專利名稱：：二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生產(chǎn)的制作方法二甲基二硫醚在微生物中用于曱硫氨酸生產(chǎn)相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2005年7月18日提交的標(biāo)題為"二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生產(chǎn)"(UseofDimethylDisulfideforMethionineProductioninMicrorganisms)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/700,698和2005年9月1日提交的標(biāo)題為"二甲基二硫醚在微生物中用于甲硫氨酸生產(chǎn)"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/713，卯7的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)涉及2005年7月18日提交的標(biāo)題為"使用芽孢桿菌il^J基因提高微生物中的甲硫氨酸產(chǎn)量，，(Useofa5""7/wsM^/GenetoImproveMethionineProductioninMicroorganisms)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/700,557和2005年9月1日提交的標(biāo)題為"使用芽孢桿菌AfW/基因提高孩l生物中的甲硫氨酸產(chǎn)量"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/60/713,905。本申請(qǐng)還涉及2005年9月1日提交的標(biāo)題為"產(chǎn)生甲硫氨酸的重組微生物"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/714，042和2005年7月18日提交的標(biāo)題為"產(chǎn)生甲硫氨酸的重組微生物"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/700,699。將這些專利申請(qǐng)的完整內(nèi)容都明確引入本文作為參考，所述內(nèi)容包括說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)和摘要，以及其附圖、表或者圖。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前通過(guò)良好建立的化學(xué)方法以DL-甲硫氨酸外消旋混合物產(chǎn)生曱硫氨酸，所述方法涉及毒性的、危險(xiǎn)的、易燃的、不穩(wěn)定的和毒性物質(zhì)或者中間體。用于甲硫氨酸的化學(xué)生產(chǎn)的原材料是丙烯醛、曱硫醇和氰化氬。甲硫氨酸的化學(xué)合成涉及甲硫醇和丙烯醛反應(yīng)，產(chǎn)生中間體3-曱基巰基丙醛(MMP)。其他處理涉及將MMP與氰化氫反應(yīng)形成5-(2-甲硫基乙基)乙內(nèi)酰脲，其然后使用苛性劑如NaOH以及Na2C03、NBb和C02水解。隨后，將DL-曱硫氨酸鈉用硫酸和Na2C03中和以產(chǎn)生DL-甲硫氨酸、Na;jS04和co2。該方法與產(chǎn)生的甲疏氨酸的量相比產(chǎn)生過(guò)量的不使用的化合物，其造成經(jīng)濟(jì)和生態(tài)學(xué)挑戰(zhàn)。用于曱硫氨酸生產(chǎn)的發(fā)酵方法通常基于用營(yíng)養(yǎng)物，包括糖源，例如，糖，如葡萄糖、果糖或者蔗糖，氮源，例如，銨和硫源，例如，疏酸鹽或者硫代硫酸鹽，以及其他不必要的培養(yǎng)基組分培養(yǎng)微生物。該方法產(chǎn)生L-曱硫氨酸和作為副產(chǎn)物的生物量，使用沒(méi)有毒性危險(xiǎn)的、易燃的、不穩(wěn)定的和/或有害的原材料。然而，為了生物(例如，微生物)從作為疏源的硫酸鹽產(chǎn)生曱硫氨酸，硫原子必須首先被還原成硫化物。該過(guò)程是能量密集的，因此，對(duì)微生物輸送比硫酸鹽進(jìn)一步還原的硫源將改善該過(guò)程。一種此類還原的硫源是硫代硫酸鹽，其中兩個(gè)硫原子的一個(gè)已經(jīng)被還原。經(jīng)還原的硫的另一來(lái)源是甲硫醇，其含有完全還原的硫原子。使用甲硫醇產(chǎn)生甲疏氨酸提供了兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，如上文提到的，已經(jīng)產(chǎn)生了硫原子。其次，提供了曱基，其可以潛在避免對(duì)甲硫氨酸生物合成通常需要的兩種酶甲基四氫葉酸還原酶(MetF)和甲硫氨酸合酶(MetE和/或MetH)的需要。有文獻(xiàn)報(bào)道公開(kāi)一些微生物，如釀酒酵母(S"cc/ia/7附j(luò);cMcei^v/s/fle)可以通過(guò)將曱石危醇與O曙乙?；呓z氨^A應(yīng)將甲硫醇直接摻入甲石克氨酸中(Yamagata，S.1971.丄祝oc/^柳.(Tokyo)70:1035)。在曱硫氨酸生產(chǎn)中使用曱硫醇的方法也公開(kāi)在WO93/17112和WO2004/076659中。然而，使用甲硫醇產(chǎn)生甲硫氨酸也具有缺點(diǎn)。它是毒性的、爆炸性氣體，容易在空氣中氧化，并且是有毒的。產(chǎn)生曱硫氨酸的化學(xué)方法還使用甲硫醇作為底物之一，因此，工程師已經(jīng)知道在工業(yè)規(guī)模處理該化合物。但是，不使用甲硫醇生產(chǎn)甲硫氨酸的改進(jìn)方法將有很大益處。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生曱硫氨酸的改進(jìn)方法(例如，微生物合成)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同于甲硫醇的硫和/或甲基來(lái)源可以用于產(chǎn)生甲辟u氨酸。具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以將二甲基二硫醚(DMDS)(也稱作二甲二硫或者CHb-S-S-CH3)加入培養(yǎng)基并被微生物用作硫化物和甲基來(lái)源，避免對(duì)MetH/MetE和MetF活性的需要和還原硫酸鹽以合成甲硫氨酸的需要。此外，本發(fā)明闡明具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑，例如失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸石克化氫解酶，和/或失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和/或失調(diào)的高絲氨酸脫氫酶的微生物可以使用曱基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基來(lái)源，如二甲基二硫醚(DMDS)用于合成甲硫氨酸。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)積累O-乙?；呓z氨酸的工程化的原養(yǎng)型菌林的甲硫氨酸產(chǎn)量通過(guò)加入DMDS而得到提高。因此，一方面，本發(fā)明描述了生產(chǎn)曱硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基來(lái)源，如二甲基二硫醚(DMDS)的存在下培養(yǎng)敞生物，使得產(chǎn)生甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或曱基來(lái)源，如DMDS以0.02%或更高濃度存在于培養(yǎng)物中。在另一實(shí)施方案中，曱基封端的硫醚化合物，例如疏和/或甲基來(lái)源，如DMDS以0.06%或更高濃度存在于培養(yǎng)物中。在其他實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚化合物，例如硫和/或曱基來(lái)源選自二甲基三硫(DMTS)或CH3-S-S-S-CH3、二曱基四硫(DMTTS)或CH3-S-S-S-S-CH3，或硫醚的更高分子量聚合物，其末端由甲基封端。本發(fā)明的另一方面描述了產(chǎn)生曱硫氨酸的方法，其包括在緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)存在下培養(yǎng)產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如，緩釋硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如，DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)是AmberliteTMXAD4。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋遞送系統(tǒng)以培養(yǎng)基中總共0.1。/o或更高水平釋放DMDS。在再一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋遞送系統(tǒng)以培養(yǎng)基中總共0.3%或更高水平釋放DMDS。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋DMDS遞送系統(tǒng)包含與水不溶混但是溶解DMDS的液體。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)包含選自動(dòng)物油、礦物油、化學(xué)油、植物油、合成油、有機(jī)溶劑、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物或者其組合的液體。在另一實(shí)施方案中，緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如硫和/或曱基遞送系統(tǒng)，例如DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)包含與水不溶混但是溶解曱基封端的硫醚化合物，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如DMDS的液體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋曱基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如硫和/或曱基遞送系統(tǒng)，例如DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)是甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源的緩慢受控的進(jìn)料，例如緩慢受控的DMDS進(jìn)料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如DMDS緩釋遞送系統(tǒng)是膜，其對(duì)于甲基封端的硫醚，例如硫和/或曱基來(lái)源，例如DMDS是可滲透的。