專利名稱：：來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。技術(shù)背景自然界中各種植物都有各自的開花期。以人為的方法改變它的開花期，對于花丼生產(chǎn)、遺傳育種及作物生產(chǎn)具有重要的價值。植物的開花受多種因素的影響，包括植株營養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境溫度和光周期等，而植株正是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的一系列基因的表達(dá)變化來感知這些因素變化的影響。因此，認(rèn)識植物開花調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而通過遺傳改良的方法調(diào)控植物的開花期，已成為當(dāng)前分子生物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)家們研究的重點和熱點。蛋白的泛素化降解途徑是植物體內(nèi)廣泛存在的分子機(jī)制。它廣泛參與細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境應(yīng)答、生長發(fā)育等細(xì)胞過程(MoonJ，ParryG，EstelleM.Theubiquitin-proteasomepathwayandplantdevelopment.PlantCell,2004，16:3181-3195;SmalleJ，VierstraRD.Theubiquitin26sproteasomeproteolyticpathway.AnnuRevPlantBiol.，2004，55:555-590)。泛素化降解途徑由El泛素激活酶、E2泛素結(jié)合轉(zhuǎn)移酶和E3泛素連接酶三部分系統(tǒng)組成，E3泛素連接酶是識別特異底物的靶位點。植物體內(nèi)存在大量編碼泛素化降解途徑的基因，其中占絕大部分是E3連接酶的因子。Sabine的研究結(jié)果表明，具有E3連接酶活性的蛋白因子BIGBROTHER(BB)能以一種劑量效應(yīng)的方式來調(diào)節(jié)植物器官的形態(tài)(Sabine，etal.TheE3UbiquitinLigaseBIGBROTHERControlsArabidopsisOrganSizeinaDosage-D印endentManner.CurrentBiology,2006，16:272-279)。Wang等的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的UFO(UNUSUALFLORAL0RGANS)基因與C0P9互作，參與調(diào)控花器官形態(tài)、種子結(jié)實率以及莖(或花)分生組織的形成(WangX，etal.TheC0P9signalosomeinteractswithSCF(UFO)andparticipatesinArabidopsisflowerdevelopment.PlantCell,2003,15:1071-1082)。擬南芥C^3&Vc^w's7力ah'朋a)是一種典型的模式生物(其作用與果蠅、線蟲、實驗鼠等作用相當(dāng))，已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究。擬南芥共有約1.3億個堿基對，2.9萬個基因，其中約有1300(約占5%)多個基因編碼泛素化降解途徑的蛋白因子，包括1200多個E3泛素連接酶組分。擬南芥的大多數(shù)基因在其它植物中都能找到同源類似物，有關(guān)擬南芥的絕大多數(shù)發(fā)現(xiàn)都能應(yīng)用于其它植物研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白，其名稱為ZbEB，來源于十字花科擬南芥(Ara/^cfoAs\z-sfAah'aras/.0^〃/;mZia)'是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與開花時間相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由383個氨基酸殘基組成，自氨基末端(N末端)第330至373位氨基酸殘基為C3HC4鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的除C3HC4鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域保守氨基酸殘基外的位點進(jìn)行取代和/或缺失和/或添加。為了(a)中的2ZW"便于純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的ZbEB可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的ZbEB的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNa:l的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因(a"萬)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。所述來源于擬南芥的與幵花時間相關(guān)蛋白的編碼基因的編碼序列可為序列表中序列1的自5'末端第48位至1199位脫氧核糖核苷酸組成的核苷酸序列。所述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因，具體可為如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3;2)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的DNA分子。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，65°C下洗膜。