專利名稱：一種甘油三酯水解酶基因有效shRNA的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種甘油三酯水解酶基因有效ShRNA的篩 選方法。
背景技術：
RNA干擾是通過雙鏈RNA(dsRNA)介導的遺傳干涉現(xiàn)象，它能夠特異、有效地 降解mRNA，從而引起基因的沉默。自2001年《Nature》雜志上首次報道在哺乳動物 細胞中通過SiRNA成功誘導了靶基因的特異性表達沉默后，RNA干擾技術就開始作為一 項特異性基因沉默工具在哺乳動物細胞上廣泛應用。2003年Rubinson等報道用病毒系統(tǒng) 在原代培養(yǎng)的細胞、干細胞及轉基因小鼠上都取得了 RNA干擾成功，更大大擴展了這項 技術的應用范圍。目前，RNAi已發(fā)展成為調(diào)控生物基因表達的遺傳學工具，廣泛應用于 功能依賴性遺傳篩選、基因功能研究等后基因組計劃研究中，并有望成為潛在的基因治 療工具。甘油三酯(TG)是脂肪的主要存在形式，其水解過程是機體主要的能量來源。 2004年，來自于三個不同的實驗室的Zimmermann，Jenk ins和Villena等人，同時發(fā)現(xiàn) 了一種性質(zhì)相似的脂肪酶，分別命名為adiposetriglyceride lipas e (ATGL)，desnutrin和 phospholipase A2 ξ (iPLA2 ξ )，經(jīng)結構和功能研究表明這三種蛋白實為一種脂肪酶，并 將其統(tǒng)一命名為甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)。Zimmermann等對不 同物種的ATGL進行研究發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列中都存在一個GXSXG(氨基乙酸_X_絲氨 酸-X-氨基乙酸)模序，并且其中間的絲氨酸位點與ATGL的活性有關。此外，在ATGL 的N端還發(fā)現(xiàn)一個α/β折疊區(qū)域(COG1752)和一個Patatin結構域(PfamO 1734)，這些 結構都是與脂肪酶活性密切相關的保守性區(qū)域。對ATGL缺陷型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi) 脂肪組織含量明顯提高，并且在多個組織中表現(xiàn)出甘油三酯堆積的現(xiàn)象；同時，心臟由 于堆積過量脂質(zhì)，引起心臟功能紊亂，并最終導致死亡。在動物細胞中應用RNA干擾技術的另一關鍵在于有效SiRNA序列的篩選。但 是截至目前，篩選有效的RNAi的序列繼而構建其腺病毒載體，尚屬空白。因此，現(xiàn)有技術存在缺陷，需要改進完善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種甘油三酯水解酶 基因有效ShRNA的篩選方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟Al 編碼目的ShRNA的單鏈DNA寡核 苷酸片段的設計、合成；Α2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構建；A3 pDsRedl-Cl-ATGL載體的構建；A4 shRNA有效序列的篩選。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟Al具體執(zhí)行以下操作根據(jù)本實驗室克隆 得到的西農(nóng)薩能羊ATGL序列，設計三條ATGL-siRNA及1條陰性對照序列，在siRNA基礎上，將19bp的寡核苷酸以正反向組合，中間添加GAGTACTG的發(fā)夾環(huán)序列間隔， 使寡核苷酸內(nèi)部形成發(fā)夾結構，每對寡核苷酸兩端分別帶有BamH I和Xho I酶切位點， 其中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號，得到ShRNA的正、反義鏈模板。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A2具體執(zhí)行以下操作A21:單鏈寡核苷 酸退火反應生成雙鏈；將合成的單鏈寡核苷酸序列用滅菌無離子水溶解成濃度為200 μ M 的溶液，然后進行退火反應，退火條件是95°C X4分鐘，取出置室溫逐漸冷卻，即獲 得濃度為50 μ M的雙鏈寡核苷酸序列，分別標記為ds422、ds600、dsll48 ；再分別取 少量稀釋成濃度為5nM的工作濃度，A22 連接反應-構建穿梭載體；用BamH I及Xho I雙酶切PRNTR/CMV-GFP/U6載體并切膠回收，然后將所述ds422、所述ds600和所述 ds 1148分別與pRNTR/CMV-GFP/U6載體酶切回收產(chǎn)物連接反應，反應條件為4°C連接 過夜，得到連接產(chǎn)物；A23:連接產(chǎn)物轉化；取10 μ L所述連接產(chǎn)物加入100 μ L感受 態(tài)DH5a細菌，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，置冰浴12分鐘，加入600 μ L LB培養(yǎng) 液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45分鐘，將細菌涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的瓊脂平板上，置 于37°C溫箱孵育；A24:篩選穿梭載體克隆。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述連接反應體系為如下PENTRTM/U6，2yL； ds oligos (5nM)，IyL ； 5X 退火緩沖液，4yL; T4DNA 連接酶，IyL;不含 DNase/ Rnase 的水，12 μ L ；總體積 20.0 μ L。