專利名稱：酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬食品抗氧化劑的制備領(lǐng)域，特別是涉及功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘 油酯的制備方法。
背景技術(shù)：
"天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能"已成為目前食品添加劑行業(yè)的發(fā)展方針。國(guó)際上對(duì)食品添加 劑品質(zhì)要求是使食品更加天然、新鮮；增強(qiáng)食品貯藏過(guò)程中品質(zhì)的穩(wěn)定性；不用或少用 化學(xué)合成的添加劑。用生物法代替化學(xué)合成安全、高效的新型食品添加劑和開(kāi)發(fā)具有免疫 調(diào)節(jié)、延緩衰老、抗疲勞、耐缺氧、抗輻射、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)整腸胃功能的功能性食品添加 劑是近年來(lái)國(guó)際上該領(lǐng)域發(fā)展的方向。
目前，被作為食用油脂抗氧化劑廣泛使用的BHA (丁基羥基茴香醚)和BHT (二丁 基羥基甲醚)雖然可以穩(wěn)定各種油脂和富脂食品，防止和延緩油脂氧化酸敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品儲(chǔ) 存期。然而，廣泛的試驗(yàn)和應(yīng)用測(cè)試表明，BHA和BHT或它們的降解產(chǎn)物可能有毒性和 致癌作用。因此，尋找新型的安全、高效油脂抗氧化劑是十分必要的。
阿魏酸(ferulic acid， FA)是高等植物中存在的酚類化合物， 一般存在于玉米、米糠 和麩皮的細(xì)胞壁及不溶性纖維中。近年來(lái)，阿魏酸已成為一種大宗的生物化工產(chǎn)品并在醫(yī) 藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。阿魏酸具有抗炎、止痛、抗血栓形成、 抗紫外線輻射、抑制自由基產(chǎn)生、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、以及調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用。在臨床上 用于冠心病、腦血管病、脈管炎、白細(xì)胞和血小板減少等疾病的治療。在食品、化妝品中 則主要作為抗氧化劑使用，但其親水性妨礙了其在防止油品氧化中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法， 該方法反應(yīng)條件更加安全、溫和，便于工業(yè)化。
本發(fā)明制備阿魏酸雙丁酸甘油酯的反應(yīng)，如下<formula>formula see original document page 4</formula>
本發(fā)明的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，包括下列步驟
(1) 在亞硫酰氯催化下，阿魏酸與無(wú)水乙醇回流加熱反應(yīng)后，溶于乙醚，碳酸氫鈉萃取，去除 乙醚，靜止析出結(jié)晶，得阿魏酸乙酯，并純化；
(2) 所得阿魏酸乙酯與丁酸甘油酯、叔丁醇，在Novozym435脂肪酶催化下反應(yīng)，純化，
得阿魏酸雙丁酸甘油酯。
所述阿魏酸與^7R乙醇的用量比為1/10 (g/mL);
所述的碳酸氫鈉是飽和的碳酸氫鈉溶液；
所述步驟(1)中的回流加熱反應(yīng)是50-80'C反應(yīng)3-7h;
所述的阿魏酸乙酯與丁酸甘油酯、叔丁醇的用量比為1:1-3:5 (mM/mM/mL); 所述步驟(2)中的反應(yīng)是30-5(TC反應(yīng)80-120h;
所述步驟(1)和(2)中的純化是硅膠柱層析純化，溶劑是乙酸乙酯，分階段洗脫， 洗脫液比例從石油醚乙酸乙酯=9:1逐漸增加至石油醚乙酸乙酯比例為1:9。
本發(fā)明的有益效果
(1) 本發(fā)明的制備方法溫和，原料來(lái)源方便，便于工業(yè)化；
(2) 制備的氧化劑符合目前國(guó)際上對(duì)食品添加劑的新要求，即天然、新鮮、具有一定的 功能性；
(3) 該氧化劑同時(shí)保持了阿魏酸及丁酸的性質(zhì)，在人體內(nèi)酯酶的作用下緩慢釋放，具有 抗氧化、抗疲勞、清除體內(nèi)有害自由基的作用，具有預(yù)防及治療各種心腦血管疾病的作用。


圖1是本發(fā)明的阿魏酸雙丁酸甘油酯的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是硅膠柱層析裝置示意圖3是純化前后的阿魏酸乙酯薄層分析圖，(a)是純化前的阿魏酸乙酯薄層分析圖，(b)是純化 后的阿魏酸乙酯薄層分析圖； 圖4是阿魏酸雙丁酸甘油酯清除DPPH，的效果圖5是阿魏酸雙丁酸甘油酯清除超氧陰離子02—的效果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限
定的范圍。
實(shí)施例1
