專利名稱：一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是協(xié)同作用將纖維素催化水解最終產(chǎn)生葡萄糖的一組酶的總稱，它們在工農(nóng)業(yè) 許多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。如纖維素酶可將秸稈、蔗渣等工農(nóng)業(yè)廢棄物生物轉(zhuǎn)化生成葡萄糖， 再經(jīng)其它微生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生產(chǎn)酒精、乳酸、申鄰胞蛋白等生物化工產(chǎn)品；利用纖維素酶做 飼料添加劑可提高飼料的利用率；纖維素酶還可用于廢紙脫墨、織物拋光等諸多方面。在植 物生物技術(shù)的研究工作中，也經(jīng)常應(yīng)用纖維素酶來水解細(xì)胞壁以便進(jìn)行基因工程和細(xì)胞工程 等操作。所以纖維素酶被譽(yù)為打開植物寶庫的金鑰匙。
目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是絲狀真菌，其中酶活力較強(qiáng)的菌種為木 霉屬、曲霉屬和青霉屬，特別是綠色木霉及其近緣菌株等較為典型，是目前公認(rèn)的較好的纖 維素酶生產(chǎn)菌。 一些厭氧微生物，如瘤胃細(xì)菌和熱纖梭菌等能分泌高活性的纖維素酶，但厭 氧微生物生長緩慢，酶產(chǎn)量很低。
一般認(rèn)為纖維素酶主要包括三類酶組分內(nèi)切纖維素酶(EG, EC 3.2丄4)、外切纖維素酶 (CBH， EC 3.2丄91)、 P-萄萄糖苷酶(BGL， EC 3.2丄21)。這三種組分的協(xié)同作用對徹底水解纖 維素非常重要。牛產(chǎn)高活性纖維素酶的關(guān)鍵是選育高產(chǎn)菌株。目前工業(yè)用纖維素酶的來源主 要是好氧絲狀真菌木霉，如里氏木霉(7Wctotto"mfln^'")、綠色木霉(7V/c/20^nwflW/7'cte)、 康寧木霉(7Wc/zo6ferw" itow'"g/0等產(chǎn)生的，其生產(chǎn)應(yīng)用中常見的問題主要有兩個 一是現(xiàn) 有的生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)酶活力還有待提高；二是木霉生產(chǎn)的纖維素酶系組成不完全，往往P-萄萄糖 苷酶比較缺乏，這些都會嚴(yán)重影響到酶解效率。
提高纖維素酶活力以及改善酶系組成的研究現(xiàn)在非常活躍，提出的方法很多，其中混合 發(fā)酵就是一種較為簡單有效的方法。將纖維素酶產(chǎn)生菌與某些其它微生物進(jìn)行混菌配伍培養(yǎng) 可以形成某種偏利的微生態(tài)關(guān)系，促進(jìn)酶的分泌；還可以發(fā)揮不同微生物互補(bǔ)的產(chǎn)酶特性， 從而使纖維素酶系組成較完全。據(jù)已有的研究和文獻(xiàn)報道，主要是木霉與黑曲霉、海棗曲霉 的混合培養(yǎng)能提高P-葡萄糖苷酶活力，但對其它兩種酶活力的影響不大；另外，木霉與某些 酵母菌混合培養(yǎng)也能少量提高纖維素酶活力。針對以上不足，本發(fā)明提出了一種新的混合發(fā) 酵方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是克服已有技術(shù)的不足，提供一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)高 活性纖維素酶的方法。即以康寧木霉(7Wc/zocferwa tom'wg"')與米根霉(及/ /zop^ wjzae)為纖 維素酶生產(chǎn)菌，接種孢子液或二級種子液于固態(tài)或液態(tài)培養(yǎng)基中，通過控制培養(yǎng)基的組成、
混菌培養(yǎng)過程中康寧木霉與米根霉的生物量以及其它培養(yǎng)條件，生產(chǎn)高活性的纖維素酶。 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供的微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法有固態(tài)發(fā)酵工藝和液態(tài)發(fā)酵工藝，其 步驟分別如下
1、 微生物混合液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工藝步驟
(1) 液體制種選擇康寧木霉和米根霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培 養(yǎng)(或發(fā)酵罐再擴(kuò)大培養(yǎng))制備所需二級液體菌種；
