專利名稱：松材線蟲分子檢測快速制樣方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種林木病害生物的檢測，具體涉及松材線蟲(^//^sp力e7e/7c力M ^^op/^7"s)分子檢測的DNA提取試劑及適合于口岸檢驗(yàn)檢疫、林間松材線蟲病早期診 斷的快速制樣技術(shù)。
背景技術(shù)：
松材線蟲LSwnra; /2e/ewc/n^"/o/7fe7附(Steiner & Buhrer 1934) Nickle 1970]是當(dāng)前 嚴(yán)重為害和威脅中國松林安全的最主要入侵的有害生物，是國際上公認(rèn)的重要的檢疫 性有害生物，也是世界四大林木病害之一。松材線蟲是引起松樹萎蔫病的主要原因，能 導(dǎo)致松樹萎蔫病。此病又稱松材線蟲病，是松樹的一種毀滅性病害，具有發(fā)病致死速度 快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點(diǎn)，因此被稱為"松樹癌癥"。松樹一旦感染此病， 最快的40多天即可枯死;病害流行很快，一般從發(fā)病到松林毀滅只需3 — 5年。此病自 1905年發(fā)現(xiàn)、1934年被報道以來，現(xiàn)己廣泛分布于日本、美國、韓國、加拿大、墨西 哥、希臘、葡萄牙、挪威和中國等。其中受害最為嚴(yán)重的是日本和中國。日本每年用于 該病的防治費(fèi)用占森林病蟲害防治費(fèi)用的93.6 % ,占林業(yè)總投資的20 % ，但每年因該病 損失木材仍然達(dá)100萬m2左右。我國于1982年發(fā)現(xiàn)該病以來，現(xiàn)己擴(kuò)展到江蘇、浙江、 安徽、廣東、山東、湖北、上海、香港和臺灣等地,發(fā)生面積已超過73 hm2 ,死亡松樹 200萬株，造成林業(yè)經(jīng)濟(jì)、森林生態(tài)上的巨大損失和自然景觀的嚴(yán)重破壞，并對我國廣大 適生區(qū)的松林構(gòu)成嚴(yán)重威脅。松材線蟲由卵發(fā)育為成蟲，其間要經(jīng)過4齡幼蟲期。雌、雄蟲交尾后產(chǎn)卵，雌蟲可 保持30天左右的產(chǎn)卵期，1條雌蟲產(chǎn)卵約100粒。在生長最適溫度(25°C)條件下約4天1 代，發(fā)育的臨界溫度為9.5'C，高于33'C則不能繁殖。由卵孵化的幼蟲在卵內(nèi)即蛻皮l 次，孵出的幼蟲為2齡幼蟲。秋末冬初，病死樹內(nèi)的松材線蟲已逐漸停止增殖，并有自 然死亡，同時開始出現(xiàn)另一種類型的3齡幼蟲，稱為分散型3齡蟲，進(jìn)人休眠階段，翌年 春季，當(dāng)媒介昆蟲松墨天牛將羽化時，分散型3齡蟲蛻皮后形成分散型4齡蟲，特稱為 dauerlarvae，即休眠幼蟲(耐久型幼蟲)。這個階段的幼蟲即分散型3齡、分散型4齡幼 蟲在形態(tài)上及生物學(xué)特性上都與繁殖階段不同，如角質(zhì)膜加厚、內(nèi)含物增多，形成休眠 幼蟲口針、食道退化，這階段幼蟲抵抗不良環(huán)境能力加強(qiáng)，休眠幼蟲適宜昆蟲攜帶傳播。松材線蟲的生物傳播媒介主要是天牛，但遠(yuǎn)距離跳躍式迅速擴(kuò)散蔓延的主要方式是 人為攜帶罹病木材和制品。松材線蟲通過天牛補(bǔ)充營養(yǎng)的傷口進(jìn)入木質(zhì)部，寄生在樹脂 道中。在大量繁殖的同時移動，逐漸遍及全株，并導(dǎo)致樹脂道薄璧細(xì)胞和上皮細(xì)胞的破 壞和死亡，造成植株失水，蒸騰作用降低，樹脂分泌急劇減少和停止。所表現(xiàn)出來的外 部癥狀是針葉陸續(xù)變?yōu)辄S褐色乃至紅褐色，萎蔫，最后整株枯死。由于松材線蟲在實(shí)際檢測中容易與同屬的擬松材線蟲CSi^^/^e/ewc/z^ 歷"crorst"s)混淆，而后者對松樹的致病力較弱，不屬于植物檢疫對象，因此對松材線 蟲的準(zhǔn)確、快速、靈敏鑒定，是控制病害擴(kuò)散的關(guān)鍵。分子生物學(xué)技術(shù)因其高靈敏度，可靠性，準(zhǔn)確性和特異性等優(yōu)點(diǎn)，在林木病原物檢 測中已經(jīng)有相當(dāng)廣泛應(yīng)用。現(xiàn)今檢測松材線蟲的分子生物學(xué)檢測技術(shù)大多基于DNA的檢 測，如DNA探針技術(shù)、基于DNA的體外擴(kuò)增(PCR技術(shù))技術(shù)和衛(wèi)星DNA技術(shù)等，其 中應(yīng)用最為廣泛的是PCR技術(shù)?，F(xiàn)有的各種松材線蟲分子檢測中，制樣占了很長的時間。 這主要是由于目前松材線蟲的檢測樣品大多都是采用布爾曼漏斗法或淺盤法以及在此 基礎(chǔ)上改進(jìn)的方法分離出松材線蟲后，再提取其DNA，然后進(jìn)行分子檢測。分離松材 線蟲一般用時需要24h后才能有良好的分離效果，而且當(dāng)松材線蟲密度低時難于分離出 松材線蟲。因此，目前這種松材線蟲分子檢測的制樣方法時間長，靈敏度低，不適用于 口岸檢驗(yàn)檢疫和林間松材線蟲病早期診斷。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能快速的從疫木木屑中直接提取低至每克木屑中l(wèi)條松 材線蟲的DNA作為模板用于出入境和林間疫病防治中病害的松材線蟲分子檢測快速制樣 方法。