專利名稱：蝴蝶蘭orap11基因編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的^ ^V/ 基因的核苷酸編碼序列，包含上述基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因植株，以及對蝴蝶蘭此基 因的表達(dá)模式進(jìn)行分析鑒定的所使用的引物序列和方法。
背景技術(shù)：
蘭科屬于世界性四個特大科之一，起源古老，進(jìn)化速率極其不同步，是種子植物系統(tǒng) 發(fā)育在單子葉植物中的一個高峰，具有典型性和代表性(吳征鎰,2003)。
蘭花結(jié)構(gòu)高度特化，其花被的高度變異(如似花瓣的萼片和唇瓣)及合蕊柱的出現(xiàn)為 研究ABC功能基因提供了新的平臺和視角，并可能會拓展經(jīng)典ABC功能基因概念的外延。
由于Sg[/v4-like家族僅存在于被子植物，但MADS-box基因家族廣泛存在于整個植物 界，因此對其研究有助于理解被子植物的起源和系統(tǒng)發(fā)育。
至今，己在蝴蝶蘭中發(fā)現(xiàn)B類和C類基因。尸eMX"52 ^PeM4AS 5屬于B類Z^FA4尸3家族 基因，而i^M4D滯屬于B類G丄OAP/家族基因。在野生型蝴蝶蘭中，PeM4AS2在萼片和花瓣 強(qiáng)表達(dá)，在蕊柱弱表達(dá)，在唇瓣和花粉塊不表達(dá)。PeM4DSj在花瓣，唇瓣強(qiáng)表達(dá)，在蕊柱 弱表達(dá)，在萼片和花粉塊不表達(dá)。戶eil^A^僅在唇瓣和蕊柱表達(dá)。尸eM4AS5主要在花瓣表 達(dá)，但在萼片，唇瓣和蕊柱中也有表達(dá)。PeMv4DS6在花芽，未成熟的子房，和成花的所有 花器官(除花粉塊外)均有表達(dá)；但在營養(yǎng)器官沒有表達(dá)。在授粉誘導(dǎo)或自然衰老的過程 中，尸eM4DS6在花和未成熟的子房中的表達(dá)減少；表明其對子房或胚珠的發(fā)育有抑制作用。 研究表明，PeM4DS6在蝴蝶蘭中不僅決定花器官特性，而且在控制花的壽命和胚珠發(fā)育也 發(fā)揮作用。
尸/^L4G7和尸/2a"G2分別屬于JG家族C類和D類基因。它們在花芽，唇瓣，蕊柱和胚珠 中都有表達(dá)，在營養(yǎng)器官沒有表達(dá)。兩者相似的表達(dá)模式表明它們在花發(fā)育中功能冗余。
目前A類基因僅在石斛蘭中有報道。來自De"AoWww Madame Thong-In的Z)OM4AS2剛 開始在六周的營養(yǎng)芽頂端分生組織表達(dá)，此時花發(fā)育明顯的形態(tài)學(xué)改變還未發(fā)生；表達(dá)貫 穿整個成花轉(zhuǎn)變過程，隨后定位于成花的蕊柱。來自De"AoWwm /^^/7on/w的 D^)TF" DA,F丄3在花序高表達(dá)，在胚珠中度表達(dá)，在根和葉為低表達(dá)。
在本研究中，我們從蝴蝶蘭花芽中分離出一個5^ 7^-like基因，(9WW/。系統(tǒng)進(jìn)化分 析表明這個基因?qū)儆趩巫尤~A類基因。原位雜交顯示它們的表達(dá)模式不同于經(jīng)典的A功能
基因。轉(zhuǎn)基因煙草表明它們能加速開花并改變植株的形態(tài)構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種從蝴蝶蘭中克隆出的0^尸//基因，其編碼序列和應(yīng)用。
本發(fā)明的 一 方面提供 一 種新的蝴蝶蘭基因，記為ow尸// ，已注冊于
GenBank/EMBL/DDBJ，登陸號為DQ104328。它為具有特定序列的DNA分子，包括一個753bp 的開放讀框，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
本發(fā)明還提供上述基因編碼翻譯出的蛋白質(zhì)分子，有長250個搭配殘基，其氨基酸序 列為SEQ ID NO. 2所示。
本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中<9iM/>7/基因的方法，即使用如下核苷酸 引物系列，分別對基因相應(yīng)區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。包括根據(jù)所述OAM/V/基因所屬保守區(qū)域設(shè)計(jì) 的兼并引物MonoAPl和MonoAP2;為獲得基因3'和5'末端的兩對引物兼并引物0RAP1F 和反向特異性引物6150RAP11R，以及正向特異性引物2260RAP11F和B25。首先使用兼 并引物MonoAPl和MonoAP2獲得長約750bp的cDNA部分片段。5'端序列通過兼并引物 ORAP1F和基因反向特異性引物6150RAP11R獲得；3'端序列通過基因正向特異性引物 2260RAP11F和B25獲得。具體序列信息參見SEQ ID NO. 3。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測樣品中蝴蝶蘭OW尸77基因拷貝數(shù)的方法，其使用前述 核苷酸序列SEQ ID NO. 1對蝴蝶蘭基因組DNA樣品進(jìn)行Southern雜交，然后檢測目的片 段的有無。樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸片段。而獲得雜 交探針分子的引物根據(jù)基因的特異區(qū)段設(shè)計(jì)，序列為500(9/M戶77F和 10080W/V7R，具體序列見SEQ ID NO. 4所示。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測^ ^V/基因在蝴蝶蘭原植株組織中表達(dá)分布狀況的方法 和為獲得檢測分子使用的DNA引物序列。取小塊組織材料，經(jīng)多聚甲醛處理和梯度脫水， 包埋于石蠟組織中。實(shí)驗(yàn)檢測時取復(fù)水和蛋白酶K處理過的切片與事先制備的DNA探針分 子在雜交液中混合雜交，顯色后觀察拍照。而雜交使用的DNA探針分子由根據(jù)^^尸W基 因的特異區(qū)段設(shè)計(jì)的引物獲得，兩引物分別為500F11和1008R11,引物序列如SEQ ID NO. 5 所示。
本發(fā)明還提供了一種將上述的編碼具有蝴蝶蘭6>WP77基因轉(zhuǎn)入煙草以改變成花過程 和形態(tài)建成的方法，具體步驟如下
(1) 將編碼蝴蝶蘭OiMP77基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1可操作的連接植物表達(dá)載 體，形成含有SEQ ID NO. l所示核苷酸序列的載體；
(2) 將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并將菌液與煙草葉片混合培養(yǎng)。
(3)通過抗生素篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因植株。 在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，為擴(kuò)增蝴蝶蘭OiWP77基因的開放閱讀框，使之可操作的
連接與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，使用到了引物ORAPF和ORAPllR。具體序列信息見SEQ ID NO. 6。


圖1 RT-PCR擴(kuò)增C^LW7基因的結(jié)果。Lane 1為根據(jù)植物中SgW-like基因的保守區(qū) 設(shè)計(jì)引物，以包括不同發(fā)育時期的蝴蝶蘭花芽的cDNA為模板，利用PCR的方法獲得的 蝴蝶蘭SgK4-like基因OiL4尸//。圖中最亮的大小約750bp的條帶即為目的片段。
圖2蝴蝶蘭中<9^1P77基因的Southern blot分析?；蚪MDNA各15 y g分別用I (d) ,￡coRV(e)和歷"dIII(h)三種市售的酶消化。右邊數(shù)字代表分子量大小(kb，千堿 基對)。結(jié)果顯示0/L4尸77基因?yàn)閱慰截悺?br> 圖3 (9iL4尸〃 基因和其它SgW-Iike基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用PAUP軟件，依據(jù)這 些基因保守的MIK區(qū)的核苷酸序列，構(gòu)建最大簡約樹。(9iL4尸77基因和來自其它單子葉植 物的同源基因聚為一類，形成一個單系亞家族，表明它們有且僅有一個共同的祖先。
圖4 Oi APW基因在蝴蝶蘭不同組織的表達(dá)模式。其中PLB圓球莖,root根,leaf葉，bud 芽,sepal萼片,petal花瓣,lip唇瓣，column蕊柱。Actin為內(nèi)源肌動蛋白，作為內(nèi)參照。
圖5原位雜交檢測OiMPW基因在蝴蝶蘭器官(根，頂芽，花芽和胚珠的縱切或橫切 切片)中的時空表達(dá)模式。OiL4P77轉(zhuǎn)錄本在蝴蝶蘭根尖、頂芽、花芽和胚珠中的表達(dá)模 式。用地高辛標(biāo)記的反義探針(a-e， g-i)和正義探針(f)雜交縱切或橫切切片。a在剛抽 梗一個節(jié)位的蝴蝶蘭中，OTL4尸77轉(zhuǎn)錄本在芽頂端分生組織和苞片中沒有表達(dá)。b在花序 分生組織，花分生組織，花原基和萼片原基中可檢測到雜交信號，在分生組織中心區(qū)的維 管束原也有表達(dá)。OiL4P77轉(zhuǎn)錄本在整個花芽發(fā)育階段都可檢測到。c-e， g在正在發(fā)育的 花瓣和唇瓣的邊緣和頂端可檢測到雜交信號，在蕊柱的花粉塊也有。h在未授粉的胚珠中 可檢測到信號。i-k在授粉后的胚珠中可檢測到信號。1在根頂端分生組織中有表達(dá)
圖6轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測。擴(kuò)增出特異性條帶說明所取煙草材料中帶有被轉(zhuǎn)入的蝴 蝶蘭OW/V/基因。
圖7異源表達(dá)(9W尸W改變煙草花時和植株形態(tài)。較野生型WT(a)相比，轉(zhuǎn)基因植株 (b)出現(xiàn)明顯的早花和矮化現(xiàn)象。