在另一實(shí)施方案中，DMDS緩釋系統(tǒng)遞送氣態(tài)的DMDS,例如，通過(guò)蒸發(fā)或者沸騰液體DMDS，或者通過(guò)例如在通向發(fā)酵容器的路上通過(guò)液體DMDS鼓空氣或者氧氣泡進(jìn)行遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物屬于棒桿菌屬(Cwy"W"cfei77i柳)。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物是谷氨酸棒桿菌(Go;we6tfcfeWw附g/"to/m'cw附)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌或者相關(guān)的腸細(xì)菌)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌(5fl"7/附sM&f7&)或者相關(guān)的芽孢桿菌)、酵母(例如，釀酒酵母(S"cc^afw^cMce"Ww'ae)或者相關(guān)的酵母菌林)，和古細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物具有至少一種失調(diào)的甲硫氨酸生物合成酶。在另一實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。在再一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物具有至少兩種失調(diào)的曱硫氨酸生物合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和失調(diào)的高絲氨酸脫氫酶。在另一實(shí)施方案中，微生物具有失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶和失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的另一方面描述了產(chǎn)生曱疏氨酸的方法，其包括在曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如，二曱基二疏醚(DMDS)的存在下培養(yǎng)具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述孩支生物屬于棒桿菌。在另一實(shí)施方案中，微生物是谷氨酸棒桿菌。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌或者相關(guān)的腸細(xì)菌)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌(5fl"7/船sw^/fo)或者相關(guān)的芽孢桿菌)、酵母(例如，g良酒酵母(5Vicrc/^附^CMce/rWwVie)或者相關(guān)的酵母菌林)，和古細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。在另一實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和失調(diào)的高絲氨酸脫氫酶。在再一實(shí)施方案中，微生物具有失調(diào)的O-乙酰基高絲氨酸硫化氬解酶和失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的再一方面描述了根據(jù)上述任一方法合成的產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面描述了用于在曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如，二甲基二硫醚(DMDS)的存在下產(chǎn)生甲硫氨酸的重組微生物，所述微生物具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所迷微生物屬于棒桿菌。在另一實(shí)施方案中，微生物是谷氨酸棒桿菌。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌或者相關(guān)的腸細(xì)菌)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌(5fla7/肌SM6說(shuō)&)或者相關(guān)的芽孢桿菌)、酵母(例如，釀酒酵母Oyflcc/^iwf^c^cereWs/"e)或者相關(guān)的酵母菌林)，和古細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的O曙乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。在另一實(shí)施方案中，所述微生物具有失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和失調(diào)的高絲氨酸脫氬酶。在再一實(shí)施方案中，微生物具有失調(diào)的O-乙酰基高絲氨酸石克化氫解酶和失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的再一個(gè)方面描述了鑒定甲硫氨^A饋抗性的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶和/或o-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶和/或編碼所述甲硫氨M饋抗性酶的基因(例如，突變基因或者等位基因)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了鑒定抵抗甲硫氨酸反饋抑制的編碼o-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶和/或o-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶的突變等位基因的方法，其包括a)將依賴于DMDS與質(zhì)粒編碼O-乙?；呓z氨酸硫化氬解酶和/或O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶以在無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物與抑制所述微生物生長(zhǎng)的甲硫氨酸類似物接觸，b)選擇所述微生物的抗所述類似物的突變變體，c)分離所述突變變體，其中所述抗性表型由所述質(zhì)粒編碼，和d)測(cè)定所述質(zhì)粒的相關(guān)部分的DNA序列以鑒定突變質(zhì)粒，該質(zhì)粒在所述O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或O-琥珀酰高絲氨酸石危化氫解酶的編碼區(qū)中具有改變的序列。本發(fā)明還描述了通過(guò)該方法分離的新的突變的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶、編碼所述突變酶的基因，以及含有所述突變酶的生物。附圖簡(jiǎn)述圖l是甲硫氨酸生物合成途徑的圖示。甲硫氨酸生物酶以粗體描繪并且它們對(duì)應(yīng)的基因以斜體指出。圖2是pH273載體的示意圖。圖3是pH373載體的示意圖。圖4是pH304載體的示意圖。圖5是pH399載體的示意圖。圖6是pH484載體的示意圖。圖7是pH491載體的示意圖。圖8A-8B是使用質(zhì)粒H215,缺失w"F部分之前(8A)和之后(8B)，附WF區(qū)中谷氨酸棒桿菌染色體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9是載體pOM86的示意圖，該載體是設(shè)計(jì)用來(lái)用大觀霉素抗性盒破壞谷氨酸棒桿菌附WF基因的質(zhì)粒。圖10是pH469載體的示意圖。圖11是pH300載體的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)用于產(chǎn)生曱疏氨酸的改進(jìn)方法(例如，微生物合成)。如本文所述的，通過(guò)化學(xué)方法產(chǎn)生甲硫氨酸當(dāng)前使用有毒和危險(xiǎn)的化學(xué)品，如甲硫醇作為硫源。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)和毒性較低的硫源可以用于甲硫氨酸的生物合成產(chǎn)生。具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，如二甲基二硫醚(DMDS)，也稱作二曱二石?？梢约尤氲脚囵B(yǎng)基中并被微生物使用。如所附實(shí)施例中所述，谷氨酸棒桿菌的A附WF菌林或A附e&Aw^^菌林可以使用甲基封端的石克醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，如二甲基二硫醚(DMDS)作為硫醚和甲基的來(lái)源，避免了為合成甲硫氨酸而對(duì)MetH/MetE和MetF活性的需要和對(duì)還原硫酸鹽的需要。甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，如二甲基二硫醚用于產(chǎn)生甲硫氨酸提供了甲硫醇的多數(shù)優(yōu)點(diǎn)但是沒(méi)有其多數(shù)缺點(diǎn)。DMDS是甲硫醇的氧化的二硫醚二聚體，其是石油蒸餾工業(yè)的相對(duì)廉價(jià)的副產(chǎn)物。它在室溫是液體，沸點(diǎn)為約109。C。DMDS難溶于水；如果以0.1。/?；蚋邼舛?，尤其以0.3%或更高濃度加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基，那么多數(shù)DMDS作為油保留在容器的底部或者側(cè)面。此外，本發(fā)明闡明MetY(也稱作MetZ;O-乙?；?高絲氨酸硫化氬解酶)是將甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS直接或間接摻入曱硫氨酸的酶，因?yàn)楣劝彼岚魲U菌的Am^FA附e訪菌抹可以使用甲基封端的硫醚，例如疏和/或甲基來(lái)源，如DMDS作為二硫醚和曱基兩者的來(lái)源。此外，通過(guò)加入甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS提高了積累O-乙?；呓z氨酸的工程化原養(yǎng)型菌林的甲硫氨酸產(chǎn)量。因此，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生甲硫氨酸的方法和微生物。為了可以更容易地理解本發(fā)明，在本文首先定義一些術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)"甲硫氨酸生物合成途徑"包括涉及在甲硫氨酸的形成和合成中利用的甲石克氨酸生物合成酶(例如，生物合成酶編碼基因編碼的多肽)、化合物(例如，前體、底物、中間物或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術(shù)語(yǔ)"甲硫氨酸生物合成途徑"包括導(dǎo)致微生物中甲硫氨酸的合成(例如，體內(nèi))的生物合成途徑以及導(dǎo)致體外甲硫氨酸合成的生物合成途徑。術(shù)語(yǔ)"甲硫氨酸生物合成酶"包括甲硫氨酸生物途徑的化合物(例如，中間物或產(chǎn)物)形成中利用的任何酶。"甲硫氨酸生物合成酶"包括涉及例如"轉(zhuǎn)硫作用途徑"和"直接巰基化途徑"、曱硫氨酸合成的替代途徑的酶。