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的具體方法是[1]用直徑為7 10mm的電鉆在待測木質(zhì)材料上鉆取木屑，將所得木屑混合均勻， 取l 8克木屑置于5 20ml離心管中； [2]將裂解液按每克木屑2 3毫升溶液的比例加入步驟[1]的離心管中，62 68°C 水浴1 2小時；所述裂解液由0.1M三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1% 十二烷基磺酸鈉(SDS)在常溫下的混合物，pH值為8.0;[3]將步驟[2]所得混合液經(jīng)5000rc璃心10min后，將上清液600pl lml轉(zhuǎn)入另一2 3ml離心管中，加入一定量變性液，使變性液的終濃度為4M,混合均勻后，室溫下放置8 15min， 10000rc璃心8 10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc璃心l 2min， 棄濾液；所述變性液是12M異硫氰酸胍；[4]在步驟[3]所述DNA吸附柱中加入清洗液600 80(V1， 10000rc璃心l 2min清洗， 棄濾液；所述清洗液是70%乙醇(V/V); [5]重復(fù)步驟[4]一次； [6]再次離心除去所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入溶解液50 60^1溶解DNA， 10000rcf離心1 2min，收集濾 液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。 采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明突出的技術(shù)進(jìn)步在于方法簡單快捷，可以在3h內(nèi)從木屑中直接提取出松材線蟲的DNA，用于PCR檢測。 可以檢測出每克疫木中低至1條松材線蟲的DNA，靈敏度高。本發(fā)明能對松材線蟲檢驗(yàn)檢疫和林間采集的各種木質(zhì)樣品進(jìn)行快速松材線蟲DNA 樣品制備，用于松材線蟲分子生物學(xué)的快速鑒定或檢測，尤其是對帶蟲的松材線蟲疫木 流向?qū)嵤└櫤土珠g病害流行學(xué)動態(tài)進(jìn)行預(yù)警監(jiān)測，實(shí)際意義非常重大。以下實(shí)驗(yàn)可以證明本發(fā)明效果實(shí)驗(yàn)一1.準(zhǔn)備用于松材線蟲分子檢測制樣的試劑，其組成為[l]裂解液0.1M三羥甲基氨基甲垸(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1%十 二烷基磺酸鈉(SDS)， PH值為8.0; [2]變性液12M異硫氰酸胍 [3]清洗液70%乙醇(V/V) [4]溶解液超純水2.松材線蟲分子檢測快速制樣的方法，按以下步驟進(jìn)行-[1]用直徑10mm的電鉆在受檢木質(zhì)材料上鉆取疫木木屑lg， 2g， 3g， 4g，分別混合 均勻后，放于5ml 15ml離心管中；[2]將上述裂解液按每克木屑2ml 3ml的比例加入有木屑的離心管中，65'C水浴1 小時；[3]將裝有木屑和裂解液的離心管經(jīng)5000rc璃心10niin后，取其上清液600pl lml 轉(zhuǎn)入另一2ml離心管中。加入上述的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室 溫下放置10min， 10000rc璃心10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc璃心lmin， 棄濾液；[4]在DNA吸附柱中加入上述的清洗液75(^1， 10000rc璃心lmin清洗，棄濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] 10000rcf再次離心DNA吸附柱l次，徹底除去上述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入上述的溶解液5(Hi1， 10000rc璃心lmin，收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是-以松材線蟲特異DNA序列為引物，通過PCR擴(kuò)增，電泳有目標(biāo)靶帶出現(xiàn)即為松材線蟲 樣品。實(shí)際檢測l 4g疫木均可以檢測出其中的松材線蟲，電泳顯示出松材線蟲特異DNA 靶帶。實(shí)驗(yàn)二[1]以直徑10mm的電鉆鉆取健康松木木屑lg， 1.5g， 2g， 2.5g，分別加入l條松材線 蟲與木屑混合均勻，放于10ml離心管中；[2]將實(shí)驗(yàn)一所述裂解液按lg/3ml比例加入步驟[l]的離心管中，65"水浴1小時；[3]木屑線蟲混合液經(jīng)5000rc璃心10min后，將上清液800nl lml轉(zhuǎn)入另一2ral離心 管中。加入實(shí)驗(yàn)一所述的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室溫下放置 10min， lOOOOrc縭心lOmin后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc璃心lmin，棄濾液；[4]在柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液750nl， 10000rc璃心lmin清洗，棄濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] 10000rcf將清洗后的DNA吸附柱再次離心l次，除去實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的溶解液50nl， 10000rc璃心lmin，收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。