專利名稱：：Eb病毒相關(guān)癌癥的早期診斷方法及各自的試劑和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：EB病毒(EBV)是嗜淋巴細(xì)胞的人皰滲病毒，可以建立終身潛伏。在兒童時(shí)期，EBV感染通常是無(wú)癥狀的。然而，在青少年和成人中，EBV初次感染可導(dǎo)致自限性淋巴組織增生病、感染性單核細(xì)胞增多癥(IM)。在EBV初次感染后，病毒存在于器官中，并終身通過(guò)唾液分泌。此外，在每10000個(gè)人外周B細(xì)胞中，約有1個(gè)潛伏存在所述病毒。在罕見(jiàn)的情況下，EBV感染可以導(dǎo)致所謂的X-連鎖淋巴細(xì)胞增生綜合征(XLP-綜合征)或Duncan綜合征，其與X染色體上的基因缺陷相關(guān)。EBV在世界范圍流行，約95%的成人群體對(duì)EBV為血清陽(yáng)性。潛伏存在病毒的B細(xì)胞具有在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)展成永生化細(xì)胞的能力，而這些細(xì)胞不受調(diào)控的增殖在體內(nèi)通常受功能性細(xì)胞免疫的抑制。然而，在免疫抑制患者中，例如經(jīng)歷器官移植的患者，或感染HIV的患者，EBV感染的B細(xì)胞可以不受控制的增殖，從而導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤。由于該刺激細(xì)胞增殖和使感染細(xì)胞永生化的性質(zhì)，所述病毒與多種人類惡性病強(qiáng)烈相關(guān)，特征是高滴度的抗EBV抗體譜，和增加的循環(huán)EBVDNA水平。除上述在免疫抑制患者中的B細(xì)胞淋巴瘤外，EBV還與伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)和唾液腺癌強(qiáng)相關(guān)，還與霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤和胃腺癌較低程度的相關(guān)。然而，尚未完全闡述清楚EBV在上述惡性腫瘤的病因?qū)W中扮演的特定角色。在通過(guò)任何合適的核酸擴(kuò)增方法(例如PCR技術(shù))確定給定樣品中的EBNA1基因負(fù)荷的情況下，可以使用本發(fā)明中提出的寡核苷酸引物組。本發(fā)明公開的、用于確定樣品中的EBNA1基因負(fù)荷的寡核苷酸引物包括SEQIDNO:l-4提出的核苷酸序列，或基本由上述序列組成，或由上述序列組成，其中SEQIDNO:l和3表示上游引物，即正義引物，而SEQIDNO:2和4表示下游引物，即反義引物。此外，SEQIDNO:l-4提出的核苷^列的互補(bǔ)序列、變體和片段也是本發(fā)明所預(yù)期的。在對(duì)照基因B動(dòng)蛋白，且確定方法是PCR技術(shù)的情況下，用于檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的合適的寡核苷酸引物可以包括SEQIDNO:21(上游，正義)和SEQIDNO:22(下游，反義)中提出的核苷酸序列，及其互補(bǔ)序列、變體或片段，或基本由上述序列組成，或由上述序列組成。為了評(píng)估所獲得的結(jié)果，可以和參照比較選定的標(biāo)志物基因的表達(dá)水平。該參照可以是正常的組織，即，非癌組織，優(yōu)選的是與生物學(xué)樣品相同的組織類型。參照可以源自自其中收集生物學(xué)樣品的受試者，或任何其它合適的來(lái)源，例如來(lái)自另一個(gè)供體的健康組織或培養(yǎng)的細(xì)胞。如果目的基因的表達(dá)水平超過(guò)了一定值，例如，與參照樣品比較的預(yù)定閾值，則認(rèn)為基因的表達(dá)水平改變。根據(jù)選定基因的生物學(xué)功能，與參照樣品相比，表達(dá)水平可以增加或降低。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于執(zhí)行發(fā)明的方法的試劑盒。因此，本發(fā)明的特征還在于用于診斷受試者的EBV-相關(guān)癌癥的試劑盒，包括至少一種用于確定EBV基因負(fù)荷的試劑(例如通過(guò)確定EBNA1基因負(fù)荷)，和至少一種用于確定標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的試劑，所述標(biāo)志物基因選自EBV基因LMP1和細(xì)胞基因RASSF1A、CHFR和DAPK。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括的試劑是寡核苷酸，優(yōu)選的寡核苷酸引物對(duì)。所述寡核苷酸可包括SEQIDNO:1-30中提出的核苷酸序列的任一種，及其互補(bǔ)序列、變體和片段，或基本由上述序列組成，或由上述序列組成。到目前尚未說(shuō)明，本文中使用的術(shù)語(yǔ)和表述具有以下含義。[0096關(guān)于核酸的"片段"，涉及給定核苷酸序列的3，和/或5，截短形式。此類片段包括例如這樣的核酸，所述核酸與全長(zhǎng)對(duì)應(yīng)物相比，在其3，和/或5，端短一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選的，這些片段具有足以保留全長(zhǎng)版功能的長(zhǎng)度，即，在用于核酸擴(kuò)增的寡核苷酸引物的情況下，此類片段優(yōu)選的具有至少9個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，更優(yōu)選的至少12,最優(yōu)選的至少15個(gè)核苷酸。"基因"是基因組DNA的一部分，其編碼多肽。