專利名稱：通過微生物發(fā)酵含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂(long-chain poly-unsaturated fatty acid-phospholipidLCPUFA-PL)的制造方法，其特征在于，該方法包含將屬于被孢霉屬的微生物以在該微生物菌體中LCPUFA-PL大量積累的條件培養(yǎng)，且可從該微生物的培養(yǎng)物中提取LCPUFA-PL。
背景技術(shù)：
磷脂(PL)具有改善腦功能的作用、抗精神壓力的作用、降低膽固醇的作用等種種生理功能。已知的PL有多種，主要可為磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)等。這些PL具有各自不同的功能及物性。
PL中，構(gòu)成要素為碳數(shù)20以上的長鏈多不飽和脂肪酸(簡稱為LCPUFA)的磷脂(為說明方便，簡稱為LCPUFA-PL)其改善腦功能的作用強(qiáng)，比構(gòu)成要素不為LCPUFA的磷脂(從說明的方便上，簡稱為non-LCPUFA-PL)具有更強(qiáng)的作用(參照非專利文獻(xiàn)1)。具體舉例，LCPUFA例如可為二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(ARA)等。
已知非磷脂型LCPUFA衍生物也具有改善腦功能的作用(參照專利文獻(xiàn)1)。但是，非磷脂型LCPUFA衍生物的改善腦功能作用與上述LCPUFA-PL、non-LCPUFA-PL等磷脂不同，是以對大腦的海馬起作用為基礎(chǔ)的。
LCPUFA-PL改善腦功能作用優(yōu)異的理由可列舉為以下各理由，(1)是腦內(nèi)實際存在的結(jié)構(gòu)，(2)可通過血腦屏障，(3)因可不經(jīng)過肝臟而被吸收，所以不由肝臟捕捉或修飾即可到達(dá)腦等的組織。
具體說明各理由。首先關(guān)于(1)的理由，已知腦內(nèi)的LCPUFA基本以磷脂的形式存在。更具體地說，LCPUFA主要作為上述PC、PS、PE、PI等化合物存在，并在腦內(nèi)發(fā)揮各項功能。其次，關(guān)于(2)的理由，因經(jīng)口攝取標(biāo)記的磷脂后可在腦組織中檢測出標(biāo)記的磷脂，所以可證明磷脂到達(dá)了腦組織(參照非專利文獻(xiàn)2)。而且關(guān)于(3)的理由，磷脂被吸收時，在消化器官內(nèi)形成的2個脂肪酸中，1個水解后生成溶血磷脂。此溶血磷脂被小腸吸收，在小腸細(xì)胞內(nèi)再形成磷脂后被淋巴管吸收(參照非專利文獻(xiàn)3)。因此，LCPUFA-PL可不經(jīng)過肝臟而被運送到生物體的全身。
LCPUFA-PL的生產(chǎn)，以往是通過從富含此物質(zhì)的動物的內(nèi)臟器官、卵等制備或精制來進(jìn)行的。具體地說，可例舉為從牛腦中制備、從豬肝臟或魚卵中精制磷脂組分等(參照專利文獻(xiàn)2及3)?；蛘哂行┓N的海洋細(xì)菌可生產(chǎn)LCPUFA-PL(參照非專利文獻(xiàn)4)，具有生產(chǎn)花生四烯酸能力的絲狀菌可在菌體內(nèi)包含含有花生四烯酸的磷脂(參照非專利文獻(xiàn)5)。
目前，磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)法一般是從原料中提取主要成分為甘油三酯的油脂時，與該油脂同時提取。提取時的溶劑可使用正己烷等。提取的油脂中含有膠質(zhì)，此膠質(zhì)成為油脂著色、起泡的原因。因此需在脫膠工序中除去膠質(zhì)，且因在此工序中幾乎所有的磷脂均轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)中，所以通過精制該膠質(zhì)可制造磷脂。
但是，通過上述以往的技術(shù)提供的LCPUFA-PL，其供給量既不穩(wěn)定，質(zhì)量也不一定穩(wěn)定。具體地說，現(xiàn)在可獲得的LCPUFA-PL，一般來自上述動物的內(nèi)臟器官、卵黃、魚卵等。來自這些動植物油的供給源存在如下問題，由于氣象條件造成的供給量、LCPUFA含量的變化，特別是環(huán)境污染的影響等。而且以牛腦為主的動物內(nèi)臟器官在瘋牛病流行以后，其利用也陷入了非常困難的境地。因此，存在著在高效且穩(wěn)定地制造LCPUFA-PL上較為困難的問題。
使用微生物技術(shù)時，因來自海洋細(xì)菌的LCPUFA-PL中含有的主要成分是人體、動物中基本不存在的細(xì)菌特有的脂肪酸支鏈脂肪酸，所以不適于作為營養(yǎng)組合物。
另外，雖有文獻(xiàn)提議，使用生產(chǎn)花生四烯酸的絲狀菌之一耳霉屬(Conidiobolussp.)進(jìn)行LCPUFA-PL的生產(chǎn)(參照專利文獻(xiàn)4)，但也有報道指出，此菌株大量含有異肉豆蔻酸(iso myristic acid)(iso14:0)、異棕櫚酸(iso palmitic acid)(iso16:0)等的支鏈脂肪酸(參照非專利文獻(xiàn)6、非專利文獻(xiàn)7)。而且一部分菌是蟲霉目(entomophthorales)特有的真菌病[被稱為entopmophthorosis病的真菌病的一種，初見于鼻腔內(nèi)粘膜，之后向喉頭、鼻腔內(nèi)的氣管、臉頰一帶擴(kuò)散]的原因菌，具有引起健康人感染的能力(BiosafetyLevel 2)(參照非專利文獻(xiàn)8、非專利文獻(xiàn)9)。從具有向昆蟲及其他小動物的寄生性(參照非專利文獻(xiàn)10)，對人體、環(huán)境產(chǎn)生不良影響的觀點來看，不適于作為工業(yè)化使用的微生物。
目前，正在對工業(yè)化生產(chǎn)含有花生四烯酸的甘油三酯時使用的被孢霉屬(Mortierellasp.)中花生四烯酸生產(chǎn)的種種條件積極地探討，其中已報到的有通過各種礦物質(zhì)鹽的添加、培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)溫度等提高花生四烯酸的生產(chǎn)率。具體地說，已知各種礦物質(zhì)鹽的添加會影響菌體內(nèi)積累的含有LCPUFA的甘油三酯和LCPUFA-PL的生產(chǎn)率(非專利文獻(xiàn)11)。并且關(guān)于初始pH值，已有文獻(xiàn)報道(1)培養(yǎng)的最適初始pH值為6.0～6.6(非專利文獻(xiàn)11)，(2)培養(yǎng)后期通過提高pH值，可提高含有花生四烯酸的甘油三酯的生產(chǎn)量(專利文獻(xiàn)5)，但還沒有關(guān)于使磷脂組分最佳化的研究。并且關(guān)于培養(yǎng)溫度也有報道指出，低溫培養(yǎng)5日以上可增加磷脂中LCPUFA的含量(非專利文獻(xiàn)12)。但實際情況是，此種長期的低溫培養(yǎng)從成本方面不適于工業(yè)化生產(chǎn)，且上述條件均是著眼于作為甘油三酯的構(gòu)成要素存在的LCPUFA的生產(chǎn)培養(yǎng)條件，對LCPUFA-PL生產(chǎn)的特定化培養(yǎng)條件還未進(jìn)行研究。用此種培養(yǎng)方法生產(chǎn)的菌體內(nèi)，LCPUFA-PL是作為大量甘油三酯中混入的微量成分被檢出的，其含量不僅是微量(11.7mg/g干燥菌體參照非專利文獻(xiàn)5)，而且是甘油三酯生產(chǎn)的副產(chǎn)品，所以質(zhì)量、供給量均不穩(wěn)定，因而不能期待LCPUFA-PL的充分利用。
綜上所述，期望開發(fā)出可更安全且穩(wěn)定地利用于食品、動物飼料中的含有LCPUFA-PL的油脂。
