專利名稱：診斷癌癥的試劑及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學領域；更具體地，本發(fā)明涉及診斷癌癥的試劑及試劑盒。
背景技術：
DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，在哺乳動物中DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C) 5位上的碳被甲基化修飾成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG 二核苷酸是發(fā)生DNA甲基化主要的位點，它在基因組中呈不均勻分布。在一些區(qū)域，主要是基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，CpG高于正常概率，這些區(qū)段因此而被稱為CpG島。整個基因組范圍內(nèi)，約有60%以上基因的啟動子區(qū)含有CpG島?？傮w來說，在哺乳動物中5mC約占C總量的2-7%，因此而有了“第五種堿基”之稱。DNA甲基化在正常和異常的生理活動中起著重要的作用。它可以抑制基因的表達，參與對染色體的結(jié)構(gòu)維持，調(diào)節(jié)X染色體失活、基因印記、和轉(zhuǎn)座子沉默等重要細胞功能。TET1,全名 Ten-Eleven Translocation I。Tetl 是一個 2-0G,Fe++依賴性的 5mC加氧酶，可以將5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?-輕甲基胞卩密唳(5-HydroxymethyICytosine) (hmc)。同時,在大腦細胞中也發(fā)現(xiàn)了 hmc的存在。TETl的生物學功能仍不知道，由于Tetl是從急性骨髓狀白血病患者的十號衍生染色體中克隆出來的，而且易位至十一號染色體上，估計它與癌癥發(fā)生發(fā)展有關，但Tetl在癌癥中的作用仍不知道。hmc是1952年在噬菌體中發(fā)現(xiàn)的。1972年發(fā)現(xiàn)hmc也存在于哺乳動物中，它存在于小鼠和青蛙的腦DNA中，也存在于大鼠的腦和肝臟中，在腦中hmc大約占總胞嘧啶的20%，在肝臟組織里占總胞嘧啶的6% (40)。目前現(xiàn)有技術中，還沒有發(fā)現(xiàn)hmc與癌癥的相關性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供診斷癌癥的試劑及試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種5-羥甲基胞嘧啶用作檢測癌癥的標志物的用途。在一個優(yōu)選例中，所述的癌癥包括(但不限于):腦癌(如膠質(zhì)瘤)、鱗狀上皮癌(如食管癌、皮膚癌、頭頸癌等)、乳腺癌、胃癌、腸癌(如結(jié)腸癌、直腸癌)、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宮癌、胰腺癌、胸腺癌、精原細胞癌、肌肉瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種5-羥甲基胞嘧啶(hmc)的用途，用于制備檢測癌癥的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測癌癥包括:確定癌癥的嚴重程度或進行癌癥的分型。在另一優(yōu)選例中，所述的5-羥甲基胞嘧啶與載體蛋白連接，用于制備檢測癌癥的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗原，所述抗原包含載體蛋白(優(yōu)選沒有免疫原性的)，以及連接于載體蛋白上的一個或多個(如1-100個；更特別地如5、10、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 個)5_ 羥甲基胞嘧啶。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的抗原的用途，用于制備檢測癌癥的試劑。在本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性識別5-羥甲基胞嘧啶(hmc)的試劑的用途，用于制備檢測癌癥的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性識別5-羥甲基胞嘧啶的抗體(包括多克隆抗體或單克隆抗體)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種多克隆抗體，其特異性地識別5-羥甲基胞嘧啶。在另一優(yōu)選例中，所述的多克隆抗體的制備方法為:用所述的抗原免疫兔子，獲取免疫血清，純化后獲得所述的多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的多克隆抗體的制備方法為:將所述的抗原與弗氏佐劑混合(較佳地1:1混合)后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔1.5-3周(較佳地2周)免疫I次，免疫2-4次(較佳地3次)，從兔血清中分離多克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種單克隆抗體，其特異性識別5-羥甲基胞嘧啶，其由保藏號為CCTCC No:C201191的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一方面，提供一種雜交瘤細胞株，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為 CCTCC No:C201191o在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測癌癥的試劑盒，其中包括特異性識別
