一種內切葡聚糖酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型內切葡聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1，該內切葡聚糖酶是從粉紅粘帚霉（Gliocladium?roseum）中分離得到的。本發(fā)明的內切葡聚糖酶最適作用溫度為55℃，且在40℃-70℃范圍內能保持80%以上的酶活力；最適pH值為6.0，且在pH4.0-7.0范圍內能保持60%以上的酶活力。所述內切葡聚糖酶可廣泛應用于紡織領域，對針織面料、梭織面料和牛仔面料的處理效果顯著，還能縮短工時，降低生產成本。
【專利說明】一種內切葡聚糖酶
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于功能基因篩選【技術領域】，具體涉及一種內切葡聚糖酶及其應用。
【背景技術】
[0002]纖維素是由β -1, 4-糖苷鍵連接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最豐富且可再生的資源。據(jù)估計，地球上每年光合作用產生1.5Χ IO11億噸纖維素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多數(shù)情況下,要高值化利用纖維素首先必須通過纖維素酶對其進行有效降解。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，將纖維素降解為寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。一般將纖維素酶分為三類:(I)內切葡聚糖酶:來自真菌簡稱EG，來自細菌簡稱Len，又稱為Cl酶。這類酶作用于纖維素內部的非結晶區(qū)，隨機水解β -1, 4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量含非還原性末端的小分子纖維素。(2)外切葡聚糖酶或纖維二糖酶:來自真菌簡稱CBH，來自細菌簡稱Cex，又稱為Cx酶。這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解1，4-β -D糖苷鍵，每次切下I個纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶。(3) β -葡萄糖苷酶:簡稱BG酶。這類酶將纖維二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。
[0003]纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。一般用于工業(yè)生產的纖維素酶來自于真菌，比較典型的是木霉屬、曲霉屬和青霉屬。而不同來源的纖維素酶具有不同的酶學性質，可在不同的工業(yè)領域發(fā)揮各自的功效。因此，篩選新型的纖維素酶就具有重要的應用的價值。

【發(fā)明內容】

`[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新型內切葡聚糖酶及其應用，并采用基因工程技術手段將粉紅粘帚霉菌(Gliocladium roseum)的內切葡聚糖酶基因轉化入黑曲霉(Aspergillusniger)中，構建得到了高效表達該酶的重組菌株，從而有利于實現(xiàn)該酶的工業(yè)化生產和廣泛應用。
[0005]本發(fā)明一方面提供了一種內切葡聚糖酶，其特征在于:
[0006]I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的內切葡聚糖酶；
[0007]2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有I)中內切葡聚糖酶活性的酶。
[0008]上述的內切葡聚糖酶是從粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)中分離的。
[0009]本發(fā)明另一方面提供了編碼上述內切葡聚糖酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQID N0:2。
[0010]本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含上述編碼內切葡聚糖酶的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明還提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述內切葡聚糖酶基因的表達載體。
[0012]上述表達宿主細胞為黑曲霉(Aspergillus niger)。[0013]本發(fā)明提供了一種新型內切葡聚糖酶，并通過構建黑曲霉工程菌株，實現(xiàn)了該酶的體外表達。所述內切葡聚糖酶的最適作用溫度為55°C，且在40°C _70°C范圍內能保持80%以上的酶活力；最適PH值為6.0，且在ρΗ4.0-7.0范圍內能保持60%以上的酶活力。所述內切葡聚糖酶可廣泛應用于紡織領域，對針織面料、梭織面料和牛仔面料的處理效果顯著，還能縮短工時，降低生產成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:本發(fā)明構建的重組表達質粒pGm-1028圖譜。[0015]圖2:陽性轉化子黑曲霉ZL-2發(fā)酵液上清SDS-PAGE電泳圖，其中箭頭所指24.8KD處的蛋白條帶即為本發(fā)明所述內切葡聚糖酶。
[0016]圖3:內切葡聚糖酶相對酶活-溫度變化曲線圖。
[0017]圖4:內切葡聚糖酶相對酶活-pH變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0019]實施例1:內切葡聚糖酶基因的克隆
[0020]以粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)全基因組DNA為模板進行PCR擴增，其中PCR過程所用到的引物分別為:
[0021]正向引物:
[0022]5' -CCGCTCGAGAGGATGGCCCCTGCCCTTCAAGTTGTCT-3'；
[0023]反向引物:
[0024]5' ~TGCTCTAGATCATGCTGAAGGGAATTGTCCATCATCAGAC~3/ ；
[0025]其中下劃線處分別表示XholUXball兩個限制性內切酶的酶切位點。
[0026]PCR 擴增條件為:98°C 30s ；98°C IOs ；72°C 30s30 個循環(huán)；72°C lOmin，所用的 DNA聚合酶為Phusion DNA聚合酶；利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。