序列表中的序列1由15^4個脫氧核糖核苷酸組成，是ZbEB的cDNA基因；序列表中的序列3由2529個脫氧核糖核苷酸組成，ZbEB的基因組基因。序列3中，自5'端第1-47位堿基為該基因組基因的5'非翻譯區(qū)，自5'端第48-131位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5'端第132-354位堿基為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5'端第355-431位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5'端第432-506位堿基為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5'端第507-701位堿基為該基因組基因的第三個外顯子，自5，端第702-799位堿基為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5'端第800-872位堿基為該基因組基因的第四個外顯子，自5'端第873-979位堿基為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5'端第980-1066位堿基為該基因組基因的第五個外顯子，自5'端第1067-1215位堿基為該基因組基因的第五個內(nèi)含子，自5'端第1216-1353位堿基為該基因組基因的第六個外顯子，自5'端第1354-1438位堿基為該基因組基因的第六個內(nèi)含子，自5，端第1439-1641位堿基為該基因組基因的第七個外顯子，自5'端第1642-1718位堿基為該基因組基因的第七個內(nèi)含子，自5'端第1719-1881位堿基為該基因組基因的第八個外顯子，自5'端第1882-2052位堿基為該基因組基因的第八個內(nèi)含子，自5'端第2053-2184位堿基為該基因組基因的第九個外顯子，自5'端第2185-2529位堿基為該基因組基因的3'非翻譯區(qū)，自5'端第48-50位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5'端第48-50位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5'端第2182-2184位堿基為該基因組基因的終止密碼子TAA。含有上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系優(yōu)選為植物細(xì)胞。對用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體沒有限制，只要該載體能在植物細(xì)胞中表達(dá)所插入的基因。術(shù)語"植物細(xì)胞"包括各種形式的植物細(xì)胞，如培養(yǎng)細(xì)胞懸液，原生質(zhì)體，葉切片，和愈傷組織。本發(fā)明的另一個目的是提供一種調(diào)控植物開花時間的方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物開花時間的方法，是將上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因，或其反義DNA導(dǎo)入目的植物細(xì)胞，調(diào)控所述目的植物的開花時間。所述反義DNA，編碼在植物細(xì)胞中抑制上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因表達(dá)的RNA。如所述反義DNA可編碼與上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNA;所述反義DNA優(yōu)選編碼與序列表中的序列1或序列3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNA。將上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锛?xì)胞，可使植物的開花時間延遲。將上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因的反義DNA導(dǎo)入目的植物細(xì)胞，可使植物的開花時間提前。所述目的植物可為單子葉植物和雙子葉植物。所述單子葉植物可為水稻，如(5r/^gL.subsp./apo/n'ca"早恢92"品種。所述雙子葉植物優(yōu)選為十字花科植物，所述十字花科植物優(yōu)選為擬南芥，如擬南使用本發(fā)明的上述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因構(gòu)建表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、花粉特異表達(dá)啟動子和水稻肌動蛋白啟動子等，它們可以單獨使用或與其他的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可以使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述的翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(如GUS基因、GFP基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(壯觀霉素標(biāo)記物、朝霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如bar基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，或者引入刪除機(jī)制刪除抗性基因。攜帶本發(fā)明基因的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、粒子轟擊等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并培育成植株。