104pfu范圍內(nèi)劑量的Ad5/hCEA免疫8到10只小鼠的實驗組。用間隔3周的兩次注射處理小鼠。第二次免疫后2周，從每只小鼠中分離脾細胞。為定量由腺病毒介導(dǎo)的免疫產(chǎn)生的分泌IFNγ的CEA特異性CD8T細胞前體頻率，用于H-2b限制T細胞表位CGIQNSVSA(SEQ ID NO14，參見下文)的ELISPOT實驗被采用。1×104pfu的免疫引發(fā)了可測量的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了53個特異于CGIQNSVSA表位(SEQ ID NO14)的IFNγ斑點形成細胞(SFC，幾何平均值)，而注射1×103pfu僅引發(fā)了可忽略的SFC數(shù)值(圖3A)。SFC在用1×105pfu Ad/hCEAopt免疫的實驗組中增加到302。相反地，至少需要1×105pfu Ad5/hCEA才能引發(fā)顯著的CD8T細胞前體頻率，該頻率在用1×106pfu劑量免疫的小鼠實驗組中增加到168SFC。在Ad5免疫的小鼠中未檢測到肽特異性IFNγ(數(shù)據(jù)未顯示)。
在ELISA中用純化的人CEA蛋白質(zhì)作為底物測試來自用1×105pfu每種hCEA腺病毒載體免疫的小鼠的血清(圖3B)。在所有經(jīng)免疫小鼠中均檢測到Ad5/hCEAopt免疫小鼠的CEA特異性抗體滴度，且Ab滴度的幾何平均值為46，474。相反地，Ad5/hCEA免疫的實驗組顯示了約低100倍的CEA特異性抗體滴度幾何平均值(454)。因此，這些數(shù)據(jù)證明經(jīng)密碼子優(yōu)化的CEA cDNA在引發(fā)細胞和體液免疫反應(yīng)方面更為有效。
實施例12統(tǒng)計學(xué)分析該實施例所示結(jié)果是通過斯氏t檢驗分析的。小于0.05的p值被認(rèn)為是顯著的。
序列表<110>Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolar P.Angeletti S.P.A.
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cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggcaccagc 2040cccggcctga gcgccggcgc caccgtgggc atcatgatcg gcgtgctggt gggcgtggcc 2100ctgatctga 2109<210>2<211>702<212>PRT<213>智人<400>2Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr675 680 685Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile690 695 700<210>3<211>2109<212>DNA<213>智人<400>3atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300tatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100ctgatatag 2109<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>肽<400>4Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys His Ala1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>5Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>6Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>7Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly1 5 10 15<210>8
<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>8Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser1 5 10 15<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>9Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp His1 5 10 15<210>10<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>10Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu1 5 10 15<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>11Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln1 5 10 15
<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>12Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr1 5 10 15<210>13<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Kozak序列<400>13gccgccacc9<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T-細胞表位<400>14Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala1 5<210>15<211>2034<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>15atggagagcc ccagcgcccc cccccaccgc tggtgcatcc cctggcagcg cctgctgctg 60accgccagcc tgctgacctt ctggaacccc cccaccaccg ccaagctgac catcgagagc 120
acccccttca acgtggccga gggcaaggag gtgctgctgc tggtgcacaa cctgccccag 180cacctgttcg gctacagctg gtacaagggc gagcgcgtgg acggcaaccg ccagatcatc 240ggctacgtga tcggcaccca gcaggccacc cccggccccg cctacagcgg ccgcgagatc 300atctacccca acgccagcct gctgatccag aacatcatcc agaacgacac cggcttctac 360accctgcacg tgatcaagag cgacctggtg aacgaggagg ccaccggcca gttccgcgtg 420taccccgagc tgcccaagcc cagcatcagc agcaacaaca gcaagcccgt ggaggacaag 480gacgccgtgg ccttcacctg cgagcccgag acccaggacg ccacctacct gtggtgggtg 540aacaaccaga gcctgcccgt gagcccccgc ctgcagctga gcaacggcaa ccgcaccctg 600accctgttca acgtgacccg caacgacacc gccagctaca agtgcgagac ccagaacccc 660gtgagcgccc gccgcagcga cagcgtgatc ctgaacgtgc tgtacggccc cgacgccccc 720accatcagcc ccctgaacac cagctaccgc agcggcgaga acctgaacct