專利名稱：雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有藥用價(jià)值的生物表面活性劑的制備方法，具體的說(shuō)是一種雙 鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法。
二背景技術(shù)：
鼠李糖脂是一類由微生物代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)。除具有化學(xué)合成表面活性劑 的一般功能外，鼠李糖脂產(chǎn)品本身無(wú)毒，環(huán)境友好，能夠被微生物100%降解，可廣泛
應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)及日常生活的很多領(lǐng)域。近年的研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂具有抗生素活
性，尤其是其中的雙鼠李糖脂可以抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)(BioresourceTechnology2007， 98:1149 1153),及輔助銀屑病、神經(jīng)性皮炎等皮膚病(Journal of Dermatological Science 2005， 40: 141 143)和自身免疫病(U. S. Patent5， 466， 675， 1999)的治療。這些發(fā)現(xiàn) 為雙鼠李糖脂在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也受到人們廣泛關(guān)注。
微生物代謝產(chǎn)生的鼠李糖脂是混合物，其中能夠用于醫(yī)藥領(lǐng)域的活性成分是雙鼠 李糖脂，而雙鼠李糖脂的含量因菌種的不同產(chǎn)生很大差別。因此，獲得雙鼠李糖脂產(chǎn) 量較多的菌種是關(guān)鍵。目前油平板篩選方法的使用較為普遍，生物表面活性劑可以促 進(jìn)微生物對(duì)油類等非極性難溶底物的利用，采用油作為單一碳源篩選容易得到生物表 面活性劑產(chǎn)生菌。上文提到的(BioresourceTechnology2007， 98:1149 1153)(文獻(xiàn)1) 和(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 1997， 19， 232 238)(文獻(xiàn)2) 中提供了雙鼠李糖脂制備的方法。前者使用的菌種為自篩選菌種，后者采用了上海有 機(jī)所提供的菌種。他們都是以植物油為單一碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，有機(jī)溶劑萃取后采用 柱層析、TLC和高效液相色譜等方法分離得雙鼠李糖脂。
上述制備雙鼠李糖脂的方法存在有以下不足:(l)無(wú)論篩選菌種還是采用現(xiàn)有菌種 都是以鼠李糖脂產(chǎn)量作為挑選依據(jù)，不能保證雙鼠李糖脂產(chǎn)量，而且結(jié)果表明雙鼠李 糖脂產(chǎn)量確實(shí)很低。文獻(xiàn)2中鼠李糖脂產(chǎn)量為17g/L_24g/L，其中雙鼠李糖脂(主要成 分Rh2Cu)Cu))和單鼠李糖脂(主要成分RhCK)CK))的質(zhì)量比為1:4，文獻(xiàn)1中雖未提供產(chǎn) 量的具體信息，但其中具有抗乳腺癌功能的雙鼠李糖脂Rh2Cu)CH)僅占萃取得粗提取物 的0.1%。 (2)采用油平板篩選可以將能夠利用植物油作單一碳源的微生物全部篩選出
來(lái)，即使選擇長(zhǎng)勢(shì)好的產(chǎn)生物表面活性劑的菌種也很難保證所產(chǎn)生物表面活性劑是鼠 李糖脂。因此，該方法選擇性較差，工作量大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種選擇性強(qiáng)、得鼠李糖脂產(chǎn)量高尤其是雙鼠李糖脂產(chǎn)量 高的菌種篩選方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)制備雙鼠李糖脂的方法。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為 一種雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選方法，包括以 下步驟
a、 選取被油脂污染的現(xiàn)場(chǎng)采集土壤樣品作為菌種篩選源；
b、 樣品浸泡處理后接種植物油作碳源的富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 72h后得富集培養(yǎng)
液；
c、 把富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于十六烷基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24 96h， 挑取長(zhǎng)勢(shì)好且數(shù)量多的單菌落斜面保種；
d、 挑取斜面保存的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 120h后測(cè)定表面活性，選擇活 性較高的菌種發(fā)酵液上清進(jìn)行TLC分析，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯 酚硫酸顯色劑顯色，初步判斷雙鼠李糖脂含量，選擇Rf值為0.46的斑點(diǎn)顏色濃重的菌 種即雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌保留，零下26'C甘油保存。