專利文獻(xiàn)1 日本特開2003-48831號公報(2003年(平成15)2月21日公開)專利文獻(xiàn)2 日本特開平11-35587號公報(1999年(平成11)2月9日公開)專利文獻(xiàn)3 日本特開平8-59678號公報(1996年(平成8)3月5日公開)專利文獻(xiàn)4 日本特公平6-2068號公報(1994年(平成6)1月12日公告)專利文獻(xiàn)5 日本特表平10-512444號公報(1998年(平成10)12月2日公表)非專利文獻(xiàn)1 A.Bruni，et al.，Nature，Vol.260，p331-333(1976)非專利文獻(xiàn)2 G.Toffano，et al.Clinical Trials Journal，Vol.24，p18-24(1987)非專利文獻(xiàn)3 今泉勝巳、臨床營養(yǎng)、第67巻、p119(1985)[日語原名；今泉勝巳、臨床栄飬、第67巻、p119(1985)]非專利文獻(xiàn)4 矢澤一良等、油科學(xué)、第44巻、p787-793(1995)[日語原名；矢澤一良ら、油科學(xué)、第44巻、p787-793(1995)]非專利文獻(xiàn)5 S.Shimizu，et al.，JAOCS，Vol.68，No.4，p254-258(1991)非專利文獻(xiàn)6 D.Tyrrell，Can.J.Microbiol.，Vol.17，p1115-1118(1971)非專利文獻(xiàn)7 D.Tyrrell，et al.，Can.J.Microbiol.，Vol.22，p1058-1060(1976)非專利文獻(xiàn)8 G.S.de Hoog，et al.，ATLAS OF CLINICAL FUNGI，2nd edition，p.118-123非專利文獻(xiàn)9 日本細(xì)菌學(xué)會、關(guān)于病原細(xì)菌的生物安全指南、改定第2版、p7(2002年)[日語原名；日本細(xì)菌學(xué)會、病原細(xì)菌に関するバイオセ一フテイ指針、改定第2版、p7(2002年)]非專利文獻(xiàn)10 長谷川武治等、微生物的分類和鑒定、p19-20、東京大學(xué)出版社(1975年)[日語原名；長谷川武治ら、微生物の分類と同定、p19-20、東京大學(xué)出版會(1975年)]非專利文獻(xiàn)11 K.Higashiyama，et al.，JAOCS，Vol.75，p1501-1505(1998)非專利文獻(xiàn)12 S.Jareonkitmongkol，et al.，Arch.Microbiol.，Vol.161，p316-319(1994)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種技術(shù)，其通過獲得支鏈脂肪酸含量低，且大量積累含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂(LCPUFA-PL)的微生物培養(yǎng)物，可高效且穩(wěn)定地供給能更放心地用于食品和動物飼料且質(zhì)量穩(wěn)定的LCPUFA-PL。
本發(fā)明者為解決上述課題，研究支鏈脂肪酸含量少且高效制造LCPUFA-PL的方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了被孢霉屬適合作為生產(chǎn)含有長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)的脂質(zhì)的脂質(zhì)生產(chǎn)菌。
并且，盡管已想到生物膜的構(gòu)成要素LCPUFA-PL在菌體內(nèi)的合成被嚴(yán)密控制，但仍發(fā)現(xiàn)了單位菌體的LCPUFA-PL的量顯著增加的條件，使本發(fā)明得以完成。
即本發(fā)明是支鏈脂肪酸含量少且含有構(gòu)成要素為LCPUFA的磷脂(LCPUFA-PL)的制造方法，其特征在于，在上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌的菌體中進(jìn)行大量積累LCPUFA-PL的培養(yǎng)。該制造法中，還包含在上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌培養(yǎng)工序的后期進(jìn)行的，獲得成為LCPUFA-PL的供給原料的干燥菌體的工序及從菌體中提取含有LCPUFA-PL的油脂的油脂提取工序。
因此，本發(fā)明的方法是LCPUFA-PL的制造方法，其包含(i)將屬于被孢霉屬的微生物以在該微生物菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)；且
(ii)從其培養(yǎng)物中獲得LCPUFA-PL，在此，作為該培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下。
且本發(fā)明的方法還是LCPUFA-PL的制造方法，其包含(i)將屬于被孢霉屬的微生物以在該微生物菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)；(ii)從其培養(yǎng)物中提取脂質(zhì)成分，并將脂質(zhì)成分作為總脂質(zhì)組分，再分離成甘油三酯組分及磷脂組分；并且(iii)從該磷脂組分中獲得LCPUFA-PL，在此，作為該培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下。


圖1 圖1a是初始pH值和提取的磷脂量的相關(guān)關(guān)系圖。圖1b是初始pH值和提取的磷脂中花生四烯酸量的相關(guān)關(guān)系圖。
圖2 圖2a是培養(yǎng)基I及培養(yǎng)基II的培養(yǎng)中pH值的變化示意圖?！癖硎九囵B(yǎng)基I(不控制pH值)，■表示培養(yǎng)基II(控制pH值)。圖2b是培養(yǎng)天數(shù)和提取的磷脂量的相關(guān)關(guān)系圖。○表示培養(yǎng)基I(不控制pH值)，□表示培養(yǎng)基II(控制pH值)。
圖3 圖3a表示培養(yǎng)第4日溫度改變后，磷脂組分總脂肪酸中的花生四烯酸(ARA)的比例。圖3b表示培養(yǎng)第4日溫度改變后，磷脂組分中存在的花生四烯酸與甘油三酯組分中存在的花生四烯酸的比。
圖4 表示培養(yǎng)第4日，溫度變?yōu)?0℃后，相對于培養(yǎng)時間，磷脂組分總脂肪酸中花生四烯酸(ARA)的比例。
具體實施例方式
本發(fā)明方法中使用的微生物本發(fā)明方法中使用的微生物，只要是屬于被孢霉屬、可生成LCPUFA-PL的微生物，無特別限定。本發(fā)明方法中使用的被孢霉屬微生物優(yōu)選為被孢霉亞屬。被孢霉亞屬的微生物包含高山被孢霉(Mortierella alpina)、多頭被孢霉(Mortierellapolycephala)、微小被孢霉(Mortierellaexigua)、喜濕被孢霉(Mortierellahygrophila)、長孢被孢霉(Mortierellaelongata)等。本發(fā)明方法中使用的被孢霉屬微生物更優(yōu)選為高山被孢霉。
屬于被孢霉屬的微生物中，已知具有生產(chǎn)LCPUFA-PL能力的種、菌株有很多，該LCPUFA-PL是含有構(gòu)成要素為LCPUFA花生四烯酸(ARA)的LCPUFA-PL(簡稱為ARA-PL)。選擇具有生產(chǎn)ARA-PL能力的被孢霉屬時，該被孢霉屬的微生物優(yōu)選為被孢霉亞屬。被孢霉亞屬的微生物可例舉為高山被孢霉、多頭被孢霉、微小被孢霉、喜濕被孢霉、長孢被孢霉等。
具有生產(chǎn)ARA-PL能力的被孢霉亞屬的微生物中更具體的菌株，例如可以是多頭被孢霉(M.polycephala)IFO6335、長孢被孢霉(M.elongata)CBS125.71、微小被孢霉(M.exigua)IFO8571、M.beljakovaeCBS601.68、M.schmuckeriNRRL2761、喜濕被孢霉(M.hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(M.alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等。這些菌株均可從日本國大阪市的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)、美國的American TypeCulture Collection(ATCC)以及Centrralbureau voorSchimmelcultures(CBS)等無任何限制地獲得。而且具有生產(chǎn)ARA-PL能力的被孢霉亞屬的其他菌株，也可例舉為包含本發(fā)明者的研究小組從土壤中分離的菌株長孢被孢霉(M.elongata)SAM0219(日本國微工研菌寄第8703號)(日本國微工研條寄第1239號)。