(2) 先將康寧木霉的二級液體菌種，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3~9%接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 基，20 35'C下通氣培養(yǎng)24 72小時后，再接種3~9%體積的米根霉二級液體菌種，20~35°C 下繼續(xù)通氣培養(yǎng)48^96小時，將發(fā)酵培養(yǎng)液過濾，過濾液即為原酶液；
(3) 將上述過濾液濃縮至原來體積的2/10~3/10可制成高活性液態(tài)纖維素酶制劑，濃縮液 經(jīng)噴霧干燥可制成粉狀高活性纖維素酶制劑。
2、 微生物混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工藝步驟
(1) 液體制種選擇康寧木霉和米根霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培 養(yǎng)(或發(fā)酵罐再擴(kuò)大培養(yǎng))制備所需二級液體菌種；
(2) 將康寧木霉和米根霉的斜面菌種制成孢子懸浮液，每毫升孢子數(shù)為107~108個，以 2~10:1的體積比例混合，按固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重量的6~14%接種；或?qū)⒖祵幠久购兔赘沟亩?級液體菌種，以2 10:1的體積比例混合，按固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重量的6~14%接種，在25 35'C、 空氣相對濕度70~90%下發(fā)酵培養(yǎng)72~144小時，3048小時翻曲一次，即成固體酶曲；
(3) 將發(fā)酵培養(yǎng)的固體酶曲按1:8~10的重量比加水浸泡1 2小時后過濾，過濾液即為纖 維素酶的提取液；
(4) 將上述過濾液濃縮至原來體積的2/10~4/10可制成高活性液態(tài)纖維素酶制劑，濃縮液 經(jīng)噴霧干燥可制成粉狀高活性纖維素酶制劑。
對本發(fā)明中有關(guān)斜面菌種、二級液體菌種、液(固)態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及營養(yǎng)液的制備，可 在已有技術(shù)發(fā)明的基礎(chǔ)上提供如下具體操作步驟
(1) 斜面菌種的制備
馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA):將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200克，切成小塊，放入1000毫升 水中煮沸三十分鐘，用4層紗布過濾，在濾液中加入稱好的瓊脂20克，然后加入20克葡萄 糖，不斷攪拌至瓊脂完全溶化，停止加熱，補(bǔ)足水分至1000毫升，分裝適量至試管中，塞上 棉塞，放入殺菌鍋中，12rC高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。分別劃線接種康寧木霉菌株和米根霉 菌株，在25 35'C下培養(yǎng)5 8天形成大量孢子，可作為二級種了液和固態(tài)發(fā)酵時的接種。
(2) 二級液體菌種的制備培養(yǎng)基配方同斜面菌種，但不加瓊脂，裝瓶滅菌，按3 5% 體積百分比接斜面菌種的孢子液，25 35'C下120 160轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)2~4天。
(3) 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稻草粉、蔗渣粉、麩皮粉、小麥秸稈粉等天然纖維素原料 或經(jīng)過一定的物理、化學(xué)方法預(yù)處理的纖維素原料或純纖維素粉中的一種或一種以上，共1~5 份，加入100份Mandels營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH4.5~5.0，裝入自動發(fā)酵罐，110 12rC高壓蒸汽滅
菌15~30分鐘。
(4) 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稻草粉、蔗渣粉、麩皮粉、小麥秸粉其中的一種或一種以
上，共2 6份，加入8 16份Mandels營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH4.5 5.0，裝入自動發(fā)酵罐，110 121°C 高壓蒸汽滅菌15~30分鐘。
(5) Mandels營養(yǎng)液的配制0.75克蛋白胨，0.25克酵母膏，0.3克尿素，1.4克(NH4) 2S04， 2.0克KH2PO4， 0.4克CaCl2'H20， 0.5毫克FeSO4*7H20， 4.0毫克ZnS04'7H20 ， 2.0 毫克CoCl2*6H20，溶于1000毫升水中。放大培養(yǎng)時按此比例配制。