圖8異源表達(dá)Oi^PW改變轉(zhuǎn)基因煙草花的發(fā)育。a， b， e裂開的花筒。c 一具有7 個花瓣(cl)， 5個正常雄蕊和2個雄蕊化的花瓣(c2)的異?；ā花序枝縮短以致所有的 花序簇成一團(tuán)。f 一具有裂開的花筒(fl)和雄蕊化的花瓣(O)的異常花。g表型嚴(yán)重受影響 的花(gl)，所有的雄蕊花瓣化(g2)。 h重度表型的花，具雄蕊化的花瓣(hl，右下角)和花瓣化的雄蕊(h2)。i具有裂筒(il)，部分雄蕊花瓣化(i2)和胚胎狀雌蕊(i3)的異常花。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅以用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。 如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York: Cold Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。 實(shí)施例1
蝴蝶蘭OiL4P77基因的克隆。
1蝴蝶蘭(尸^/ae"o; ^ /^6"c/a)品種Formosa rosa來自上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜園藝研究 所；生長條件為光周期16h/8h(L/D)， 25°C。
2RNA提取。取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1 riiL TriBlue試劑，用 力搖15 s，室溫放置5 min。加0.2 mL氯仿，去蛋白，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加等體 積異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min。用DEPC配制的75%乙醇1 mL洗滌沉淀，重復(fù)一 次。室溫干燥5 10 min，溶于20叱DEPC水中，測0D值，電泳檢測。
3基因的克隆。通過對已發(fā)表的OiM尸77基因序列進(jìn)行同源性比較，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì) 兼并引物MonoAPl和MonoAP2，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。得到約750bp的 cDNA部分片段，命名為OWi577。 5'端序列通過兼并引物0RAP1F和基因反向特異性引 物6150RAP11R獲得；3'端序列通過基因正向特異性引物2260RAP11F和B25獲得。具 體序列信息參見SEQ ID NO. 3。 實(shí)施例2
蝴蝶蘭OiL4W7基因的拷貝數(shù)分析
用CTAB法抽取蝴蝶蘭基因組，取10PgDNA分別用Dra I，五coR V和歷"d III三種市 售的酶消化，37。C酶切過夜。以0.8%瓊脂糖凝膠將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)果如圖 2所示。轉(zhuǎn)移DNA并固定于尼龍膜上。探針雜交確定其為單拷貝。 實(shí)施例3
蝴蝶蘭OiL4PW基因表達(dá)模式分析
分別提取蝴蝶蘭植株的根、葉片、花梗、花蕾以及花器官(花萼、翼瓣、唇瓣和蕊柱) 的總RNA。測定0D26。后定量取出l)ag RNA，反轉(zhuǎn)錄.以特異引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)產(chǎn)物以1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖4所示。 實(shí)施例4
原位雜交
l取得較小的組織材料，以4%的多聚甲醛固定12小時。再以乙醇梯度脫水，包埋于 石蠟塊當(dāng)中。
2將載玻片和蓋玻片浸于鉻酸洗液中2天，然后蒸餾水漂洗。再以多聚賴氨酸(PLL， lmg/ml)浸泡或涂片，37。C或42。C烘干備用。
3特異性探針分子為基因3'末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域一段特異的長約250bp的DNA序列。
4石蠟樣品切片后脫臘，復(fù)水并以蛋白酶消化組織蛋白。經(jīng)預(yù)雜交后與事先變性處理 的探針分子在雜交液中5(TC共浴16h。
5雜交后，以血清封閉探針，利用特異性抗體與雜交上的探針分子結(jié)合，并予染色。
6水溶性封片劑封片，顯微觀察并照相。
原位雜交結(jié)果如圖5所示。 實(shí)施例5