本發(fā)明的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)τ谘芯恐参镩_花調(diào)控的分子機(jī)制，以及利用其調(diào)節(jié)植物的開花時間具有重要的理論和實際意義。通過調(diào)節(jié)植物的開花時間對糧食作物進(jìn)行遺傳改良在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用價值及市場前景。下面結(jié)合具體的實施實例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。圖1示ZM^基因定位及基因克隆結(jié)果圖2示野生型與z力W突變體在長日照(每天光照16小時)條件下培育28天的表型觀察結(jié)果圖3示野生型與轉(zhuǎn)全長cDNA序列的z力e力突變體在長日照(每天光照16小時)條件下培育28天的表型觀察結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)基因水稻PCR檢測電泳5為培育至90天的轉(zhuǎn)pART27植株和轉(zhuǎn)pART-ZM^植株照片具體實施方式本發(fā)明用以下實施例舉例說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。實施例中所用的方法如無特別的說明，均為常規(guī)方法。所用的引物合成由北京生工生物工程有限公司完成，測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。實施例l、ZbEB及其編碼基因的獲得擬南芥z/eZ突變體(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,ABRC提供)為Columbia生態(tài)型的突變體，該突變體與野生型相比，具有開花時間提前，葉片幼小，生育期短的特點。1、高精度連鎖分析基于圖位克隆的原理，以z力W突變體為供體，Landsberg生態(tài)型的野生型為受體，構(gòu)建了一個包含10，OOO個單株的分離群體。在這個F2群體中，正常開花的個體與提早開花的個體的比例為7653:2347，符合3:1的比例，表明這個調(diào)節(jié)植物開花的基因突變后性狀為隱性，正常為顯性。應(yīng)用NCBI上的擬南芥MapViewer資源(即遺傳圖譜和物理圖譜http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/i卿view/mapsearch-cgi*taxid=3702)，根據(jù)CereonGenomics(http:〃www.arabidopsis.org/browse/Cereon/index.jsp)提供的多態(tài)性信息設(shè)計SSLP(simplesequencelengthpolymorphism)分子標(biāo)記引物，進(jìn)行基因定位檢測。結(jié)果證實ZM^粗定位在1號染色體的中下部。進(jìn)一步的精細(xì)定位將ZM^定位在F20D21和F20N2兩個細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)克隆之間，包含T22H22、F14C2KT7N22、F7A10、F7A10、T5A14共6個BAC克隆。更進(jìn)一步的精細(xì)定位將ZM^限定在細(xì)菌人工染色體F7A10上的F7A10-1(引物5，-AGTTCCCAATGAGCAATG-3，和5，-AAATAGTTTCGGGTTCCA-3，)和F7A10-3(引物5，-CTCTCATGTCCCTTTCTC-3，和5，-GTTTCTTCAACCAAGGAC-3，)兩個SSLP分子標(biāo)記之間的51kb范圍內(nèi)，并與分子標(biāo)記F7A10-0共分離(引物5，-TGTTGGGTTCTGTTTGT-3，和5，-CTTCGGTCTGTTGATGT-3，)。2、通過核苷酸序列分析鑒定候選基因為了界定力^9的候選基因組區(qū)并鑒定該候選基因，分析了擬南芥BAC克隆F7A10的核苷酸序列。在此51kb的范圍內(nèi)，根據(jù)TAIR的擬南芥基因組注釋(http:〃爾.arabidopsis.org/)共分布17個候選基因。根據(jù)TAIR的基因組信息，分別在每個基因的5，非翻譯區(qū)上游和3'非翻譯區(qū)的下游設(shè)計正義引物和反義引物，從基因組水平上進(jìn)行擴(kuò)增并克隆測序，結(jié)果表明Atlg55255在第九個外顯子處(即自序列3的5，端始第2053-2078位)發(fā)生了26個堿基的缺失(圖1)。序列分析表明，Atlg55255的基因組DNA由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，具有序列表中序列3的核苷酸序列，序列表中SEQIDNq:3由2529個堿基組成，自5，端第1-47位堿基為該基因組基因的5'非翻譯區(qū)，自5'端第48-131位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5'端第132-354位堿基為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5'端第355-431位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5，端第432-506位堿基為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5，端第507-701位堿基為該基因組基因的第三個外顯子，自5，端第702-799位堿基為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5，端第800-872位堿基為該基因組基因的第四個外顯子，自5'端第873-979位堿基