gagctgccac 780gccgccagca acccccccgc ccagtacagc tggttcgtga acggcacctt ccagcagagc 840acccaggagc tgttcatccc caacatcacc gtgaacaaca gcggcagcta cacctgccag 900gcccacaaca gcgacaccgg cctgaaccgc accaccgtga ccaccatcac cgtgtacgcc 960gagcccccca agcccttcat caccagcaac aacagcaacc ccgtggagga cgaggacgcc 1020gtggccctga cctgcgagcc cgagatccag aacaccacct acctgtggtg ggtgaacaac 1080cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggc2034<210>16<211>678<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>16Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670Thr Val Ser Ala Ser Gly67權(quán)利要求
1.合成的核酸分子，包含編碼如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該合成核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達進行了密碼子優(yōu)化。
2.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是mRNA。
4.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是cDNA。
5.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
6.包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
7.包含權(quán)利要求6的載體的宿主細胞。
8.在重組宿主細胞中表達人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包含權(quán)利要求1的核酸的載體導(dǎo)入到合適的宿主細胞中；并(b)在允許該人CEA蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)該宿主細胞。
9.預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給哺乳動物施用包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子的疫苗載體，核酸分子包含編碼如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白質(zhì)或如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原變體的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中哺乳動物為人類。
11.權(quán)利要求9的方法，其中載體為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中載體為腺病毒載體，包含具腺病毒E1區(qū)缺失和腺病毒E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達盒，所述表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
13.權(quán)利要求9的方法，其中載體為質(zhì)粒疫苗載體，包含質(zhì)粒部分和可表達盒，該可表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
14.腺病毒疫苗載體，包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達盒，所述表達盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
15.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad5載體。
16.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad6載體。
17.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad24載體。
18.包含質(zhì)粒部分和表達盒部分的疫苗質(zhì)粒，表達盒部分包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
19.保護哺乳動物免患癌癥的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；(b)允許經(jīng)過一段預(yù)定時間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中第一種載體是質(zhì)粒而第二種載體是腺病毒載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中第一種載體是腺病毒載體而第二種載體是質(zhì)粒。
22.治療患結(jié)直腸癌的哺乳動物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子；(b)允許經(jīng)過一段預(yù)定時間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中第一種載體是質(zhì)粒而第二種載體是腺病毒載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中第一種載體是腺病毒載體而第二種載體是質(zhì)粒。
25.包含編碼如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)變體的核苷酸序列的合成核酸分子，該合成核酸分子為在人體細胞內(nèi)高水平表達而進行了密碼子優(yōu)化；
26.權(quán)利要求25的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO15所示的核苷酸序列。
27.包含權(quán)利要求25的核酸分子的載體。
28.包含權(quán)利要求27的載體的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼人癌胚抗原(CEA)的合成多核苷酸，該合成多核苷酸為在人體細胞環(huán)境中表達經(jīng)過了密碼子優(yōu)化。編碼CEA的基因通常與人類腫瘤的發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明提供了引發(fā)或增強針對由CEA腫瘤相關(guān)抗原表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，其中，異常的CEA表達與癌或其發(fā)展有關(guān)。具體而言，本發(fā)明提供了攜帶有經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA的腺病毒載體和質(zhì)粒，且公開了它們在用于預(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物方面的用途。
文檔編號C07K14/47GK1784424SQ200480012115
公開日2006年6月7日 申請日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月5日
發(fā)明者N·拉莫尼卡, A·拉姆, C·門努尼, R·薩維諾 申請人:P.安杰萊蒂分子生物學(xué)研究所