5-羥甲基胞嘧啶的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有:顯色劑等免疫組化試劑。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、MALD1-T0F 4800質(zhì)譜檢測未偶聯(lián)對照組BSA (下圖)和偶聯(lián)后產(chǎn)物hmc-BSA(上圖)的分子量。圖2、SDS-PAGE分離偶聯(lián)后產(chǎn)物(conju)、未偶聯(lián)對照組BSA(Control，Ctrl)和未經(jīng)過反應的BSA對照。圖3、MALD1-T0F 4800質(zhì)譜檢測未偶聯(lián)對照組OVA (control)和偶聯(lián)后各種產(chǎn)物的分子量。U-OVA、5mU-0VA、A-OVA, G-OVA, hmc-OVA分別是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、和5-羥甲基胞嘧啶偶聯(lián)到OVA上。圖4、紫外分光光度分析游離的KLH、hmc、KLH和hmc偶聯(lián)反應后產(chǎn)物的吸收峰，以判斷偶聯(lián)反應是否成功。圖5、免疫印跡檢測hmc兔多克隆抗體HMC-PA01的特異性。5mC或hmc (初始量分別為125納克)以2倍遞減量固定到膜上，與hmc兔多克隆抗體HMC-PA01 (上圖)或5mC抗體(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)(中圖)反應后，經(jīng)過二抗和顯色后顯不:hmc的兔多克隆抗體HMC-PAOl只識別hmc，基本不識別5-甲基胞嘧啶(5mC)(上圖)。而5mC抗體只認識5mC,不識別hmc (中圖)。Ponceau-S顯示各點含有稀釋物質(zhì)(下圖)。圖6、免疫熒光染色檢測hmc兔多克隆抗體HMC-PAOl的特異性。編碼Tetl和GFP的質(zhì)粒(mTETl-1res-GFP)被轉(zhuǎn)入細胞中，用DAPI染每個細胞的細胞核(左上圖)、hmc兔多克隆抗體HMC-PAOl染hmc (右上圖)、5mC抗體染5mC(左下圖)、綠色顯示mTETl-1res-GFP轉(zhuǎn)入的細胞(中下圖)，Merge是四個圖像重疊。圖7、hmc兔多克隆抗體可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES細胞(左圖)、293T(control)(中圖)、或轉(zhuǎn)入Tetl的293T細胞(Tetl)分別用5mC抗體(5mC)或hmc抗體(hmc)進行免疫共沉淀,沉淀的DNA經(jīng)Agarose膠分離后,用溴化乙錠染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗體對照。圖8、免疫印跡檢測hmc鼠單克隆抗體MA7的特異性。5mC或hmc (初始濃度分別為5納克)以10倍遞減量固定到膜上，與hmc鼠單克隆抗體MA7(上圖)、同時含有5mC抗體(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)和hmc鼠單克隆抗體MA7 (中圖)反應后，經(jīng)過二抗和顯色后顯示:hmc的鼠單克隆抗體只識別hmc，不識別5mC (上圖)。而5mC抗體認識5mC (中圖)。Ponceau-S顯示各點含有稀釋物質(zhì)(下圖)。圖9、免疫熒光染色檢測hmc鼠單克隆抗體MA7的特異性。編碼Tetl和GFP的質(zhì)粒(Tetl-1res-GFP)被轉(zhuǎn)入細胞中，用DAPI染每個細胞的細胞核(左上圖)、hmc鼠單克隆抗體MA7免疫染色(右上圖)、hmc兔多克隆抗體免疫染色(左下圖)、綠色顯示mTETl-1res-GFP轉(zhuǎn)入的細胞(中下圖)，Merge是四個圖像重疊。圖10、hmc鼠單克隆抗體可以被用于免疫共沉淀。293T(control)(左圖)和轉(zhuǎn)入Tetl的293T細胞(Tetl)分別用5mC抗體(5mC)或hmc抗體(hmc)進行免疫共沉淀,沉淀的DNA經(jīng)Agarose膠分離后,用溴化乙錠染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗體對照。圖11、hmc鼠單克隆抗體可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES細胞(左圖)、和腦組織(右圖)分別用5mC抗體(5mC)或hmc抗體(hmc)進行免疫共沉淀,沉淀的DNA經(jīng)Agarose膠分離后,用溴化乙錠染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗體對照。