具有生產(chǎn)LCPUFA-PL能力的微生物的更具體的菌株，該LCPUFA-PL是含有構(gòu)成要素為LCPUFA二高-γ-亞麻酸(DGLA)的LCPUFA-PL(簡稱為DGLA-PL)，可例舉為包含本發(fā)明者的研究小組從土壤中分離的菌株長孢被孢霉(M.elongata)SAM1860(日本國微工研條寄第3589號)。
而且，具有生產(chǎn)LCPUFA-PL能力的微生物的更具體的菌株，該LCPUFA-PL是含有構(gòu)成要素為LCPUFA M酸(Mead acid)的LCPUFA-PL(簡稱為M酸-PL)，可例舉為包含本發(fā)明者的研究小組從土壤中分離的菌株高山被孢霉(M.alpina)SAM2086(FERMP-15766)。
本發(fā)明方法中使用的屬于被孢霉屬的微生物，可只選擇1種與生產(chǎn)的LCPUFA種類相應(yīng)的菌株，也可組合選擇2種以上。
本說明書中，將用于本發(fā)明方法的微生物記載為脂質(zhì)生產(chǎn)菌或菌。在本說明書中這些意思相同。
本發(fā)明方法中的微生物培養(yǎng)工序本發(fā)明方法中使用的微生物的培養(yǎng)條件無特別限定，可對應(yīng)于欲培養(yǎng)的菌株的種類適當(dāng)設(shè)定。
為培養(yǎng)包含本發(fā)明中使用的上述菌株的微生物，將其菌株的孢子、菌絲或預(yù)先培養(yǎng)獲得的前培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為液體培養(yǎng)基時，碳源可使用任一種葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇等一般可使用的物質(zhì)，此處無限制。氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麥芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽餅等的天然氮源以外，還可使用尿素等有機(jī)氮源及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無機(jī)氮源，特別是從大豆中得到的氮源，具體地說為大豆、脫脂大豆、大豆餅、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等。還可以是脫脂大豆熱變性后的產(chǎn)物，更優(yōu)選為可將脫脂大豆進(jìn)行70～90℃熱處理且再除去乙醇可溶成分后的產(chǎn)物單獨或多數(shù)或與上述氮源組合后使用。從實用上，一般碳源的總添加量優(yōu)選為0.1～40重量％的范圍，更優(yōu)選為1～25重量％的范圍。另外，氮源的總添加量優(yōu)選為0.01～10重量％的范圍，更優(yōu)選為0.1～10重量％的范圍。而且流加培養(yǎng)基時，優(yōu)選初始碳源的添加量為1～5重量％的范圍，同時優(yōu)選初始氮源的添加量為0.1～6重量％的范圍。培養(yǎng)過程中流加的培養(yǎng)基的成分可為碳源及氮源的兩者，更優(yōu)選只流加碳源。
對上述碳源、氮源以外的成分也無特別限定，必要時，可適當(dāng)添加公知的微量營養(yǎng)源等。微量營養(yǎng)源，例如可以是磷酸離子、鈣離子、鈉離子、鎂離子等的堿金屬或堿土類金屬的離子；鐵、鎳、鈷、錳等的VIIB～VIII族金屬離子；銅、鋅等的IB～I(xiàn)IB族金屬離子；各種維生素類等。對液體培養(yǎng)基中上述各成分的含有率(添加率)無特別限定，只要是對本發(fā)明方法中使用的微生物的生長發(fā)育無阻礙的濃度，可為公知的范圍。
特別是在磷脂的生產(chǎn)率方面，優(yōu)選添加磷酸鹽。添加的磷酸鹽例如可為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等。添加的磷酸鹽濃度，只要是不阻礙本發(fā)明方法中使用的微生物生長發(fā)育的濃度，無特殊限定，但優(yōu)選為3.7mM～147mM的范圍，更優(yōu)選為3.7mM～44mM的范圍，特別優(yōu)選為22mM～44mM的范圍。由此可提高脂質(zhì)生產(chǎn)菌體內(nèi)的磷脂含量。
培養(yǎng)液的pH值，只要是不阻礙本發(fā)明方法中使用的微生物生長發(fā)育的范圍，無特別限定。例如，初始pH值可以是pH4～pH10的范圍，優(yōu)選為弱酸性的pH4～pH6，更優(yōu)選為調(diào)整到pH4～pH5。可控制培養(yǎng)中的pH值，也可不控制。本發(fā)明方法的優(yōu)選形態(tài)是控制培養(yǎng)中的pH值。將本發(fā)明中使用的被孢霉屬置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，培養(yǎng)后期特別是碳源枯渴后，培養(yǎng)液中的pH值會上升。通過抑制此pH值上升，控制培養(yǎng)開始到培養(yǎng)期間的pH值，使其維持在pH4～pH6、優(yōu)選為pH4～pH5.5的低范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，可提高菌體內(nèi)積累的磷脂的量，并由此可增加單位菌體的LCPUFA-PL量。
培養(yǎng)溫度，只要是不阻礙本發(fā)明方法中使用的微生物生長發(fā)育的溫度，無特別限定，但一般可為5～40℃的范圍，優(yōu)選20～30℃的范圍。培養(yǎng)時間也無特別限定，但通常可為2～20日的范圍，從工業(yè)化上優(yōu)選3～10日的范圍，更優(yōu)選3～6日的范圍。
優(yōu)選形態(tài)中，如下控制本發(fā)明方法的培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間。首先在一般的絲狀菌的最適生育溫度28℃左右的較高溫度范圍內(nèi)，進(jìn)行2～20日，優(yōu)選3～10日，更優(yōu)選3～6日，進(jìn)一步優(yōu)選2～4日，最優(yōu)選4日的培養(yǎng)使菌體增殖后，如在比最初的培養(yǎng)溫度低的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)時，可提高生產(chǎn)出的不飽和脂肪酸中多不飽和脂肪酸(PUFA)的比例。此時的低溫溫度范圍優(yōu)選10～25℃，更優(yōu)選15～25℃，但從實用性上特別優(yōu)選20～25℃。進(jìn)行此種低溫培養(yǎng)的時間無特別限定，優(yōu)選4小時～18小時的范圍，更優(yōu)選12小時～18小時的范圍。通過此種短時間的溫度控制，可降低成本，同時提高獲得的磷脂中的LCPUFA比例。
對培養(yǎng)中的培養(yǎng)基實施的外部處理也無特別限定，可適當(dāng)選擇通氣攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)等公知的培養(yǎng)方法。特別是通氣攪拌培養(yǎng)中，通過攪拌提高培養(yǎng)液的流動性，可提高LCPUFA-PL的生產(chǎn)率，此時的最大所需攪拌動力(KLA＝(P/V)0.95·Vs0.67)為8.0以上，優(yōu)選為8.3以上。
通過單獨或組合使用上述培養(yǎng)條件，即初始pH值、培養(yǎng)中pH值的控制、培養(yǎng)基中添加的磷酸鹽的濃度、培養(yǎng)溫度及時間以及攪拌力等的條件，可在菌體內(nèi)大量積累目標(biāo)LCPUFA-PL。
本發(fā)明涉及的制造方法中，以增加含有LCPUFA的不飽和脂肪酸的得率為目的，可在培養(yǎng)基中添加不飽和脂肪酸的前體和基質(zhì)。不飽和脂肪酸的前體、底物，具體地說，例如可為十六烷、十八烷酸等碳?xì)浠衔?；油酸、亞油酸、二十二碳六烯酸等的脂肪酸或其鹽；乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯等的脂肪酸酯；橄欖油、豆油、菜籽油、棉籽油、椰子油、魚油等的油脂類等，但無特別限定。這些可單獨使用，也可2種以上適當(dāng)組合使用。上述不飽和脂肪酸的前體、底物的添加量無特別限定，但一般可為培養(yǎng)基總重量的0.001～10％的范圍，優(yōu)選0.5～10％的范圍。也可將上述物質(zhì)作為唯一的碳源培養(yǎng)脂質(zhì)生產(chǎn)菌。通過將此種適當(dāng)?shù)牡孜锾砑佑谂囵B(yǎng)基中，可使目的脂肪酸有效攝入磷脂內(nèi)。