例如，大腸桿菌利用轉(zhuǎn)硫作用途徑，而其他微生物如釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌和這些微生物的近親已經(jīng)發(fā)展了直接巰基化途徑。盡管許多微生物使用轉(zhuǎn)硫作用途徑或者直接巰基化途徑之一，而不是兩種途徑，但是一些微生物，如谷氨酸棒桿菌使用兩種途徑用于甲硫氨酸合成。"甲硫氨酸生物合成酶"包括通常在微生物中發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)曱硫氨酸產(chǎn)生的所有酶。表1列出了甲硫氨酸生物合成途徑中的多種酶和編碼它們的對(duì)應(yīng)的基因，并且圖l描繪了曱硫氨酸生物合成途徑的圖示。可以理解在一些孩吏生物中，編碼對(duì)應(yīng)酶的基因的名稱可以與本文所列的名稱不同。^丄'產(chǎn)碗肩凝_^參^4途徑尹^雜#竊竭它//7#差西酶基因天冬氨酸激酶osA:高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶附c汰高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶胱硫醚Y-合成酶膨詔胱硫醚p-裂合酶附CCo-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶0-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶附CZ維生素B『依賴性甲硫氨酸合酶維生素B『獨(dú)立的曱硫氨酸合酶附c必N"、亞甲基-四氫葉酸還原酶附"F^-腺苷曱硫氨酸合酶附C根據(jù)圖1，甲硫氨酸從草酰乙酸(OAA)的合成通過(guò)中間物天冬氨酸磷酸天冬氨酸和天冬氨酸半醛進(jìn)行。天冬氨酸半醛被高絲氨酸脫氫酶(b/W基因的產(chǎn)物，在其他生物中也稱作/7^4,附d，AW爭(zhēng))轉(zhuǎn)變成高絲氨酸。土、、'在轉(zhuǎn)硫作用途徑中，高絲氨酸被高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(柳WAT基因的產(chǎn)物，有時(shí)也稱作附e")通過(guò)加入乙酰CoA轉(zhuǎn)變成O-乙酰高絲氨酸，或者被基因的產(chǎn)物(高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶)通過(guò)加入琥珀酰CoA轉(zhuǎn)變成O-琥珀酰高絲氨酸。通過(guò)胱硫醚v-合酶(附e詔基因的產(chǎn)物)，來(lái)自半胱氨酸的硫基團(tuán)供給O-乙酰高絲氨酸或者O-琥珀酰高絲氨酸產(chǎn)生了胱硫醚。然后胱硫醚被w^C基因(在一些生物中也稱作^cD基因)的產(chǎn)物胱硫醚p誦裂合酶轉(zhuǎn)變成高半胱氨酸。在直接巰基化途徑中，w"y基因(有時(shí)稱作w^Z基因)的產(chǎn)物O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶催化硫醚直接加入O-乙酰高絲氨酸而形成高半胱氨酸。通過(guò)附WZ基因基因的產(chǎn)物O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶將一-硫醚基向O-琥珀酰高絲氨酸的直接加入，也可以在直接的巰基化途徑中形成高半胱氨酸。不管使用轉(zhuǎn)石克作用途徑還是直接巰基化途徑的那種途徑，通過(guò)維生素812-依賴的曱硫氨酸合酶(/Me很基因的產(chǎn)物)或者B『獨(dú)立的曱硫氨酸合酶(/w"五基因的產(chǎn)物)，通過(guò)加入甲基從高半胱氨酸隨后產(chǎn)生甲硫氨酸。甲硫氨酸的甲基由甲基-四氬葉酸(甲基-THF)供給，曱基-四氬葉酸又通過(guò)m^F基因產(chǎn)物催化的反應(yīng)中還原亞甲基-THF產(chǎn)生。一方面，本發(fā)明描述了產(chǎn)生曱硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚，例如硫和/或曱基來(lái)源，優(yōu)選二甲基二硫醚(DMDS)存在下培養(yǎng)產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物，從而產(chǎn)生L-曱硫氨酸或者L-甲硫氨酸的鹽。"產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物"是能夠產(chǎn)生曱硫氨酸的任何微生物，例如，細(xì)菌、酵母、真菌、古細(xì)菌等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物屬于棒桿菌屬。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物是谷氨酸棒桿菌。在再一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌或者相關(guān)的腸細(xì)菌)、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如，枯草芽孢桿菌(i5""7/附^^說(shuō)/s)或者相關(guān)的芽孢桿菌)、酵母(例如，釀酒酵母(5Vicc/^nw^cesce"v/w'fle)或者相關(guān)的酵母菌抹)，和古細(xì)菌，例如，適于用于本發(fā)明方法中的孩吏生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，屬于腸細(xì)菌組的所述^L生物是大腸桿菌。在另一實(shí)施方案中，屬于芽孢桿菌屬的微生物是枯草芽孢桿菌。在再一個(gè)實(shí)施方案中，酵母孩吏生物是釀酒酵母或者其近親。在本發(fā)明的一個(gè)以上的實(shí)施方案中，在包含甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，優(yōu)選二曱基二硫醚(DMDS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如DMDS以0.02%或更高濃度存在于培養(yǎng)基中。在另一實(shí)施方案中，曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如DMDS以0.04%或更高濃度存在于培養(yǎng)基中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源，例如DMDS以0.06%或更高濃度存在于培養(yǎng)基中。在本發(fā)明的一個(gè)以上的實(shí)施方案中，曱基封端的硫醚，例如硫和/或甲基來(lái)源是二甲基三硫、二曱基四硫或者硫醚的更高分子量的聚合物，其末端被曱基封端。被甲基封端的此類硫醚聚合物的實(shí)例是H3C-(SVCH3，其中n為2-50。在一個(gè)實(shí)施方案中，n為40-50。在另一實(shí)施方案中，n為30-40。在另一實(shí)施方案中，n為20-30。在另一實(shí)施方案中，n為10-20。在另一實(shí)施方案中，n為5-10。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，n為5、6、7、8、9或10。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，n為2、3或4。含有硫醚的聚合物的其他實(shí)例是聚(環(huán)氧乙烷硫醚)，其由內(nèi)部環(huán)氧乙烷寡聚物和二硫鍵(見(jiàn)例如，LeeWfl/.,丑/owflCfY附o/ec"/^.2005Jan-Feb;6(l):24畫(huà)6)和聚(^^克醚)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)，例如，緩釋硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如，緩釋二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)向培養(yǎng)物遞送曱基封端的石危醚，例如，硫和/或曱基來(lái)源。如本文使用的，短語(yǔ)"緩釋曱基封端的硫醚遞送系統(tǒng)"、"緩釋硫和/或曱基遞送系統(tǒng)"和"緩釋二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)"包括任何惰性物質(zhì)，其可以加入或者接觸培養(yǎng)基使得小的疏7K有機(jī)化合物，如曱基封端的硫醚，如硫和/或曱基來(lái)源，如DMDS可以釋放到7jC相，使得曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS的穩(wěn)態(tài)濃度保持在所用的生物的亞致死濃度。"緩釋甲基封端的硫醚遞送系統(tǒng)"，例如，"緩釋硫和/或甲基遞送系統(tǒng)"，例如，"緩釋二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)，，也允許這些化合物隨時(shí)間以對(duì)微生物無(wú)毒并且不會(huì)不利地影響^:生物自身生長(zhǎng)的水平延長(zhǎng)、持續(xù)釋放這些化合物到溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)是液體，其與水不溶混，但是可以溶解甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS。在優(yōu)選實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS的緩釋遞送系統(tǒng)是珠狀大孔聚苯乙烯樹(shù)脂，例如，AmberliteTMXAD4。AmberliteTMXAD4由不溶性小珠組成，其作為浸滲氯化鈉和碳酸鈉的水濕產(chǎn)品提供。在甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS的吸收前，如生產(chǎn)商推薦的用乙醇和水洗滌AmberliteTMXAD4，在水中產(chǎn)生懸浮液。甲基封端的硫醚，如硫和/或曱基來(lái)源，如DMDS吸收到AmberliteTMXAD4并將該混合物加入培養(yǎng)基后，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS以足夠維持/w^F或/w^^營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的速率從小珠釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，曱基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS以0.1%或更高存在于含有AmberliteXAD4的培養(yǎng)基中。在另一實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS以0.2。/?；蚋叽嬖谟诤蠥mberliteTMXAD4的培養(yǎng)基中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS以0.3。/。或更高存在于含有AmberliteXAD4的培養(yǎng)基中。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩釋曱基封端的疏醚遞送系統(tǒng)，例如，緩釋硫和/或甲基遞送系統(tǒng)，例如，DMDS緩釋遞送系統(tǒng)是緩釋曱基封端的硫醚進(jìn)料，例如，硫和/或曱基來(lái)源進(jìn)料，例如，DMDS進(jìn)料。