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟Α24具體執(zhí)行以下操作(1)穿梭載體克隆 的質(zhì)粒酶切鑒定ds oligos的黏性末端與試劑盒提供的線性載體pENTRTM/U6的黏性末 端互補，經(jīng)連接反應后，形成環(huán)形質(zhì)粒；于卡那霉素瓊脂平板上挑取單克隆菌落，轉種 于4mL的含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時，取菌液2mL 提取質(zhì)粒，大小符合的再進行Sca I及EcoR V雙酶切鑒定，產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電 泳觀察；(2)穿梭載體克隆的測序鑒定取(1)中雙酶切鑒定正確的單克隆菌液，送南京 金思瑞生物技術有限公司以ABI377型DNA自動熒光序列分析儀進行序列測定，引物為 測序引物U6或M13。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A3具體執(zhí)行以下操作A31:構建 pDsRedl-Cl-ATGL克隆載體；將回收的目的基因片段與pGM-Τ載體連接，16°C保溫過 夜，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)E.C0liDH5ci菌株，涂布于含氨芐青霉素和X-gal/IPTG的LB培 養(yǎng)平皿中，于37°C培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落搖菌，同時進行菌落PCR，反應結束后取 10 μ L反應液進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽性克隆菌液利用堿裂解法抽提質(zhì)粒，然 后用Xho I和Sal I內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，酶切反應體系如下10 XH Buffer，2.0 μ L ； Xho I，0.7 μ L ； Sal I，0.7 μ L ； pGM-T-gATGLlAl, 10.0 μ L ； ddH20, 6.6 μ L ；總體 積20.0yL; 37°C水浴反應過夜，取全部反應液在瓊脂糖凝膠上電泳，回收帶有設計 酶切位點的目的基因片段；A32:構建pDsRedl-Cl-ATGL表達載體。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A 32具體執(zhí)行以下操作(1)配制 pDsRedl-Cl酶切反應體系并進行37°C水浴反應過夜；(2)酶切反應結束后，取全部反應 液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收pDsRedl-Cl載體酶切后的線性化片段；(3)將載體片 段與目的基因片段連接，16°C反應過夜；(4)將pDsRedl-Cl-ATGL轉化至E.coli DH5 α 感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的平皿，37°C孵育過夜，挑取單菌落搖菌，同時進行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述酶切反應體系為IOXH Buffer，2.0 μ L ； Xho I，0.7 μ L ； Sal I，0.7 μ L ； pDsRedl—Cl—ATGL，5.0 μ L ； ddH20, 11.6 μ L ；總體積 20.0 μ L。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟Α4具體執(zhí)行以下操作Α41:去內(nèi)毒素質(zhì) 粒提??；Α42 細胞的復蘇；Α43細胞傳代培養(yǎng)Α44 細胞轉染。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟Α41具體執(zhí)行以下操作(1)柱平衡向 吸附柱中加入500 μ L的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg)離心1分 鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL過夜培養(yǎng)的菌液 加入離心管中，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，吸除上清液；(3)向留有菌體沉淀的 離心管中加入500 μ L已加入RNaseA的溶液P1，使用渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉 淀；(4)向離心管中加入500 yL溶液Ρ2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解；(5) 向離心管中加入700 yL溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，出現(xiàn)白色絮 狀沉淀，12000rpm(13400Xg)離心10分鐘，在離心管底部形成沉淀，收集上清液；(6) 將(5)中收集的上清液分次加入過濾柱，過濾柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg)離 心2分鐘，將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7) 12000rpm(13400Xg)離 心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μ1去 蛋白液，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管 