將得到的樣品對松材線蟲特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)DNA擴(kuò)增條帶的亮度來判斷本制樣方法的檢測靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該制樣方法配合常規(guī)PCR技術(shù)，可以檢測出1.5克木屑中的1條松材線蟲。實(shí)驗(yàn)三、(一)、常規(guī)布氏漏斗法提取疫木中松材線蟲DNA:[1]將待檢感病松木段去皮砍成厚薄為l 2mm的薄木片20克置于鋪有雙層濾紙的布 氏漏斗上。布氏漏斗下接一段乳膠管，用止水夾夾住末端。加溫水(2(TC 3(TC)浸泡 木片，8hr以后打開止水夾放水到培養(yǎng)皿中，顯微鏡檢査水中是否有游離出的線蟲。[2]如有線蟲則離心收集含線蟲水懸液200nl，加入實(shí)驗(yàn)一所述裂解液40(^1， 65°C 水浴30分鐘；[3]線蟲裂解物經(jīng)12000rc璃心10min后，將上清液約500nl轉(zhuǎn)入另一3ml離心管中。 加入實(shí)驗(yàn)一所述的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室溫下放置12min， 10000rc縭心10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc璃心1.5min，棄濾液；[4]在DNA吸附柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液750nl， 10000rc璃心2min清洗，棄濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] 10000rcf再次離心DNA吸附柱l次，除去實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的溶解液50^1， 10000rc璃心2min，收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。此方法所需時間為9小時左右。時間太短不能保證松材線蟲已經(jīng)分離出來，可能造成假陰性。(二)、用本發(fā)明所述方法提取疫木中松材線蟲DNA:[1]用直徑9mra的電鉆在受檢材料不同位置上鉆取疫木木屑20克，木屑混合均勻，取3克木屑于10ml離心管中；[2]將實(shí)驗(yàn)一所述裂解液按lg/3ml比例加入步驟[l]的離心管中，65'C水浴1小時； [3] 線蟲裂解產(chǎn)物經(jīng)5000rcf離心10min后，將上清液約80(^l linl轉(zhuǎn)入另一3ml離心管中。加入實(shí)驗(yàn)一所述的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室溫下放置12min， 10000rc璃心10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc縭心1.5min，棄濾液；[4]在DNA吸附柱柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液750pl， 10000rc璃心2min清洗，棄 濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] 10000rcf離心經(jīng)步驟[5]清洗后的DNA吸附柱l次，除去實(shí)驗(yàn)一所述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入實(shí)驗(yàn)一所述的溶解液50nl， 10000rc縭心2min，收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。此方法所需制樣時間為2小時以內(nèi)。不需要分離線蟲，保證了檢測效果可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用傳統(tǒng)方法即常規(guī)布氏漏斗法提取疫木中松材線蟲DNA，所花時 間長，而且受松材線蟲活動性影響大，結(jié)果不確定；而采用本發(fā)明方法直接從感病寄主 木屑中提取松材線蟲DNA作為PCR檢測的模板，不受松材線蟲活動性影響，結(jié)果可靠， 并大大縮短了制樣的時間。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:1. 準(zhǔn)備用于松材線蟲分子檢測制樣的試劑，共4種試劑，其組成分別是-[l]裂解液0.1M三羥甲基氨基甲烷(Tris)， 0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)， 1%十 二烷基磺酸鈉(SDS)， PH值為8.0; [2]變性液12M異硫氰酸胍 [3]清洗液70%乙醇(V/V) [4]溶解液超純水2. 