圖12、病理號200401486腎癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌組織和癌旁組織的腎癌組織切片用hmc抗體(左圖)或5mC抗體(右圖)進行免疫組化染色，癌旁組織有高水平的hmc (左圖右上角)，但癌組織基本檢測不到5-hmc (左圖右下角)。相反地，癌組織(右圖右上角)和其癌旁組織(右圖右下角)有相似的5mC水平。圖13、病理號200309294腎癌病人的組織經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn):癌旁組織(a)有高強度的hmc染色，但癌組織基本檢測不到hmc (b)。相反地，癌組織(c)和其癌旁組織(d)有相似強度的hmc染色。圖14、腎癌組織中hmc水平明顯下降。根據(jù)表一的定量積分方法，將著色強度和廣度乘積作為組織的hmc染色程度。每個圓圈代表一個癌組織，每個三角代表一個癌旁組織，兩條橫線分別是癌組織和癌旁組織hmc染色程度的平均值，癌旁組織有高水平的hmc，而癌組織中hmc水平明顯下降。圖15、hmc免疫組化染色病理號201003780和201004888的正常尿路上皮，hmc染色陽性。圖16、舉例說明膀胱癌病人組織hmc染色程度。hmc免疫組化染色病理號200216104(上圖)、200300702(中圖)、和200309678(下圖)膀胱癌病人的組織，它們的hmc染色程度分別為I分(陰性)、6分(弱陽性)、和9分(陽性)。圖17、膀胱癌組織中hmc水平與膀胱癌的嚴重程度相關聯(lián)。參照前述，將著色強度和廣度乘積作為染色程度，以顯示不同惡化程度膀胱癌的積分。橫線分別是不同惡化程度膀胱癌癌組織hmc染色程度的平均值，隨著惡化程度的加深，hmc水平不斷減少。LN1:低級別非浸潤性尿路上皮癌，Low:低級別尿路上皮癌，High:聞級別尿路上皮癌，H1:聞級別浸潤性尿路上皮癌。圖18、hmc免疫組化染色正常腦組織，DAPI染細胞核、NeuN染神經(jīng)細胞，神經(jīng)細胞hmc染色陽性。圖19、hmc免疫組化染色正常腦組織，DAPI染細胞核、GFAP染膠質(zhì)細胞，膠質(zhì)細胞hmc染色陽性。圖20、舉例說明膠質(zhì)瘤組織hmc染色程度。hmc免疫組化染色膠質(zhì)瘤病人的組織，它們的hmc染色程度分別為O分(A，0x0)、I分(B, 1x1)、4分(C，2x2)和9分(D，3x3)。圖21、膠質(zhì)瘤組織hmc免疫組化染色程度與膠質(zhì)瘤的癌癥嚴重程度相關聯(lián)。根據(jù)病理診斷級別把膠質(zhì)瘤分成4級:1、I1、III和IV級。參照所述積分方法，對膠質(zhì)瘤組織hmc染色結(jié)果進行定量積分分析，以著色強度和廣度乘積作為染色程度，以顯示不同惡化程度膀胱癌的積分。橫線分別是不同惡化程度膠質(zhì)瘤癌組織hmc染色程度的平均值，隨著惡化程度的加深，hmc水平不斷減少。A，第一組55例病人樣品，B，第二組103例病人樣品。圖22、膠質(zhì)瘤癌組織中hmc水平可以判斷膠質(zhì)瘤癌癥病人的存活時間。根據(jù)膠質(zhì)瘤癌組織hmc染色結(jié)果把病人分成分成陰性(2分及以下)、弱陽性(3-4分)、陽性(6分及以上)，然后繪制每一類病人的Kaplan-Meier生存時間曲線。A，第一組55例病人樣品，B，第二組103例病人樣品。圖23、病理診斷嚴重程度相同的癌癥病人可以通過hmc水平進一步分型。第一組55例病人和第二組103例病人樣品合在一起，Kaplan-Meier生存時間曲線分別分析病理診斷為II級癌癥樣品㈧或III級癌癥樣品⑶。圖24、乳腺癌組織hmc免疫組化染色。兩例包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的乳腺癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，癌旁組織中正常乳腺導管細胞hmc染色呈陽性，但其相鄰的癌組織hmc染色呈陰性。圖25、乳腺癌組織hmc免疫組化染色。4例乳腺癌組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中hmc水平有不同程度的下降。圖26、前列腺癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的前列腺癌組織切片用hmc抗體(上圖)或5mC抗體(下圖)進行免疫組化染色，癌旁組織有高水平的hmc (左上圖)，但癌組織基本檢測不到hmc (右上圖)。相反地，癌組織(右下圖)和其癌旁組織(左下圖)有相似的5mC水平。圖27、前列腺癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左圖)和癌組織(右圖)的前列腺癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，癌旁組織有高水平的hmc (左圖)，盡管癌組織基本檢測不到hmc，但仍有一些細胞含有低水平的hmc (右圖)。