中；(9)按照3倍體積向漂洗液中加入無水乙醇，向吸附柱中加入700 μ L所述漂洗液， 12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(10) 向吸附柱中加入500μ 漂洗液，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢 液；(11)將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，將吸附柱中 殘余的漂洗液去除；(12)將吸附柱置于一干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴 加100-300 μ L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm(13400 Xg)離心1分鐘后將質(zhì)粒 溶液收集到離心管中。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A42具體執(zhí)行以下操作(1)從液氮罐中取 出1支凍存的HEK293細胞，立即放入38°C水浴鍋中，至細胞完全融化；(2)將凍存管內(nèi) 容物轉入IOmL離心管中，加入4mL含10%FBS&DMEM，洗脫凍存時加入的DMSO ； (3) 1400rpm,離心10分鐘，棄掉上清液；(4)加入2.0mL含10% FBS的DMEM，吹勻， 轉移入塑料培養(yǎng)瓶中，在所述離心管中再次加入2.0mL含10% FBS的DMEM，吹勻， 將殘余細胞轉入所述塑料培養(yǎng)瓶中；(5)擰松培養(yǎng)瓶瓶蓋，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A43具體執(zhí)行以下操作(1)將培養(yǎng)瓶內(nèi)培 養(yǎng)基吸棄，加入ImL培養(yǎng)基清洗后吸棄，以除去血清；(2)加入ImL 0.25%的ATV，置 于鏡下觀察，當細胞飽滿后吸棄ATV ； (3)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹打貼壁 細胞，使細胞均勻分散，將細胞懸液分裝至2-3個新培養(yǎng)瓶中，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。所述的方法，其中優(yōu)選的，所述步驟A44具體執(zhí)行以下操作將低血 清Opti-MEM培養(yǎng)液及LipofectamineTM2000于室溫條件下平衡；按2 1比例將Lipofectamine 2000及質(zhì)粒分別加入250 μ L低血清Opti-MEM中，輕彈管壁使混勻，室 溫靜置5min，將質(zhì)粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入LipofectamineTM2000低血清 Opti-MEM混合物中，輕彈管壁使之混勻，室溫孵育20min;將轉染復合物均勻、緩慢地 加入細胞培養(yǎng)皿中，輕旋培養(yǎng)皿混勻液體，將細胞放入37°C細胞培養(yǎng)箱孵育。
本發(fā)明在構建重組腺病載體之前先在HEK 293細胞中驗證所設計序列的干擾 效果，以節(jié)省時間及成本，將干擾載體及靶基因表達載體分別用綠色熒光和紅色熒光標 記，共轉染HEK 293細胞，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光及紅色熒光的強度就可以 判斷干擾載體的轉染效率及靶基因的干擾效率，由于采用紅光和綠光兩種不同熒光分別 標記干擾載體及靶基因，使得干擾序列篩選過程省時高效，結果更直觀可靠，而且可以 同時篩選多條序列。


圖1為pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA質(zhì)粒凝膠電泳分析圖2 為 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 酶切鑒定圖3為pGM-T-ATGL雙酶切鑒定圖4為pDsRedl-CI-ATGL陽性轉化子的PCR鑒定；圖5 為 pDsRedl-CI-ATGL 酶切鑒定；圖6為RNA干擾序列的篩選(200X)，其中A組、B組、C組、D組分別為 shRNA-NC、shRNA-422、shRNA-1148、shRNA-600 序列的干擾效果檢測；1 (Al、 Bi、Cl、Dl)、2(A2、B2、C2、D2)分另Ij 為 pENTR/CMV_GFP/U6-shRNA 干擾 載體與pDsRedl-Cl-ATGL靶基因表達載體共轉染HEK 293細胞48小時后熒光顯微 鏡下綠色熒光及紅色熒光表達情況；3(A3、B3、C3、D3)為對照組，即單獨轉染 pDsRedl-Cl-ATGL靶基因表達載體48小時后熒光顯微鏡下紅色熒光表達情況。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。第一步編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設計、合成；根據(jù)本實驗室克隆得到的西農(nóng)薩能羊ATGL序列，利用在線SiRNA選擇 程序(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php)設計三條 ATGL—siRNA 及 1 條陰性對照序列，艮口 s i RNA-422 TCCGGAGCTGCCTGCTGAA(SEQID NO 1) ； siRNA-600 CCTCATCCCCCCTTCCTTC (SEQ ID NO 2) ； siRNA-1148 CCACGGCCATGATGGTGCC (SEQ I D NO 3)； 陰性對照 siRNA-NC ACTACCGTTGTTATAGGTG (SEQ ID NO 4)。在 siRNA 基礎上，將 19bp 的寡核苷酸以 正反向組合，中間添加0八0丁八^^(含3(^1酶切位點，以便載體構建中進行鑒定)的發(fā) 夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸內(nèi)部可形成發(fā)夾結構，每對寡核苷酸兩端分別帶有BamH I和 Xho I酶切位點，其中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號，即得到ShRNA的正、反義 鏈模板，見表1 表IATGL特異的編碼ShRNA的寡核苷酸序列
