專(zhuān)利名稱(chēng)：：日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因tsp2的克隆、表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2(四跨膜蛋白2)的克隆、表達(dá)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血吸蟲(chóng)病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)童的人畜共患寄生蟲(chóng)病。對(duì)其治療藥物具有一定的付作用，因而防治工作很重要，抗血吸蟲(chóng)病疫苗研究成為血吸蟲(chóng)病防治研究的熱點(diǎn)之一。血吸蟲(chóng)長(zhǎng)期寄生在血管內(nèi)，它的體表與宿主血液直接接觸，血吸蟲(chóng)表膜(包括酶、表面暴露分子、受體等)是宿主免疫系統(tǒng)與血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體接觸的界面，完整的膜蛋白分子在血吸蟲(chóng)與宿主相互作用中及對(duì)血吸蟲(chóng)逃避宿主的免疫攻擊和血吸蟲(chóng)在宿主血管內(nèi)生存的適應(yīng)性等方面均起著重要作用。因此對(duì)血吸蟲(chóng)表膜相關(guān)蛋白的研究不僅可以了解血吸蟲(chóng)與宿主相互作用中的關(guān)鍵因子，而且也有助于深入探討血吸蟲(chóng)免疫逃避機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的、高效的疫苗候選抗原。東方田鼠(ifc'cro^/s/br"s)在分類(lèi)學(xué)上隸屬于嚙齒目倉(cāng)鼠科O:rj'cen'Ae)田鼠亞科n'cro"/7aeJ田鼠屬6^'crottAA分布于中國(guó)西北、東北及南方16個(gè)省區(qū)，是血吸蟲(chóng)病流行區(qū)洞庭湖洲上廣泛分布的一個(gè)優(yōu)勢(shì)鼠種。東方田鼠是至今在中國(guó)血吸蟲(chóng)病疫區(qū)發(fā)現(xiàn)的唯一一種感染日本血吸蟲(chóng)尾呦后不致病的哺乳類(lèi)動(dòng)物。近年來(lái)研究證實(shí)，日本血吸蟲(chóng)流行區(qū)野生東方田鼠、非日本血吸蟲(chóng)流行區(qū)野生東方田鼠和室內(nèi)繁殖的東方田鼠均具有抗日本血吸蟲(chóng)病現(xiàn)象。為探討東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)感染機(jī)制，將新鮮東方田鼠血清通過(guò)尾靜脈注射被動(dòng)轉(zhuǎn)移給昆明系小鼠后，與對(duì)照組比較，小鼠體內(nèi)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)荷、糞便蟲(chóng)卵數(shù)、毛蚴孵出率，均顯著減少。為進(jìn)一步研究東方田鼠血清中哪些成分和因子與東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)感染相關(guān)，以ELISA方法檢測(cè)東方田鼠抗血吸蟲(chóng)可溶性童蟲(chóng)抗原不同亞型的抗體，結(jié)果提示體液免疫在東方田鼠抗血吸蟲(chóng)病中發(fā)揮了重要作用，抗體可能是東方田鼠血清中抗日本血吸蟲(chóng)病的重要成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于根據(jù)東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染具有天然抵抗力這一特性，利用重復(fù)攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾呦的東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)，獲得一個(gè)日本血吸蟲(chóng)SjTSP2基因，并對(duì)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了含SjTSP2基因第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)的原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2，并在大腸桿菌表達(dá)體系中表達(dá)得到了融合蛋白SjTSP2EM2/HIS和SjTSP2EM2/GST。本發(fā)明對(duì)日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2進(jìn)行小鼠日本血吸蟲(chóng)病免疫保護(hù)試驗(yàn)。本發(fā)明應(yīng)用東方田鼠兩次感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴后采集的血清免疫篩選日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，獲得一陽(yáng)性克隆，利用NCBI的Blast進(jìn)行基因序列的同源性分析，表明該基因?yàn)槿毡狙x(chóng)膜蛋白TSP2基因。該基因0RF含645個(gè)堿基對(duì)，編碼215個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，SjTSP2基因推導(dǎo)氨基酸序列的N端含有信號(hào)肽，并有4個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)膜外區(qū)，符合四跨膜蛋白家族的主要特征。該蛋白第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)具有多個(gè)功能位點(diǎn)，抗原性分析表明其具有較強(qiáng)的抗原性。在此基礎(chǔ)上，將SjTSP2基因第二個(gè)膜外區(qū)DNA片段克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28c和pGEX-4T-2，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2，轉(zhuǎn)化Rossetta(DE3)表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白rSjTSP2EM2/HIS、rSjTSP2EM2/GST分子量分別為15KD和36KD。本發(fā)明提供了日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)。