本發(fā)明方法中LCPUFA-PL的提取及精制工序本發(fā)明涉及的制造方法中，如上所述，為從培養(yǎng)的培養(yǎng)物中獲得LCPUFA-PL，作為必須工序應(yīng)具有磷脂(PL)提取工序。在此PL提取工序中，從菌體中提取PL的方法無特別限定，但優(yōu)選使用通過提取劑的提取。
本發(fā)明方法中提取LCPUFA-PL的培養(yǎng)物，可以是如上述培養(yǎng)的培養(yǎng)液本身，也可以是滅菌處理后的培養(yǎng)液?；蚺囵B(yǎng)物可使用從培養(yǎng)液中集菌的培養(yǎng)菌體，即生菌的狀態(tài)，也可將生菌滅菌處理后使用。另外，上述培養(yǎng)液可以是培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)液，也可以是培養(yǎng)結(jié)束時的培養(yǎng)液。集菌后的菌體可使用其本身的塊狀，也可加工成板狀、線狀、粒狀、粉末狀等任意的形狀后使用。菌體的集菌方法也無特別限定，當(dāng)培養(yǎng)的菌體為少量時，可使用一般的離心分離機(jī)進(jìn)行離心分離。為大量時，優(yōu)選通過連續(xù)離心分離進(jìn)行分離，但也可與通過膜等的過濾組合使用。集菌后的菌體可使用濕菌體，也可使用干燥濕菌體后的干燥菌體。特別是本發(fā)明中優(yōu)選使用干燥菌體。由此可高效提取油脂。濕菌體的干燥方法無特別限定，可例舉為送風(fēng)、熱處理、減壓處理、凍干等公知的干燥處理。
由上述提取劑進(jìn)行的提取，其所使用的提取劑無特別限定，一般來說，可例舉為脂肪族系有機(jī)溶劑及水的至少任一種提取液或超臨界二氧化碳。上述提取液中，脂肪族有機(jī)溶劑，具體地說，例如可為己烷、石油醚等的飽和碳?xì)浠衔?；丙酮等的酮類；甲醇、乙醇等的醇類；乙酸乙酯等的酯類；氯仿等的鹵化烴；乙腈等的氰化烴；乙醚等的醚類等?？芍皇褂眠@些提取液中的1種，也可適當(dāng)選擇2種以上使用。上述提取液中，用于高效提取磷脂的脂肪族系有機(jī)溶劑，優(yōu)選使用飽和碳?xì)浠衔铩⒋碱?、飽和碳?xì)浠衔锖痛碱惖幕旌先軇┗螓u化烴和醇類的混合溶劑。飽和碳?xì)浠衔飪?yōu)選使用己烷，醇類優(yōu)選使用乙醇，飽和碳?xì)浠衔锖痛碱惖幕旌先軇﹥?yōu)選使用己烷/乙醇混合溶劑，鹵化烴和醇類的混合溶劑優(yōu)選使用氯仿/甲醇混合溶劑。上述各有機(jī)溶劑中，特別是用于食品時，優(yōu)選使用己烷及/或乙醇。且使用己烷及乙醇的混合溶劑或乙醇時，可在其中加入少量的水。
通過上述提取劑的提取處理，可用間歇式進(jìn)行，也可用連續(xù)式進(jìn)行。通過提取劑提取的條件也無特別限定，可用與欲提取的PL的種類、菌體的量(體積、重量)相應(yīng)的適當(dāng)?shù)臏囟取⑦m當(dāng)?shù)奶崛┑牧?、適當(dāng)?shù)臅r間提取。提取時，優(yōu)選將菌體分散于提取劑中同時緩慢攪拌。由此可進(jìn)行高效提取。
通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL，可作為溶解于含有高濃度LCPUFA的液狀油脂(甘油三酯等)中的組合物而被提取。含有高濃度LCPUFA的液狀油脂(甘油三酯等)，可例舉為甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、脂肪酸、脂肪酸醇酯(fatty acid alcohol ester)等。構(gòu)成含有高濃度LCPUFA的液狀油脂(甘油三酯等)的LCPUFA，只要是碳數(shù)20以上具有雙鍵的不飽和結(jié)構(gòu)的脂肪酸即可，無特別限定。且由本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL也可作為含有固醇、固醇酯、糖脂質(zhì)、鞘脂、蠟、色素、類胡蘿卜素、維生素E類等的脂溶性物質(zhì)的組合物被提取。
PL精制工序的具體方法，即精制用上述PL提取工序得到的粗PL的方法無特別限定，可使用公知的精制方法，例如薄層色譜法(TLC)、柱色譜法、丙酮分離等的溶劑分離法等。色譜法中使用的載體無特別限定，可優(yōu)選使用公知的載體。用于溶劑分離法的溶劑也無特別限定，可優(yōu)選使用公知的溶劑。
通過本發(fā)明方法制造的脂質(zhì)通過本發(fā)明方法制造的磷脂，是含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)的磷脂。本說明書中的LCPUFA是指，碳數(shù)20以上具有雙鍵的不飽和結(jié)構(gòu)的脂肪酸。
通過本發(fā)明方法獲得的干燥菌體中所含有的磷脂，只要是含有構(gòu)成要素為LCPUFA的磷脂(LCPUFA-PL)無特別限定，可以是公知的全部磷脂，例如甘油磷脂、鞘磷脂、溶血磷脂等。具體地說，例如甘油磷脂可以是磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)等；鞘磷脂(sphingophospholipid)可以是鞘磷脂(sphingomyelin)(SP)等；溶血磷脂可以是溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血磷脂酰甘油(LPG)、磷脂酸等。這些磷脂中，優(yōu)選PC、PS、PE、PI、磷脂酸及CL。
通過本發(fā)明方法制造的磷脂中，作為構(gòu)成要素含有的LCPUFA只要是碳數(shù)20以上具有雙鍵的不飽和結(jié)構(gòu)的脂肪酸，無特別限定。優(yōu)選從ω9系列多不飽和脂肪酸、ω6系列多不飽和脂肪酸及ω3系列多不飽和脂肪酸組成的群中選擇的LCPUFA。此處，ω9系列、ω6系列、ω3系列是指對應(yīng)于不飽和脂肪酸的雙鍵位置的系統(tǒng)。具體地說，ω9系列、ω6系列、ω3系列是指從脂肪酸的與羧基相反側(cè)的碳開始編號時，分別在其9位、6位、3位具有雙鍵的不飽和脂肪酸的系統(tǒng)。具體的LCPUFA，例如ω9系列多不飽和脂肪酸可以是5，8，11-二十碳三烯酸(M酸；20:3、ω9)；7，10，13-二十二碳三烯酸(22:3、ω9)；4，7，10，13-二十二碳四烯酸(22:4、ω9)等。ω6系列多不飽和脂肪酸可以是11，14-二十碳二烯酸(20:2、ω6)；8，11，14-二十碳三烯酸(二高-γ-亞麻酸；20:3、ω6)；5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸；20:4、ω6)；13，16-二十二碳二烯酸(22:2、ω6)；7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4、ω6)；4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5、ω6)等。ω3系列多不飽和脂肪酸可以是11，14，17-二十碳三烯酸(α-亞麻酸；20:3、ω3)；8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4、ω3)；5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(20:5、ω3)；7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5、ω3)；4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6、ω3)等。且在上述各LCPUFA的名稱后的括號內(nèi)中間夾著冒號的2個數(shù)字，表示脂肪酸的碳鏈長及不飽和度，以「(碳鏈長)(雙鍵數(shù))」表示。上述LCPUFA中，更優(yōu)選使用花生四烯酸(ARA)及/或4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)。這些LCPUFA，作為LCPUFA-PL的構(gòu)成要素，可只包含1種，也可包含2種以上。
上述LCPUFA結(jié)構(gòu)中含有的碳-碳雙鍵結(jié)構(gòu)(-C＝C-)中，至少1個可以是共軛雙鍵。此共軛雙鍵可以與羰基(C＝O)共軛，也可以是相鄰的碳-碳雙鍵之間共軛。
因此，本發(fā)明的方法是用于制造以上詳細(xì)敘述的LCPUFA-PL的方法。且通過本發(fā)明的制造方法制造的磷脂也屬于本發(fā)明的范圍。