權利要求
1.一種甘油三酯水解酶基因有效ShRNA的篩選方法，其特征在于，包括以下步 驟Al:編碼目的ShRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設計、合成；A2 : pENTR/ CMV-GFP/U6-shRNA 載體的構建；A3: pDsRedl-Cl-ATGL 載體的構建；A4 shRNA有效序列的篩選。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al具體執(zhí)行以下操作根據(jù) GenBank公布的西農(nóng)薩能羊ATGL序列，設計三條ATGL-siRNA及1條陰性對照序列， 在SiRNA基礎上，將19bp的寡核苷酸以正反向組合，中間添加GAGTACTG的發(fā)夾環(huán)序 列間隔，使單鏈DNA寡核苷酸內(nèi)部形成發(fā)夾結構，每對單鏈DNA寡核苷酸兩端分別帶 有BamH I和XhoI酶切位點，其中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號，得到shRNA 的正、反義鏈模板。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟A2具體執(zhí)行以下操作 A21 單鏈DNA寡核苷酸退火反應生成雙鏈；將合成的單鏈DNA寡核苷酸序列用滅菌無 離子水溶解成濃度為200 μ M的溶液，然后進行退火反應，退火條件是95°CX4分鐘， 取出置室溫逐漸冷卻，即獲得濃度為50 μ M的雙鏈寡核苷酸序列，分別標記為ds422、 ds600、dsll48 ；再分別取少量稀釋成濃度為5nM的工作濃度，A22 :構建穿梭載體；用 BamHI及XhoI雙酶切pRNTR/CMV-GFP/U6載體并切膠回收，然后將所述ds422、所 述ds600和所述dsll48分別與pRNTR/CMV-GFP/U6載體酶切回收產(chǎn)物連接反應，反應 條件為4°C連接過夜，得到連接產(chǎn)物；A23:連接產(chǎn)物轉化；取IOyL所述連接產(chǎn)物加入 100 μ L感受態(tài)DH5 α細菌，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，置冰浴12分鐘，加入600 μ L LB培養(yǎng)液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45分鐘，將細菌涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的瓊脂平板 上，置于37°C溫箱孵育；A24:篩選穿梭載體克隆。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述連接反應體系為如下 pENTRTM/U6, 2 μ L ； ds oligos (5nM)，1 μ L ； 5 X 退火緩沖液，4 μ L ； T4DNA 連接 酶，IyL;不含 DNase/Rnase 的水，12yL;總體積 20.0 μ L
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟Α24具體執(zhí)行以下操作 (1)穿梭載體克隆的質(zhì)粒酶切鑒定ds oligos的黏性末端與試劑盒提供的線性載體 PENTRTM/U6的黏性末端互補，經(jīng)連接反應后，形成環(huán)形質(zhì)粒；于卡那霉素瓊脂平板上 挑取單克隆菌落，轉種于4mL的含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng) 12-16小時，取菌液2mL提取質(zhì)粒，大小符合的再進行Sca I及EcoR V雙酶切鑒定，產(chǎn) 物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察；(2)穿梭載體克隆的測序鑒定取(1)中雙酶切鑒定 正確的單克隆菌液，送測序公司以ABI377型DNA自動熒光序列分析儀進行序列測定， 引物為測序引物U6或M13。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A3具體執(zhí)行以下操作 A31 構建pDsRedl-Cl-ATGL克隆載體；將回收的目的基因片段與pGM_T載體連 接，16°C恒溫過夜，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)E.C0liDH5ci菌株，涂布于含氨芐青霉素和 X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)平皿中，于37°C培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落搖菌，同時進行菌落 PCR,反應結束后取IOyL反應液進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽性克隆菌液利用 堿裂解法抽提質(zhì)粒，然后用Xho I和Sal I內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，酶切反應體系如下 IOXH Buffer, 2.0 