如本文所用的短語(yǔ)"緩釋甲基封端的疏醚進(jìn)料"、"緩釋硫和/或甲基來(lái)源進(jìn)料，，和"緩釋DMDS進(jìn)料"是緩釋進(jìn)料，其將曱基封端的硫醚，例如，硫和/或曱基來(lái)源，例如DMDS以足夠量漸增或者連續(xù)遞送到培養(yǎng)物，使得產(chǎn)生目的產(chǎn)物，如曱硫氨酸，但是避免對(duì)生產(chǎn)微生物有毒性的水平。在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的緩釋遞送系統(tǒng)是對(duì)甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS可滲透的膜，并且允許甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS通過(guò)該膜擴(kuò)散或者流入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。膜的非限制性實(shí)例包括在有機(jī)溶劑(如DMDS)和水性培養(yǎng)基存在下可以保持結(jié)構(gòu)和功能完整性的^f壬寸可膜?！坟邦惸ぴ贛illiporez〉司目錄(MilliporeCorporationCatalog)和才示題為"1994-1995MilliporeDirect，，的技術(shù)參考手冊(cè)(MilliporeCorporation,Bedford,MA，USA)中描述，將其完整引入本文作為參考。合適的膜包括包含PVDF(聚偏氟乙烯)、PTFE(聚四氟乙烯)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚砜、尼龍和聚碳酸酯的那些膜，其具有或者沒(méi)有親水涂層。此外，可以用作緩釋二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括其他珠化的疏水樹(shù)脂、動(dòng)物油、礦物油、化學(xué)油、植物油、合成油、有機(jī)溶劑、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物，或者其組合。如本文所述，其中已經(jīng)遺傳改變了甲硫氨酸生物合成途徑，例如以過(guò)量產(chǎn)生O-乙?；呓z氨酸的微生物導(dǎo)致在含有甲基封端的硫醚，如硫和/或甲基來(lái)源，如DMDS的培養(yǎng)基中甲硫氨酸的產(chǎn)量提高。因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括在曱基封端的硫醚，如硫和/或曱基來(lái)源，優(yōu)選二甲基二硫醚(DMDS)存在下，培養(yǎng)具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。本發(fā)明的方法描述了微生物，例如，重組微生物，其優(yōu)選包括如本文所述的載體或基因(例如，野生型和/或突變基因)和/或以導(dǎo)致產(chǎn)生目的產(chǎn)物(如甲硫氨酸)的方式培養(yǎng)。術(shù)語(yǔ)"重組"微生物包括微生物(例如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等)，其已經(jīng)經(jīng)遺傳改變、修飾或工程化(例如，遺傳工程化)，使得它與它所來(lái)源的天然存在的微生物相比顯示出改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，當(dāng)遺傳修飾影響微生物的編碼核列時(shí))。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)或者工程化重組微生物，使得表達(dá)或過(guò)表達(dá)至少一種天然甲硫氨酸生物合成酶。術(shù)語(yǔ)"過(guò)表達(dá)的"包括在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中表達(dá)基因產(chǎn)物(例如，生物合成酶)，其表達(dá)水平高于該微生物的操作前或者沒(méi)有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏械谋磉_(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以遺傳設(shè)計(jì)或者工程化微生物以*達(dá)一定水平的基因產(chǎn)物，該水平高于在沒(méi)有工程化的相當(dāng)?shù)奈⑸镏械谋磉_(dá)水平。優(yōu)選地，生物合成酶編碼基因被包括在重組載體中和/或從重組載體表達(dá)生物合成酶。技術(shù)人員將理解表達(dá)或者過(guò)表達(dá)基因產(chǎn)物的微生物由于編碼該基因產(chǎn)物的核酸序列和/或基因的表達(dá)或過(guò)表達(dá)而產(chǎn)生或者過(guò)量產(chǎn)生該基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)操作的微生物"包括這樣的微生物，其已經(jīng)被工程化(例如，遺傳工程化)或者修飾，使得該微生物的甲硫氨酸生物合成途徑的至少一種酶的量或者結(jié)構(gòu)被修飾，使得曱硫氨酸產(chǎn)量增加。此類微生物的修飾或工程化可以根據(jù)本文描述的任一種方法，包括但不限于，生物合成途徑的失調(diào)和/或至少一種生物合成酶的過(guò)表達(dá)。"經(jīng)操作的"酶(例如，"經(jīng)操作的"生物合成酶)包括這樣的酶，其表達(dá)、產(chǎn)生或者活性已經(jīng)被改變或者修飾，使得該酶的至少一種上游或下游前體、底物或產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)的野生型或者天然存在的酶相比被改變或者修飾(例如，前體、底物和/或產(chǎn)物的改變或修飾的水平、比率等等)。"經(jīng)操作的，，酶還包括一種酶，其中對(duì)例如一種或多種產(chǎn)物或者中間體的抑制，如反饋抑制的抗性已經(jīng)得到增強(qiáng)。例如，能夠在例如甲硫氨酸存在下有效發(fā)揮酶促功能的酶。術(shù)語(yǔ)"過(guò)表達(dá)的"或"過(guò)表達(dá)"包括基因產(chǎn)物(例如，甲硫氨酸生物合成酶)的水平表達(dá)高于該微生物操作前或者在沒(méi)有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏械谋磉_(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以遺傳操作(例如，遺傳工程化)微生物以過(guò)表達(dá)一定水平的基因產(chǎn)物，該水平高于該微生物操作前或者在沒(méi)有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏械谋磉_(dá)水平。遺傳操作可以包括，但不限于，改變或者修飾與特定基因的表達(dá)有關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)(例如，通過(guò)加入強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者多個(gè)啟動(dòng)子或者通過(guò)除去調(diào)節(jié)序列使得表達(dá)是組成型的)，^奮飾特定基因的染色體位置，改變與特定基因如核糖體結(jié)合部位或者轉(zhuǎn)錄終止子相鄰的核酸序列，增加特定基因的拷貝數(shù)，修飾涉及特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或者本領(lǐng)域中常規(guī)的失調(diào)特定基因表達(dá)的任何其他常規(guī)方法(包括但不限于，使用反義核酸分子，例如，阻斷阻抑蛋白的表達(dá)和/或^f吏用增變等位基因，例如，增強(qiáng)遺傳變異和加速例如適應(yīng)性進(jìn)化的細(xì)菌等位基因)。在另一實(shí)施方案中，可以在物理上或者環(huán)境上操作微生物以過(guò)表達(dá)一定水平的基因產(chǎn)物，該水平高于微生物操作前或者在沒(méi)有操作的相當(dāng)?shù)奈⑸镏械谋磉_(dá)水平。例如，可以在已知或者懷疑增強(qiáng)特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的物質(zhì)存在下處理或者培養(yǎng)孩史生物，使得轉(zhuǎn)錄和/或翻譯得到增強(qiáng)或者增加。備選地，可以在經(jīng)選擇以增強(qiáng)特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的溫度下培養(yǎng)微生物，使得轉(zhuǎn)錄和/或翻譯得到增強(qiáng)或者增力口。本發(fā)明優(yōu)選的"重組"微生物是具有失調(diào)的曱硫氨酸生物合成途徑或者酶的微生物。術(shù)語(yǔ)"失調(diào)的，，或者"失調(diào)"包括改變或者修飾微生物中編碼生物合成途徑中的酶的至少一種基因，使得孩t生物中該生物合成酶的水平或者活性被改變或者修飾。優(yōu)選地，改變或者修飾編碼生物合成途徑中的酶的至少一種基因使得該基因產(chǎn)物得到增強(qiáng)或者增加。短語(yǔ)"失調(diào)的途徑，，還可以包括這樣的生物合成途徑，其中一種以上的編碼生物合成途徑中的酶的基因被改變或者修飾，使得一種以上的生物合成酶的水平或活性被改變或者修飾。"失調(diào)"微生物中途徑的能力(例如，同時(shí)失調(diào)給定生物合成途徑中的一種以上的基因，例如，2、3、4、5、6、7種基因)由^:生物中的特定現(xiàn)象引起，其中在遺傳物質(zhì)的連續(xù)片段上相互相鄰存在的基因編碼的一種以上的酶(例如，2、3、4、5、6、7等種生物合成酶)被稱作"操縱子"。術(shù)語(yǔ)"操縱子"包括至少兩個(gè)相鄰的基因或者ORF,任選在序列中在至少一個(gè)基因或ORF的5'或者3'端重疊。術(shù)語(yǔ)"操縱子，，包括協(xié)調(diào)的基因表達(dá)單位，其含有啟動(dòng)子和可能地與一種或多種、優(yōu)選至少兩種結(jié)構(gòu)基因(例如，編碼酶，如生物合成酶的基因)結(jié)合的調(diào)節(jié)元件。結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以例如通過(guò)結(jié)合調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)蛋白或者通過(guò)轉(zhuǎn)錄的反終止協(xié)同地調(diào)節(jié)。結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄得到編碼所有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的單個(gè)mRNA。由于操縱子中包括的基因的協(xié)同調(diào)節(jié)，單個(gè)啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件的改變或者修飾可以導(dǎo)致操縱子編碼的每種基因產(chǎn)物的改變或者修飾。