具體包括下列步驟(1)根據(jù)SjTSP2第二個(gè)膜外區(qū)SjTSP2EM2兩端序列設(shè)計(jì)引物，并在其擴(kuò)增序列的5'端和3'端分別引入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到含第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)SjTSP2EM2的基因片段；(2)將SjTSP2EM2的基因定向克隆至原核表達(dá)載體pET28c(+)及pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重鄉(xiāng)且原4亥表達(dá)質(zhì)米立SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2;(3)將上述兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，并在LB固體劃培養(yǎng)基線(xiàn)挑單菌落制備菌種，將菌種接種于LB培養(yǎng)基，用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集細(xì)菌后，按非變性條件下His親合層析操作流程純化重組抗原rSjTSP2EM2/HIS和用純化GST融合蛋白的方法純化SjTSP2EM2/GST重組蛋白。本發(fā)明日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2具有SEQIDNO.1序列。本發(fā)明人應(yīng)用東方田鼠兩次感染日本血吸蟲(chóng)尾呦后采集的血清免疫篩選日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，獲得一陽(yáng)性克隆，利用NCBI的Blast進(jìn)行基因序列的同源性分析，表明該基因?yàn)槿毡狙x(chóng)膜蛋白TSP2基因。該基因0RF含645個(gè)堿基對(duì)，編碼215個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，SjTSP2基因推導(dǎo)氨基酸序列的N端含有信號(hào)肽，并有4個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)膜外區(qū)，符合四跨膜蛋白家族的主要特征。該蛋白第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)具有多個(gè)功能位點(diǎn)，抗原性分析表明其具有較強(qiáng)的抗原性。在此基礎(chǔ)上，將SjTSP2基因第二個(gè)膜外區(qū)DNA片段克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28c和pGEX-4T-2，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2，轉(zhuǎn)化Rossetta(DE3)表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白rSjTSP2EM2/HIS、rSjTSP2EM2/GST分子量分別為15KD和36KD。Western-blotting實(shí)驗(yàn)顯示重組抗原可被日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原免疫小鼠血清識(shí)別，而載體表達(dá)蛋白不與抗體發(fā)生反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性。本發(fā)明的另一目的是提供了日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2在制備防治血吸蟲(chóng)病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)行了表達(dá)純化rSjTSP2EM2/GST、rSjTSP2EM2/HIS重組融合蛋白，并將重組蛋白結(jié)合佐劑FCA(每鼠卡介苗注射量lmg)免疫6周齡的昆明系小鼠。重組蛋白注射劑量均為每次每鼠20Pg。共免疫三次，每次間隔二周，末次免疫2周后攻擊日本血吸蟲(chóng)尾蚴，攻擊后6周剖殺小鼠，門(mén)靜脈灌洗收集成蟲(chóng)，肝臟用8c/。K0H消化后計(jì)算每克肝組織所荷蟲(chóng)卵數(shù)。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，重組蛋白rSjTSP2EM2/GST在昆明系小鼠中誘導(dǎo)了25.78%(P=0.012)和21.90%(P=0.035)的減蟲(chóng)率，34.54%(P=0.027)和42.67%(P=0.020)的肝組織減卵率，差異均顯著。重組蛋白rSjTSP2EM2/HIS誘導(dǎo)的減蟲(chóng)率為22.30%(P=0.125)，差異不顯著，但rSjTSP2EM2/HIS誘導(dǎo)了較高的肝組織減卵率，達(dá)41.99%(P=0.0028)，差異極顯著。本發(fā)明提供了日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2DNA疫苗的構(gòu)建。將TSP2基因用HindIII,EcoRI酶切后克隆至pVAXl載體。具體包括下列步驟將前述制備的TSP2/pMD18-T、pVAXl載體分別用HindIII,EcoRI酶切后回收TSP2基因片段和線(xiàn)性質(zhì)粒DNA;然后用取T4DNA連接酶將兩者連接；取連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將菌液涂布于含K朋amycin的LB固體培養(yǎng)基上37'C溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行小量培養(yǎng)，小抽質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定。得到TSP2/pVAXl重組質(zhì)粒，即TSP2DNA疫苗。為制備防治血吸蟲(chóng)病的疫苗提供了基礎(chǔ)。圖l:SjTSP2/pMD18-T重組質(zhì)粒的鑒定M:DNAMaker2000，1:PCR鑒定結(jié)果，2:EcoRI、PstI雙酶切鑒定結(jié)果。圖2:SjTSP2EM2/pET28c(左)和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2(右)重組質(zhì)粒示意圖。圖3:SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M.DNAmarkerDL2000,1.SjTSP2EM2/pET28c重組質(zhì)?！阠of/和/雙酶切，2.SjTSP2EM2/pGEX-4T-2重組質(zhì)粒fcoW/和/雙酶切。圖4:SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2重組質(zhì)粒PCR鑒定M.DNAmarkerDL2000;1.SjTSP2EM2/pET28c重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2SjTSP2EM2/pGEX-4T-2重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖5:SDS-PAGE分析SjTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)不同時(shí)相的表達(dá)蛋白M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，A-F:SJTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)在IPTG誘導(dǎo)0h、lh、2h、3h、4h、5h的表達(dá)產(chǎn)物。