μ L ； Xho I, 0.7 μ L ； Sal I, 0.7 μ L ； pGM-T-gATGLlAl, 10.0 μ L ；ddH20, 6.6uL ；總體積20.0μ ; 37°C水浴反應過夜，取全部反應液在1 %瓊脂糖凝膠 上電泳，回收帶有設計酶切位點的目的基因片段；A32:構建pDsRedl-Cl-ATGL表達載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟A32具體執(zhí)行以下操作(1) 配制pDsRedl-Cl酶切反應體系并進行37°C水浴反應過夜；(2)酶切反應結束后，取全 部反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收pDsRedl-Cl載體酶切后的線性化片段；(3)將 載體片段與目的基因片段連接，16°C反應過夜；(4)將pDsRedl-Cl-ATGL轉化至E.coli DH5a感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的平皿，37°C孵育過夜，挑取單菌落搖菌，同時進 行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶切反應體系為IOXHBuffer， 2.0 μ L ； Xho I, 0.7 μ L ； Sal I, 0.7 μ L ； pDsRedl—Cl—ATGL，5.0μ L ； ddH20, 11.6μ L ；總體積 20.0 μ L。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A4具體執(zhí)行以下操作 A41 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提?。籄42 細胞的復蘇；A43細胞傳代培養(yǎng)A44 細胞轉染。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟A41具體執(zhí)行以下操作(1) 柱平衡向吸附柱中加入500 μ L的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg) 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL過夜培 養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，吸除上清液；(3)向留有菌體 沉淀的離心管中加入500 μ L已加入RNaseA的溶液Ρ1，使用渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細 胞沉淀；(4)向離心管中加入500 μ L溶液Ρ2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解；(5)向離心管中加入700yL溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，出現(xiàn)白色 絮狀沉淀，12000rpm(134(K)Xg)離心10分鐘，在離心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)將(5)中收集的上清液分次加入過濾柱，過濾柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg) 離心2分鐘，將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7) 12000rpm(13400Xg) 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μ1 去蛋白液，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集 管中；(9)按照3倍體積向漂洗液中加入無水乙醇，向吸附柱中加入700yL所述漂洗 液，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中； (10)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000rpm(13400Xg)離心1分鐘，倒掉收集管中的 廢液；(11)將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，將吸附柱 中殘余的漂洗液去除；(12)將吸附柱置于一干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空 滴加100-300 μ L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm(13400 Xg)離心1分鐘后將質(zhì) 粒溶液收集到離心管中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘油三酯水解酶基因有效shRNA的篩選方法，其包括以下步驟A1編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設計、合成；A2pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構建；A3pDsRed1-C1-ATGL載體的構建；A4shRNA有效序列的篩選；由于采用紅光和綠光兩種不同熒光分別標記干擾載體及靶基因，使得干擾序列篩選過程省時高效，結果更直觀可靠，而且可以同時篩選多條序列。
文檔編號C12N15/55GK102021190SQ20101053500
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權日2010年11月9日
發(fā)明者滕炎玲, 王偉, 羅軍, 趙旺生 申請人:西北農(nóng)林科技大學