一種雙鼠李糖脂的制備方法，包括以下步驟
a、 選取被油脂污染的現(xiàn)場(chǎng)采集土壤樣品作為菌種篩選源；
b、 樣品浸泡處理后接種植物油作碳源的富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 72h后得富集培養(yǎng)
液；
c、 把富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于十六烷基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24 96h， 挑取長(zhǎng)勢(shì)好且數(shù)量多的單菌落斜面保種；
d、 挑取斜面保存的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 120h后測(cè)定表面活性，選擇活 性較高的菌種發(fā)酵液上清進(jìn)行TLC分析，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/vA^65:15:2，苯 酚硫酸顯色劑顯色，初步判斷雙鼠李糖脂含量，選擇Rf值為0.46的斑點(diǎn)顏色濃重的菌 種即雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌保留，零下26T:甘油保存；
e、 將篩選所得菌種接種LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 36h后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25—38'C
培養(yǎng)72 120h;
f、 發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液離心除菌體；
g、 調(diào)整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取劑，攪拌、靜置分液，保 留機(jī)相；
h、 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸除溶劑，得到鼠李糖脂粗提取物；
i、 將粗提取物在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以洗脫劑洗脫，部分收集；
j、 TLC檢測(cè)分離情況，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸顯色劑 顯色，將Rf值為0.46的洗脫液合并，減壓蒸干得所需雙鼠李糖脂。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)(1)在菌種初篩過(guò)程中選用了植物 油作唯一碳源的液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，使生物表面活性劑產(chǎn)生菌在富集過(guò)程中成為優(yōu) 勢(shì)菌群，之后稀釋涂布于十六垸基三甲基溴化銨瓊脂平板進(jìn)行篩選，該培養(yǎng)基中革蘭 氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差，大腸桿菌不能生長(zhǎng)，而產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)良好，而且具有以下特征:菌落呈灰白色，扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延， 表面濕潤(rùn)，菌落周圍培養(yǎng)基擴(kuò)散有水溶性色素，因此其選擇性較強(qiáng)，減少了工作量。(2) 復(fù)篩過(guò)程中，除了以產(chǎn)量作標(biāo)準(zhǔn)外，增加了TLC分析過(guò)程。單鼠李糖脂較雙鼠李糖脂 少一糖基，極性較弱，采用氯仿:甲醇:乙酸v/vA^65:15:2作展開劑時(shí)，它們的Rf值分 別為0.75和0.46，因此可通過(guò)顯色斑點(diǎn)大致判斷雙鼠李糖脂所占比例，進(jìn)一步提高了 篩選準(zhǔn)確度。G)篩選得到的生物表面活性劑高產(chǎn)菌株中，鼠李糖脂產(chǎn)生菌約占挑取 菌株總量的66%，其中假單胞菌尸"t^omonfl^ sp.SC-02發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂，最高產(chǎn) 量可達(dá)24g/L。目標(biāo)產(chǎn)物雙鼠李糖脂產(chǎn)量為16.3g/L，約占鼠李糖脂總質(zhì)量的68%，而 文獻(xiàn)2中雙鼠李糖脂占鼠李糖脂總產(chǎn)量20%的，該結(jié)果優(yōu)于文獻(xiàn)2.該菌株所產(chǎn)雙鼠李 糖脂中，已證實(shí)具有抑制乳腺癌細(xì)胞分裂功能的Rh2doQo約占雙鼠李糖脂總質(zhì)量的 90%，占總提取物質(zhì)量的23%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)1報(bào)道的占總提取物的0.1%。 (4)該雙鼠 李糖脂制備方法工藝流程簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，配合該方法中各比例乙酸乙酯和甲醇作 洗脫劑，普通的硅膠柱層析方法即可從發(fā)酵液萃取物中分離出較純的雙鼠李糖脂。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 四