圖6:SDS-PAGE分析SjTSP2EM2/pGEX-4T-2/Rosetta(DE3)不同時(shí)相的表達(dá)蛋白M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，1:pGEX-4T-2/Rosetta(DE3)在IPTG誘導(dǎo)4h后的表達(dá)產(chǎn)物，2-7:SjTSP2EM2/pGEX-4T-2/Rosetta(DE3)在IPTG誘導(dǎo)后0h、0.5h、lh、2h、3h、4h的表達(dá)產(chǎn)物。圖7:重組融合蛋白rSjTSP2EM2/GST和rSjTSP2EM2/HIS的純化標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量97、66、44、29、20、14KD。圖8:Western-blotting分析M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1:SjTSP2EM2/pGEX-4T-2/Rosetta(DE3)表達(dá)產(chǎn)物；2:SjTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)表達(dá)產(chǎn)物。圖9:SjTSP2/pVAXl重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M.DNAmarkerDL2000,1.SjTSP2/pVAXl重組質(zhì)粒HindIII,EcoRI雙酶切。圖10:SjTSP2/pVAXl重組質(zhì)粒PCR鑒定M.DNAmarkerDL2000;1.SjTSP2/pVAXl重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。具體實(shí)施方式一.日本血吸蟲(chóng)膜SjTSP2基因的克隆、表達(dá)1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性新西蘭白兔，2.5kg3kg，購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。1.2日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)成蟲(chóng)日本血吸蟲(chóng)尾蚴由中國(guó)農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染2000條血吸蟲(chóng)尾蚴，感染后42天解剖，以胸主動(dòng)脈灌注法從肝門(mén)靜脈收集日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，用無(wú)菌PBS充分洗滌蟲(chóng)體，去除來(lái)自宿主的粘附物質(zhì)。沖洗好的血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)在液氮中凍存?zhèn)溆谩?.3菌種、質(zhì)粒及主要試劑大腸桿菌Rosetta(DE3)、pET28c載體等購(gòu)自Novagen公司。pGEX-4T-2載體購(gòu)自Pharmacia公司。TRIzol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。RNA酶抑制劑購(gòu)自Promega公司。大腸桿菌DH5a、DNA膠回收純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司。pMD18-TVector、OneSt印RNAPCRKit、ExTaq酶、T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、HindIII、DNAMarkerDL2000等購(gòu)自TaKaRa公司。RedTaq購(gòu)自賽百盛基因技術(shù)有限公司。2.1.4引物根據(jù)日本血吸蟲(chóng)EST序列(GenebankID:EF553319、AY815387)設(shè)計(jì)引物序列。1)RT-PCR引物SjTSP2Senseprimer:5'-ATGTTTCTTATTGCCGTATTG-3'SjTSP2Anti-senseprimer:5'-CGCATTACATTTCTTGATTAG-3'2)SjTSP2基因第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)PCR引物:TSP2em2Senseprimer:5'-GAAGAATTCCAATAATAGAAAAGCCGAAGG-3'(橫線(xiàn)示限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn))TSP2em2Anti-senseprimer:5'-ACGTCGACTATGGTGGCATTTAGGTGCT-3'(橫線(xiàn)示限制性?xún)?nèi)切酶SalI酶切位點(diǎn))引物均由上海上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。2方法2.1SjTSP2基因克隆2.1.1總RNA提取取液氮中凍存的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，按TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取。將RNA溶解于H20(RNasefree)?？俁NA溶液立即用于下步實(shí)驗(yàn)或于-8(TC凍存。2.1.2RT-PCR擴(kuò)增SjTSP2基因1)根據(jù)日本血吸蟲(chóng)EST序列(GenebankID:EF553319、AY815387)和曼氏血吸蟲(chóng)TSP2基因序列(GenebankID:AF521091)設(shè)計(jì)引物序列。SjTSP2Senseprimer:5'—ATGTTTCTTATTGCCGTATTG—3'SjTSP2Anti-senseprimer:5'—CGCATTACATTTCTTGATTAG—3'2)應(yīng)用TaKaRa公司的OneStepRNAPCRKit進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增SjTSP2基因，方法具體如下按下列組成在冰上配制RT-PCR反應(yīng)液10XOneSt印RNAPCRBuffer5u1MgCl2(25raM)10u1dNTPMixture(10mM)5ii1RNaseInhibitor(40U/lU)lii1AMVRTaseXL(5U/u1)liilAMV-OptimizedTaq(5U/ul)In1上游特異性引物(20pmo1/u1)lul下游特異性引物(20pmol/ul)ly1RNA模板10y1RNaseFreedH2015u1Total50ii1按以下程序進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)50°C30min94°C2min94°C30sec一51°C30sec72°C2min4°Clhour30cycles反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。