[OOlOOj"表達(dá)產(chǎn)物"是基因表達(dá)的產(chǎn)物，包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA，和翻譯產(chǎn)物，即多肽。本文中使用的"表達(dá)水平"涉及基因轉(zhuǎn)錄的程度?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方法學(xué)，確定本發(fā)明中的表達(dá)水平，例如，通過(guò)Northern印跡、轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴(kuò)增或其它已知技術(shù)，來(lái)確定特定mRNA的存在或量。還可以通過(guò)確定編碼蛋白質(zhì)的存在來(lái)確定表達(dá)水平，例如通過(guò)4吏用Western印跡、免疫染色、免疫沉淀或其它已知的技術(shù)。如本發(fā)明中公開的，還可以通過(guò)評(píng)估基因的外遺傳狀態(tài)，直接確定表達(dá)水平。啟動(dòng)子過(guò)度甲基化提示表達(dá)水平是低的或?qū)嵸|(zhì)上不存在的，而未甲基化的啟動(dòng)子區(qū)域提示目的基因是表達(dá)的。通過(guò)RT-PCT(mRNA)或Western印跡(蛋白質(zhì))，或通過(guò)甲基化特異的PCR(DNA片段)顯示，特定基因的啟動(dòng)子的曱基化程度與基因表達(dá)水平相關(guān)。本發(fā)明中使用的"基因負(fù)荷(geneload)"涉及細(xì)胞或含有細(xì)胞的樣品中的某一基因或基因組的拷貝數(shù)，特別是EBV基因組。換言之，表述"基因負(fù)荷"指細(xì)胞或生物學(xué)樣品中，某一基因的量，例如EBV基因EBNA1。所述量可以定性地確定，即，通過(guò)確定它比參照樣品的量更高、相等或更低；或定量地確定，例如通過(guò)與具有定義的拷貝數(shù)的參照比較，計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)。如本文中使用的，確定基因負(fù)荷還可以包括檢測(cè)基因的存在或缺失，所述基因例如EBNA1。在過(guò)去幾年中，發(fā)現(xiàn)病毒DNA負(fù)荷是后續(xù)臨床事件的良好預(yù)兆劑(prognosticator)(Tan等人，(2006)5AfCC"騰r6:227)。本文中示例性描述的發(fā)明可以適合在缺少任何一種或多種元件或一種或多種限制的條件下實(shí)踐，不特別限于本文公開的內(nèi)容。因此，例如術(shù)語(yǔ)"包括"、"包含"、"含有"等，應(yīng)該理解為廣泛地，不帶限制的。此外，本文中使用的術(shù)語(yǔ)和表述是作為說(shuō)明而非限制的術(shù)語(yǔ)使用的，此類術(shù)語(yǔ)和表述的使用沒(méi)有任何意圖排除所示和所描述特征的任何等價(jià)方式或其部分，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)存在不同的修飾。因此，應(yīng)該理解，雖然本發(fā)明特定的公開了優(yōu)選的實(shí)施方案和任選的特征，但是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以借助本文公開的發(fā)明的修飾和變化，從而此類修飾和變化也認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文已經(jīng)廣泛的、普遍的描述了發(fā)明。每種落入普遍公開內(nèi)容內(nèi)的更小的種類和亞屬也構(gòu)成發(fā)明的一部分。其包括具有附加條件或負(fù)限制的發(fā)明的普遍描述，所述條件或限制是從所述屬中去除任何主題，不論其是否是本文中特別敘述過(guò)的特定材料。[00109根據(jù)下列示例性實(shí)例和權(quán)利要求，發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將更顯而易見(jiàn)。應(yīng)該理解，實(shí)施例僅出于示例性的目的，不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例還通過(guò)常規(guī)的酚/氯仿方法從拭子的細(xì)胞沉淀中抽提基因組DNA。表1中總結(jié)了特異針對(duì)基因EBNA1、未甲基化的LMP1、甲基化RASSF1A、甲基化CHFR、甲基化DAPK和肌動(dòng)蛋白的PCR引物序列，以及預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小。對(duì)于PCR反應(yīng)，向^本積為25^1的PCR混合物中添加2jil的亞硫酸氫鹽修飾的DNA，所述混合物含有l(wèi)xPCR緩沖液、1.5mMMgCl2、lOOpmol的各種脫氧核苷三鱗酸、lOOpmol的各種使用的引物，和一單位的AmpiTaqGold(AppliedBiosystems,Branchburg，NJ)。在95"C實(shí)施PCR擴(kuò)增10分鐘，然后進(jìn)行34圏以下循環(huán)94匸下30秒，特異的退火溫度55X:下45秒，和72X:下90秒。每個(gè)反應(yīng)都包括陽(yáng)性的甲基化對(duì)照(Namalwa細(xì)胞DNA，每個(gè)細(xì)胞1份EBV基因組)、陰性甲基化對(duì)照(正常的鼻咽上皮組織)和空白水對(duì)照。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析MMSP產(chǎn)物，并將其用溴化乙錠染色。重復(fù)所有的實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)估結(jié)果的可重復(fù)性，與Namalwa細(xì)胞相比，半定量的評(píng)估EBVDNA負(fù)荷，其中Namalwa細(xì)胞^:個(gè)細(xì)胞1拷貝EBV基因組作為參照。