松材線蟲分子檢測快速制樣的方法，按以下步驟進(jìn)行[1]用直徑7mm的電鉆在受檢木質(zhì)材料不同部位上鉆取疫木木屑10g左右，將木屑混合均 勻后取5g裝入15ml離心管中；將上述裂解液按lg/2ml比例加入步驟[l]的離心管中，63。C水浴l小時；[3]將木屑及裂解液混合物經(jīng)5000rc璃心10min后，將其上清液1000pl轉(zhuǎn)入另一3ml 離心管中，加入上述的變性液，使變性液的終濃度為4M,混合均勻后，室溫下放置10min， 10000rc璃心10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，lOOOOrc璃心lmin，棄濾液；[4]經(jīng)步驟[3]后的DNA吸附柱中加入上述的清洗液80(V1， 10000rc璃心lmin清洗， 棄濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] lOOOOrcf再次對DNA吸附柱離心l次，除去上述的清洗液； [7]經(jīng)步驟[6]清洗后的DNA吸附柱中加入上述的溶解液50pl， 10000rc璃心lmin， 收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。實(shí)施例2:取用實(shí)施例l所述的松材線蟲分子檢測制樣的試劑裂解液、變性液、清洗液、溶解液。松材線蟲分子檢測快速制樣的方法，按以下步驟進(jìn)行[1]用直徑10mm的電鉆在受檢木質(zhì)材料不同部位上鉆取疫木木屑1.5g，將木屑混合 均勻后轉(zhuǎn)入5ml離心管中；[2]將上述裂解液按lg/3ml比例加入有木屑的離心管中，65匸水浴1.5小時；[3]木屑與裂解液混合物經(jīng)5000rc璃心10min后，取上清液600nl轉(zhuǎn)入另一新的2ml 離心管中，加入上述的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室溫下放置15min， 10000rc璃心12min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rc璃心1.5min，棄濾液；[4]在DNA吸附柱中加入上述的清洗液650pl， 10000rc璃心1.5min清洗，棄濾液；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6] DNA吸附柱10000rc璃心l次，除去上述的清洗液；[7] DNA吸附柱中加入上述的溶解液60)il， 10000rcf離心1.5min，收集濾液，即為 松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。
權(quán)利要求
1.一種松材線蟲分子檢測快速制樣方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行[1]用直徑為7～10mm的電鉆在待測木質(zhì)材料上鉆取木屑，將所得木屑混合均勻，取1～8克木屑放于5～20ml離心管中；[2]將裂解液按每克木屑2～3毫升溶液的比例加入步驟[1]的離心管中，62～68℃水浴1～2小時；所述裂解液由0.1M三羥甲基氨基甲烷(Tris)，0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸鈉(SDS)在常溫下的混合物，pH值為8.0；[3]將步驟[2]所得混合液經(jīng)5000rcf離心10min后，將其上清液600μl～1ml轉(zhuǎn)入另一2～3ml離心管中，加入一定量的變性液，使變性液的終濃度為4M，混合均勻后，室溫下放置8～15min，10000rcf離心8～10min后將上清液轉(zhuǎn)入DNA吸附柱中，10000rcf離心1～2min，棄濾液；所述變性液是12M異硫氰酸胍；[4]在上一步的DNA吸附柱中加入清洗液600～800μl，10000rcf離心1～2min清洗DNA，棄濾液；所述清洗液是70％乙醇(V/V)；[5]重復(fù)步驟[4]一次；[6]再次離心除去所述的清洗液；[7]DNA吸附柱中加入溶解液50～60μl溶解DNA，10000rcf離心1～2min，收集濾液，即為松材線蟲DNA樣品，直接用于PCR檢測。所述溶解液為超純水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種松材線蟲分子檢測快速制樣方法，是專門針對對林業(yè)影響巨大的松材線蟲而建立起的快速制樣的方法。利用該方法，不需要分離線蟲，就可以直接提取疫木中松材線蟲DNA用于分子檢測。配合PCR技術(shù)，可以檢測出1.5克木屑中的1條松材線蟲，時間僅需要3h，效果穩(wěn)定可靠。該方法克服了傳統(tǒng)松材線蟲檢測制樣方法時間較長、效果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；適用于進(jìn)出口通關(guān)木質(zhì)材料松材線蟲的快速檢驗(yàn)檢疫和林間病害早期診斷中大批量樣品的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101153334SQ20071009278
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者劉裕蘭, 夏玉先, 彭國雄, 曹月青, 殷幼平, 王中康, 青 袁 申請人:重慶大學(xué)