(1) 底物阿魏酸疏水化 5g阿魏酸與50mL無(wú)水乙醇在3mL亞硫酰氯催化下，80。C回流加熱并連續(xù)攪拌5h，將反應(yīng)
液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到淡黃色油狀物質(zhì)，溶于少量乙醚中，用飽和的碳酸氫鈉溶液萃取3次后 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，得到的液態(tài)物質(zhì)，靜止至致大量的白色針狀結(jié)晶析出，得到阿魏酸乙酯。
(2) 阿魏酸乙酯的柱層析純化
純化條件裝柱取25 30g硅膠G，以乙酸乙酯為溶劑濕法裝柱，控制流速為l滴 /s。層析條件采用分階段洗脫的方法，洗脫液比例從石油醚乙酸乙酯=9:1逐漸增加至 石油醚乙酸乙酯比例為1:9?？刂屏魉?min接流出液，每管5mL;每管樣品取5/zL按
試管編號(hào)順序在同一塊薄層板上依次點(diǎn)樣，用雙波長(zhǎng)薄層色譜掃描儀在波長(zhǎng)為254nm下掃 描并處理數(shù)據(jù)。合并阿魏酸乙酯峰范圍內(nèi)試管溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到得到純化后阿魏酸乙 酯于棕色試劑瓶中保存待用。純化前后薄層分析結(jié)果，見(jiàn)圖4。從純化前后的阿魏酸乙酯的 薄層層析掃描圖中可以看出通過(guò)硅膠柱層析后的阿魏酸乙酯滿足后續(xù)反應(yīng)的純度需要。
(3) 阿魏酸雙丁酸甘油酯的制備
酶催化反應(yīng)在25mL的具塞三角瓶瓶中，加入l.OmmoL阿魏酸乙酯，3.0mmoL 丁酸甘 油酯，120mgNovozym435脂肪酶，5mL叔丁醇，50。C度下空氣浴振蕩150r/min進(jìn)行反應(yīng) 96h，純化方法參見(jiàn)阿魏酸乙酯的柱層析分離方法。
(4) 阿魏酸雙丁酸甘油酯功能性評(píng)價(jià) ①抗氧化效果評(píng)價(jià)
采用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB1046—88對(duì)其抗氧化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表l。由表可知，添加抗 氧化劑的豬油樣品的誘導(dǎo)時(shí)間均大于空白樣品的誘導(dǎo)時(shí)間。每組添加量阿魏酸雙丁酸甘油 酯的保護(hù)系數(shù)均大于1，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)豬油具有抗氧化作用，且隨著添加量的增加，其對(duì) 豬油的抗氧化作用增強(qiáng)。阿魏酸雙丁酸甘油酯的添加量達(dá)到0.06%時(shí)，即具有明顯的抗氧
化活性(PF>2);當(dāng)添加量達(dá)到0.08%時(shí)，其抗氧化能力已大于BHT。
表1阿魏酸雙丁酸甘油酯的抗氧化效果評(píng)價(jià)
添加物及量存放時(shí)間(d)誘導(dǎo)時(shí)間PF值
048121620(d)
空白2.158.7233.5152.3273.22119.447.151
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.01%2.155.4225.2144.3958.1382.219.371.31
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.02%2.154.9817.2139.0444.9869.779.811.37
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.04%2.154.2212.3725.0531.2244.9411.091.55
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.06%2.153.878.3215.3719.1327.0913.412.13
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.08%2.153.317.9911.3213.5717.9815.982,22
阿魏酸雙丁酸甘油酯0.10%2.152.877.243.9911,1812.1818.602.61
BHTO.02%2.153.558.0613.1515.5224.1514.742.16
注PF〉2表示具有顯著的抗氧化效果
② 清除DPPH 的效果評(píng)價(jià)
取0.2mL的FeS04-EDTA混合液(10mmol/L)于具塞試管中，加入0.2mL的a-脫氧
核糖溶液(1Ommol/L)，然后再加入一定量的樣品提取液，并用磷酸緩沖液(pH7.4， O.lmol/L) 定容到1.8mL，最后加入0.2mL的H202 (1Ommol/L)，混勻后于37。C保溫lh，再加入2.8% 三氯乙酸1.00mL， 1.0%硫代巴比妥酸溶液lmL，混勻后，沸水浴煮沸10min，冷水冷卻。 不加a-脫氧核糖的反應(yīng)混合液不發(fā)生反應(yīng)，作為比色時(shí)的空白液，測(cè)As32，根據(jù)下面計(jì)算 清除率(SA)。