圖28、結(jié)腸癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(右邊圖)和癌組織(左邊圖)的結(jié)腸癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，部分正常結(jié)腸腺體細胞hmc染色呈陽性，但癌組織基本檢測不到hmc。圖29、兩例結(jié)腸癌組織的hmc免疫組化染色，癌組織喪失了 hmc。圖30、胃癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的胃癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，正常胃腺體細胞hmc染色呈陽性，但癌組織基本檢測不到hmc。圖31、直腸癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的直腸癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，正常腺體細胞有一定的hmc染色，但癌組織基本檢測不到hmc。圖32、子宮癌組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的子宮癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，癌旁組織中正常平滑肌細胞hmc染色呈陽性，但來源于同一病人的癌組織hmc染色呈陰性(上圖)。在另一例中，癌旁組織中正常子宮鱗狀上皮和間質(zhì)細胞有一定的hmc染色，但來源于同一病人的子宮鱗癌組織hmc染色呈陰性。圖33、平滑肌肉瘤組織的hmc免疫組化染色。包含有癌旁組織(左邊圖)和癌組織(右邊圖)的平滑肌肉瘤組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，癌旁組織中正常平滑肌細胞有一定的hmc染色，但來源于同一病人的癌組織hmc染色呈陰性(上圖)。圖34、肺癌組織的hmc免疫組化染色。肺癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，大部分癌組織hmc染色呈陰性。圖35、肝癌組織的hmc免疫組化染色。肝癌組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，癌組織hmc染色呈陰性。圖36、白血病組織的hmc免疫組化染色。白血病細胞用hmc抗體進行免疫組化染色，M2型非淋巴性白血病hmc染色呈陽性或弱陽性，但M4型非淋巴性白血病hmc染色呈陰性。圖37、淋巴瘤組織的hmc免疫組化染色。淋巴瘤組織切片用hmc抗體進行免疫組化染色，癌組織hmc染色呈陰性。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次揭示5-羥甲基胞嘧啶(hmc)在組織中的存在情況與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關，組織中hmc水平明顯下降提示癌癥的發(fā)生或發(fā)展；并且hmc水平的高低還能指示癌癥的嚴重程度。因此，檢測hmc的試劑可良好地應用于癌癥的診斷、預后或分型，具有很高的臨床應用價值。如本文所用，所述的“癌癥”是指多種癌癥，只要其癌組織中hmc的水平明顯下降(如明顯低于癌旁組織)。較佳地，所述的癌癥包括(但不限于):腦癌(如膠質(zhì)瘤)、鱗狀上皮癌(如食管癌、皮膚癌、頭頸癌等)、乳腺癌、胃癌、腸癌(如結(jié)腸癌、直腸癌)、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宮癌、胰腺癌、胸腺癌、精原細胞癌、肌肉瘤。如本文所用，所述的“診斷癌癥”包括:確定癌癥的發(fā)生、確定癌癥的發(fā)展、確定癌癥的嚴重程度、對癌癥進行預后、進行癌癥的易感性分析，進行癌癥的分型等。Hmc及其用途5_輕甲基胞卩密唳(5-HydroxymethyI Cytosine,hmc)為一種小分子化合物。它以共價形式連接于DNA鏈的胞嘧啶上，前人研究發(fā)現(xiàn)其存在于哺乳動物的腦和肝臟中，并存在于胚胎干細胞中。本發(fā)明人第一次揭示hmc在組織中的存在情況與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關，組織中hmc水平明顯下降提示癌癥的發(fā)生或發(fā)展；并且hmc水平的高低還能指示癌癥的嚴重程度，hmc水平越低預示著癌癥越嚴重?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以利用hmc:(i)進行癌癥的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析；( )評估相關人群的癌癥治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評估相關人群癌癥患病風險，早期監(jiān)測早期預防等。在得知了 hmc與癌癥的相關性后，可方便地基于此來診斷癌癥。任何可鑒定出組織中hmc表達情況的方法都包含在本發(fā)明中。這些鑒定方法是本領域技術人員所熟知的，較為經(jīng)典的例如是免疫組化方法或免疫共沉淀方法。免疫組化(Immunohistochemistry)是本領域技術人員所熟知的技術，即應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量。免疫組化方法一般是用標記的特異性抗體(或抗原)對組織內(nèi)抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測。