另外，固態(tài)發(fā)酵選用孢子液接種比采用二級種子液接種效果要好，因為孢子比菌絲體在 固態(tài)培養(yǎng)基中分散得均勻一些。如果孢子接種量很大，可用克氏燒瓶培養(yǎng)。
康寧木霉與米根霉都是好氧真菌，生長發(fā)酵所需要的溫度(25~35°C)和pH值(4.5~6.0) 相近，混合培養(yǎng)無明顯拮抗作用。我們在分別培養(yǎng)兩種微生物產(chǎn)酶的研究中發(fā)現(xiàn)康寧木霉 濾紙酶活力較高(濾紙酶活力反映纖維素酶系各組分作用纖維素產(chǎn)生葡萄糖的綜合能力，是 目前最廣泛采用的檢測纖維素酶活力的指標(biāo))，卩-葡萄糖苷酶活力很低；而米根霉在一定條 件下能產(chǎn)生高活力的(3-葡萄糖苷酶和很少量的濾紙酶活力。在混合培養(yǎng)中，控制適當(dāng)培養(yǎng)條 件，培養(yǎng)基中P-葡萄糖苷酶活力提高4 5倍，濾紙酶活力也有較大程度的提高，而且產(chǎn)酶高 峰時間也有不同程度的提前，從而可以縮短發(fā)酵時間。這種混菌發(fā)酵協(xié)同效應(yīng)的詳細(xì)機(jī)理尚 在研究之中。
本發(fā)明的優(yōu)點在于將蔗渣、稻草等工農(nóng)業(yè)廢棄物作為原料，利用康寧木霉與米根霉形
成偏利的微生態(tài)關(guān)系，混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，發(fā)酵工藝可以采用固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵工藝。本 發(fā)明提供的方法對提高纖維素酶的活力、完善酶系組成以及縮短產(chǎn)酶時間，都具有良好的效 果。本發(fā)明操作簡單易行，成本低，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明采用康寧木霉與米根霉混合固態(tài)發(fā)酵工藝，所制得的酶曲濾紙酶活力和p-萄萄糖
苷酶活力，分別比康寧木霉單菌發(fā)酵提高60~70%， 420-490%;產(chǎn)酶高峰吋間比康寧木霉單 菌固態(tài)發(fā)酵提前12小時左右。
本發(fā)明采用康寧木霉與米根霉混合液態(tài)發(fā)酵工藝，所制得的原酶液濾紙酶活力和p-萄萄 糖苷酶活力，分別比康寧木霉單菌發(fā)酵提高80~100%， 390-430%;產(chǎn)酶高峰時間比康寧木霉 單菌液態(tài)發(fā)酵提前8小時左右。
本發(fā)明在開發(fā)利用蔗渣、秸稈等天然纖維素資源的同時，無環(huán)境污染，是一條工農(nóng)業(yè)廢 棄物資源化、高值化、生態(tài)化利用的有效途徑。
本發(fā)明提供的微生物混合發(fā)酵的方法，既可采用液態(tài)發(fā)酵工藝，也可采用固態(tài)發(fā)酵工藝， 具有就地取材、因地制宜的特點，有利于推廣應(yīng)用。
具體實施方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明試驗過多株產(chǎn)生纖維素酶的木霉與多株米根霉的混菌配伍發(fā)酵，其協(xié)同效應(yīng)因不
同菌種而異，以篩選的一株康寧木霉QF-2與米根霉NRRL395HS99配伍發(fā)酵效果最佳。在 此基礎(chǔ)上，研究了影響產(chǎn)酶的多種因素，獲得了優(yōu)化的培養(yǎng)條件。實驗結(jié)果表明除配伍關(guān)
系外，兩種微生物在培養(yǎng)基中生物量的比例也是影響混合發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。由于米根霉 比康寧木霉生長速度快，很容易導(dǎo)致混合培養(yǎng)過程中米根霉優(yōu)勢生長，這種情況反而使培養(yǎng) 基中濾紙酶活力下降。因此，保持混菌體系中康寧木霉的優(yōu)勢生長，二者才能形成某種理想 的微生態(tài)關(guān)系。
保持康寧木霉的優(yōu)勢生長的方法包括控制康寧木霉與米根霉接種量在2 10:1;或者控
制康寧木霉與米根霉的接種時機(jī)，以康寧木霉先于米根霉接種培養(yǎng)24~72小時為宜。
至于培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)過程的其它條件控制可以參考以下具體實施例 實施例l:斜面菌種、二級液體菌種的制備，具體操作步驟如下。
(1) 生產(chǎn)菌株
康寧木霉(7Wc/zoAw^tom'"g//) QF國2和米根霉(i / /zop^ W7zae) NRRL395HS99 (均由
本校微生物實驗室保存)。
(2) 斜面菌種的制備
先制備馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面，然后分別劃線接種康寧木霉菌株和米根霉菌株， 在28'C下分別培養(yǎng)5天和7天后形成大量孢子，可作為二級種子液和固態(tài)發(fā)酵時的接種。