S A(%)=[ 1 -(As-A0)/( Ac-A0)] x 100
AS:加樣品提取液并在37t:水浴中反應(yīng)的吸光值；Ac:不加樣品提取液，同上操作的吸 光值；Aq:不加樣品提取液并且不在37。c水浴中反應(yīng)的吸光值。
測(cè)試結(jié)果下圖4，阿魏酸雙丁酸甘油酯清除自由基的反應(yīng)進(jìn)行的很快，在開(kāi)始的lOmin， 清除率就己經(jīng)達(dá)到了 92.05%。而后按三個(gè)階段增加，分別為在25min清除率達(dá)到92.67%， 55min時(shí)達(dá)到93.17， 75min時(shí)即不再變化，達(dá)到93.34%。因此，反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除率的影響 不及抗氧化劑的濃度變化，只要清除劑的濃度適宜，便可在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到清除率的平 衡。
③ 清除超氧陰離子02_的效果評(píng)價(jià)
取0.05mol/LpH8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL， lmL試樣置于20'C水浴中反應(yīng)5min， 加入8mol/LHCl lmL終止反應(yīng)，420nm處測(cè)定吸光度A，空白對(duì)照組AO以相同體積的蒸
餾水代替樣品。根據(jù)公式下面計(jì)算清除率。 清除率計(jì)算公式P氣Ao-Ai)/Ao
測(cè)試結(jié)果圖5，阿魏酸，阿魏酸雙丁酸甘油酯和BHT對(duì)Or都有清除作用，且隨濃度 的增加而增強(qiáng)。三者在濃度小于0.12mg/mL時(shí)的清除能力相近，濃度增大，阿魏酸雙丁酸 甘油酯溶液表現(xiàn)出優(yōu)于阿魏酸及BHT清除自由基的能力。在實(shí)驗(yàn)選定的濃度范圍內(nèi)，阿 魏酸雙丁酸甘油酯對(duì)自由基最終的清除率達(dá)到90.12%，表現(xiàn)出了良好的清除效果。
權(quán)利要求
1.酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，包括下列步驟(1)在亞硫酰氯催化下，阿魏酸與無(wú)水乙醇回流加熱反應(yīng)后，溶于乙醚，碳酸氫鈉萃取，去除乙醚，靜止析出結(jié)晶，得阿魏酸乙酯，并純化；(2)所得阿魏酸乙酯與丁酸甘油酯、叔丁醇，在Novozym435脂肪酶催化下反應(yīng)，純化，得阿魏酸雙丁酸甘油酯。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其 特征在于所述阿魏酸與無(wú)水乙醇的用量比為1/10 (g/mL)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其特 征在于所述的碳酸氫鈉是飽和的碳酸氫鈉溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其 特征在于所述步驟(1)中的回流加熱反應(yīng)是50-8(TC反應(yīng)3-7h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其特 征在于所述的阿魏酸乙酯與丁酸甘油酯、叔丁醇的用量比為1:1-3:5 (mM/mM/mL)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其 特征在于所述步驟(2)中的反應(yīng)是30-5(TC反應(yīng)80-120h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，其 特征在于所述步驟(1)和(2)中的純化是硅膠柱層析純化，溶劑是乙酸乙酯，分階段洗 脫，洗脫液比例從石油醚乙酸乙酯=9:1逐漸增加至石油醚乙酸乙酯比例為1:9。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶促合成功能性食品抗氧化劑阿魏酸雙丁酸甘油酯的方法，包括(1)在亞硫酰氯催化下，阿魏酸與無(wú)水乙醇回流加熱反應(yīng)后，溶于乙醚，碳酸氫鈉萃取，去除乙醚，靜止析出結(jié)晶，得阿魏酸乙酯，并純化；(2)所得阿魏酸乙酯與丁酸甘油酯、叔丁醇，在Novozym435脂肪酶催化下反應(yīng)，純化，得到阿魏酸雙丁酸甘油酯。該方法反應(yīng)條件溫和、安全，制備的氧化劑保持了阿魏酸及丁酸的性質(zhì)，在人體內(nèi)酯酶的作用下緩慢釋放，具有抗氧化、抗疲勞、清除體內(nèi)有害自由基的作用，具有預(yù)防及治療各種心腦血管疾病的作用。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101168756SQ20071004729
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者朱利民, 靜 權(quán), 柴艷倩, 妍 鄭 申請(qǐng)人:東華大學(xué)