[0027]用Xhol I和Xbal I兩種限制性內切酶分別對PCR產物以及載體pGm進行酶切；運用膠純化試劑盒對這兩種酶切產物進行純化，并用T4DNA連接酶連接上述兩個酶切產物；將連接后的產物轉化大腸桿菌DH5a，用氨芐青霉素進行選擇。為確保正確，對若干個轉化子進行菌落PCR并進行測序。
[0028]測序結果顯示，上述PCR擴增產物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2 ;其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ;多個克隆的測序結果都一致。
[0029]經(jīng)NCBIBlast 比對發(fā)現(xiàn),SEQ ID NO:1 與來源于 Verticillium dahliae VdLs.17的內切葡聚糖酶同源性最高，為62%，表明本發(fā)明擴增得到的是一個編碼內切葡聚糖酶的新等位基因。
[0030]使用質粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中提取重組質粒，命名為pGm-1028 (質粒圖譜見圖1)。
[0031]實施例2重組質粒轉化黑曲霉Gl菌株及驗證[0032]吸取黑曲霉(Aspergillus niger)Gl孢子懸浮液于CMA平板中心(9cm培養(yǎng)皿)，待菌落長滿整個培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14~16h。
[0033]用無菌的Miracloth濾布收集菌體,并用solution A沖洗一次,在無菌條件下用棉簽將其轉移到40ml的裂解液中，在30°C、200rpm條件下裂解兩個小時，用顯微鏡觀察原生質體的形成情況。
[0034]用無菌的Miracloth濾布過濾上述裂解液,用兩個50ml無菌離心管收集原生質體并用solution B沖洗定容使每管大約25ml。在2000rpm條件下離心5min棄去上清,用20ml solution B對沉淀再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL solution B中，并用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)。將原生質體再次離心并棄去上清液,根據(jù)血球計數(shù)板計數(shù)結果,加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質體數(shù)目在I X IO7個/mL左右。
[0035]在冰上向預先冷卻的15ml離心管中加入100 μ L上述原生質體、10 μ L重組質粒pGm-1028、12.5μ L solution C冰浴20min。與此同時將預先配制好的上層試管MMSA融化并置于55°C水浴中。
[0036]取出冰浴中的15ml離心管，向其加入1ml solution C、2ml solution B并混勻后作為混合液。
[0037]向3個融化的上層麗SA試管中的每一個中加入1ml上述混合液混勻并立即倒于MMSA平板中，將此平板在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d直到長出轉化子。
[0038]將長出的轉化子菌株接入到二次篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至長出黑色菌落；提取菌落的基因組DNA，并按照實施例1所述PCR反應條件進行PCR擴增；通過膠回收與測序驗證，驗證結果正確的菌株即為陽性轉化子，將其中一株陽性轉化子命名為黑曲霉ZL-2(Aspergillus niger ZL-2)。
[0039]Solution A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLlM KH2PO4,48.156g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500mL，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0040]Solution B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0041]Solution C:250g PEG4000，2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0042]裂解液:將0.6g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0043]MMSA 平板:0.59g 乙酰胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma) ,0.52g KCl，1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0044]MMSA 上層瓊脂試管:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，
1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml微量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時，加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。
[0045]微量元素:在250mL dl H20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0046]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，1g蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0047]CMA液體培養(yǎng)基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，1g蛋白胨，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0048]二篩培養(yǎng)基:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH2PO4,Iml微量元素，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0049]實施例3陽性轉化子菌株的發(fā)酵驗證
