專利名稱：siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋 白融合靶基因表達(dá)載體。 現(xiàn)有技術(shù)
RNA干擾(RNAinterference, RNAi)技術(shù)是涉及基因功能、基因治療、 藥物靶分子篩選等領(lǐng)域的重要研究手段。其中，篩選具有生物活性的小干擾 RNA ( small interference RNA, siRNA)是RNAi技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。目前， 商品化的RNAi篩選系統(tǒng)以lac為報告基因，與耙基因序列重組構(gòu)建融合基 因表達(dá)載體。
(1)目前有invitrogen公司開發(fā)的商品化的RNAi目標(biāo)篩選系統(tǒng) ——BLOCK-IT RNAi目標(biāo)篩選系統(tǒng)。該篩選系統(tǒng)工作原理為從任一 Gateway 中間載體或Ultimate ORF克隆.重組目的基因到 pSCREEN-IT/lacZ-DEST Gat,eway載體，并使用RNAi抑制試劑進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。 表達(dá)基因?qū)⑴clacZ融合。通過分析檢測e-半乳糖苷酶的活性，將產(chǎn)生的結(jié) 果與從qRT-PCR獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。P -半乳糖苷酶水平是目的基因RNAi 誘導(dǎo)降解量的指示劑，P-半乳糖苷酶的水平越低，介導(dǎo)RNAi試劑的效果就 越好。該篩選系統(tǒng)的不足之處在于需要的實驗步驟與實驗試劑過多，不能 直接從細(xì)胞內(nèi)檢測到篩選效果，而需要單獨的半乳糖苷酶量化試劑盒，步驟 繁多，而且價格昂貴，不適于大面積推廣(2) Xiu-Min ZHOU, Ju-Sheng LIN, Yi SHI，et al.Establishment of a Screening System for Selection of siRNA Target Sites Directed against Hepatitis B Virus Surface GeneJ.Acta Biochimica et Biophyska Sinica2005, 37(5): 310"316.該文獻(xiàn)研究的siRNA篩選系統(tǒng)的原理是擴(kuò)增目的基因， 在其引物5'端分別設(shè)計///^////和/^"/兩個內(nèi)切酶位點，并將其重組入pGEM-T 載體中，即構(gòu)成篩選psiRNA-HBs的載體pHBs-EGFP，將psiRNA-HBs和 pHBs-EGFP共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡檢測HBs-GFP融合蛋白的 表達(dá)來判斷有效的psiRNA-HBs。該文獻(xiàn)存在的問題是其表達(dá)載體上用于連 接目的基因的兩個內(nèi)切酶位點是隨機(jī)選用的，不能實現(xiàn)商品化生產(chǎn)。 發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的就是提供siRNA篩選系統(tǒng)的 通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，通過檢測熒光強度可以非常方便 快速地鑒定相應(yīng)siRNA序列的沉默效果，從而篩選出最有效的siRNA序列。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明包括該載體以pEGFP-Cl載體 為基礎(chǔ)，在1336-1363 ^造SSe8387I和Notl兩個內(nèi)切酶位點，其竿體大小 為4695bp，載體命名為pEGFP-RNAi，序列,如下1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACG&GGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCGSI CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGOCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT121 GACGTCAATA ATGAGGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATT&ACGTCA181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCJL CTTG&CAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA301 CATGACCTTA T&GGACTTTC CTACTTG&CA GTACATCTAC GTATTA&TCA TCGCTATTAC3" CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGC&GTTTG ACTCACGGGG421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TG&GAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGTS41GTCTATATAATTTAGTGAACGCTAGCGCTA60JLGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGSSIAAACGGCCAC721GATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAA781CCCTGC'CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCCCGCTACCCC841GACCACATGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTA301CGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC361GGCGACACCCTGGTGAACCGAAGGGCATCGACTTCAAGGA1021GTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATAT10S1GGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA1141GTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGCGTGCTGCTG1201CCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAARACCCCAACGAGAA&CGCGTTCGTGACCGCCGCC&GGATCACTCTCGG1321CTGTACAAGTAGGGAATTCCCGCATTCTAGATAACTGATC1381ATAATCAGCCATACCACATTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTC1441CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCT1S01TATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTJlGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAG&CC&AAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAA1741TGTTGTTCCAGTTTGGAACAATTAAAGAACGTGGACTCCA1801GCGAAAAACCGTCTATCAGGACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTT18S1TTTGGGGTCGAAGCACTAAATC&GAACCCTCCCGATTTAG13211381GCGCTGGCAAGTAACCACCACACCCGCCGC2041GCTTAATGCGTGGCACTTTT2101CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC2701 CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT27S1 GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG2821 CGCAGCTGTG CTCGAC&TTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT2SS1 GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC2341 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC3001 GAAJLCATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA30" TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG3121~CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT3181 GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCG&ACCG3241CTACCCGTGA3301TGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGC33S1TCGCCTTCTTGACGAGTTCT3421ACGCCCAACCTGCCATCJlCG3481TTCGGAATCGTTTTCCGGGA3S41"GTTCTTCGCCCACCCTAG3S01AATAAAAAGAGTTCATAAAC3721AATACGCCCGCGTTTCTTCCTATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGG&C C&CTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA ACTCTGGGGT TCGAAATGAC CGACCAAGCG TCCACCGCCG CCTTCTATGA AAGGTTGGGC ATGATCCTCC AGCGCGGG&A TCTCATGCTG ACTGAAACAC GGAAGGAGAC AATACCGGAA CAGAATAAAA CGCACGGTGT TGGGTCGTTT TGGCACTCTG TCGATACCCC ACCGAGACCC TTTTCCCCAC CCCACCCCCC AAGTTCGG&T3781 GAAGGCCCAG GGCTCGCAGC CAACGTCGGG GCGGCAGGCC CTGCCATAGC CTCAGGTTAC3841 TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG3901 ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG3961 TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC4021 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG4081 CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC JUATACTGTC4141 CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC4201 CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACCGGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT4SS1ATTACCGCCA TGCAT所述的pEGFP-RNAi載體1336-1343為SSe8387I內(nèi)切酶位點 CCTGCAGG，pEGFP-RNAi載體1356-1363為Notl內(nèi)切酶位點GCGGCCGC。本發(fā)明對pEGFP-Cl載體進(jìn)行了改造(命名為pEGFP-RNAi)，增加了人 類基因組中罕見的內(nèi)切酶位點SSe8387I和Notl酶切位點。該設(shè)計將保證新 型pEGFP-RNAi載體在人類基因組siRNA設(shè)計中的通用性。同時，設(shè)計了與 之配套的攜帶SSe8387I和Notl酶切位點上、下游引物的接頭，保證siRNA 靶基因片段方便地插入新型pEGFP-RNAi載體。本發(fā)明構(gòu)建的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，可以通過檢測 熒光強度非常方便快速地鑒定相應(yīng)siRNA序列的沉默效果，從而篩選出最有 效的siRNA序列。本發(fā)明在成功構(gòu)建通用性綠色熒光蛋白融合耙基因表達(dá)載 體后，用一條針對MAPK基因的siRNA來驗證該載體是否能正常工作。結(jié)' 果顯示不同濃度siRNA與通用性綠色熒光蛋白融^ MAPK基因衷達(dá)載體 共轉(zhuǎn)染后，用激光共聚焦顯微鏡檢測到在各siRNA濃度組，細(xì)胞內(nèi) MAPK-GFP融合蛋白的表達(dá)量均有不同程度的下降。證實該通用性綠色熒光 蛋白融合耙基因表達(dá)載體可以成為siRNA的篩選系統(tǒng)。