圖1是本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法的流程圖。
圖2是本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法的產(chǎn)生菌篩選流程圖。
圖3是本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法的微生物發(fā)酵法制備雙鼠李糖
脂的流程圖。
五具體實(shí)施例方式
結(jié)合圖l，本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法，包括以下步驟-
a、 選取被油脂污染的現(xiàn)場(chǎng)采集土壤樣品作為菌種篩選源；
b、 樣品浸泡處理后接種植物油作碳源的富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 72h后得富集培養(yǎng)
液；
c、 把富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于十六垸基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24 96h， 挑取長(zhǎng)勢(shì)好且數(shù)量多的單菌落斜面保種；
d、 挑取斜面保存的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 120h后測(cè)定表面活性，選擇活 性較高的菌種發(fā)酵液上清進(jìn)行TLC分析，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v-65:15:2，苯 酚硫酸顯色劑顯色，初步判斷雙鼠李糖脂含量，選擇Rf值為0.46的斑點(diǎn)顏色濃重的菌 種即雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌保留，零下26'C甘油保存；
e、 將篩選所得菌種接種LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 36h后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25—38'C 培養(yǎng)72 120h;
f、 發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液離心除菌體；
g、 調(diào)整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取劑，攪拌、靜置分液，保 留機(jī)相；
h、 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸除溶劑，得到鼠李糖脂粗提取物；
i、 將粗提取物在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以洗脫劑洗脫，部分收集；
j、 TLC檢測(cè)分離情況，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸顯色劑 顯色，將Rf值為0.46的洗脫液合并，減壓蒸干得所需雙鼠李糖脂。
實(shí)施例1:結(jié)合圖2，本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選方法，即在長(zhǎng)期被油脂污染 的廚房排污口附近采集土壤樣品，稱取10g土壤樣品加入裝有50mL去離子水的燒杯 中，攪拌混勻。浸泡lh后取20mL接入80mL富集培養(yǎng)基，250mL錐形瓶，置于32°C 搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速230r/min。 36h后取出富集液，梯度稀釋，分別取稀釋倍數(shù)為104， 105， 106的菌懸液涂布十六垸基三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，30'C培養(yǎng)48h(環(huán) 境溫度低于此溫度也可，但需延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至菌落長(zhǎng)大至便于觀察形態(tài))，觀察菌落形 態(tài)，挑選同形態(tài)菌落數(shù)居多的菌種，尤其應(yīng)選擇具有以下特點(diǎn)的菌落:灰白色，扁平無(wú) 定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。接 種環(huán)挑取目的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，250mL錐形瓶，裝液量80mL， 30'C搖床培養(yǎng)， 220r/min。 72h后取出，10000r/min離心15min，取上清液分別用排油法和表面張力法 測(cè)試表面活性，選擇排油圈大于10cm，且表面張力低于30mN/m的菌種作為高產(chǎn)菌保 留，上清液毛細(xì)管點(diǎn)樣薄層層析硅膠板，為增加樣品濃度可在同一位置多次點(diǎn)樣，注 意每次點(diǎn)樣前等待上次點(diǎn)樣的水分揮干。