免疫共沉淀(Co-1mmunoprecipitation)也是本領域技術人員所熟知的技術,其是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎 的用于研究蛋白質(zhì)相互作用或蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與DNA在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。識別Hmc的試劑及其用途所述的hmc可用于制備診斷癌癥的試劑。由于hmc為小分子化合物，具有較弱的免疫原性，因此，優(yōu)選地將hmc作為半抗原連接(偶聯(lián)或附著)到載體蛋白上，制備具有免疫原性的抗原。所述的載體蛋白是本身沒有或具有較低的免疫原性的一類生物大分子，例如所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)。所述的抗原免疫動物可獲得特異性識別hmc的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的抗原可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生，所述的動物如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:292,1976 ； Hammer I ing 等人，InMonoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y., 1981)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的單克隆抗體由保藏號為CCTCC No:C201191的雜交瘤細胞株產(chǎn)生，經(jīng)測其識別抗原的特異性良好。所述的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測標本中的hmc水平，從而用于診斷癌癥。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了一種多克隆抗體，該抗體的制備方法如下^fhmc偶聯(lián)牛血清白蛋白(BSA)，獲得免疫抗原，將所述免疫抗原與弗氏佐劑混合后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔2周免疫I次，免疫3次，從兔血清中分離多克隆抗體。該抗體特異性好，檢測靈敏度高，準確性高，可良好地應用于免疫組織化學檢測。試劑盒本發(fā)明還提供了用于診斷癌癥的試劑盒，該試劑盒包括:特異性識別5-羥甲基胞嘧啶的試劑。所述的試劑例如是:單克隆抗體或多克隆抗體。此外，所述的試劑盒中還可含有:用于免疫組織化學分析的試劑，所述的試劑例如:染色劑、顯色劑等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:(I)首次揭示hmc可以作為診斷癌癥的標志物，其可廣譜地用于多種癌癥的診斷，且可指示癌癥的嚴重程度；對于一些癌癥還能作為分型的依據(jù)。(2)首次制備出了特異性識別hmc的試劑，所述試劑特異性好，檢測靈敏度高，準確性高，具有良好的臨床應用價值。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、5_輕甲基胞喃唳(hmc)抗原的制備5-羥甲基胞嘧啶(hmc)是小分子化合物，直接注射入兔子、大鼠、小鼠或其它免疫動物的體內(nèi)不足以引起抗原抗體免疫反應。因此，本發(fā)明人把hmc作為半抗原偶聯(lián)到BSA (牛血清白蛋白)、OVA (卵清白蛋白)、KLH(血藍蛋白)等載體蛋白上，然后再將其注射入兔子、小鼠等免疫動物體內(nèi)制備識別hmc的多抗，并通過與克隆細胞的融合和篩選，制備識別hmc的單抗。1.牛血清白蛋白BSA與5-羥甲基胞嘧啶hmc偶聯(lián)的方法和產(chǎn)物檢測(I)稱取 IOmg hmc (PY7596, Berry & Associates, Inc.USA)，放入 1.5ml 的 Ep 管中；(2)加入500 μ I 0.1M的NaIO4,與hmc室溫下暗處反應20min ；(3)加入30 μ I IM的乙二醇，室溫下反應5min，以反應掉多余的NaIO4 ；(4)將上述反應混合液加入到Iml 28mg/ml的BSA溶液中(稱取28mg BSA粉末(北京鼎盛，lot:15310450),用Iml雙蒸水(Mill1-Q級別的水也可)溶解，再用5% (w/v)的K2CO3調(diào)節(jié)PH至9.1-9.5，現(xiàn)用現(xiàn)配)，邊攪動邊調(diào)節(jié)PH，確保PH保持在9.1-9.5，室溫下反應45min ；(5)加入 Iml 15mg/ml 的 NaBH4,室溫下反應 18h ；(6)加入500 μ I IM的甲醇，室溫下反應lh，以反應掉多余的NaBH4 ；