圖l是通用性綠色熒光蛋白融合耙基因表達(dá)載體示意圖及其內(nèi)切酶位點
詳細(xì)序列(插入的兩個新的內(nèi)切酶位點位置在1336-136b); 圖2 (A)為MAPK的PCR產(chǎn)物； 圖2 (B)為pMAPK-EGFP的雙酶切結(jié)果；圖3是具體實施例中對照組及通用性綠色熒光蛋白融合MAPK表達(dá)載體 與siRNA共轉(zhuǎn)染各組激光共聚焦圖像；圖3 (A)熒光對照組；圖3 (B) siRNA5nM組； 圖3 (C) siRNA10nM組；圖3 (D) siRNA25nM組； 圖3 (E) siRNA50nM組。 圖4是具體實施例中流式細(xì)胞熒光檢測結(jié)果；圖4 (A)細(xì)胞空白組；圖4 (B)細(xì)胞熒光對照組；圖4 (C) siRNA 50nM組；圖4 (D) siRNA 25nM組； 圖4 (E) siRNA10nM組；圖4 (F) siRNA5nM組。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實施方式
siRNA篩選系統(tǒng)的通用,綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，包括孕用 性綠.色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體、感受牽細(xì)菌、質(zhì)粒提取試劑盒、 HEK293細(xì)胞。參照圖1所示，包括通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，該載體 以pEGFP-Cl載體為基礎(chǔ)，包括人巨細(xì)胞病毒CMV啟動子，增強的綠色熒 光蛋白基因EGFP，單純皰疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信號，SV40 早期啟動子組成元件，在1336-1363增加SSe83871和Notl兩個內(nèi)切酶位點， 其載體大小為4695bp，載體命名為pEGFP-RNAi。 SiRNA篩選流程
1) 設(shè)計目標(biāo)基因的PCR引物針對pEGFP-RNAi載體的SSe83871和NotI 酶切位點，設(shè)計靶基因PCR引物。在上游引物5，端增加CCTGCAGG(SSe83871酶切位點)，下游引物5'端增加GCGGCCGC (Notl酶切位點)。
2) PCR擴(kuò)增靶基因片斷。
3) 通過TA克隆，把目的基因連接到T載體，測序確認(rèn)。
4) 雙酶切重組T載體及pEGFP-RNAi，電泳分離并提取靶基因和線型 pEGFP-RNAi，連接耙基因和線型pEGFP-RNAi，綠色熒光報告-耙基 因載體(融合基因載體)，測序確認(rèn)。
5) 將融合基因載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，形成siRNA篩選系統(tǒng)(靶基因與 GFP融合蛋白的表達(dá)率與siRNA的有效率成反比)。
6) 根據(jù)siRNA設(shè)計原則(遺傳2006， 28 (11 ) 1457-61)設(shè)計多條siRNA 序列，化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄后備用。
7) 應(yīng)用篩選出的有效siRNA轉(zhuǎn)染融合基因載體-HEK293細(xì)胞，以激光共 聚焦顯微鏡、^光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測siRNA沉默效，果。
MAPK-EGFP熒光報告載體構(gòu)建及有效siRNA的篩選驗證實驗?zāi)康臉?gòu)建MAPK-EGFP熒光報告載體并利用此系統(tǒng)快速篩選驗證有效的siRNA序列。
實驗步驟
1) MAPK基因片斷的獲取提取正常人小腸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的 MAPK基因序列(NM—002745)設(shè)計引物，'序列為sense: 5， gcgcctgcagggggtgtagaggtaaccagtagc 3，(含SSe8387I酉每切位點)，antisense: 5， cccgcggccgcgttcaggaggatgaggagatg 3，(含NotI酶切位點)；PCR后將產(chǎn)物連入 pMD19-T載體并酶切鑒定陽性克隆。2) pMAPK-EGFP熒光報告載體構(gòu)建及鑒定將MAPK重組T載體及pEGFP-RNAi分別用SSe8387I及Notl雙酶切，凝膠電泳后分別回收純化酶切片斷，通過T4連接酶16'C連接過夜后，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10菌株中擴(kuò)增，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定重 組子并測序確認(rèn)。3) 針對MAPK基因的siRNA序列的設(shè)計與合成綜合最新的各種有效siRNA序列的設(shè)計原則，通過siRNA設(shè)計系統(tǒng)軟件 選擇針對MAPK基因的特異性干擾區(qū)域(目標(biāo)區(qū)域為MAPKcDNA: 5， GGCACCTGACTTGTAAAAA3')，再根據(jù)Ambion公司的Silencer siRNA轉(zhuǎn) 錄試劑盒說明書合成siRNA轉(zhuǎn)錄模板，序列為sense, 5， aatttttacaagtcaggtgcccctgtctc 3 ， ， antisense ， 5 ， aaggcacctgacttgtaaaaacctgtctc 3 ，。4) 熒光報告載體與siRNA共轉(zhuǎn)辯入HaLa細(xì)胞待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增殖期，通過脂質(zhì)體2000把pMAPK-EGFP重組質(zhì)粒及 siRNA共轉(zhuǎn)染入HaLa細(xì)胞，siRNA干擾組設(shè)4個濃度5nM， 10nM， 25nM及 50nM。轉(zhuǎn)染后24小時檢測熒光強度變化。5) 激光共聚焦檢測熒光強度置爬片于24孔板內(nèi)并種植Hala細(xì)胞，24小時后用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染熒光報 告載體及siRNA， 4小時后換全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，PBS洗滌細(xì)胞2次后