(3) 二級液體菌種的制備
培養(yǎng)基配方同斜面菌種，但不加瓊脂，裝瓶滅菌，按3 5%重量百分比接斜面菌種的孢 子液(每毫升孢子數(shù)為107~108個)，28t:下150轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)3天。
實施例2:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基、液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基制備
(1) 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基蔗渣粉3份，麩皮2份，10份Mandels營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH4.5 5.0， 12rC滅菌25分鐘。
(2) 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基稻草粉3份，100份Mandels營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH4.5~5.0，裝入自動 發(fā)酵罐，12rC滅菌20分鐘。
實施例3:微生物混合液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工藝步驟
(1) 液體制種按照實施例1的方法制種；
(2) 先將康寧木霉的二級液體菌種，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%接種量接種于按照實施 例2方法制得的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，3(TC下通氣培養(yǎng)48小時后，再接種4%體積的米根霉二級 液體菌種，30'C下繼續(xù)通氣培養(yǎng)72小時，將培養(yǎng)液過濾，過濾液即為原酶液；
(3) 將上述過濾液濃縮至原來體積的3/10，濃縮液經(jīng)噴霧干燥制成粉狀高活性纖維素酶 制劑。
原酶液中濾紙酶活力為2.2 111/毫升，卩-葡萄糖苷酶活力為1.6IU/毫升，分別比康寧木霉 單菌發(fā)酵提高90%、 420%。產(chǎn)酶高峰時間比康寧木霉單菌發(fā)酵提前8小時左右。(以每分鐘 產(chǎn)生1微摩爾葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力國際單位IU.)
實施例4:微生物混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工藝步驟
(1) 液體制種按照實施例1的方法制種；
(2) 將按照實施例1方法制得的康寧木霉和米根霉的斜面菌種的孢子懸浮液，以5:1的體 積比例混合，按固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10%接種于按照實施例2方法制得的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在3(TC、空氣相對濕度85%下發(fā)酵培養(yǎng)96小時，36小時翻曲一次，即成固體酶曲；酶 曲濾紙酶活力可達(dá)35 40IU/克干曲，P-葡萄糖苷酶活力33 37IU/克干曲，分別比康寧木霉單 菌發(fā)酵提高60~70%， 420~490%;產(chǎn)酶高峰時間比康寧木霉單菌發(fā)酵提前12小時左右。
(3) 將發(fā)酵培養(yǎng)的固體酶曲按1:10的重量比加水浸泡1 2小時，過濾，過濾液為纖維素 酶的提取液；
(4) 將上述過濾液濃縮至原來體積的2/10，濃縮液經(jīng)噴霧干燥制成粉狀高活性纖維素酶。
權(quán)利要求
1.一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于將康寧木霉與米根霉兩種微生物接種于固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用固態(tài)發(fā)酵工藝或液態(tài)發(fā)酵工藝，混合培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶。通過控制兩種微生物的生物量等培養(yǎng)條件來提高纖維素酶的活力，并改善酶系的組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述的固態(tài)發(fā)酵工藝的步驟是(1) 液體制種選擇菌種康寧木霉和米根霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培 養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)(或發(fā)酵罐再擴(kuò)大培養(yǎng))制備所需二級液體菌種；(2) 將康寧木霉和米根霉的斜面菌種制成孢子懸浮液，每毫升孢子數(shù)為 107~108個，以2 10:1的體積比例混合，按固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重量的6~14%接種； 或?qū)⒖祵幠久购兔赘沟亩壱后w菌種，以2~10:1的體積比例混合，按固態(tài)發(fā) 酵培養(yǎng)基重量的6~14%接種。接種后在25 35'C、空氣相對濕度70~90%下培養(yǎng) 72-144小時，30 48小時翻曲一次，即成固體酶曲；(3) 將固體酶曲按1:8 10的重量比加水浸泡1~4小時后過濾，過濾液即為纖 維素酶的提取液；(4) 將上述提取液濃縮至原來體積的2/10~4/10可制成高活性液態(tài)纖維素酶制 劑，濃縮液經(jīng)噴霧干燥可制成粉狀高活性纖維素酶制劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征 在于，所述的液態(tài)發(fā)酵工藝的步驟是-(1) 液體制種選擇菌種康寧木霉和米根霉為生產(chǎn)菌株，分別經(jīng)斜面試管培 養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)(或發(fā)酵罐再擴(kuò)大培養(yǎng))制備所需二級液體菌種；(2) 先將康寧木霉的二級液體菌種，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1~9%接種量接 種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，20 35。C下通氣培養(yǎng)24~72小時后，再接種1~9%體積的 米根霉二級液體菌種，20 35'C下繼續(xù)通氣培養(yǎng)24 96小時，將培養(yǎng)液過濾，過 濾液即為原酶液；(3) 將上述原酶液濃縮至原來體積的2/10 3/10即為高活性液態(tài)纖維素酶制 劑，濃縮液經(jīng)噴霧干燥可制成粉狀高活性纖維素酶制劑。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征 在于，所述的固態(tài)發(fā)酵工藝中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法是稻草粉、蔗渣粉、 麩皮粉、小麥秸稈粉等天然纖維素原料或經(jīng)過物理、化學(xué)方法預(yù)處理的纖維素原 料或純纖維素粉中的一種或一種以上，與l 3倍重量Mandds營養(yǎng)液混合，調(diào)節(jié) pH4.5~5.0， 110 12rC高壓蒸汽滅菌20~30分鐘。
5. 如權(quán)利要求3所述的一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征 在于，所述的液態(tài)發(fā)酵工藝中的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法是稻草粉、蔗渣粉、 麩皮粉、小麥秸桿粉等天然纖維素原料或經(jīng)過物理、化學(xué)方法預(yù)處理的纖維素原 料或純纖維素粉中的一種或一種以上，共1~5份，加入100份Mandels營養(yǎng)液， 調(diào)節(jié)pH4.5 5.0，裝入自動發(fā)酵罐，110 12rC高壓蒸汽滅菌15~30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法。本發(fā)明以康寧木霉(Trichoderma koningii)與米根霉(Rhizopus oryzae)為纖維素酶生產(chǎn)菌，接種孢子液或二級種子液于固態(tài)或液態(tài)培養(yǎng)基中，通過控制培養(yǎng)基的組成、混菌培養(yǎng)過程中康寧木霉與米根霉的生物量以及其它培養(yǎng)條件，可使濾紙酶活力、β-葡萄糖苷酶活力比康寧木霉單菌發(fā)酵分別提高60％～100％、400％～500％，并明顯縮短發(fā)酵時間。本發(fā)明并通過控制兩種微生物的接種量或接種時機(jī)，使之形成偏利的微生態(tài)關(guān)系，從而有利于纖維素酶的分泌并改善酶系的組成。本發(fā)明操作簡單易行，成本低，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/14GK101100660SQ20071007496
公開日2008年1月9日 申請日期2007年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日
發(fā)明者吳清林, 王尚武, 韻 鄧, 鄒水洋 申請人:東莞理工學(xué)院