并應(yīng)用申能博彩公司的3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit純化、回收PCR產(chǎn)物(操作步驟同說(shuō)明書(shū))。2.1.3利用回收PCR片段進(jìn)行T-A克隆將純化回收的DNA片段插入到pMD18-TVector，連接反應(yīng)用TaKaRa公司的T4DNALigase進(jìn)行，具體如下按下列組分在冰上配制連接反應(yīng)液:pMD-18Tvectorlu1純化回收PCR產(chǎn)物3u110XLigationBufferlu1T4DNALigase0.5u1ddH204.5u1Total10u116'C水浴連接1小時(shí)(或4'C過(guò)夜)。制備￡co7/DH5a感受態(tài)細(xì)胞。將重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，(方法參見(jiàn)分子克隆指南，薩姆布魯克，2002)。將適當(dāng)體積(每900mm平板200ul)上述液體轉(zhuǎn)移到含氨芐青霉素(Amp+)的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上。將平板放置于室溫至液體被吸收。倒置平皿，37。C培養(yǎng)1216小時(shí)后可見(jiàn)藍(lán)白斑。挑選陽(yáng)性克隆并抽提質(zhì)粒①挑選平皿上形態(tài)圓整的白色單菌落至含Amp+的LB培養(yǎng)液(4ml)，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，②提取質(zhì)粒，用50ylTE溶解，用于酶切鑒定和PCR鑒定或保存于-20'C。2.1.4重組質(zhì)粒SjTSP2/pMD18-TVector酶切鑒定利用pMD18T載體上的限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定。按下列組分配制酶切反應(yīng)體系:ddH20110XH緩沖液2u1重組質(zhì)粒pMD18T-SjTSP8ul限制性?xún)?nèi)切酶EcoRIly1限制性?xún)?nèi)切酶SalIlu1Total20u1稍離心混勻，37。C水浴2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入10Xloadingbuffer終止酶切反應(yīng)，并取5"1反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并保存圖像。2.1.5重組質(zhì)粒SjTSP2/pMD18-TVectorPCR檢測(cè)，應(yīng)用賽百盛公司的RedT叫進(jìn)行PCR檢測(cè)。按下列組成配制PCR反應(yīng)液SjTSP2-pMD18T1u110XPCRBuffer2ix1Cl2Mg(25mM)1U1dNTP(2.5mM)2yl上游特異性引物(20pniol/ix1)1P1下游特異性引物(20pmol/y1)1"1RedTaq(5U/u1)1U194。C5min94。C45sec、51。C45sec—30cycles72。Clmin」72°C10min4°ClhourPCR結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5y1進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。2.1.6SjTSP2序列測(cè)定經(jīng)酶切鑒定、PCR檢測(cè)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送上海奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序弓l物為BcaBESTSequencingPrimerRV_M。2.2SjTSP2基因生物信息分析2.2.1SjTSP2基因序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析利用SignalIP3.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進(jìn)行信號(hào)肽分析。跨膜區(qū)預(yù)測(cè)利用Tmpred(www.ch.embnet.org/software/TMPRED—form.html)程序進(jìn)行在線(xiàn)分析。利用anth印ro2000進(jìn)行進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能域以及抗原性和疏水性等分析。2.3SjTSP2基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建2.3.1根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)SjTSP2第二個(gè)跨膜區(qū)(EM2)引物TSP2em2Senseprimer:5'-GAAGAATTCCAATAATAGAAAAGCCGAAGG-3'(橫線(xiàn)示限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn))TSP2em2Anti-senseprimer:5'-ACGTCGACTATGGTGGCATTTAGGTGCT-3'(橫線(xiàn)示限制性?xún)?nèi)切酶SalI酶切位點(diǎn))預(yù)測(cè)擴(kuò)增的SjTSP2EM2基因片段長(zhǎng)282bp。2.3.2SjTSP2EM2基因片段擴(kuò)增利用TaKaRa公司的ExTaq，以重組質(zhì)粒SjTSP2/pMD18_TVector為模板擴(kuò)增SjTSP2EM2基因片段。根據(jù)下列組分配制PCR反應(yīng)體系(2(^1):溶液組分體積(ul)ddH2012lOXExBuffer(Mg2+Plus)2dNTPs(各2.5mM)2TSP2em2s(20yM)1TSP2em2as(20PM)1SjTSP2-pMD18T1ExTaq(5U/u1)130cycles按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C3min94。C30sec一56°C30sec72°C30min72°C5min4°ClhourPCR結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5u1進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。