調(diào)節(jié)元件的改變或者修飾可以包括但不限于，除去內(nèi)源啟動(dòng)子和/或調(diào)節(jié)元件、加入強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者多個(gè)啟動(dòng)子或者除去調(diào)節(jié)序列使得基因產(chǎn)物的表達(dá)被修飾、改變操縱子的染色體位置、改變與操縱子相鄰或者操縱子內(nèi)的核酸序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增加操縱子的拷貝數(shù)、修飾涉及操縱子轉(zhuǎn)錄和/或操縱子基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白、抑制子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或者本領(lǐng)域常規(guī)的失調(diào)基因表達(dá)的任何其他常規(guī)方法(包括但不限于，例如使用反義核酸分子阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。失調(diào)還可以涉及改變一種或多種基因的編碼區(qū)以產(chǎn)生例如，反饋抗性的或者抗產(chǎn)物或者中間物的抑制，或者具有更高或者更低比活性的酶。本發(fā)明的尤其優(yōu)選的"重組"微生物已經(jīng)被遺傳工程化以過(guò)表達(dá)細(xì)菌來(lái)源的基因或者基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌來(lái)源的"或者"來(lái)自"例如細(xì)菌，包括在細(xì)菌中天然發(fā)現(xiàn)的基因，或者細(xì)菌基因編碼的基因產(chǎn)物(例如，高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶和O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶)(例如分別由附ca:、Ao附(也稱作aw等)，和附^y編碼)。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物的至少一種甲硫氨酸生物合成酶^L失調(diào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，失調(diào)的甲硫氨酸生物合成酶是O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物的至少兩種甲硫氨酸生物合成酶被失調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，失調(diào)的甲硫氨酸生物合成酶是高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和高絲氨酸脫氫酶。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，失調(diào)的曱硫氨酸生物合成酶是O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶和高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了甲硫氨酸生物合成途徑的多種生物合成酶的修飾。具體地，本發(fā)明描述了通過(guò)修飾或者改變編碼所述生物合成酶的基因<務(wù)飾與所述途徑有關(guān)的多種酶活性。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"基因"包括核酸分子(例如，DNA分子或者其區(qū)段)，其在生物中可以通過(guò)基因間DNA(即，間插或者間隔DNA,其天然處于該基因的側(cè)翼和/或分離生物的染色體DNA中的基因)與另一基因或者其他基因分開(kāi)。備選地，基因可以與另一基因稍微重疊(例如，第一個(gè)基因的3，末端與第二個(gè)基因的5'末端重疊)，重疊的基因通過(guò)基因間DNA與其他基因分離?；蚩梢灾苯雍铣擅富蛘咂渌鞍踪|(zhì)分子(例如，可以包含編碼序列，例如，編碼蛋白質(zhì)的連續(xù)可讀框(ORF))或者可以自身在生物中是有功能的。生物中的基因可以聚簇在操縱子中，如本文定義，所述操縱子通過(guò)基因間DNA與其他基因和/或操縱子分離。如本文所用的"分離的基因，，包括這樣的基因，其基本上沒(méi)有該基因所來(lái)自的生物的染色體DNA中天然位于該基因側(cè)翼的序列(即，沒(méi)有編碼另一種或不同蛋白質(zhì)的相鄰編碼序列、相鄰的結(jié)構(gòu)序列等等)，并且任選包括5，和3，調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子序列和/或終止子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的基因主要包括蛋白質(zhì)的編碼序列(例如，編碼棒桿菌蛋白質(zhì)的序列)。在另一實(shí)施方案中，分離的基因包括蛋白質(zhì)(例如，棒桿菌蛋白質(zhì))的編碼序列和相鄰的5，和/或3，調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列來(lái)自該基因所來(lái)源的生物的染色體DNA(例如，相鄰的5，和/或3，棒桿菌調(diào)節(jié)序列)。優(yōu)選地，分離的基因含有小于約10kb、5kb、2kb、lkb、0.5kb、0.2kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp核脊紗歹寸，其天然位于該基因所來(lái)源的生物的染色體DNA中該基因的側(cè)翼。如本文所用的"具有突變的基因"或"突變基因"包括具有包括至少一個(gè)改變(例如，替代、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，所述改變使得所述蛋白質(zhì)不同的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，當(dāng)在相似的條件下測(cè)定(例如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測(cè)定)時(shí)，具有突變的基因或者突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)相比具有增加活性的多肽或蛋白質(zhì)。如本文所用的"增加的活性"或者"增加的酶活性"是這樣的活性，其比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性大至少5%,優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性大至少5-10%，更優(yōu)選大至少10-25%或甚至更優(yōu)選至少25-50%、50-75%或75-100%。上面引用的值中間的范圍，例如，75-85%、85-卯％、90-95%也意在被本發(fā)明包括。如本文使用的"增加的活性，，或者"增加的酶促活性"還包括比野生型基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性大至少1.25倍，優(yōu)選比野生型基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性大至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍、甚至更優(yōu)選至少3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。在另一實(shí)施方案中，例如，當(dāng)在相似的條件下測(cè)定(例如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測(cè)定)時(shí)，具有突變的基因或者突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)相比具有降低活性的多肽或蛋白質(zhì)。突變基因還可以不編碼蛋白質(zhì)或者產(chǎn)量水平降低的野生型多肽。如本文所用的"降低的活性，，或者"降低的酶活性"是這樣的活性，其比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性低至少5%，優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性低至少5-10%，更優(yōu)選低至少10-25%和甚至更優(yōu)選低至少25-50°/0、50-75%或75-100%。上面引用的值中間的范圍，例如，75-85%、85-卯％、90-95%也意在被本發(fā)明包括。如本文所用的"降低的活性"或者"降低的酶活性，，還包括已經(jīng)被缺失或"敲除"的活性(例如，比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性低約100%)。在一個(gè)以上的實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有失調(diào)基因組合的微生物產(chǎn)生甲硫氨酸，其水平例如比每種失調(diào)的基因存在時(shí)產(chǎn)生的甲硫氨酸水平總和大至少1-2%,或大至少3-5%，或大至少5-10%，或大至少10-20%，或大至少20-30%,或大至少30-40%，或大至少40-50%，或大至少50-60%,或大至少60-70%，或大至少70-80%，或大至少80-卯％,或大至少卯-95%。在一些實(shí)施方案中，包括失調(diào)基因的組合的微生物產(chǎn)生的甲硫氨酸的水平比每種失調(diào)的基因存在時(shí)產(chǎn)生的甲硫氨酸水平總和高至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少3.5倍、或至少4倍、或至少4.5倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少15倍、或至少20倍、或至少25倍、或至少30倍、或至少35倍、或至少40倍、或至少45倍、或至少50倍、或至少100倍。在其他實(shí)施方案中，包括改變的基因組合的微生物在合適的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的甲硫氨酸的量比存在每種改變的基因或者不存在基因改變時(shí)微生物產(chǎn)生的量的總和大至少5g、或至少7g、或至少8g、或至少9g、或至少10g、或至少llg、或至少12g、或至少13g、或至少14g、或至少15g、或至少16g、或至少17g、或至少18g、或至少19g、或至少20g、或至少25g、或至少30g、或至少40g、或至少50g/升。本文描述的微生物產(chǎn)生的甲硫氨酸的水平可以使用本文所述的一種或多種測(cè)定法容易地測(cè)量?？梢愿鶕?jù)任何普遍接受的用于測(cè)量具體的目的蛋白質(zhì)的活性的測(cè)定法測(cè)量活性。例如，通過(guò)測(cè)量從細(xì)胞或微生物分離或者純化的蛋白質(zhì)的活性，可以直接測(cè)量或測(cè)定活性。備選地，可以測(cè)量或測(cè)定細(xì)胞或者微生物內(nèi)或者細(xì)胞外培養(yǎng)基中的活性。