蝴蝶蘭OW尸/7基因在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定 1含目的基因(蝴蝶蘭OiM尸W基因)表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)以蝴蝶蘭0iM尸W基因全長編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在 正反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。 以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在5'端和3'端分別加入^6a I和&c I酶切位點(diǎn)。 經(jīng)I和Sac I雙酶切的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過同樣雙酶切的pCAMBIA 2301M植物表達(dá)載體 連接，轉(zhuǎn)化，測序，確保開放讀框正確。將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。利用葉圓盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式 植物煙草。
2利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
用滅菌牙簽挑取LB選擇培養(yǎng)基上的陽性克隆，接種于2mlLB液體(利福平40mg/L,
卡那霉素50mg/L,鏈霉素50mg/L) ，28°C200 rpm振蕩培養(yǎng)24—36h; * 室溫下4000g離心10min;
*棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸，稀釋到原體積的5—20倍，使OD6。(r0.5左 右；
*取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去其葉主脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉 片；
*將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2—5min，在無菌濾紙上吸干菌液； 將侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)48h;
將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0. lmg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉 素250mg/L)上，25—28。C光照下培養(yǎng)，7—15天見愈傷組織形成；*約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+
卡那霉素50mg/L+頭孢霉素250mg/L); 待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，溫室中培養(yǎng)。
3轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
以SDS方法小量抽提部分轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以轉(zhuǎn)pCAMBIA2301M空載體的 煙草作為對照，根據(jù)蝴蝶蘭C^L4尸77基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測(部分結(jié)果)，檢 測結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明攜帶有外源蝴蝶蘭基因己經(jīng)插入到煙草基因組中。 4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定
如圖7所示，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)為提前開花；節(jié)間縮短，植株矮化；營養(yǎng)器官的發(fā) 育嚴(yán)重改變，特別是葉片的形態(tài)。例如，幼葉剛開始常呈線狀，隨后發(fā)育成巻曲的或不 完整的結(jié)構(gòu)。如圖8所示，轉(zhuǎn)基因植物的花器官的發(fā)育也在受影響， 一些花的花筒裂開， 而野生型的花筒是聯(lián)合的。而且有些花瓣雄蕊化；另外花序枝縮短以致所有的花序簇成一 團(tuán)，在一些表型嚴(yán)重的花中，第三輪器官帶有花瓣的特征。因此，轉(zhuǎn)基因研究表明這OW尸 基因能加速開花，并能改變?nèi)~和花的形態(tài)。序列表
SEQ ID NO. 1:
AAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO. 2:
AEDPTLLQMNSISLPPWMLRSST
SEQ ID NO. 3:
MonoAP 1: 5 ，-GGTGCAGCTGAAGCGRATMGAGAA陽3' MonoAP2: 5'-TTSAKRTGRCTSASCATCCAYRGKGGMAG-3， ORAP 1F: 5'-ATGGGKCGSGGSARGGTGCAGCTGAAGCG-3' 6150RAP11R: 5'-TTTGGTGGTAGGAAGGGAGA-3' B25: 5，-GACTCGAGTCGACATCG-3， 2260RAP1 IF: 5' -CCAGATTACAGAACCGGAGT-3'
SEQ ID NO. 4:
5000iL4尸77F: 5'陽TTCTGGAGGCGAAGTTGTGC-3', 10080iMP淑5'-AGAAGATGCAATCCGGAAAA-3'. SEQ ID NO. 5:
500F11: 5'-TTCTGGAGGCGAAGTTGTGC-3' 1008R11:5'-AGAAGATGCAATCCGGAAAA-3' SEQ ID NO. 6:
ORAPF: 5，-GC Maga| G(CA)(AT) ATGGGTCGCGGGAGGGTGCAG-3，(Jfta I)
ORAP11R: 5'-GC |gagctc| TTAGGTTGAGGAGCGAAGCAT-3' (Sac I)
框內(nèi)為酶切位點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種分離出的蝴蝶蘭ORAP11基因，其特征在于為具有特定序列的DNA分子，包括一個753bp的開放讀框；其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2. —種由如權(quán)利要求1所述的OiL4尸77基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于為長250 個氨基酸殘基，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。
3. 用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中基因核苷酸的引物序列，包括根據(jù)權(quán)利要求1 所述OiL4i377基因所屬家族保守區(qū)域設(shè)計(jì)的兼并引物MonoAPl和MonoAP2，為獲得基因 3'和5'末端的兩對引物兼并引物0RAP1F和反向特異性引物6150RAP11R，以及正 向特異性引物2260RAP11F和B25，這些引物序列如SEQ ID NO.3所示。
4. 一種用于檢測樣品中蝴蝶蘭OiL4P77基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于使用核苷酸 序列SEQ ID NO. 1對蝴蝶蘭基因組DNA樣品進(jìn)行Southern雜交，然后檢測目的片段的有 無；樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸片段；獲得雜交探針分 子的引物根據(jù)朋尸/I"基因的特異區(qū)段設(shè)計(jì)，序列為5006^APL F和1008(9iL4尸7m，見 SEQ ID NO. 4所示。
5. —種用于檢測基因在蝴蝶蘭原植株組織中表達(dá)分布狀況的方法，其特征 在于具體步驟如下取小塊組織材料，經(jīng)多聚甲醛處理和梯度脫水，包埋于石蠟組織中； 實(shí)驗(yàn)檢測時取復(fù)水和蛋白酶K處理過的切片與事先制備的DNA探針分子在雜交液中混合雜 交，顯色后觀察拍照；雜交使用的DNA探針分子由根據(jù)6^/77基因的特異區(qū)段設(shè)計(jì)的引 物獲得，兩引物分別為500F1I和1008R11,引物序列如SEQ ID NO. 5所示。
6. —種將如權(quán)利要求1所述的編碼具有蝴蝶蘭OWP//基因的核苷酸序列轉(zhuǎn)入煙草 以改變花發(fā)育的方法，具體步驟如下(1) 將編碼蝴蝶蘭OW尸77基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1可操作的連接于植物表達(dá) 載體，形成含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的載體；(2) 將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并將菌液與煙草葉片混合培養(yǎng)；(3) 通過抗生素篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的SQUA基因家族的ORAP11基因的核苷酸編碼序列及其在改變花發(fā)育，成花轉(zhuǎn)變和形態(tài)構(gòu)建方面的應(yīng)用。本發(fā)明涉及包含上述基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因植株，獲得此基因的核苷酸引物系列，用于檢測內(nèi)源表達(dá)模式的寡核苷酸探針序列，以及對蝴蝶蘭此內(nèi)源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析鑒定的方法。將本發(fā)明所說基因轉(zhuǎn)入煙草，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株開花時間和植株?duì)I養(yǎng)與生殖器官形態(tài)均發(fā)生明顯變化。
文檔編號C12N15/29GK101200722SQ20071004718
公開日2008年6月18日 申請日期2007年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日
發(fā)明者劉啟昆, 鳳 明, 沈大棱 申請人:復(fù)旦大學(xué)