將PCR產(chǎn)物用酒精純化回收。2.2.3.3SjTSP2EM2基因片段、質(zhì)粒pET28c及pGEX-4T-2的酶切和純化分別取回收SjTSP2EM2基因片段、質(zhì)粒pET28c及pGEX-4T-2用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、SalI進(jìn)行酶切反應(yīng)。按下列組分配制酶切反應(yīng)體系溶液組分體積(lU)ddH20§10XHBuffer2SjTSP2EM2基因片段、pET28c、pGEX-4T-28EcoRI1Sail1總體積2037。C孵育2小時(shí)。結(jié)束后用申能博彩3SDNAGelPurificationKitV3.1純化目的片段(方法同上)。將純化得到的DNA片段立即進(jìn)行連接或-2(TC凍存。2.3.4酶切SjTSP2EM2基因片段與pET28c及pGEX-4T-2載體的連接和轉(zhuǎn)化按下述反應(yīng)體系在16'C連接1小時(shí)或4'C過(guò)夜，將酶切SjTSP2EM2基因片段插入pET28c及PGEX-4T-2載體中溶液組分體積("l)ddmo3.510XLigationBuffer1雙酶切pET28c/pGEX-4T-21.5雙酶切SjTSP2EM2基因片段3T4DNALigase1total10將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)。分別取200ulSjTSP2EM2/pGEX-4-2/Rosetta(DE3)和SjTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)菌液涂于含氨節(jié)青霉素(Amp+)或卡那霉素(KANA)LB瓊脂平板培養(yǎng)基，37t:倒置培養(yǎng)12小時(shí)(方法同上)。2.3.5重組質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2的鑒定1)從過(guò)夜培養(yǎng)的平板上，選擇菌落形態(tài)圓整、微隆起的克隆至含Amp或KANA的LB培養(yǎng)液(4ml)，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，抽提重組質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2進(jìn)行酶切鑒定和PCR檢測(cè)。2)酶切鑒定(方法同上)酶切反應(yīng)體系如下-溶液組分體積(ul)膽20810XHBuffer2質(zhì)粒DNA8EcoRI1Sail13)PCR檢測(cè)(方法同上):在冰上配制PCR反應(yīng)體系(20y1)溶液組分體積"1)ddH2014.510XRedTaqBuffer2dNTPs(2.5mMeach)0.5TSP2em2s(20uM)0.5TSP2em2as(20uM)0.5質(zhì)粒DNA1RedTaq(lU/u1)130cycles按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C3min94°C30sec_56°C30sec72°C30min72°C5min4°Clhour4)分別取酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察。并將鑒定正確的陽(yáng)性克隆送上海奧科生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定。2.4SjTSP2EM2基因表達(dá)及純化條件的優(yōu)化2.4.1表達(dá)時(shí)相分析1)將鑒定正確的陽(yáng)性克隆劃線(xiàn)培養(yǎng)，挑生長(zhǎng)良好的單菌落接種至3mlLB培養(yǎng)基中(含Amp或Kana)，37。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。2)在三角瓶里加入20ml含Amp或Kan的LB液體培養(yǎng)基，按1:100比例接種過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，于37'C培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(0D600"0.6)。3)在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入IPTG，使其終濃度為lmM，繼續(xù)于37'C振蕩培養(yǎng)。分別在加入IPTG后0h、0.5h、、lh、2h、4h、6h取出lml細(xì)菌培養(yǎng)物。4)將不同時(shí)間取出的菌液在12000rpm離心lmin，棄上清。細(xì)菌沉淀用100pllxSDSPAGE上樣緩沖液充分懸浮并混勻。樣品IO(TC煮開(kāi)5min，直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳或保存于-2(TC。5)SDS-PAGE電泳(薩姆布魯克等，2002)，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。1XSDSPAGE上樣緩沖液溶液組分體積(ml)0.5MTrisHC1，pH6,82.0丙三醇2.020%(W/V)SDS2.00.1。/。(W/V)溴酚藍(lán)0.5e-巰基乙醇1.0dH2012.52.4.2rSjTSP2EM2融合蛋白鑒定將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在4'C、12000rpm離心lmin，棄上清。按原lml菌液加100nllxSDSPAGE上樣緩沖液充分懸浮并混勻。樣品10(TC煮開(kāi)5min，直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉(PBST溶)在室溫下對(duì)NC膜封閉lh。PBST洗滌3次，每次10min，在雜交袋中加入1:100稀釋的一抗(經(jīng)大腸桿菌裂解液吸附的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清)，室溫孵育lh或4。C過(guò)夜。PBST洗滌3次，加入1:500稀釋的二抗(羊抗兔IgG-服P)室溫孵育lh。PBST洗滌3次，加入二氨基聯(lián)苯胺底物反應(yīng)液，作用15min，用流水沖洗，拍照保存。2.4.4大量表達(dá)及重組融合蛋白純化1)將SjTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)在LB固體培養(yǎng)基(含50Mg/mlKana)上劃線(xiàn)培養(yǎng)，挑生長(zhǎng)良好的單克隆菌落接種于含抗生素Kana的5mlLB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)過(guò)夜，制備菌種。次日取3ml接種于300ml含Kana的LB中，37。C振蕩培養(yǎng)約4h，加入IPTG至終濃度為1mM,誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，4'C離心收集細(xì)菌。