例如，突變基因的測(cè)定(即，編碼降低的酶活性的所述突變體)可以通過(guò)在微生物，如其中所述酶是穩(wěn)定敏感的突變微生物中表達(dá)所述突變的基因，并測(cè)定該突變基因互補(bǔ)溫度敏感型(Ts)突變體的酶活性的能力還完成。編碼"增加的酶活性"的突變基因可以是比例如對(duì)應(yīng)的野生型基因更有效地互補(bǔ)Ts突變體的基因。編碼"降低的酶活性，，的突變基因是例如，沒(méi)有對(duì)應(yīng)的野生型基因那樣有效互補(bǔ)Ts突變體的基因。技術(shù)人員將理解即使核酸或者基因序列中的單個(gè)替代(例如，編碼對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氛基酸改變的堿基替代)與對(duì)應(yīng)的野生型多肽或蛋白質(zhì)相比也可以顯著影響所編碼的多肽或蛋白質(zhì)的活性。如本文定義的突變基因(例如，編碼突變多肽或蛋白質(zhì))可以與編碼蛋白質(zhì)同源物的核酸或者基因容易地區(qū)分，因?yàn)橥蛔兓蚓幋a具有改變活性的蛋白質(zhì)或多肽，任選在表達(dá)所述突變基因或者產(chǎn)生所述突變蛋白或多肽的微生物(即，突變微生物)中與對(duì)應(yīng)的表達(dá)野生型基因的微生物相比可觀察到為不同的或者可區(qū)分的表型。相比，蛋白質(zhì)同源物可以具有相同或者基本上相似的活性，任選當(dāng)在微生物中產(chǎn)生時(shí)，與表達(dá)野生型基因的對(duì)應(yīng)微生物相比在表型上不可辨別。因此，例如，不是核酸分子、基因、蛋白質(zhì)或多肽之間的序列同一性程度用于區(qū)分同源物和突變體，而是所編碼的蛋白質(zhì)或多肽的活性區(qū)分同源物和突變體同源物具有例如低序列同一性(例如，30-50%序列同一性)而具有基本上等同的功能活性，突變體例如共有99%序列同一性而具有顯著不同或改變的功能活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物是革蘭氏陽(yáng)性生物(例如，由于存在圍繞微生物的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞壁，而保留堿性染料，如結(jié)晶紫的微生物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物是棒桿菌屬微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物為芽孢桿菌屬。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物選自地衣芽孢桿菌(5tf"7/附//c/^附y(tǒng)b/7M/)、解淀粉芽孢桿菌(必《"7/附fl/w^/o/^Me/acie/w)、J5fl"7/附Aa/o^/尸a"s、枯草芽孑包桿菌(5"ci7/"51和短小芽孢桿菌(5""7/附p"柳7"s)。在另一實(shí)施方案中，重組微生物是革蘭氏陰性(排阻堿性染料)生物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物是屬于腸細(xì)菌的微生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組微生物是屬于選自沙門(mén)菌屬(1^/附卵《//")、埃希氏菌屬(」Esc/^r/c/r/")、克雷伯氏菌屬(氾^>//")、沙雷菌屬0^irffftVi)和變形桿菌屬(iVote"s)的屬的微生物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組微生物是埃希氏菌屬(^c^m'c/^1)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組微生物是大腸桿菌(」Esc力c/c似flco//)。在另一實(shí)施方案中，重組孩t生物是酵母屬(例如，釀酒酵母)酵母和古細(xì)菌(Archaea)。本發(fā)明的一個(gè)重要的方面涉及培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，使得產(chǎn)生目的化合物(例如，甲硫氨酸)。術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)，，包括保持和/或生長(zhǎng)本發(fā)明的活微生物(例如，保持和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)物或菌林)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一實(shí)施方案中，在固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在包含對(duì)于微生物的保持和/或生長(zhǎng)必須或者有益的營(yíng)養(yǎng)物(例如，碳源或者碳底物，例如，糖類、烴、油、脂肪、脂肪酸、有機(jī)酸和醇；氮源，例如，胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源，如磷酸、其鈉和鉀鹽；微量元素，例如鎂、鐵、錳、鈣、銅、鋅、硼、鎳、鉬和/或鈷鹽；以及生長(zhǎng)因子，如氨基酸、維生素、生長(zhǎng)促進(jìn)劑等等)的培養(yǎng)基(如無(wú)菌液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可以連續(xù)或者分批發(fā)酵或者以補(bǔ)料分批或者重復(fù)補(bǔ)料分批方法培養(yǎng)以產(chǎn)生甲硫氨酸。已知的培養(yǎng)方法的綜述可以見(jiàn)Chmid的教科書(shū)(A—,oze版c/r"汰7.￡7"yi7r/*""g/"&J5/ove^/ii/r/^fwfecAw/A:(GustavFischerVerlag，Stuttgart，1991))或者Storhas的教科書(shū)(5/omiA:tomiww//m》/^re￡f/7'c/^wigew(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994》。優(yōu)選地，在受控的pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語(yǔ)"受控的pH，，包括導(dǎo)致產(chǎn)生目的產(chǎn)物(例如，甲硫氨酸)的任何pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約7的pH下培養(yǎng)微生物。在另一實(shí)施方案中，在6.0到8.5的pH下培養(yǎng)孩史生物?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一種方法保持希望的pH。還優(yōu)選地，在受控的通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語(yǔ)"受控的通氣"包括足夠的通氣(例如，氧氣)以導(dǎo)致產(chǎn)生目的產(chǎn)物(例如，甲石克氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的氧氣水平，例如，通過(guò)調(diào)節(jié)溶解在培養(yǎng)基中的氧氣量來(lái)控制通氣。優(yōu)選地，通過(guò)攪拌培養(yǎng)物控制培養(yǎng)物的通氣。通過(guò)螺旋槳或者類似的機(jī)械攪拌設(shè)備，通過(guò)旋轉(zhuǎn)或者搖動(dòng)培養(yǎng)容器(例如，管或瓶)或者通過(guò)多種泵動(dòng)設(shè)備提供攪拌。還可以經(jīng)由培養(yǎng)基(例如，經(jīng)由發(fā)酵混合物)穿過(guò)無(wú)菌空氣或氧氣控制通氣。還優(yōu)選地，在沒(méi)有過(guò)量泡沫(例如，通過(guò)加入消泡劑)存在下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。此外，本發(fā)明的微生物可以在受控的溫度下培養(yǎng)。術(shù)語(yǔ)"受控的溫度，，包括導(dǎo)致產(chǎn)生目的產(chǎn)物(例如，曱硫氨酸)的任何溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，受控的溫度包括15。C到95。C之間的溫度。在另一實(shí)施方案中，受控的溫度包括15。C到70。C之間的溫度。優(yōu)選的溫度為20。C到55°C，更優(yōu)選30。C到50°C.微生物可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(例如，保持和/或生長(zhǎng))，并且優(yōu)選連續(xù)或者間歇培養(yǎng)，通過(guò)常規(guī)方法如靜置培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)(例如，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)等等)、通氣旋動(dòng)培養(yǎng)或者發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在發(fā)酵罐(例如，發(fā)酵方法)中培養(yǎng)微生物。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括，但不限于，分批、補(bǔ)料分批和連續(xù)方法或者發(fā)酵方法。短語(yǔ)"分批方法"或者"分批發(fā)酵"指這樣的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)物、補(bǔ)充添加劑等等在發(fā)酵開(kāi)始設(shè)置并且在發(fā)酵期間不受到改變，然而，可以試圖控制諸如pH和氧氣濃度等因子以防止過(guò)量的培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。短語(yǔ)"補(bǔ)料分批方法"或者"補(bǔ)料分批"發(fā)酵指分批發(fā)酵，只是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，加入一種或多種底物或補(bǔ)充物(例如，以增量加入或者連續(xù)加入)。短語(yǔ)"連續(xù)方法"或"連續(xù)發(fā)酵"指這樣的系統(tǒng)，其中將確定的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)加入到發(fā)酵罐并且將等量使用的或者"條件的，，培養(yǎng)基同時(shí)除去，優(yōu)選用于回收目的產(chǎn)物(例如，甲硫氨酸)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種此類方法并且它們是本領(lǐng)域公知的。將使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足具體菌株的需要。用于多種微生物的培養(yǎng)基的描述包含在美國(guó)細(xì)菌學(xué)協(xié)會(huì)的手冊(cè)"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C.，USA,1981)中。