為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5'端第980-1066位堿基為該基因組基因的第五個外顯子，自5'端第1067-1215位堿基為該基因組基因的第五個內(nèi)含子，自5'端第1216-1353位堿基為該基因組基因的第六個外顯子，自5'端第1354-1438位堿基為該基因組基因的第六個內(nèi)含子，自5'端第1439-1641位堿基為該基因組基因的第七個外顯子，自5'端第1642-1718位堿基為該基因組基因的第七個內(nèi)含子，自5，端第1719-1881位堿基為該基因組基因的第八個外顯子，自5'端第1882-2052位堿基為該基因組基因的第八個內(nèi)含子，自5，端第2053-2184位堿基為該基因組基因的第九個外顯子，自5'端第2185-2529位堿基為該基因組基因的3，非翻譯區(qū)，自5，端第48-50位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5'端第48-50位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5'端第2182-2184位堿基為該基因組基因的終止密碼子TAA。比較發(fā)現(xiàn)，We力突變體與Columbia生態(tài)型的野生型相比較，z力A突變體在基因組水平上的自5'端第2053-2078位發(fā)生了26個堿基的丟失，而此處正是第九個外顯子區(qū)，編碼序列表中序列2的自N端第341-349位氨基酸殘基序列(Val-Val-Ile-Val-Lys-Cys-Tyr-His-Leu)。發(fā)生堿基丟失后，造成此基因蛋白質(zhì)編碼在自N端第342位氨基酸處發(fā)生移碼，殘基序列對應(yīng)變成Val-Leu-Pro-Ala-MET-His-Pro-Thr，自N端第349位氨基酸處發(fā)生終止。自序列1的N末端第330-373位氨基酸殘基為C3HC4鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。實施例2、通過轉(zhuǎn)化鑒定候選基因的功能根據(jù)野生型的ZMA的全長cDNA序列設(shè)計引物對Pl(引物ZnOver-F:5'-at^ATGGTAatgctaacaaaggcagacg-3'禾口ZnOver-R:5'-aaACTAGTactatctccgtccatttgtg-3'其中下劃線標(biāo)示的CCATGG為Ncol酶切位點，ACTAGT為Specl酶切位點)，以Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥7力￡&的CDS序列，回收PCR產(chǎn)物連接到pMD18-TSimpleVector(TaKaRa)載體上測序，將測序結(jié)果表明含有序列表中序列1的自5'末端第48位至1199位脫氧核糖核苷酸的刀W"片段的重組載體命名為pMD18-Ts-ZM^。用限制性內(nèi)切酶NcoI和Sped從pMD18-Ts-Z/^9切下Z&叨片段，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1305.1(購自CAMBIA)的多克隆位點Ncol和SpecI之間，將經(jīng)Ncol和Sped酶切鑒定表明含有1470bpZM^片段的重組載體命名為pCAM-ZZ^。將pCAM-2M^轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株Gv3101感受態(tài)細(xì)胞中，并利用上述引物對PI做PCR鑒定，將PCR鑒定得到1470bpZM^片段的陽性農(nóng)桿菌菌落經(jīng)2次搖菌擴(kuò)繁后用Floraldip法(CloughSJ"andBentAF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacteri咖—mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ,1998,16:735-743)轉(zhuǎn)化擬南芥z&力突變體。對得到的T。代轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株)用80mg/ml潮霉素(HygromycinB，購自Roche公司)篩選轉(zhuǎn)化苗。對經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)pCAM-ZM^T。代植株利用上述引物對PI做PCR鑒定，PCR鑒定得到1470bpZ力^9片段的植株為PCR陽性轉(zhuǎn)pCAM-2M^T。代植株。收獲上述T。代PCR陽性植株的所結(jié)種子(L代)進(jìn)行種植，用80mg/ml潮霉素(HygromycinB，購自Roche公司)篩選，挑出綠色的陽性轉(zhuǎn)化植株25株經(jīng)MS基本培養(yǎng)基復(fù)壯后移植到土中在長日照條件下(每天光照16小時)進(jìn)行表型觀察。同時以相同發(fā)育期(萌發(fā)期)的25株Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型植株作為對照，以相同發(fā)育期(萌發(fā)期)的25株z力eZ;突變體作為對照，以相同發(fā)育期(萌發(fā)期)的25株轉(zhuǎn)pCAMBIA1305.1的z力e/;突變體作為對照，在相同的條件下進(jìn)行培育至開花(該開花標(biāo)準(zhǔn)是指薹均高2.5士lcm，第一朵小花開放)。結(jié)果表明，25株轉(zhuǎn)pCAM-ZM^的z^Z突變體到達(dá)開花所需的天數(shù)與Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型一致，無顯著差異。葉片等表型也極為相似，轉(zhuǎn)pCAM-ZZ^的z力e力突變體和Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型植株在每天光照16小時、相同條件下培育至23±2天才開始開花(表1和表2)。