配制展開劑(氯仿:甲醇:乙酸=65:15:2)于層 析缸中，將硅膠板放入，待展開劑距硅膠板頂部lcm時(shí)取出，揮干展開劑，用玻璃噴 霧器向硅膠板噴灑顯色劑(顯色劑3g苯酚和5mL濃硫酸溶于95mL無(wú)水乙醇)電吹 風(fēng)加熱顯色。鼠李糖脂產(chǎn)生菌發(fā)酵液經(jīng)展開顯色后會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)棕黃色斑點(diǎn)，Rf值分別 為0.75和0.46，選擇Rf值為0.46處斑點(diǎn)顏色濃重的菌種保留。此方法得到的29株發(fā) 酵液具表面活性的菌種中鼠李糖脂產(chǎn)生菌為22株，從中挑選雙鼠李糖脂產(chǎn)量較多的菌 株。其中菌株SC-02為本次篩選得到的雙鼠李糖脂產(chǎn)量最高的菌種，零下26"C甘油保 存菌種。
實(shí)施例2:本發(fā)明雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選方法，即在油煙機(jī)排氣管附近采集土壤 樣品，稱取10g土壤樣品加入裝有50mL去離子水的燒杯中，攪拌混勻。浸泡lh后取 10mL接入40mL富集培養(yǎng)基，150mL錐形瓶，置于不高于4(TC搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速230r/min。 在24-72h后取出富集液，梯度稀釋，分別取稀釋倍數(shù)為103， 104， 105的菌懸液涂布十 六烷基三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，4(TC培養(yǎng)24-96h，觀察菌落形態(tài)， 挑選同形態(tài)菌落數(shù)居多的菌種，尤其應(yīng)選擇具有以下特點(diǎn)的菌落:灰白色，扁平無(wú)定型， 向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。接種環(huán)挑 取目的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，150mL錐形瓶，裝液量40mL， 38'C搖床培養(yǎng)，220r/min。 在48-120h后取出，10000r/min離心15min，取上清液分別用排油法和表面張力法測(cè)試 表面活性，選擇排油圈大于8cm，且表面張力低于30mN/m的菌種作為高產(chǎn)菌保留， 上清液毛細(xì)管點(diǎn)樣薄層層析硅膠板，為增加樣品濃度可在同一位置多次點(diǎn)樣，注意每 次點(diǎn)樣前等待上次點(diǎn)樣的水分揮干。配制展開劑(氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2)于 層析缸中，將硅膠板放入，待展開劑距硅膠板頂部lcm時(shí)取出，揮干展開劑，用玻璃
噴霧器向硅膠板噴灑顯色劑(顯色劑3g苯酚和5mL濃硫酸溶于95mL無(wú)水乙醇)電 吹風(fēng)加熱顯色。鼠李糖脂產(chǎn)生菌發(fā)酵液經(jīng)展開顯色后會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)棕黃色斑點(diǎn)，Rf值分 別為0.75和0.46，選擇Rf值為0.46處斑點(diǎn)顏色濃重的菌種保留。
上述排油活性法方法如下取直徑為16cm的培養(yǎng)皿經(jīng)洗滌劑清洗，去離子水沖洗 兩次后，加入60mL去離子水水，水面上加入0.5mL正十六垸形成一薄層油膜，在油 膜中心慢慢加入30nL的經(jīng)離心的發(fā)酵液上清液，中心油膜被擠向四周形成一圓圈，圓 圈直徑與表面活性劑含量大約成正比。排油圈越大，說(shuō)明表面活性劑產(chǎn)量越高。表面 張力法方法如下:采用表面張力儀測(cè)試。表面張力越小，說(shuō)明表面活性越高。
上述各培養(yǎng)基的配制方法如下
基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基(g/L):NaN03 1.0， KH2PO42.0， K2HPO41.0， MgS04-7H20 0.50， KC1 0.1， CaCl2*2H20 0.01 ， FeS04'7H20 0.012，酵母提取物0.01，微量元素液0.05ml/L。 制法:上述成分混合加熱溶解，Imo/LNaOH溶液調(diào)pH為7.2 7.4， 12rC保持20min 滅菌后冷卻至室溫備用。
微量元素液(g/L):H3B03 0.26， CuS04'5H20 0.5， MnS04'H20 0.5， MoNa204'2H20 0.06， ZnSO4.7H2O0.7。制法:依次將以上各組分按比例溶于水中，搖勻，備用。
十六垸基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10， NaC15，十六垸基 三甲基溴化銨0.3，瓊脂20。制法:除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4 7.6，加入瓊脂，12rC20min滅菌后，制成平板備用。
富集培養(yǎng)基:基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基中加入25g/L大豆油(其他植物油也可)。制法:基礎(chǔ) 離子培養(yǎng)基和大豆油分別12rC20min滅菌后按比例混合，備用。