適于用于培養(yǎng)基的碳源為例如，糖和糖類，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素、油和脂肪，如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油、脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸、醇，如甘油和乙醇，和有機(jī)酸，如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或者作為混合物使用。有機(jī)含氮化合物，如胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素或者無(wú)機(jī)化合物，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨可以用作氮源。氮源可以單獨(dú)或者作為混合物使用。磷酸、磷酸二氫鉀或者磷酸氬二鉀或者對(duì)應(yīng)的含鈉鹽可以用作磷源。除了DMDS夕卜，末端用甲基封端的二甲基三疏、二甲基四硫或者更高分子量硫醚聚合物、有機(jī)和無(wú)機(jī)的含硫化合物，如硫化物、亞硫酸鹽、硫酸鹽和硫/[戈硫酸鹽可以用作額外的硫源。培養(yǎng)基可以還包含生長(zhǎng)必須的金屬鹽，如硫酸鎂或者硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)外，還可以使用必需和非必需生長(zhǎng)物質(zhì)，如氨基酸和維生素。此外，可以向培養(yǎng)基中加入合適的前體。所提到的起始物質(zhì)可以以單個(gè)批的形式加入，或者可以在培養(yǎng)期間以合適的方式進(jìn)料。堿性化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或者氨水，或者酸性化合物，如磷酸或硫酸可以以合適的方式用于控制pH。消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制泡沫的產(chǎn)生。可以將具有選擇作用的合適物質(zhì)，如抗生素加入培養(yǎng)基中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為了保持需氧條件，向培養(yǎng)物中導(dǎo)入氧氣或者含有氧氣的氣體混合物，如空氣。培養(yǎng)物的溫度通常為20。C到45。C，優(yōu)選25。C到40。C。持續(xù)培養(yǎng)直到已經(jīng)形成了最大的目的產(chǎn)物。該目標(biāo)通常在10小時(shí)到160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。短語(yǔ)"在產(chǎn)生目的產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)"包括在適合或者足夠得到目的化合物的產(chǎn)量或得到希望產(chǎn)量的具體待產(chǎn)生的化合物的條件(如溫度、壓力、pH、持續(xù)時(shí)間等等)下保持和/或生長(zhǎng)微生物。例如，培養(yǎng)持續(xù)足夠的時(shí)間以產(chǎn)生所希望量的化合物(例如，曱硫氨酸)。優(yōu)選地，培養(yǎng)持續(xù)足夠的時(shí)間以基本上達(dá)到該化合物的合適產(chǎn)量(例如，足夠達(dá)到合適濃度的甲硫氨酸的時(shí)間)。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)持續(xù)約12到24小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)持續(xù)約24到36小時(shí)、36到48小時(shí)、48到72小時(shí)、72到96小時(shí)、96到120小時(shí)、120到144小時(shí)、或者大于144小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)持續(xù)足夠的時(shí)間以達(dá)到甲硫氨酸的希望的生產(chǎn)產(chǎn)量，例如，培養(yǎng)敞生物4吏得產(chǎn)生至少約7到10g/L、或至少10到15g/L,或至少約15到20g/L、或至少約20到25g/L、或至少約25到30g/L、或至少約30到35g/L、或至少約35到40g/L、或至少約40到50g/L甲硫氨酸。在其他實(shí)施方案中，在一定條件下培^^L生物使得在約24小時(shí)內(nèi)、約36小時(shí)內(nèi)、約48小時(shí)內(nèi)、約72小時(shí)內(nèi)、或約96小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生甲石克氨酸的優(yōu)選產(chǎn)量，例如在上面給出范圍內(nèi)的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法還可以包括回收目的化合物(例如，甲硫氨酸)的步驟。術(shù)語(yǔ)"回收"目的化合物包括從培養(yǎng)基濃縮、提取、收獲、分離或純化化合物?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)分離或者純化方法進(jìn)行化合物的回收，包括但不限于，用常規(guī)樹(shù)脂(例如，陰離子或者陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、非離子吸附樹(shù)脂等等)處理，用常規(guī)吸附劑(例如，活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、諷土等等)處理，改變pH，溶劑萃取(例如，用常規(guī)溶劑如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，過(guò)濾，濃縮，結(jié)晶，重結(jié)晶，pH調(diào)節(jié)，凍干，干燥，蒸發(fā)等等。例如，通過(guò)首先從培養(yǎng)物除去微生物，可以從培養(yǎng)基回收甲硫氨酸。優(yōu)選地，"提取"、"分離"或者"純化"本發(fā)明的目的化合物使得所得制備物基本上沒(méi)有其他培養(yǎng)基組分(例如，沒(méi)有培養(yǎng)基組分和/或發(fā)酵副產(chǎn)物)。短語(yǔ)"基本上無(wú)其他培養(yǎng)基組分"包括目的化合物的制備物，其中該化合物與產(chǎn)生該化合物的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備物具有大于約80%(干重)的目的化合物(例如，小于約20%的其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選大于約90%的目的化合物(例如，小于約10%其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選大于約95%的目的化合物(例如，小于約5%其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)，最優(yōu)選大于約98-99%的目的化合物(例如，小于約1-2%的其他培養(yǎng)基組分或者發(fā)酵副產(chǎn)物)。^^開(kāi)還包括生物轉(zhuǎn)化方法，其描述了多種本文所述的重組微生物。術(shù)語(yǔ)"生物轉(zhuǎn)化方法"在本文中也稱作"生物轉(zhuǎn)變方法"，包括導(dǎo)致產(chǎn)生(例如，轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)變)合適的底物和/或中間化合物成為目的產(chǎn)物(例如，曱硫氨酸)的生物學(xué)方法。用于生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的^:生物和/或酶為允許它們執(zhí)^f亍它們預(yù)期功能(例如，產(chǎn)生目的化合物)的形式。此類微生物可以是全細(xì)胞，或者可以僅僅是得到所希望的最終結(jié)果必要的那些細(xì)胞部分(例如，基因和/或酶)。可以將這些微生物懸浮(例如，在合適的溶液中，如緩沖溶液或者培養(yǎng)基中)、沖洗(例如，沖洗除去培養(yǎng)孩t生物的培養(yǎng)基)、丙酮干燥、固定化(例如，用聚丙烯酰胺凝膠或者k-角叉菜聚糖或者在合成的支持體如小珠、基質(zhì)等等上)、固定、交聯(lián)或者透化(例如，具有透化的膜和/或細(xì)胞壁使得化合物如底物、中間體或者產(chǎn)物可以容易地穿過(guò)所述膜或者細(xì)胞壁)。在備選實(shí)施方案中，例如當(dāng)微生物是生物學(xué)無(wú)害(例如安全)時(shí)，不從微生物純化目的化合物。例如，整個(gè)培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)可以用作產(chǎn)物來(lái)源(例如，粗產(chǎn)物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)不用修飾而直接使用。在另一實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)濃縮。在再一個(gè)實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物(或者培養(yǎng)上清液)干燥或凍干。通過(guò)本發(fā)明得到的產(chǎn)物除了甲硫氨酸外還可以包括發(fā)酵培養(yǎng)液的其他組分，如磷酸鹽、碳酸鹽、剩余的糖類、生物量、復(fù)雜培養(yǎng)基組分，等等。//.:Tig裙凝為、f、本發(fā)明還描述了重組核酸分子(例如，重組DNA分子)，其包括本文描述的基因(例如，分離的基因)，優(yōu)選棒桿菌基因，更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌基因，甚至更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸生物合成基因。術(shù)語(yǔ)"重組核酸分子"包括已經(jīng)改變、<務(wù)飾或者工程化的核酸分子(例如，DNA分子)，所述改變、修飾或者工程化使得它在核苷酸序列上與該重組核酸分子所來(lái)源(例如，通過(guò)加入、缺失或替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸)的原來(lái)的或者天然核酸分子不同。優(yōu)選地，重組核酸分子(例如，重組DNA分子)包括有效連接調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離的基因。短語(yǔ)"有效連接調(diào)節(jié)序列"指目的基因的核苷^列以允許該基因的表達(dá)(例如，增強(qiáng)的、增加的、組成型、基礎(chǔ)的、減弱的、減少的或者抑制的表達(dá))，優(yōu)選該基因編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，當(dāng)重組核酸分子包括在如本文定義的重組載體中并且導(dǎo)入微生物中時(shí))的方式連接到調(diào)節(jié)序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"異源核酸"指不通常存在于目標(biāo)生物中的核麟列。它們可以還包括存在于目標(biāo)生物中，但是通常不在目的目標(biāo)生物的遺傳區(qū)中發(fā)現(xiàn)的核斷列。類似地，術(shù)語(yǔ)"異源基因"指不存在于宿主生物的野生型分離林中的基因。異源核酸和異源基因通常包含重組核酸分子。