通過本發(fā)明方法制造的磷脂，可包含上述的至少1種的磷脂，也可包含2種以上的磷脂。且不經(jīng)過精制工序的粗磷脂也可含有各種微量成分。此種微量成分可例舉為來自脂質(zhì)生產(chǎn)菌的磷脂以外的脂質(zhì)成分(油脂等)。
通過本發(fā)明方法獲得的磷脂的組成特色通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL的組成，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一方法測定。例如，磷脂的脂肪酸部分的定性及定量，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過公知的鹽酸甲醇法將磷脂的構(gòu)成要素脂肪酸衍生為甲酯后，用氣相色譜法評價。磷脂親水基部分的分析可使用公知的分離法，例如薄層色譜法(TLC)、柱色譜法、質(zhì)譜分析法、丙酮分離等的溶劑分離法等進(jìn)行。
通過本發(fā)明方法從培養(yǎng)物中獲得的磷脂，其特征在于，作為其構(gòu)成要素含有的異肉豆蔻酸(isomyristic acid)(iso14:0)、異棕櫚酸(iso palmitic acid)(iso16:0)等的支鏈脂肪酸少。支鏈脂肪酸的含有率，例如可用異棕櫚酸的含有率評價。具體地說，支鏈脂肪酸少是指作為全部PL中的構(gòu)成要素而含有的總脂肪酸總量中，異棕櫚酸的組成比為5％以下，優(yōu)選為0.5％以下，更優(yōu)選為0.1％以下。
通過本發(fā)明方法獲得的含有LCPUFA-PL的磷脂，在作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下，且該脂肪酸總量中花生四烯酸的組成比可為13％以上?？蓛?yōu)選異棕櫚酸的組成比為0.5％以下或0.1％以下，花生四烯酸的組成比為20％以上或25％以上。
而且，通過本發(fā)明方法獲得的含有LCPUFA-PL的磷脂，在作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下，且該異棕櫚酸的組成比與該脂肪酸總量中花生四烯酸的組成比的比值為1/6以下?？蓛?yōu)選異棕櫚酸的組成比為0.5％以下或0.1％以下，異棕櫚酸的組成比與花生四烯酸的組成比的比值為1/10以下或1/20以下。
用本發(fā)明涉及的制造方法獲得的磷脂，作為1g干燥菌體中含有的全部磷脂的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸量無特別限定，優(yōu)選為34.7mg以上，更優(yōu)選為36.3mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為47.7mg以上，特別優(yōu)選為65.2mg以上。
用本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL的構(gòu)成要素LCPUFA含有花生四烯酸(ARA)時，作為1g干燥菌體中含有的全部磷脂的構(gòu)成要素而含有的ARA量無特別限定，優(yōu)選為12.1mg以上，更優(yōu)選為15.1mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為19.9mg以上。
用本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL的構(gòu)成要素LCPUFA含有二高-γ-亞麻酸(DGLA)時，作為1g干燥菌體中含有的全部磷脂的構(gòu)成要素而含有的DGLA量無特別限定，優(yōu)選為1.5mg以上，更優(yōu)選為1.8mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為2.0mg以上。
用本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL是磷脂酰膽堿(PC)時，作為1g干燥菌體中含有的全部PC的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸量無特別限定，可為5.99mg以上，優(yōu)選為10.0mg以上，更優(yōu)選為15.0mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20.0mg以上。用本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL是磷脂酰乙醇胺(PE)時，作為1g干燥菌體中含有的全部PE的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸量無特別限定，可為7.62mg以上，優(yōu)選為10.0mg以上，更優(yōu)選為15.0mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20.0mg以上。而且，用本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL是磷脂酰絲氨酸(PS)時，作為1g干燥菌體中含有的全部PS的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸量無特別限定，可為1.09mg以上，優(yōu)選為2.0mg以上，更優(yōu)選為3.0mg以上。
通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL中，包含含有構(gòu)成要素為花生四烯酸(ARA)的磷脂酰膽堿(ARA-PC)時，作為全部磷脂酰膽堿的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量無特別限定，每1g干燥菌體中可為1.0mg以上，優(yōu)選為1.08mg以上，更優(yōu)選為4.0mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5.0mg以上。且通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL中，包含含有構(gòu)成要素為ARA的磷脂酰乙醇胺(ARA-PE)時，作為全部磷脂酰乙醇胺的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量無特別限定，每1g干燥菌體中可為0.5mg以上，優(yōu)選為1.35mg以上，更優(yōu)選為2.0mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為3.0mg以上，特別優(yōu)選為5.0mg以上。而且通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL中，包含含有構(gòu)成要素為ARA的磷脂酰絲氨酸(ARA-PS)時，作為全部磷脂酰絲氨酸的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量無特別限定，每1g干燥菌體中可為0.05mg以上，優(yōu)選為0.06mg以上，更優(yōu)選為0.15mg以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.3mg以上，特別優(yōu)選為0.4mg以上。
通過本發(fā)明方法獲得的LCPUFA-PL中，包含含有構(gòu)成要素為二高-γ-亞麻酸(DGLA)的磷脂酰膽堿(DGLA-PC)時，作為全部磷脂酰膽堿的構(gòu)成要素而含有的DGLA量無特別限定，每1g干燥菌體中可為0.11mg以上、優(yōu)選為0.3mg以上、更優(yōu)選為0.6mg以上。通過本發(fā)明的方法獲得的LCPUFA-PL中，包含含有構(gòu)成要素為DGLA的磷脂酰乙醇胺(DGLA-PE)時，作為全部磷脂酰乙醇胺的構(gòu)成要素而含有的DGLA量無特別限定，每1g干燥菌體中可為0.1mg以上，優(yōu)選為0.3mg以上，更優(yōu)選為0.5mg以上。