取出爬片于激光共聚焦顯微鏡下觀測熒光強度。 6)流式細(xì)胞儀檢測熒光強度種植HaLa細(xì)胞于6孔板內(nèi)，24小時后用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染熒光報告載體 及siRNA， 4小時后換全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，胰酶消化并用PBS洗漆細(xì)胞 2次，用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白表達(dá)情況。 實驗結(jié)果1) 熒光報告系統(tǒng)pMAPK-EGFP載體的構(gòu)建參照圖2 (A)、圖2 (B)所示，采用RT-PCR成功地從人小腸組織擴(kuò)增出 MAPK基因片斷，大小約為1.2kb。 PCR產(chǎn)物連接于pMD-T載體后雙酶切，再 與pEGFP-RNAi連接，雙酶切鑒定顯示重組成功測序結(jié)果亦顯示與NCBI上的序列一致。2) 激光共聚焦結(jié)果參照圖3所示，共轉(zhuǎn)染后24小時取出爬片檢測，以熒光對照組為標(biāo)準(zhǔn)， 固定激光共聚焦各個參數(shù)，每組各取細(xì)胞10個左右，方差分析顯示RNA干擾 各組熒光強度明顯下降，在10nM濃度組達(dá)最高降幅70X。3) 寧式細(xì)胞結(jié)果 ，參照圖4所示，以正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)各參數(shù)后，每組各獲取10000個 細(xì)胞并計數(shù)，結(jié)果顯示正常細(xì)胞有微弱熒光，熒光對照組有強熒光表達(dá)，而 各個RNA千擾組熒光表達(dá)均有明顯的下降，其中10nM及25nM具有最高熒' 光下調(diào)率達(dá)60%。上述實施例證明該系統(tǒng)可以很好的評價siRNA的千擾效果。該熒光篩選 系統(tǒng)亦可作為研究有效siRNA設(shè)計原則的良好工具。
序列表1TAGTTATTAATAGTAATCAAATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAACCCAACGACCCCCGCCCATT121GACGTCAATATTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA181AAACTGCCCACATCAAGTGTATCATATGCC241CCTATTGACGTAAATG&CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTA301CATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACJLTCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC361CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATAGCGGTTTG421ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTGGCACCAAAATCAACG481GGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGS41GTCTATATAATTTAGTGAACSOIGCCCATCCTG6S1ACGGCGACGTAAACGGCCAC721GATGCCACCTACGGCAAGCTTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTG781CCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCCCGCTACCCC841GACCACATGACttcttCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAC'&AG301CGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC3"TGGTGAACCG1021ACGTCTATAT10S1ACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA1141GTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCC1201CCCGACAACCCACCCAGTCCAAGACCCCAAC&AGAAGCGCTCCTGCTGGAGTTCGTGACCTCACTCTCGG1321A&GGAATTCCCGCATTCTAGATAACT&ATC13S1ATJUTCAGCCTTACTTG€TTTAAAAAACCTCCCACACCTC1441CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCT1S01TATAATGGTTACAAATAAAGCAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAJUTTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCATCCCTTATAAATCAAAAGAA1741TGTTGTTCCA1801GCGAAAAACCGTCTATCAGGCCATCACCCTAATCAAGTTT1SS1TTTGGGGTCGAAGCACTAAATCGGAACCCTCCCGATTTAG1921CGAAAGGAGC19S1CACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGC2041GCTTAATGCGTGGCACTTTTTGCGCGGAAC2101CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC2701CCGGCTGTCAGCCCGGTTCTACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGCGCGGCTGCGTTCCTTG2S21CGCAGCTGTGTCACTGAAGC28S1GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCCCATCATGGC2341TCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGC3001GAAACATCGCCiLCGTACTCG30S1GAGCATCAGGTTCGCCAGGC3121CATGCCCGACTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCAT31S1GGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGC12 