[0050]挑取陽性轉化子黑曲霉ZL-2，接種于20ml TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000g條件下離心10min，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳分析。結果如圖2所示，箭頭所指24.SkDa處有一清晰的蛋白條帶，與本發(fā)明所述內切葡聚糖酶的理論分子量大小一致。
[0051]TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基:12g NaNO3,0.5g KCl, 1.5g KH2PO4, 2.05g MgSO4.7H20，3.5gNaH2PO4.H20，45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，1g吐溫80，1mL微量元素(見下)，加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的40%麥芽糖。
[0052]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0053]實施例4內切葡聚糖酶酶活測定
[0054]1、酶活測定的方法:CMC法
[0055]2、測定的原理:纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和單糖在沸水浴條件下可以與3，5- 二硝基水楊酸(DNS)試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的深度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中纖維素酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中纖維素酶的活力。
[0056]3、測定過程:取三支試管各加入0.5mlCMC底物，與待測酶液一起50°C水浴預熱5min。在第一、二試管中各加入0.5ml待測液，并計時，50°C水浴中反應15min。反應完后在三支試管中各加入1.5ml的DNS試劑，并在第三支試管中補加0.5ml的待測酶液。取出并搖勻三支試管后，在沸水浴中反應5min。迅速冷卻至室溫,用水定容至5.0ml。以第三支試管液為對照在540nm波長條件下測得第一、二試管液的吸光度。根據(jù)預先繪制的標準曲線計算出酶活力值。
[0057]4、酶活力計算:
[0058]酶活力(Iu/ml或 IU/g)=(葡萄糖等量值 /180/15/0.5) X n
[0059]式中:180—葡萄糖從微克換算成微摩爾
[0060]15—待測液與底物的反應時間
[0061]0.5—加入反應的待測酶液量
[0062]n—酶樣的稀釋倍數(shù)[0063]采用上述方法測定實施例3獲得的黑曲霉ZL-2發(fā)酵上清液，結果顯示其酶活為218.17U/ml。
[0064]實施例5酶學性質分析
[0065]1、最適作用溫度
[0066]以NaH2PO4-Na2HPO4 為緩沖溶液(ρΗ6.0 )，分別在 30°C、35 °C、40°C、45 °C、50 V、55 V、60°C、65°C、70°C、75°C、80 V條件下，測定上述黑曲霉ZL-2發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活計100%，計算相對酶活。結果如圖3所示，本發(fā)明所述內切葡聚糖酶的最適作用溫度為55°C，且在40°C _70°C范圍內能保持80%以上的酶活力。
[0067]2、最適作用pH
[0068]分別以ρΗ3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液稀釋上述黑曲霉ZL-2發(fā)酵上清液，并在55°C條件下測定其酶活，以最高酶活計100%,計算相對酶活。結果如圖4所示,本發(fā)明所述內切葡聚糖酶的最適pH值為6.0,且在PH4.0-7.0范圍內能保持60%以上的酶活力。
[0069]實施例6內切葡聚糖酶在紡織領域的應用
[0070]1、針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝
[0071]應用溫度為40-55°C;處理時間為50-150分鐘；pH范圍為5.0-8.0 ;適用的浴比范圍為1:5-1:30，使用的設備類型為溢流染色機，卷染機，水洗機等，本發(fā)明所述內切葡聚糖酶的用量為600-800U/L。
[0072]利用本發(fā)明的內切葡聚糖酶處理針織面料和梭織面料，不僅除毛干凈，而且對織物的強力損失小。`
[0073]2、牛仔面料的起花及除毛應用工藝
[0074]應用溫度為45_55°C ;處理時間為15-50分鐘；pH范圍為4.0-7.5 ;適用于單獨石磨洗條件下的除毛、起花工藝；適用的浴比范圍為1:5-1:25，使用的設備類型為工業(yè)水洗機等，內切葡聚糖酶的用量為450-800U/L。
[0075]利用本發(fā)明的內切葡聚糖酶處理牛仔面料，除毛干凈，起花均勻，花點較小，對織物強力損失小，效果明顯。
[0076]綜上，本發(fā)明的內切葡聚糖酶可廣泛應用于紡織領域，對針織面料、梭織面料和牛仔面料的處理效果顯著，還能縮短工時，降低生產成本。
【權利要求】
1.一種內切葡聚糖酶，其特征在于，所述的內切葡聚糖酶包含有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的內切葡聚糖酶； 2)在I)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有I)中內切葡聚糖酶活性的酶。
2.如權利要求1所述的內切葡聚糖酶，其特征在于，所述的內切葡聚糖酶是從粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)中分離的。
3.一種基因，其特征在于，所述基因編碼權利要求1所述的內切葡聚糖酶。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQID N0:2。
5.一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體攜帶有權利要求3所述的基因。
6.一種重組表達宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞攜帶有權利要求5所述的重組表達載體。
7.如權利要求6所述的重組表達宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為黑曲霉(Aspergillus niger )。
【文檔編號】C12N9/42GK103865905SQ201410092591
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權日:2014年3月13日
【發(fā)明者】王華明, 張亮 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所