且通過本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)物，除LCPUFA-PL以外，包含含有構(gòu)成要素為LCPUFA的甘油三酯，所含有的比例無特別限定，但通過本發(fā)明方法培養(yǎng)的培養(yǎng)物與用其他方法培養(yǎng)的培養(yǎng)物相比，LCPUFA-PL的含有率得到了提高。培養(yǎng)物中LCPUFA-PL的含有率得到提高，例如可用作為磷脂的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸(ARA-PL)與作為甘油三酯的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸(ARA-TG)的比值進(jìn)行評價。通過本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)物中，例如ARA-PL與ARA-TG的比值(ARA-PL/ARA-TG)為0.2以上，優(yōu)選為0.84以上，更優(yōu)選為1.05以上，進(jìn)一步優(yōu)選為1.70以上。
通過使用本發(fā)明涉及的制造方法培養(yǎng)被孢霉屬，此被孢霉屬可生成含有構(gòu)成要素為LCPUFA的磷脂(LCPUFA-PL)，可在短時間內(nèi)，在上述菌體中大量積累LCPUFA-PL。而且用本發(fā)明涉及的培養(yǎng)法制造的菌體中的磷脂，其支鏈脂肪酸的含量少。因此，通過將其菌體作為供給原料提取LCPUFA-PL，可將至今為止只能從有限的供給源獲得很少量，因而使供給量不穩(wěn)定且質(zhì)量也不穩(wěn)定的LCPUFA-PL作為可更放心地用于食品、動物飼料的高質(zhì)量的工業(yè)產(chǎn)品而高效且穩(wěn)定地提供。
實施例以下，根據(jù)比較例、實施例，更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。且在以下比較例、實施例中所示的磷脂，定義為在硅膠柱中用氯仿洗滌不能洗脫，之后用甲醇可洗脫回收的組分，或用己烷∶乙醚＝7∶3為展開劑的硅膠薄層色譜法(TLC)，完全不從點樣位置移動的組分。
實施例1支鏈脂肪酸[異棕櫚酸(iso16:0)]的生產(chǎn)率在100mL的錐形瓶中制備含有酵母浸膏1％、葡萄糖4％的培養(yǎng)基(pH6.3)20mL，并在120℃下殺菌20分鐘。將屬于耳霉屬的2菌株ConidiobolusthromoboidesCBS183.60及ConidiobolusnanodesCBS154.56以及表1所示的屬于被孢霉屬的菌株A～E于培養(yǎng)基中接種1白金耳，往返振蕩120rpm，在溫度28℃的條件下培養(yǎng)7日。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾回收菌體，充分水洗后，用凍干干燥一夜，獲得干燥菌體。
在所得到的干燥菌體中加入4mL氯仿/甲醇＝2∶1的混合溶劑，在70℃下緩慢攪拌1小時回收有機(jī)溶劑層后，再加入4mL的上述混合溶劑，并收集全部有機(jī)溶劑層。用離心蒸發(fā)器餾去此有機(jī)溶劑，得到總脂質(zhì)組分。所得到的總脂質(zhì)組分用硅膠薄層色譜法(TLC)分離成甘油三酯(TG)及磷脂(PL)。展開劑為己烷∶乙醚＝7∶3(v/v)的混合溶劑。分別刮取兩組分，用鹽酸甲醇法衍生為甲酯后，通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸的定性及定量。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)使用十五烷酸。
其結(jié)果如表2所示。且表2中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。
表1

表2

※表中的簡稱分別表示以下含義。
PL磷脂、TG甘油三酯、ARA花生四烯酸、iso16:0異棕櫚酸、ARA-PL作為磷脂的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸ARA-TG作為甘油三酯的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸。
可證明被孢霉屬積累了磷脂，其磷脂以高比例含有花生四烯酸，且與耳霉屬相比支鏈脂肪酸的含有率低。
實施例2被孢霉屬中含有LCPUFA的磷脂組成在20mL的錐形瓶中制備含有酵母浸膏1％、葡萄糖4％的培養(yǎng)基(pH6.3)4mL，并在120℃下殺菌20分鐘。將表1所示的菌株A、B、D及E于培養(yǎng)基中接種1白金耳，往返振蕩120rpm，在溫度28℃的條件下培養(yǎng)7日，得到干燥菌體A’、B’、D’及E’。再在20mL的錐形瓶中制備含有Soya Flour 1％、葡萄糖1.5％、KH2PO40.3％的培養(yǎng)基(pH5.0)4mL后，接種表1所示的菌株C，與上述同樣進(jìn)行培養(yǎng)，獲得干燥菌體C’。
將與實施例1同樣獲得的總脂質(zhì)組分使用氯仿∶甲醇∶醋酸∶水＝50∶37.5∶3.5∶2(v/v/v/v)的展開劑進(jìn)行TLC，分離成磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、心磷脂(CL)的各磷脂組分，并用與實施例1同樣的方法進(jìn)行脂肪酸的定性及定量。
其結(jié)果如表3所示。表3中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。
表3

*ND用TLC未能檢出※表中的簡稱分別表示以下含義。
LCPUFA長鏈多不飽和脂肪酸、ARA花生四烯酸、DGLA二高-γ-亞麻酸實施例3磷酸鹽的添加培養(yǎng)在20mL的錐形瓶中制備含有Soya Flour 1％、葡萄糖3％、表4所示的6種濃度的KH2PO4培養(yǎng)基(pH6.3)4mL，并在120℃下殺菌20分鐘。將MortierellaschmuckeriNRRL2761和高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37的孢子懸浮液接種于上述培養(yǎng)基中，往返振蕩120rpm，在溫度28℃的條件下培養(yǎng)5日。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例1同樣的方法從冷凍干燥菌體中提取總脂質(zhì)，并通過SEP-PAK PLus柱色譜法分離成甘油三酯(TG)及磷脂(PL)。洗脫溶劑，洗脫甘油三酯使用氯仿，洗脫磷脂使用甲醇，通過將此有機(jī)溶劑用離心蒸發(fā)器餾去獲得各組分。分離后，用鹽酸甲醇法衍生為甲酯，通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸的定性及定量。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)使用十五烷酸。
其結(jié)果如表4所示。且表4中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。
表4

※表中的簡稱分別表示以下含義。
LCPUFA長鏈多不飽和脂肪酸、ARA花生四烯酸、DGLA二高-γ-亞麻酸ARA-PL作為磷脂的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸ARA-TG作為甘油三酯的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸。
通過在培養(yǎng)基中添加磷酸鹽，單位菌體的磷脂量、磷脂中的LCPUFA增加，并證明其作用在磷脂中比甘油三酯更有效。
實施例4初始低pH值培養(yǎng)將含有Soya Flour 1％、葡萄糖1.5％、KH2PO40.3％的培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)整為7種pH值(pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.3、pH7.0、pH8.0)，將其培養(yǎng)基4mL放入20mL的錐形瓶內(nèi)，并在120度下殺菌20分鐘。將高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37的孢子懸浮液接種于上述培養(yǎng)基中，往返振蕩120rpm，在溫度28℃的條件下培養(yǎng)5日。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例3同樣的方法從冷凍干燥菌體中提取總脂質(zhì)，通過SEP-PAK PLus柱色譜法分離成甘油三酯(TG)及磷脂(PL)后，進(jìn)行脂肪酸的定性及定量。