按非變性條件下His親合層析操作流程純化重組抗原rSjTSP2EM2/HIS。將細(xì)菌懸浮于15mlBindingBuffer溶液中，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲粉碎使菌體裂解，4°ClOOOOg離心15min，收集上清，通過(guò)His結(jié)合樹(shù)脂純化出目的蛋白rSjTSP2EM2/HIS。2)將SjTSP2EM2/pGEX-4T-2/Rosetta(DE3)同上劃線(xiàn)挑克隆后，于30。C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，制備菌種。次日取3ml接種于300ml含A卿的LB中，3(TC振蕩培養(yǎng)約6h，加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，4'C離心收集細(xì)菌。用純化GST融合蛋白的方法純化SjTSP2EM2/GST重組蛋白。將細(xì)菌沉淀懸浮于15mlPBS(含l%Triton)溶液中，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲粉碎使菌體裂解，4"C10000g離心15min，上清通過(guò)GLUTATHIONE-AGAROSE親和純化SjTSP2EM2/GST重組蛋白。3)收集兩種重組抗原，分別用PBS透析，測(cè)蛋白濃度，分裝保存于-8(TC備用。3結(jié)果3.1SjTSP2基因的克隆利用EST序列(GenBank登錄號(hào)EF553319)和RT-PCR擴(kuò)增到一段長(zhǎng)776個(gè)堿基的DNA片段。將PCR產(chǎn)物通過(guò)T/A克隆連接到pMD18-TVector體中，隨后將重組質(zhì)粒SjTSP2/pMD18-T轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑選出生長(zhǎng)良好的白色單菌落，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定(見(jiàn)圖1)，將鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。核苷酸測(cè)序結(jié)果表明，該序列含有完整的0RF，位于核苷酸序列的20bp667bp區(qū)域，編碼完整的SjTSP2蛋白。3.2SjTSP基因編碼蛋白分析利用SignalP3.0Server程序分析表明SjTSP2蛋白N端的第1-35個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。利用Tmpred程序進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明SjTSP2蛋白是含有4個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)膜外區(qū)的膜蛋白，4個(gè)跨膜區(qū)分別位于第10-32、50-72、83-105、185-207個(gè)氨基酸之間。3.3重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/PGEX-4T-2的構(gòu)建生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，SjTSP2基因的第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)具有較高的抗原性。根據(jù)SjTSP2第二個(gè)膜外區(qū)SjTSP2EM2兩端序列設(shè)計(jì)引物，并在其擴(kuò)增序列的5'端和3'端分別引入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到含第二個(gè)膜外區(qū)(EM2)SjTSP2EM2的基因片段，并將該片段定向克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)及pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2(見(jiàn)圖2)。重組表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)PCR、酶切鑒定及核苷酸序列測(cè)定等方法驗(yàn)證(見(jiàn)圖3-4)，結(jié)果表明插入的目的基因片段長(zhǎng)度為282bp，插入方向及蛋白讀碼框均正確無(wú)誤。6XHis及GST標(biāo)簽位于重組蛋白的N端，重組融合蛋白的預(yù)期分子量分別為15和36kD。3.4SjTSP2EM2基因在大腸桿菌中表達(dá)和純化條件的優(yōu)化3.4.1SjTSP2EM2/HIS表達(dá)和純化將重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),37。C振蕩培養(yǎng)，加入lmMIPTG誘導(dǎo)2h即達(dá)到最大表達(dá)量(圖5)，重組融合蛋白是可溶性表達(dá)，約占菌體總蛋白的5%。融合蛋白的分子量約為15kD，與預(yù)期結(jié)果相符。重組蛋白的N端具有6個(gè)組氨酸殘基，可在非變性條件下利用His結(jié)合樹(shù)脂進(jìn)行rSjTSP2EM2/HIS的純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化純度可達(dá)95%以上(圖7)。SjTSP2EM2/pET28c/Rosetta(DE3)基因工程菌在LB培養(yǎng)基中重組蛋白的產(chǎn)量約為8mg/L。3.4.2SjTSP2EM2/GST可溶性表達(dá)和純化將重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pGEX-4T-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，于30°C振蕩培養(yǎng)，加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白4h即達(dá)到最大表達(dá)量(圖6)，重組蛋白的分子量約為36kD，表達(dá)融合蛋白約占菌體總蛋白的6%。用GLUTATHIONE-AGAROSE親和純化重組融合蛋白，產(chǎn)量約為5mg/L，純化純度可達(dá)90%以上(圖7)。2.3.5表達(dá)產(chǎn)物抗原性的鑒定分別用IPTG對(duì)含重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌沉淀加適量上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清作一抗進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。在重組融合蛋白的位置出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，分子量分別為15和36kD,表明SjTSP2EM2重組蛋白具有良好的抗原性(圖8)。