[00124表2中描述了樣品評(píng)估產(chǎn)生的結(jié)果。表2.對(duì)NPC早期診斷和預(yù)后的評(píng)估<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>§:Y:NPC，N:非NPC;*:5-3是可以診斷為NPC，2:不確定；0:非NPC[00125EBVEBNA1基因存在于所有NPC中，但不存在于正常上皮細(xì)胞中。因此，其似乎對(duì)于診斷和預(yù)測(cè)NPC是關(guān)鍵的。LMP1在超過(guò)60。/。的NPC中表達(dá)。EBNA1和LMP1陽(yáng)性的樣品獲得100%確定的NPC診斷。為了診斷LMP1陰性樣品中的NPC，需要有陽(yáng)性的EBNA1，加上甲基化RASSF1A或同時(shí)甲基化CHFR/DAPK為陽(yáng)性。因此，NPC診斷的基準(zhǔn)是EBNA1的可檢測(cè)性，加上未甲基化LMP1、甲基化RASSF1A或甲基化CHFR/DAPK中任一項(xiàng)的可檢測(cè)性。[00126來(lái)自98例匹配的NPC(具有活組織檢查和拭子/刷子/漱口液)，35例不匹配的NPC活組織檢查，和34例正常對(duì)照樣品的結(jié)果，顯示對(duì)拭子樣品92。/。的癌癥檢測(cè)率，從而MMSP檢測(cè)方法的特異性是約90。/。(表3)。靈敏度等價(jià)于從105個(gè)細(xì)胞檢測(cè)出2個(gè)細(xì)胞，假陽(yáng)性和陰性少于5%。表3.匹配的NPC樣品中的MMSP結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>[00127因此，本發(fā)明首次提供了高特異性、高靈敏度、非侵入式的方法,用于EBV相關(guān)癌癥(例如鼻咽癌)的早期診斷。權(quán)利要求1.診斷受試者中EB病毒相關(guān)癌癥的方法，其包括(a)從所述受試者收集生物學(xué)樣品；(b)通過(guò)確定EBNA1基因負(fù)荷，以及至少一個(gè)選自EB病毒基因LMP1和細(xì)胞基因RASSF1A、CHFR和DAP的基因的表達(dá)水平，來(lái)確定所述生物學(xué)樣品中EB病毒基因負(fù)荷的量；和(c)將確定的所述生物學(xué)樣品中的所述基因的表達(dá)水平和參照比較。2、權(quán)利要求l的方法，其還包括在b)前，從所述生物學(xué)樣品中分離和純化DNAo3、4又利要求2的方法，其中分離和純化的DNA是基因組DNA。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)確定至少一個(gè)選自EB病毒基因LMP1和細(xì)胞基因RASSFIA、CHFR和DAP中的基因的外遺傳狀態(tài)，來(lái)確定表達(dá)水平。5、根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中外遺傳狀態(tài)是甲基化狀態(tài)。6、根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中甲基化狀態(tài)是通過(guò)甲基化特異性PCR(MSP)來(lái)確定的。7、根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中甲基化特異性PCR是多重甲基化特異性PCR(MMSP)。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7的任一項(xiàng)的方法，其還包括確定EBNA1的基因負(fù)荷，以及LMP1和RASSFIA的表達(dá)水平。9、根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其還包括確定CHFR和/或DAP的表達(dá)水平。10、根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其還包括確定對(duì)照基因的表達(dá)水平，作為樣品DNA質(zhì)量的對(duì)照。11、根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中將持家基因用作為對(duì)照基因。12、根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中使用肌動(dòng)蛋白和/或甘油醛-3肩酸脫氬酶(GAPDH)作為對(duì)照基因。13、根據(jù)權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)的方法，其中EB病毒相關(guān)癌癥選自B細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤，其包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，與免疫抑制相關(guān)的淋巴瘤，和致死性中線肉芽腫；癌癥，其包括鼻咽癌(NPC)、唾液腺癌、和胃腺癌；以及肉瘤，其包括平滑肌肉瘤。14、根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一項(xiàng)的方法，其中c)中的參照是正常組織。15、根據(jù)權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)的方法，其中，確定EBNA1的基因負(fù)荷包括使用至少兩種寡核苷酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:l或SEQIDNO:3中提出的核苷#列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4中提出的核苷,列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。