其結(jié)果如表5及圖1所示。且表5中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。
表5

※表中的簡稱分別表示以下含義。
LCPUFA長鏈多不飽和脂肪酸、ARA花生四烯酸、DGLA二高-γ-亞麻酸可證明通過降低初始pH值，可使磷脂中LCPUFA的比例增加，特別是使單位菌體的磷脂量、磷脂中的LCPUFA量顯著增加。
實施例5培養(yǎng)后期的低pH值控制將含有Soya Flour 1.5％、葡萄糖2％、KH2PO40.3％的培養(yǎng)基(pH5.0)5L放入10L的發(fā)酵罐中，在120度下殺菌20分鐘(培養(yǎng)基I)。并將含有Soya Flour 1.5％、葡萄糖2％的培養(yǎng)基(pH4.5)5L放入10L發(fā)酵罐內(nèi)，同樣在120度下殺菌20分鐘(培養(yǎng)基II)。接種高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37，在通氣量1vvm下進(jìn)行6日的通氣攪拌培養(yǎng)。攪拌在培養(yǎng)開始時為300rpm，培養(yǎng)第2日開始提高到500rpm，培養(yǎng)溫度在培養(yǎng)開始時為28℃，從培養(yǎng)第3日開始下降到20℃。培養(yǎng)第1日添加1.0％、第2日添加0.75％的葡萄糖。且只將培養(yǎng)基II用0.5N的H2SO4控制，使培養(yǎng)6日期間的培養(yǎng)基的pH值為5.0以下。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例3同樣的方法提取總脂質(zhì)，并進(jìn)行甘油三酯(TG)及磷脂(PL)的分離、脂肪酸的定性及定量。
培養(yǎng)第5日的結(jié)果如表6所示。其表6中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。用圖2a表示培養(yǎng)中pH值的變化，用圖2b表示pH值控制對提取后磷脂量變化的作用。
表6

※表中的簡稱分別表示以下含義。
LCPUFA長鏈多不飽和脂肪酸、ARA花生四烯酸、DGLA二高-γ-亞麻酸、PL磷脂抑制培養(yǎng)后半期pH值上升的培養(yǎng)法(培養(yǎng)基II)，使其單位干燥菌體的LCPUFA量、特別是單位培養(yǎng)基的生產(chǎn)率優(yōu)異，表明在10L發(fā)酵罐中抑制培養(yǎng)后期pH值上升的pH控制法非常有效。
實施例6攪拌控制將含有Soya Flour 1.0％、葡萄糖2％、KH2PO40.3％的培養(yǎng)基(pH5.0)5L放入10L發(fā)酵罐中，在120度下殺菌20分鐘。接種高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37，在培養(yǎng)溫度28℃、通氣量1vvm的條件下通氣攪拌培養(yǎng)7日。攪拌如表7所示，培養(yǎng)第2日時作4種變更繼續(xù)培養(yǎng)，第2日時添加0.5％的葡萄糖。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例3同樣的方法提取總脂質(zhì)，進(jìn)行甘油三酯(TG)及磷脂(PL)的分離、脂肪酸的定性及定量。
培養(yǎng)第4日的結(jié)果如表7所示。且表7中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。表7中所示的攪拌參數(shù)KLA，是指由每單位液量的所需攪拌動力P/V(W/m3)和通氣線速度參數(shù)Vs(m/sec)定義的最大所需攪拌動力(KLA＝(P/V)0.95·Vs0.67)[(W/m3)0.95(m/sec)0.67]。
表7

*第1日所有的罐均用KLA＝8.27培養(yǎng)。ARA是花生四烯酸。
通過提高KLA增強(qiáng)培養(yǎng)液的流動性，可使磷脂組分中花生四烯酸的比例、單位干燥菌體的花生四烯酸量同時增加。
實施例7低溫培養(yǎng)將含有Soya Flour 1％、葡萄糖1.5％、KH2PO40.3％的培養(yǎng)基(pH5.0)20mL放入100mL的錐形瓶中，并在120度下殺菌20分鐘。將高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37的孢子懸浮液接種于上述培養(yǎng)基中，往返振蕩120rpm，在溫度28℃下培養(yǎng)4日后，將培養(yǎng)溫度變?yōu)?種(10℃、16℃、20℃、24℃、28℃、32℃)，再往返振蕩120rpm培養(yǎng)18小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例3同樣的方法進(jìn)行總脂質(zhì)的提取、甘油三酯(TG)及磷脂(PL)的分離、脂肪酸的定性及定量。其結(jié)果如表8及圖3所示。
且在與上述同樣的培養(yǎng)基中，將高山被孢霉(Mortierellaalpina)CBS224.37的孢子懸浮液接種于上述培養(yǎng)基中，往返振蕩120rpm，并在溫度28℃下培養(yǎng)4日后，將培養(yǎng)溫度降到20℃，再培養(yǎng)2小時、4小時、8小時、12小時、14小時、18小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用與實施例3同樣的方法進(jìn)行總脂質(zhì)的提取、甘油三酯(TG)及磷脂(PL)的分離、脂肪酸的定性及定量。其結(jié)果如表9及圖4所示。
且表8、表9中的重量均表示每1g干燥菌體中的量。
表8

※表中的簡稱分別表示以下含義。
ARA花生四烯酸、ARA-RL作為磷脂的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸、ARA-TG作為甘油三酯的構(gòu)成要素含有的花生四烯酸。
表9

※ARA是花生四烯酸通過在培養(yǎng)過程中改變?yōu)榈蜏?，使磷脂組分中花生四烯酸的比例、單位干燥菌體的花生四烯酸的量同時大幅度增加(表8、圖3a)，其效果從4小時的低溫培養(yǎng)即可看出，表明在非常短的時間內(nèi)即有效(表9、圖4)。且磷脂組分的花生四烯酸增加的效果比甘油三酯組分大，所以可使「ARA-PL/ARA-TG」比大的油脂在菌體內(nèi)積累(表8、圖3b)。
權(quán)利要求
1.一種制造方法，其是含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂(LCPUFA-PL)的制造方法，該方法包括以下內(nèi)容(i)將屬于被孢霉屬的微生物以在該微生物菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)；并且(ii)從其培養(yǎng)物中獲得LCPUFA-PL，在此，作為該培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下。
2.權(quán)利要求1中所述的方法，其中，屬于被孢霉屬的微生物為被孢霉亞屬。
3.權(quán)利要求2中所述的方法，其中，屬于被孢霉屬的微生物是高山被孢霉。
4.權(quán)利要求1～3中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含在含有pH4～pH10的初始pH值條件下培養(yǎng)。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含培養(yǎng)的同時控制并維持pH值在pH4～pH6。
6.權(quán)利要求1～5中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含在含有3.7mM～147mM磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求1～6中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含培養(yǎng)的同時用8.3以上的最大所需攪拌動力(KLA＝(P/V)0.95·Vs0.67)攪拌。
8.權(quán)利要求1～7中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含使菌體增殖后在10～25℃培養(yǎng)4～18小時。