二.SjTSP2重組融合蛋白的免疫保護(hù)效果評(píng)估和機(jī)制研究2.1材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料56周齡雄性昆明系小鼠購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。中國(guó)大陸株日本血吸蟲(chóng)尾呦由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)購(gòu)自Sig腿公司。206佐劑購(gòu)自SEPPIC公司。其它試劑同前述。2.1.3小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)將昆明系小鼠隨機(jī)分組，試驗(yàn)設(shè)rSjTSP2EM2/GST免疫組、rSjTSP2EM2/HIS免疫組、空白對(duì)照組等三組。每組共進(jìn)行三次免疫，每次間隔2周。第一次rSjTSP2EM2/GST免疫組、rSjTSP2EM2/HIS免疫組小鼠分別用rSjTSP2EM2/GST、rSjTSP2EM2/HIS重組抗原分別結(jié)合佐劑FCA(每鼠卡介苗注射量lmg)和206佐劑免疫小鼠大腿肌肉，第二次用同樣抗原結(jié)合佐劑FIA和206佐劑免疫小鼠，第三次用抗原/PBS注射小鼠大腿或背部皮下強(qiáng)化免疫。重組蛋白注射劑量均為每次每鼠20Pg。空白對(duì)照組均用PBS代替重組蛋白免疫。末次免疫2周后，每只小鼠用腹部蓋玻片法感染尾呦40±2條。攻擊尾蚴后6周，解剖小鼠，肝門(mén)靜脈沖洗法收集成蟲(chóng)記數(shù)，同時(shí)收集每只小鼠的肝臟。稱(chēng)取全肝組織重量，剪碎后加5%K0H20ml，組織勻漿器勻漿，置50。C水浴消化1h，定容至50ml，混勻，按l:50稀釋?zhuān)⑽?00W的懸液4份，鏡檢計(jì)數(shù)肝組織蟲(chóng)卵，最后換算成平均每克肝組織中所負(fù)荷蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)。按以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率、肝臟減卵率對(duì)照組平均載蟲(chóng)數(shù)一免疫組平均載蟲(chóng)數(shù)減蟲(chóng)率=-X100%對(duì)照組平均載蟲(chóng)數(shù)對(duì)照組EPG—免疫組EPG減卵率=-X100%對(duì)照組EPG4.2結(jié)果4.2.1免疫保護(hù)效果小鼠經(jīng)重組蛋白免疫三次后，用日本血吸蟲(chóng)尾呦攻擊感染，6周后解剖沖蟲(chóng)，計(jì)算減蟲(chóng)率，同時(shí)計(jì)數(shù)肝組織蟲(chóng)卵，計(jì)算減卵率。各組疫苗免疫保護(hù)結(jié)果見(jiàn)表l。與空白對(duì)照組相比，重組蛋白rSjTSP2EM2/GST在昆明系小鼠中誘導(dǎo)了25.78%(P=0.012)和21.90%(P=0.035)的減蟲(chóng)率，34.54%(P=0.027)和42.67%(P-0.020)的肝組織減卵率，差異均顯著。重組蛋白rSjTSP2EM2/HIS誘導(dǎo)的減蟲(chóng)率和rSjTSP2EM2/GST相當(dāng)，為22.30%(P=0.125)，差異不顯著，但rSjTSP2EM2/HIS誘導(dǎo)了較高的肝組織減卵率，達(dá)41.99%(P=0.0028)，差異極顯著。表l:SjTSP2EM2在昆明鼠中誘導(dǎo)的減蟲(chóng)、減卵率Table1.WormandeggreductioninducedbySjTSP2EM2inKun-mingmice<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>三.日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因DNA疫苗的構(gòu)建1實(shí)驗(yàn)材料pVAXl真核表達(dá)載體購(gòu)自Irwitrogen公司。其它同前述。2SjTSP2/pVAXl重組質(zhì)粒的構(gòu)建將前述制備的TSP2/pMD18-T、pVAXl載體分別用HindIII，EcoRI酶切后，用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線(xiàn)性質(zhì)粒DNA。取2pl質(zhì)粒載體DNA、3^1目的基因、lpl10XRapidLigationBuffer、T4DNA連接酶，3ulddH20，總體積為10)al，混勻后，4t:連接過(guò)夜。取5ial連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基上，37。C溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行小量培養(yǎng)，小抽質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖9)和PCR鑒定(圖IO)。將鑒定陽(yáng)性克隆送奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序分析結(jié)果表明，SjTSP2正確插入pVAXl真核表達(dá)載體。序列表SEQIDNO.1本發(fā)明所述日本血吸蟲(chóng)膜蛋白的基因TSP2具有下列序列:atgagattccctta犯atcatggcactcgggtgtgg咖caagtgtttgcagtgtttgct60犯ttattttt犯ttctggagtgtttstatgtgg組tgggttg3ttgttgttggagcact120tgggctccactctactgtaaatcactggaaagaactcgaccctccactccagtcactgat180attgcccttggeitgcttcctatttgtxt"tagtatgtttgg240tgcttgtaca犯gaMgtttgctt3tta^ctacgtattgcatcctcttgtcaMtttaat3003atcgctcagatagc"tgc兆g犯tatatgcaataatag肌犯gccg犯gg360tgtcactacagc3ttaaaagaccttgtaggacaatocgg3C8cga^gacacttagacaa420agttttggscga^ttca^gataaattacaatgttgtggtgccgaatcgcctgctgatta480ttctcg兆gaccacctccatttataatgagggatgcattggtaaagtcac540cgatctgactt肌atgccacgtatttata/tttgcgttact600aca肌tgatttgtctagtattcgc敏gtgtgttcttatggctataaaacgaggcgatg3660agtagac犯aaagcaacacgcaaccttaaatax^gtgstctcaaataaaa720actgtaacattgaattgc肌77權(quán)利要求1.