16、根據(jù)權(quán)利要求1-15的任一項(xiàng)的方法，其中確定LMP1的表達(dá)水平包括利用至少兩種寡核苷酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中提出的核苷紗列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中提出的核苷,列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。17、根據(jù)權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)的方法，其中確定RASSF1A的表達(dá)水平包括利用至少兩種寡核普酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:9或SEQIDNO:ll中提出的核苷絲列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:10或SEQIDNO:12中提出的核苷紗列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。18、根據(jù)權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)的方法，其中確定CHFR的表達(dá)水平包括利用至少兩種寡核苷酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中提出的核苷,列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中提出的核香絲列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。19、根據(jù)權(quán)利要求1-18的任一項(xiàng)的方法，其中確定DAPK的表達(dá)水平包括利用至少兩種寡核苷酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:17或SEQIDNO:19中提出的核苷,列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中提出的核苷醋列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。20、根據(jù)權(quán)利要求12-19的任一項(xiàng)的方法，其中確定作為對(duì)照基因的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平包括利用至少兩種寡核苷酸引物，其中，第一種引物包括SEQIDNO:21中提出的核苷#列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段，第二種引物包括SEQIDNO:22中提出的核苷,列，或其變體、互補(bǔ)序列和片段。21、根據(jù)權(quán)利要求l-20的任一項(xiàng)的方法，其中生物學(xué)樣品選自鼻咽拭子、漱口液和體液。22、根據(jù)權(quán)利要求1-21的任一項(xiàng)的方法，其中受試者是哺乳動(dòng)物。23、根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中受試者是人。24、通過(guò)權(quán)利要求l-23的任一項(xiàng)的方法獲得的結(jié)果的用途，其用于發(fā)展針對(duì)EB病毒相關(guān)癌癥的預(yù)防性或治療性方案。25、寡核苷酸，其具有選自SEQIDNO:1-30提出的序列的核苷,列。26、用于診斷受試者中EB病毒相關(guān)癌癥的試劑盒，其包括至少一種用于確定EBNA1基因負(fù)荷的試劑，和至少一種用于確定至少一個(gè)選自EB病毒基因LMP1和細(xì)胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表達(dá)水平的試劑。27、根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其還包括用于確定參照基因的基因表達(dá)水平的試劑。28、根據(jù)權(quán)利要求26或27的試劑盒，其中用于檢測(cè)EBNA1基因負(fù)荷，至少一個(gè)選自EB病毒基因LMP1和細(xì)胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表達(dá)水平，和/或參照基因的表達(dá)水平的試劑是一種或多種寡核苷酸引物。29、根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其中一種或多種寡核苷酸引物包括SEQIDNO:l-30中提出的任一種核苷酸序列，或基本由上迷序列組成，或由上述序列組成。30、修飾DNA分子的方法，其中，DNA分子是變性的，與液體瓊脂糖混合，移入冷的液體中形成瓊脂糖珠，其中瓊脂糖珠含有變性的DNA分子，其中，隨后將獲得的瓊脂糖珠進(jìn)行后續(xù)的修飾和純化步驟。全文摘要本發(fā)明涉及診斷與受試者中EB病毒(EBV)感染相關(guān)的癌癥類型的方法，利用確定EBV基因負(fù)荷和一些分子標(biāo)志物的基因表達(dá)譜，所述標(biāo)志物是與EBV相關(guān)癌癥相關(guān)的病毒和細(xì)胞來(lái)源的。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101617056SQ200680056919公開日2009年12月30日申請(qǐng)日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者胡立夫申請(qǐng)人:伊諾基因卡爾生物技術(shù)私人有限公司