3241ATAGCGTTGOCTACCCGTGA3301TGACCGCTTCCTC&TGCTTTCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTA33"TCGCCTTCTTCGACCAAGCG3421ACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGA3481TTCGGAATCGTTTTCCGGGAATGATCCTCCTCTCATGCTG3S41GAGTTCTTCGCCCACCCTAG3601AATAAAAAGACAGAATAAAATGGGTCGTTTGTTCATAAACTGGCACTCTGTCGATACCCC3721CJlTTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCJLCCCCCC3781CAACGTCGGGCTGCCATAGCCTCAGGTTAC3S41TCATATATACTTTA"TTGATTTAAAACTTCATTTTTAAT3901ATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCGCGCGTAATC4021TGCT&CTT&CAAACAAAAAATTTGTTTGCC4081CTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCJLGAGCGCAGATACCAAATACTGTC41"CTTCTAGTGTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC4201CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCGATAAGTCGTGTCTTACCATTACCGCCATGCAT
權(quán)利要求
1、 siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，其特 征在于，該載體以pEGFP-Cl載體為基礎(chǔ)，在1336-1363改造SSe83871和 Notl兩個內(nèi)切酶位點，其載體大小為4695bp，載體命名為pEGFP-RNAi，序 列如下1TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGSlCTTJLCGGTJUCCCAACGACCCCCGCCCATT121GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA1S1TATTTACG&TAAACTGCCCACATCAAGTGT241AAGTACGCCCCCTATTGACGTAAATGGCCCATGCCCAGTA301CTACTTGGCAGTACATCTACTCGCTJLTTAC3S1CGGTTTTGGCA(VTACATCAAACTCACGGGG421ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTGGCACC4S1AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTCTATATAATTTAGTGAACCGTCAGATCCS01CCGGTCGCCAGCCCATCCTGSS1AAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA721GATGCCACCTTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTG7S1CCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCCCGCTACCCC841TCCGCCATGC901CGCACCATCT3S1GGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGACTTCAAGGAGGACC'GCAAC1021ATCCTGG&GCAACAGCCACAACGTCTATAT1081AAGATCCGCCACAACATCGA11"CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG1201CCCGACAACCACTACCTGAGCACFCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAATCACTCTCG&1321CTGTACAAGTCCGGACCTGCAGGGAATTCC1381'ATAATCAGCCATACCACATTTTACTTGCTTCCCACACCTC144丄CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCATTAACTTGTT1S01TJtTAAT&GTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCA1SS丄CTGCATTCTAGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGTTTTTGTTAATTTTTAACCA1SS1TCCtTTATAA1741TGTTGTTCCAGTTT&&AACAATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGG1S01GCGAAAAACCGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTT18S1TTTC'GGGTCGAAGCACTAAATCGGAACCCTCCCGATTTAG1321AGCTTGACGG1981CACCCGCCGC2041GCTTAATGCGTGGCACTTTT2101CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAiLATATGTATCCGCTCATGA <formula>formula see original document page 3</formula>
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋白融合 耙基因表達(dá)載體，其,征在于，pEGFP-RNAi載體1336-1343為，SSe8387I 內(nèi)切酶位點CCTGCAGG， 1356-1363為Notl內(nèi)切酶位點GCGGCCGC。
全文摘要
本發(fā)明公開了siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，該載體以pEGFP-C1載體為基礎(chǔ)，包括人巨細(xì)胞病毒CMV啟動子，增強的綠色熒光蛋白基因EGFP，單純皰疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信號，SV40早期啟動子組成元件，在1336-1363增加SSe8387I和NotI兩個內(nèi)切酶位點，其載體大小為4695bp，載體命名為pEGFP-RNAi。本發(fā)明通過檢測熒光強度可以非常方便快速地鑒定相應(yīng)siRNA序列的沉默效果，從而篩選出最有效的siRNA序列。
文檔編號C12Q1/68GK101121939SQ20071001785
公開日2008年2月13日 申請日期2007年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日
發(fā)明者劉利英, 宋土生, 許德暉, 辰 黃 申請人:西安交通大學(xué)