一種日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)方法，其特征在于所述日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因具有如下序列atgagattcccttaaaatcatggcactcgggtgtggatacaagtgtttgcagtgtttgct60aattatttttaattctggagtgtttatatgtggaattgggttgattgttgttggagcact120tgggctccactctactgtaaatcactggaaagaactcgaccctccactccagtcactgat180tatatttatcattgcccttggatgcttcctatttgtcttaggcgccttgggtatgtttgg240tgcttgtacaaagaatgtttgcttattaactacgtattgcatcctcttgtcaattttaat300aatcgctcagatagctgcaggaatatatgcaataatagaaaagccgaaggtgaaaagaca360tgtcactacagcattaaaagaccttgtaggacaatacggacacgatagacacttagacaa420agttttggacgaaattcaagataaattacaatgttgtggtgccgaatcgcctgctgatta480ttctcgaggaccacctccatcatgtaagaattataatgagggatgcattggtaaagtcac540cgatctgactaaaaagcacctaaatgccaccatagttacagtatttatatttgcgttact600acaaatgatttgtctagtattcgcagtgtgtgttcttatggctataaaacgaggcgatga660tgaatagatcagtagacaaaaagcaacacgcaaccttaaatacagtgatctcaaataaaa720atatctggaatataaaaaaaaacaaattatactgtaacattgaattgcaaaataat776。2、一種權(quán)利要求1所述日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)據(jù)SjTSP2第二個(gè)膜外區(qū)SjTSP2EM2兩端序列設(shè)計(jì)引物，并在其擴(kuò)增序列的5'端和3'端分別引入EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到含第二個(gè)膜外區(qū)SjTSP2EM2的基因片段；(2)將SjTSP2EM2的基因定向克隆至原核表達(dá)載體pET28c(+)及pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2;(3)將上述兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，并在LB固體劃培養(yǎng)基線(xiàn)挑單菌落制備菌種，將菌種接種于LB培養(yǎng)基，用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集細(xì)菌后，按非變性條件下His親合層析操作流程純化重組抗原rSjTSP2EM2/HIS和用純化GST融合蛋白的方法純化SjTSP2EM2/GST重組蛋白。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于表達(dá)的是第332位到第574位核苷酸編碼第二個(gè)跨膜區(qū)EM2，對(duì)應(yīng)的蛋白是第105位到第185位氨基酸。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌Rosetta(DE3)，原核表達(dá)質(zhì)粒為pET28c(+)，表達(dá)的重組蛋白是帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌Rosetta(DE3)，原核表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-4T-2，表達(dá)的重組蛋白是帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達(dá)質(zhì)粒為pVAXl。7、一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在制備防治血吸蟲(chóng)病的疫苗中的應(yīng)用。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種防治日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在制備防治血吸蟲(chóng)病的疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫用重組蛋白是帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種防治日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在制備防治血吸蟲(chóng)病的疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫用重組蛋白是帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種防治日本血吸蟲(chóng)膜TSP2基因在制備防治血吸蟲(chóng)病的疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫疫苗為日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2的DNA疫苗。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2的基因序列、日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)、日本血吸蟲(chóng)膜蛋白基因TSP2的DNA疫苗構(gòu)建，及其在制備防治血吸蟲(chóng)病疫苗中的應(yīng)用。Western-blotting實(shí)驗(yàn)顯示重組抗原可被日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原免疫小鼠血清識(shí)別，而載體表達(dá)蛋白不與抗體發(fā)生反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性。文檔編號(hào)C12N15/09GK101397558SQ20071004663公開(kāi)日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年9月29日優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日發(fā)明者傅志強(qiáng),馮新港,劉金明,姚利曉,楊健美,林矯矯,王欣之,苑純秀申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所