發(fā)酵培養(yǎng)基:基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基中加入40g/L葵花籽油、大豆油或甘油。制法:基礎(chǔ)離 子培養(yǎng)基和植物油分別12rC20min滅菌后按比例混合，備用。如果選擇甘油作碳源， 制法如下:基礎(chǔ)離子培養(yǎng)基中加入甘油，待全部溶解，12rC20min滅菌，備用。
實(shí)施例3:結(jié)合圖3，本發(fā)明雙鼠李糖脂的制備方法，即將篩選得到的高產(chǎn)菌株 SC-02接種LB培養(yǎng)基，接種量2%， 32'C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時(shí)間18-36h (24h較好)，種子液接入甘油作碳源(也可選葵花籽油，大豆油)的發(fā)酵培養(yǎng)基，裝 液量占搖瓶體積的25%， 25—38。C (3(TC較好)搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速230r/min，培養(yǎng)時(shí)間 72-120h。取出離心處理，10000r/min， 30min，取上清液，6mol/LHCl溶液調(diào)PH值為
2.0。分兩次加入兩倍于上清液體積，氯仿/甲醇&"=2:1)混合溶劑，磁力攪拌20min， 靜置6h，分液漏斗分液，合并有機(jī)相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀4(TC下減壓蒸除溶劑，得到鼠李糖 脂粗提取物。接下來(lái)對(duì)鼠李糖脂粗提取物進(jìn)行分離純化，采用硅膠柱層析方法。使用 丙酮、甲醇或乙酸乙酯將所得產(chǎn)物溶解后進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)一步純化。
LB培養(yǎng)基(g/L):胰化蛋白胨10，酵母提取物5， NaCllO。制法:上述成分混合加 熱溶解，lmol/LNaOH溶液調(diào)pH為7.2 7.4， 121 。C保持20min滅菌后冷卻至室溫備 用。
a、 裝柱:濕法裝柱(26x2.5cm)，首先在柱中裝入1/2體積的乙酸乙酯，打開下端活 塞，然后從頂端慢慢加入乙酸乙酯浸泡的柱層析硅膠，邊加入邊用洗耳球輕敲柱身。 裝柱完成后，繼續(xù)加入約l個(gè)柱體積的乙酸乙酯平衡。
b、 上樣:將糖脂粗品溶于盡量少的乙酸乙酯，待柱內(nèi)乙酸乙酯距離硅膠頂部約 1.5cm時(shí)，用移液器緩慢且連續(xù)加入樣品，上樣過(guò)程要慢而連續(xù)，而且要使樣品平鋪于 硅膠頂端。關(guān)閉下端活塞，等樣品慢慢滲入硅膠內(nèi)部，在上端加一團(tuán)脫脂棉，開始洗 脫，控制流速l滴/s。
c、 洗脫先用乙酸乙酯洗脫至黃色帶展開，依次用乙酸乙酯/甲醇(vA^10:l)，乙 酸乙酯/甲醇& =4:1)，乙酸乙酯/甲醇^"=2:1)，乙酸乙酯/甲醇(v/v-l:l)各100mL洗脫。 每10mL收集一次，轉(zhuǎn)入安瓿瓶編號(hào)保存。
d、 柱層析結(jié)果分析:采用排油法測(cè)試各瓶流出液的表面活性，TLC檢測(cè)分離情況， 展開顯色后，挑選只顯示一個(gè)棕黃色斑點(diǎn)且Rf值為0.46的樣品合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓 濃縮，得較純的雙鼠李糖脂。顯棕黃色斑點(diǎn)且Rf值為0.76的樣品為單鼠李糖脂，將其 合并，減壓蒸干得單鼠李糖脂。
e、 將上述各樣品溶于乙酸乙酯，采用其他溶劑，如甲醇、丙酮也可，靜止，重結(jié) 晶，到得較純的的雙鼠李糖脂。
采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，負(fù)離子檢測(cè)，SRM掃描，雙鼠李糖脂約占鼠李 糖脂總質(zhì)量的68%， Rh2Cn)CH)約占雙鼠李糖脂總質(zhì)量的90X，約占萃取得粗提取物 的23%，此外雙鼠李糖脂中還含有少量Rh2C8do 、 Rh2C1()C8 、 Rh2CI()C12、 Rh2C12C10 等組分。
權(quán)利要求
1、一種雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選方法，包括以下步驟a、選取被油脂污染的現(xiàn)場(chǎng)采集土壤樣品作為菌種篩選源；b、樣品浸泡處理后接種植物油作碳源的富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～72h后得富集培養(yǎng)液；c、把富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于十六烷基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24～96h，挑取長(zhǎng)勢(shì)好且數(shù)量多的單菌落斜面保種；d、挑取斜面保存的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48～120h后測(cè)定表面活性，選擇活性較高的菌種發(fā)酵液上清進(jìn)行TLC分析，展開劑為氯仿∶甲醇∶乙酸v/v/v＝65∶15∶2，苯酚硫酸顯色劑顯色，初步判斷雙鼠李糖脂含量，選擇Rf值為0.46的斑點(diǎn)顏色濃重的菌種即雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌保留，零下26℃甘油保存。