(7)加入 350-450 μ I IM 的氨水，調(diào)節(jié) PH 至 8.5 ;(8)反應液在流動的水中透析IOh ；(9)質(zhì)譜或者SDS-PAGE檢測確定hmc成功地被偶聯(lián)到BSA上。MALD1-T0F 4800質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)未偶聯(lián)的對照組BSA分子量是66809，但偶聯(lián)后產(chǎn)物的分子量變成了 69022(圖1)。由于偶聯(lián)后一個hmc分子量是(274-18)，因此，平均一個BSA 分子上偶聯(lián)的 hmc 數(shù)目為:(69022-66809) / (274-18) = 8.3 個。通過SDS-PAGE把未偶聯(lián)對照組BSA和偶聯(lián)后產(chǎn)物分離開來,用Coomassic染色發(fā)現(xiàn):反應后BSA比未偶聯(lián)對照組BSA移動慢,說明反應后hmc已經(jīng)被成功地偶聯(lián)到BSA上(圖 2)。2.卵清白蛋白OVA與5-羥甲基胞嘧啶hmc偶聯(lián)的方法(I)稱取 5mg hmc,放入 1.5ml 的 Ep 管中；(2)加入500 μ I 0.1M的NaIO4,與hmc室溫下暗處反應20min ；(3)加入30μ1 IM的乙二醇，室溫下反應5min，以反應掉多余的NaIO4;(4)將上述反應混合液加入到Iml 28mg/ml的OVA溶液中(稱取28mg OVA粉末(Sigma，A5503-lG)，用Iml雙蒸水(Mill1-Q級別的水也可)溶解，再用5%的K2CO3調(diào)節(jié)PH至9.1-9.5，現(xiàn)用現(xiàn)配)，邊攪動邊調(diào)節(jié)PH，確保PH保持在9.1-9.5，室溫下反應45min ；(5)加入 Iml 15mg/ml 的 NaBH4,室溫下反應 18h ；(6)加入500 μ I IM的甲醇，室溫下反應lh，以反應掉多余的NaBH4 ；⑵加入350_450μ I IM的氨水，調(diào)節(jié)PH至8.5 ;(8)反應液在流動的水中透析IOh ；(9)質(zhì)譜檢測確定hmC成功地被偶聯(lián)到OVA上(圖3)。同樣方法，通過調(diào)整摩爾比例，可以把不同的堿基偶聯(lián)到OVA上(表I)。表1、不同堿基偶聯(lián)到OVA上所使用的摩爾比例
權(quán)利要求
1.一種5-羥甲基胞嘧啶用作檢測癌癥的標志物的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌癥包括:腦癌、鱗狀上皮癌、乳腺癌、胃癌、腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宮癌、胰腺癌、胸腺癌、精原細胞癌、肌肉瘤。
3.一種5-羥甲基胞嘧啶的用途，用于制備檢測癌癥的試劑。
4.按權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的檢測癌癥包括:確定癌癥的嚴重程度或進行癌癥的分型。
5.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的5-羥甲基胞嘧啶與載體蛋白連接，用于制備檢測癌癥的試劑。
6.按權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血監(jiān)蛋白。
7.一種抗原，其特征在于，所述抗原包含載體蛋白，以及連接于載體蛋白上的一個或多個5-羥甲基胞嘧啶。
8.按權(quán)利要求7所述地抗原，其特征在于，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血監(jiān)蛋白。
9.權(quán)利要求7或8所述的抗原的用途，用于制備檢測癌癥的試劑。
10.一種特異性識別5-羥甲基胞嘧啶的試劑的用途，用于制備檢測癌癥的試劑盒。
11.按權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性識別5-羥甲基胞嘧啶的抗體。
12.一種多克隆抗體，其特異性地識別5-羥甲基胞嘧啶。
13.按權(quán)利要求12所述的多克隆抗體，其特征在于，其制備方法為:用權(quán)利要求5所述的抗原免疫兔子，獲取免疫血清，純化后獲得所述的多克隆抗體。
14.一種單克隆抗體，其特異性識別5-羥甲基胞嘧啶，其由保藏號為CCTCC No:C201191的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。
15.一種雜交瘤細胞株，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為CCTCCNo:C201191。
16.一種用于檢測癌癥的試劑盒，其中包括特異性識別5-羥甲基胞嘧啶的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷癌癥的試劑及試劑盒。本發(fā)明首次揭示5-羥甲基胞嘧啶(hmc)在組織中的存在情況與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關，組織中hmc水平明顯下降提示癌癥的發(fā)生或發(fā)展；并且hmc水平的高低還能指示癌癥的嚴重程度。因此，檢測hmc的試劑可良好地應用于癌癥的診斷、預后或分型，具有很高的臨床應用價值。
文檔編號C07K14/795GK103091492SQ20111034658
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者陳德桂, 張豐, 劉一帆 申請人:中國科學院上海生命科學研究院