圖3為每天光照16小時培育28天結(jié)果，主莖第1、2個莢果已形成，第3朵花正開。圖3中，CK表示Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型植株，WeZ^ZM^表示轉(zhuǎn)pCAM-ZZ^的z力e^突變體。而z&力突變體和轉(zhuǎn)pCAMBIA1305.1的z力e6突變體在每天光照16小時、相同條件下培育17士1天時開始開花(表3和表2)，至28天時除頂端個別小花外花己基本開完(圖2)。圖2中，CK表示Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型植株，We力表示z》e6突變體。轉(zhuǎn)pCAM-ZZ^5的z力e力突變體到達(dá)開花所需的天數(shù)與z/W突變體和轉(zhuǎn)pCAMBIA1305.1的z力eA突變體均有顯著差異。z力e力突變體到達(dá)開花所需的天數(shù)與轉(zhuǎn)pCAMBIA1305.1的zZ^/突變體無顯著差異。表么擬南芥各品種長日照條件培養(yǎng)至開花所需的天數(shù)(天)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3.方差分析單因素方差分析SUMMARY_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3、利用編碼與WW的cDNA互補(bǔ)的反義RNA調(diào)控水稻開花時間根據(jù)野生型的ZMS的全長cDNA序列設(shè)計引物對P2(引物ZnRNAi-Fl:5'-atTCTAGAaattcagatggctcaagtcg-3，和ZnRNAi-Rl:5，-taATCGATatggaagagtgggaaggaag-3，其中下劃線標(biāo)示的TCTAGA為Xbal酶切位點，ATCGAT為Clal酶切位點)和引物對P3(ZnRNAi-F2:5，-atCTCGAGtattcagatggctcaagtcg-3，和ZnRNAi-R2:5'-ta^MI1^atggaagagtgggaaggaag-3，其中下劃線標(biāo)示的CTCGAG為XhoI酶切位點，GAATTC為EcoRI酶切位點)，以Columbia生態(tài)型擬南芥的野生型(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥Z^^的CDS序列自5'端805-1290位片段，分別回收PCR產(chǎn)物并連接到pMD18-TSimpleVector(TaKaRa)載體上測序，將測序結(jié)果表明含有P2擴(kuò)增的目的片段(Z-ZM)的重組載體命名為pMD18-TsZ-"^，含有P3擴(kuò)增的目的片段(F-Z^S)的重組載體命名為pMD18-TsF-ZM5"。轉(zhuǎn)pCAM-ZM^的z6e6突變體25588Columbia生態(tài)型擬南芥的野^c。n頓25580轉(zhuǎn)pCAMBIA1305.1的zbeb突Qc變體zbeb突變體25420用限制性內(nèi)切酶Xbal和Clal從pMD18-TsZ-Z力fi9切下Z-Z力^9片段，插入中間載體pKANNIBAL(購自CAMBIA)的多克隆位點Xbal和Clal之間，得到含有Z-力朋片段的重組載體pKAN-Z-2M萬。用限制性內(nèi)切酶Xhol和EcoRI酶切從pMD18-TsF-乃fi9切下F-力￡5片段，插入pKAN-Z-2M^的多克隆位點Xhol和EcoRI之間，將經(jīng)Xbal和Clal、Xhol和EcoRI兩組酶分別酶切鑒定表明含有490bpZ-ZM5和490bpF-ZMA兩個片段的重組載體命名為pKAN-刀W凡用限制性內(nèi)切酶NotI酶切從pK認(rèn)-Z/^9切下ZF-^M^片段(含有Z-ZM^和F-ZM^片段)，插入植物表達(dá)載體pART27(購自CAMBIA)的多克隆位點Notl和Notl之間，將經(jīng)Notl酶切鑒定表明含有3940bp包含有Z-Z^^和F-Z^^片段的序列的重組載體命名為pART-ZM^。將pART-ZZ^9轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，并利用上述引物對P2和P3做PCR鑒定，將PCR鑒定得到490bpZ-a"叨和F-ZM^片段的陽性農(nóng)桿菌菌落經(jīng)2次搖菌擴(kuò)繁后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(HieiY，0htaS，KomariT，etal.Efficienttransformationofrice(。jyzaL)mediatedbyAgrobacteri咖andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJournal,1994，6:271-282)并在lOOrag/ml卡那霉素篩選壓下轉(zhuǎn)化水稻粳稻(Oryza^L.subsp./apo/n'ca"早恢92"品種，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)。對得到的轉(zhuǎn)pART-^^^T。代植株利用上述引物對P2和P3做PCR鑒定(如圖4)，PCR鑒定得到490bpZ-力朋和F-2M萬片段的植株為PCR陽性轉(zhuǎn)pART-ZMST。代植株。圖4中，l為陰性對照，水；2-14為轉(zhuǎn)基因植株；15為陽性對照，pART-ZM^;16為DNA分子Marker,GeneRulerlkbLadder(購自晶美公司)。對獲得的陽性轉(zhuǎn)化植株(11株)在短日照條件下(每天光照10小時)進(jìn)行表型觀察。同時以相同發(fā)育期(萌發(fā)期)的11株未轉(zhuǎn)基因水稻粳稻(&y^sa"VaL.subsp./邵o/n'ca"早恢92"品種)植株作為對照，以相同發(fā)育期(萌發(fā)期)的11株轉(zhuǎn)pART27水稻粳稻(&丁zsMWraL.subsp.J邵o"ic3"早恢92"品種)植株作為對照，在相同的條件下培育，進(jìn)行表型觀察。