2、 一種雙鼠李糖脂的制備方法，包括以下步驟-a、 選取被油脂污染的現(xiàn)場(chǎng)采集土壤樣品作為菌種篩選源；b、 樣品浸泡處理后接種植物油作碳源的富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 72h后得富集培養(yǎng)液；c、 把富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布于十六垸基三甲基溴化銨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24 96h， 挑取長(zhǎng)勢(shì)好且數(shù)量多的單菌落斜面保種；d、 挑取斜面保存的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 120h后測(cè)定表面活性，選擇活 性較高的菌種發(fā)酵液上清進(jìn)行TLC分析，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯 酚硫酸顯色劑顯色，初步判斷雙鼠李糖脂含量，選擇Rf值為0.46的斑點(diǎn)顏色濃重的菌 種即雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌保留，零下26'C甘油保存；e、 將篩選所得菌種接種LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 36h后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 — 38。C 培養(yǎng)72 120h;f、 發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液離心除菌體；g、 調(diào)整上清液pH4.0 5.0，加入氯仿甲醇混合物作萃取劑，攪拌、靜置分液，保 留機(jī)相；h、 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸除溶劑，得到鼠李糖脂粗提取物；i、將粗提取物在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以洗脫劑洗脫，部分收集； j、 TLC檢測(cè)分離情況，展開劑為氯仿:甲醇:乙酸v/v/v二65:15:2，苯酚硫酸顯色劑 顯色，將Rf值為0.46的洗脫液合并，減壓蒸干得所需雙鼠李糖脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法，其特征在于: 步驟b的富集培養(yǎng)過(guò)程環(huán)境溫度為25—4(TC。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法，其特征在于 步驟c的培養(yǎng)溫度為25—40'C 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙鼠李糖脂的制備方法，其特征在于步驟i的洗脫劑 為甲醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者它們的混合物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法，其特征在于使 用丙酮、甲醇或乙酸乙酯將所得產(chǎn)物溶解后進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)一步純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙鼠李糖脂的產(chǎn)生菌篩選及制備方法。即菌種篩選選擇了長(zhǎng)期被油脂污染的土壤樣品作為菌源，采用了植物油作單一碳源的液體培養(yǎng)基富集后涂布選擇性較強(qiáng)的十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板，依據(jù)菌落形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)挑選疑似菌種。初篩所得菌種發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)試表面活性，活性高的菌種采用TLC直接分析發(fā)酵液，選取雙鼠李糖脂產(chǎn)量高的菌種。從篩選所得菌種發(fā)酵液中萃取法提取鼠李糖脂，柱層析分離得較純雙鼠李糖脂。本發(fā)明所用篩選方法準(zhǔn)確度高，篩選所得菌株鼠李糖脂產(chǎn)量高，尤其雙鼠李糖脂產(chǎn)量較高，制備工藝簡(jiǎn)單，克服了目前篩選方法中僅依靠鼠李糖脂總產(chǎn)量篩選而難以獲得雙鼠李糖脂高產(chǎn)菌的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101173210SQ20071013277
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日 公開號(hào)200710132773.發(fā)明者崇 孫, 孟廣榮, 孟欣欣, 楊樹林, 影 王, 王永斌, 艾鳳祥, 鈕小松 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)