9.權(quán)利要求1～7中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含在28℃下培養(yǎng)2日～20日后，再在10～25℃下培養(yǎng)4～18小時。
10.權(quán)利要求1～3中任一項所述的方法，其中，以在菌體中LCPUFA-PL積累的條件培養(yǎng)，包含從(a)在含有pH4～pH10的初始pH值條件下培養(yǎng)；(b)培養(yǎng)的同時控制并維持pH值在pH4～pH6；(c)在含有3.7mM～147mM磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(d)培養(yǎng)的同時用8.3以上最大所需攪拌動力(KLA＝(P/V)0.95·Vs0.67)攪拌；及(E)使菌體增殖后或在28℃下培養(yǎng)2日～20日后，再在10～25℃下培養(yǎng)4～18小時；組成的群中選擇的至少2項培養(yǎng)條件。
11.權(quán)利要求1～10中任一項所述的方法，其中，培養(yǎng)物包含培養(yǎng)液或滅菌處理后的培養(yǎng)液，或者從其中集菌的培養(yǎng)菌體或其干燥菌體。
12.權(quán)利要求1～11中任一項所述的方法，其中，LCPUFA-PL包含從磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸及心磷脂組成的群中選擇的至少1種甘油磷脂。
13.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其是用于制造LCPUFA-PL的方法，該LCPUFA-PL含有的構(gòu)成要素為從ω6系列多不飽和脂肪酸、ω3系列多不飽和脂肪酸及ω9系列多不飽和脂肪酸組成的群中選擇的長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)。
14.權(quán)利要求13中所述的方法，其中，ω6系列多不飽和脂肪酸是從11，14-二十碳二烯酸(20:2、ω6)、8，11，14-二十碳三烯酸(二高-γ-亞麻酸；20:3、ω6)、5，8，11，14-二十碳四烯酸(花生四烯酸；20:4、ω6)、13，16-二十二碳二烯酸(22:2、ω6)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4、ω6)以及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5、ω6)組成的群中選擇的1種以上的脂肪酸。
15.權(quán)利要求13中所述的方法，其中，ω3系列多不飽和脂肪酸是從11，14，17-二十碳三烯酸(α-亞麻酸；20:3、ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4、ω3)、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(20:5、ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5、ω3)以及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6、ω3)組成的群中選擇的1種以上的脂肪酸。
16.權(quán)利要求13中所述的方法，其中，ω9系列多不飽和脂肪酸是從5，8，11-二十碳三烯酸(M酸；20:3、ω9)、7，10，13-二十二碳三烯酸(22:3、ω9)以及4，7，10，13-二十二碳四烯酸(22:4、ω9)組成的群中選擇的1種以上的脂肪酸。
17.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其是用于制造LCPUFA-PL的方法，該LCPUFA-PL含有的構(gòu)成要素為從花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)及二十二碳六烯酸(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)組成的群中選擇的LCPUFA。
18.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其是用于制造LCPUFA-PL的方法，該LCPUFA-PL含有的構(gòu)成要素為分子中至少具有1個共軛雙鍵的LCPUFA。
19.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其中，作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下，且該脂肪酸總量中花生四烯酸的組成比為13％以上。
20.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其中，作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下，且該異棕櫚酸的組成比該脂肪酸總量中與花生四烯酸的組成比的比值為1/6以下。
21.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其特征在于，LCPUFA-PL包含含有花生四烯酸的磷脂，且培養(yǎng)物中含有的全部磷脂中的花生四烯酸量在每1g干燥菌體中為11.8mg以上。
22.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其特征在于，LCPUFA-PL包含含有二高-γ-亞麻酸(DGLA)的磷脂，且培養(yǎng)物含有的全部磷脂中的DGLA量在每1g干燥菌體中為1.5mg以上。
23.權(quán)利要求1～11中任一項所述的方法，其特征在于，LCPUFA-PL包含含有花生四烯酸的磷脂酰膽堿，且作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂酰膽堿的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量在每1g干燥菌體中為1.0mg以上。
24.權(quán)利要求1～11中任一項所述的方法，其特征在于，LCPUFA-PL包含含有花生四烯酸的磷脂酰乙醇胺，且作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂酰乙醇胺的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量在每1g干燥菌體中為0.5mg以上。
25.權(quán)利要求1～11中任一項所述的方法，其特征在于，LCPUFA-PL包含含有花生四烯酸的磷脂酰絲氨酸，且作為培養(yǎng)物中含有的全部磷脂酰絲氨酸的構(gòu)成要素而含有的花生四烯酸量在每1g干燥菌體中為0.05mg以上。
26.權(quán)利要求1～12中任一項所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)物包括含有構(gòu)成要素為花生四烯酸的磷脂及含有構(gòu)成要素為花生四烯酸的甘油三酯，此處，作為磷脂的構(gòu)成要素存在的花生四烯酸量與作為甘油三酯的構(gòu)成要素存在的花生四烯酸量的比值為0.2以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有構(gòu)成要素為長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂(LCPUFA－PL)的制造方法，該方法包含(i)將屬于被孢霉屬的微生物以在該微生物菌體中LCPUFA－PL積累的條件培養(yǎng)；以及(ii)從其培養(yǎng)物中獲得LCPUFA－PL[在此，作為該培養(yǎng)物中含有的全部磷脂(PL)的構(gòu)成要素而含有的脂肪酸總量中，支鏈脂肪酸異棕櫚酸的組成比為5％以下]。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的磷脂。
文檔編號C12R1/645GK101041838SQ200710008090
公開日2007年9月26日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者白石明子, 河島洋 申請人:三得利株式會社