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因水稻粳稻(&r^ss"raL.subsp./apOTic3"早恢92"品種)和轉(zhuǎn)pART27水稻粳稻((2r，^iraL.subsp./邵o/3ica"早恢92"品種)110天抽穗期相比，陽性轉(zhuǎn)pART-ZM5植株能在90天左右即抽穗揚(yáng)花(表5和表4)。其中，開花的標(biāo)準(zhǔn)是指水稻全部分枝抽穗并裂穎。圖5顯示的是培育至90天的轉(zhuǎn)pART27植株和轉(zhuǎn)pART-ZM^植株，可見，轉(zhuǎn)pART-ZM5植株已抽穗揚(yáng)花，而轉(zhuǎn)pART27植株均未抽穗。轉(zhuǎn)pART-2M^水稻粳稻((9r/zss3WraL.subsp./邵o/n'ca"早恢92"品種)到達(dá)開花所需的天數(shù)，與未轉(zhuǎn)基因水稻粳稻(Orj^ssa^'raL.subsp./a/o/7ica"早恢92"品種)和轉(zhuǎn)pART27水稻粳稻(&yzasaWraL.subsp./邵o/ica"早恢92"品種)均有顯著差異。未轉(zhuǎn)基因水稻粳稻(&丁zaL.subsp./邵oWca"早恢92"品種)到達(dá)開花所需的天數(shù)和轉(zhuǎn)pART27水稻粳稻(fo，3^h'raL.subsp./ap朋A^"早恢92"品種)無顯著差異。表4.水稻各品種培養(yǎng)至開花所需的天數(shù)(天)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表5.水稻各品種培養(yǎng)至開花所需的天數(shù)方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序列表<160>3<210>1<211>1544<212>麗〈213〉擬南芥屬擬南芥(^raWo/^i'sMa7i's朋)<400〉1gtattggactaatttagtagactgctccctga犯t3ttgattttctcatgctaacaaagg60cagacgaacag卿ggtttggtgcta犯cagatggcggaaattaaatctc120tc犯ggctctCt￡LCtC3^ggctgcaaaatctagcaagca180tctgtacgcggatgacaggggactggcagaaatcaaggattcacaacgga240aagccc犯gctcaggctg犯gagctgaaaaacgttttggatgaacactttcttgaattga300g3gtg犯3gCggctcatgagactg卿gtgcttgcc犯g已a(bǔ)aggcttgctaccgccaagg360ctg犯attgctgaattgaggactcagttagatctttctgattggaactta420gagcaggaggcagaggcatccattgctgaa■taggtc犯gcctatgaagacatgcagacactttgttgcagcaggtggctg540agcgggacgattataatatcaagcttgtttccgaaagtgtcatgctt已ca600acactcacttstctgag犯gcaagtaatggaaaagcagctccatcaggttaatgcatccg660t已g已ga已ttttaaagcaagg已ttgcacatagatgaaaggctgtttttctg720aggcttataaattgattc犯gaagatcgtcacctcgttatcagcctcgaaaccaccaaat780ggg犯gt3gCtgatgctgacgatggctc犯gtcggccgtgtcttcatccg8406L3aaggaat已tgaacagstcagtaggaggacagacgaceLtcaaactgg^ctggatgatg900Cttg3gg犯gagctt6Ltggagagcttgaag960agttgggttctg卿gtgtag已3gCtgC3已ttgtgaggctccaggaaLg已a(bǔ)gttaagaatt1020gcaaaaacatcctcaaatgtggtgtatgttttgatcggcctaa卿ggtggtaattgtga1080aa/tgttatcatctgttctgctccaacgtagcttagagatccgacaccgga1140aatgtccaggctgcggtaccgcctttggccagaatgacgtccggcttgtc1200tcaaaacattcactatgtgttggtacataacaaac11aattaaggtccac1260acagtctcatcttccttcccactcttccatgttagatatgtcatatatgt1320tctggtttttgggtgatg犯aaattaggtg1380ggttctttatggagaaagtgtaggttttaggtatgtgacagtcgtgtttgtgttacctcc1440atttatgccttggttttatgacatggggaccgacatagacatcacaaatggacggagata1500gttggttttgtattttcctcaaaacaatatagaattatgtgaac1544<210〉2<211>383<212>PRT〈213〉擬南芥屬擬南芥(vira/^Vopw^t力3^'a朋)〈400>2MetLeuThrLysAlaAspGluGinLysGlyLeuGluAspLysCysAla151015LysGinMetAlaGlulieLysSerLeuLysAlaLeulieGluLysLeu202530LeuLysGluLysLeuGinLeuGinAsnLeuAlaSerlieCysThrArg354045GluCysAsnAspAspArgGlyLeuAlaGlulieLysAspSerGinArg505560LysAlaGinAlaGinAlaGluGluLeuLysAsnValLeuAspGluHis65707580PheLeuGluLeuArgValLysAlaAlaHisGluThrGluSerAlaCys859095GinGluArgLeuAlaThrAlaLysAlaGlulieAlaGluLeuArgThr100105110GinLeuAspLeuSerGluArgGluValLeuGluLeuLysGluGlylie115120125LysValLysGluGinGluAlaGluAlaSerlieAlaGluMetGluThr130135140lieGlyGinAlaTyrGluAspMetGinThrGinAsnGinHisLeuLeu145150155160GinGinValAlaGluArgAspAspTyrAsnlieLysLeuValSerGlu165170175SerValLysThrLysHisAlaTyrAsnThrHisLeuSerGluLysGin180185190ValMetGluLysGinLeuHisGinValAsnAlaSerValGluAsnPhe195200205LysAlaArglieAlaHisAsnGluGluGinMetLysGlyCysPheSer210215220GluAlaTyrLysLeulieGinGluAspArgHisLeuVallieSerLeu225230235240GluThrThrLysTrpGluValAlaAspAlaAspLysGluPheArgTrp245250255LeuLysSerAlaValSerSerSerGluLysGluTyrGluGinlieSer260265270ArgArgThrAspAsplieLysLeuGluLeuAspAspGluArgArgGlu275280285LysLysLysLeuGluGluGluLeuMetGluLeuAsnLysGluLeuGlu290295300GluLeuGlySerGluSerValGluAlaAlalieValArgLeuGinGlu305310315320GluValLysAsnCysLysAsnlieLeuLysCysGlyValCysPheAsp325330335ArgProLysGluValVallieValLysCysTyrHisLeuPheCysGin340345350GinCyslieGinArgSerLeuGlulieArgHisArgLysCysProGly355360365CysGlyThrAlaPheGlyGinAsnAspValArgLeuValLysMet〈210〉3〈211〉2529<212〉DNA〈213〉擬南芥屬擬南芥(^ra&Vop^^^sh'朋s)<400〉3gtattggactaatttagtagactgctccctgaaatattgattttctxatgctaacaaagg60C3gacgaac3gaagggtttggsgga^aMgtgctaaacagatggcgg^atta^tctx120txaaggctctagtaagttttctttatgtccctaaaaccatctactccaaaaaaatttgtg180tggtaattacaatgttcttttgctctatttacatgcctctctccaaccgtttcctaggca240ctttaactcatccacgtacttagttgtttttttgccatcttttaggaattcatggatact300gaaactccagaaaatttagcagtaagagtctgsatttaaattgtaMattgcagattgag360aaactactcaaagaaaaact:acagctgcaaaatctagcaagcatctgtacgcgtgaatgt420aatgatgacaggtatgtgaccatttgagtgtgtttaagctcttcaaattttgctgaaaac480atgagatttgagctttacaatttcaggggactggcagaaatcaaggattcacaacgga^a540gcccaagctcaggctgaagagctga犯aacgttttggatgaacactttcttgaattgaga600gtgaaagcggctcatgagactgagagtgcttgccaagaaaggcttgctaccgccaaggct660gaaattgctgaattgaggactcagttagatctttctgagaggtatgctctctcatggtac720cacatccaaggtxattcattatattcttttcaccgttttgggggcattaatcagtattat780attgctttctcatttgcagggaggttttggaacttaaggagggtattaaagttaaagagc840aggaggcagaggcatccattgctgaaatggaggtacaatcatccttctgctcgtttttcc%0tattttaatgttcttaaggagtttattagaaatxtgaaagtcgaaatgctcgtttctcat%0caatactttacttctctagactataggtcaagcctatgaagacatgcagacacagaacca1020acatttgttgcagcaggtggctgagcgggacgattataatatcaaggtaaattttagtgt1080taataggacactttgatactgagatttgttttttgttttttttttcatcttttctcaatt1140ccaatctttgactttaactatatctagcctttgaacacatcttttgtagatttctgattt1200gatctatgatttcagcttgtttccgaaagtgtcaagacaaagcatgcttacaacactcac1260ttatctgagaagcaagtaatggaaaagcagctccatcaggttaatgcatccgtagagaat1320tttaaagcaaggattgcacataatgaggaacaggttagaggagagttcttgtgtaatttt1380tgtaactctctaaaacttctctcatcagtgtcttttactaatgttcttatgttcgcagat1440gaaaggctgtttttctgaggcttataaattgattcaagaagatcgtcacctcgttatcag1500cctcgaaaccaccaaatgggaagtagctgatgctgacaaggaattcagatggctcaagtc1560ggccgtgtcttcatccgaaaaggaatatgaacagatcagtaggaggacagacgacatcaa1620actggaactggatgatgaaaggtgacctaaaaacagatctcttgtttgaacccaattact1680atattatgacagtgatataaattctatctatggaacaggagggagaagaagaagcttgag1740gaagagcttatggagttgaacaaagagcttgaagagttgggttctgagagtgtagaagct1800gcaattgtgaggctcc3gg3agaagttaagaattgcaaaaacatcc"tc犯atgtggtgta1860tgttttgatcggcctaaagaggtaacaMgctcataacaatcctatatctcactgtcaag1920gcagacataatgattcgataatcctttctcatcactgtca"taatcatcatcaatagtcat1980atatcatgcatcagaaaatatcattttcagcgcatatcaac犯ccgctttttgtttcaaa2040cattatttgcaggtggtaattgtgaaatgttatcatctgttctgccagcaatgcatccaa2100cgtagcttagagatccgacaccggaaatgtccaggctgcggtaccgcctttggccagaat2160gacgtccggcttgtxaaaatgtaactcaaaacattcacacaaatgcactatgtgttggta2220cataacaaacttaattaaggtccacacagtctcatcttxcttcccactcttccataaaat2280tgttagttagatatgtcatatatgtatcggttaaaacactgaatctctggtttttccagc2340taagagggtgatgaaaaattaggtgggttctttatggagaaagtgtaggttttaggtatg2400tgacagtcgtgtttgtgttacctccatttatgccttggttttatgacatggggaccgaca2460tagacatcacaaMggacggagatagttggttttgtattttcctcaaa^caatatagaat2520tatgtgaac2529權(quán)利要求1.來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與開花時間相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求1所述的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因，為如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3;2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因宿主菌；所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系優(yōu)選為植物細(xì)胞。5、一種調(diào)控植物開花時間的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因，或其反義DNA導(dǎo)入目的植物細(xì)胞，調(diào)控所述目的植物的開花時間。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述反義DNA，編碼在植物細(xì)胞中抑制權(quán)利要求2或3所述的來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因表達(dá)的RNA。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述反義DNA編碼與權(quán)利要求2或3所述的編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNA;所述反義DNA優(yōu)選編碼與序列表中的序列1或序列3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNA。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物和雙子葉植物；所述單子葉植物優(yōu)選為水稻。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述水稻為粳稻(Or;^asati'raL.subsp./ap。/7_z.c<3)早恢92。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為十字花科植物，所述十字花科植物優(yōu)選為擬南芥；所述擬南芥優(yōu)選為擬南芥zZ^6突變體。全文摘要本發(fā)明公開了一種來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與開花時間相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該來源于擬南芥的與開花時間相關(guān)蛋白的編碼基因可用于調(diào)控植物的開花時間。文檔編號C12N15/82GK101265293SQ20071006452公開日2008年9月17日申請日期2007年3月16日優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日發(fā)明者濤王,董江麗,鄧昌旺,曦陳申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)