異源核酸或者異源基因可以包含或不包含修飾(例如，通過(guò)加入、缺失或者替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸)。;^^開(kāi)還包括本文描述的多種基因和蛋白質(zhì)的同源物。基因的"同源物"指核苷^f列，其與該基因的至少部分或者與它的互補(bǔ)鏈或者其部分基本上同一，條件是該核苷*列編碼的蛋白質(zhì)與該基因的同源物編碼的蛋白質(zhì)具有基本上相同的活性/功能。通過(guò)推定的同源物的氨基酸和核苷*列和所述基因(例如，谷氨酸棒桿菌基因"W、Ao附、附CX、附WF、we戰(zhàn)、/mC好、we必、附WF、附WC和/we^T的核普酸序列或者它們的互補(bǔ)鏈)或它們編碼蛋白質(zhì)的序列之間的百分比同一性，可以鑒定本文所述基因的同源物。例如，通過(guò)視覺(jué)檢查或者通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的或者本文所述的多種計(jì)算機(jī)程序可以確定百分比同一性。例如，使用DevereuxWa/.(1984)7V"c/.^"Vfe.12:387戶斤述并且可以從UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG))得到的GAP計(jì)算機(jī)程序，通過(guò)比較序列信息可以確定兩個(gè)核苷酸序列之間的百分比同一性。使用如TatusovaCfl/.(1999)/^TW^Af/cw^o/.丄e".，174:247所述的基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST.RTM.))程序，通過(guò)比對(duì)兩個(gè)核苷酸序列，也可以確定百分比同一性。例如，對(duì)于使用BLASTTM程序進(jìn)行的核苷酸序列比對(duì)，默認(rèn)設(shè)置如下匹配得分2，錯(cuò)配罰分-2,打開(kāi)缺口和延伸缺口罰分分別為5和2，缺口時(shí)間減少(gap.times.dropoff)為50，期望值為10，字長(zhǎng)ll，濾器(filter)為關(guān)閉(OFF)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"同源性"和"同源的"不限于指定具有理論上的共同遺傳祖先的蛋白質(zhì)，而是包括可以在遺傳上無(wú)關(guān)但是仍然經(jīng)進(jìn)化而執(zhí)行相似功能和/或具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。本文所述的多種蛋白質(zhì)的功能同源性還包括具有其同源物的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。為了蛋白質(zhì)具有功能同源性，不需要它們?cè)谒鼈兊腗酸序列中具有顯著同一性，而是具有功能同源性的蛋白質(zhì)通過(guò)具有相似的或者相同的活性，如酶促活性定義。類似地，具有結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)被定義為具有類似的三級(jí)(或者四級(jí))結(jié)構(gòu)并且不必需要氨基酸同源性或者編碼它們的基因的核酸同源性。在一些情況中，結(jié)構(gòu)同源性可以包括僅在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或者結(jié)合位點(diǎn)保持結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)。除了結(jié)構(gòu)和功能同源性外，本發(fā)明還包括與本文所述的多種蛋白質(zhì)和酶具有至少部分氨基酸同一性的蛋白質(zhì)。為了確定兩個(gè)M酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的將序列比對(duì)(例如，可以在一個(gè)蛋白質(zhì)的M酸序列中引入缺口以與另一蛋白質(zhì)的氨基酸序列最佳比對(duì))。然后比較對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上的氨基酸殘基。當(dāng)一個(gè)序列中的位置被另一序列中對(duì)應(yīng)位置上相同氨基酸占據(jù)時(shí)，這兩個(gè)分子在該位置上是同一的。兩條序列之間百分比同一性是這些序列享有的同一位置數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=同一位置數(shù)/位置總數(shù)xl00)。在一些實(shí)施方案中，本文所述分子的核酸和M酸序列包含與本文所述的核酸或^J^酸序列雜交或者至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99。/o或以上同一性的核苷酸序列或者^(guò)i^^列。本發(fā)明還包括本領(lǐng)域中公知的用于本文所述的蛋白質(zhì)的遺傳工程化以產(chǎn)生具有改進(jìn)的或者修飾特征的酶的技術(shù)。例如，本領(lǐng)域中可利用的教導(dǎo)中公知^參飾蛋白質(zhì)，使得該蛋白質(zhì)具有增加的或者減少的底物結(jié)合親和性。還有利的并且在本領(lǐng)域的教導(dǎo)內(nèi)的是設(shè)計(jì)具有增加或者減少的酶促速率的蛋白質(zhì)。尤其對(duì)于多功能酶，有用的是差別地細(xì)孩史調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的多種活性以在特定環(huán)境下最佳地執(zhí)行。此外，調(diào)節(jié)酶對(duì)反饋抑制(例如，被甲硫氨酸)的敏感性的能力可以通過(guò)選擇性改變參與甲硫氨酸或者可能參與負(fù)或者正反饋的其他輔因子的結(jié)合或者協(xié)調(diào)的氨基酸來(lái)完成。此外，遺傳工程化包括與在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)的事件。例如，當(dāng)完全或者部分操縱子用于克隆和表達(dá)時(shí)，可以修飾基因的調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列，〗吏^^它們產(chǎn)生希望水平的轉(zhuǎn)錄。本文所述的任一種基因的"同源物"還可以通過(guò)該同源物編碼的蛋白質(zhì)的活性鑒定。例如，這種同源物可以互補(bǔ)它的同源物基因中的突變。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"包括影響(例如，調(diào)控或調(diào)節(jié))其他核酸序列(即基因)表達(dá)的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列被包括在重組核酸分子中，處于相對(duì)于具體目的基因相似或相同的位置和/或方向上，如為調(diào)節(jié)序列和目的基因觀察到的出現(xiàn)在天然的，如在天然位置和/或方向上。例如，重組核酸分子中可以包括目的基因，其有效連接到調(diào)節(jié)序列，在天然生物中，該調(diào)節(jié)序列伴隨或者鄰接目的基因(例如，有效連接到"天然，，調(diào)節(jié)序列(例如，連接到"天然"啟動(dòng)子)。備選地，目的基因可以包括在重組核酸分子中，有效連接到在天然生物中伴隨或鄰接另一(例如，不同的)基因的調(diào)節(jié)序列。備選地，目的基因可以包括在重組核酸分子中，有效連接到來(lái)自另一生物的調(diào)節(jié)序列。例如，來(lái)自其他微生物的調(diào)節(jié)序列(例如，其他細(xì)菌調(diào)節(jié)序列、噬菌體調(diào)節(jié)序列等等)可以有效連接到具體目的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列是非天然或非天然存在的序列(例如，已經(jīng)經(jīng)修飾、突變、替代、衍生、缺失的序列，包括化學(xué)合成的序列)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止信號(hào)、抗終止信號(hào)和其他表達(dá)控制元件(例如，抑制子或者誘導(dǎo)子結(jié)合的序列和/或例如在轉(zhuǎn)錄的mRNA中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn))。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如Sambrook，J.,Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Afo/ecw/fWC7(w/"g:j丄fl6ora,or^Mflww"A2/w/，^/.,Co/t/SpnVig/Ttf/^or丄a6onitoi^，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989，和Patek，M."a/，(2003)/ow7m/o/祝otec^"o/ogy104:311-323中。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中組成型表達(dá)的那些(例如，組成型啟動(dòng)子和強(qiáng)組成型啟動(dòng)子)、指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中誘導(dǎo)型表達(dá)的那些(例如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如，木糖可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)和減弱或者阻抑核苷酸序列在微生物中表達(dá)的那些(例如，減弱信號(hào)或阻抑序列)。還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是通過(guò)除去或者缺失調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。例如，可以除去涉及轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)的序列使得目的基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子可以包括編碼至少一種細(xì)菌基因產(chǎn)物(例如，甲硫氨酸生物合成酶)的核酸序列或者基因，其有效連接啟動(dòng)子或者啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子包括棒桿菌啟動(dòng)子和/或噬菌體啟動(dòng)子(例如，感染棒桿菌的噬菌體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是棒桿菌啟動(dòng)子，優(yōu)選強(qiáng)的棒桿菌啟動(dòng)子(例如，與棒桿菌中生物化學(xué)管家基因結(jié)合的啟動(dòng)子)。在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是噬菌體啟動(dòng)子。例如，用于革蘭氏陽(yáng)性生物的額外優(yōu)選的啟動(dòng)子包括但不限于，超氧化物歧化酶、g/Y￡X、延伸因子Tu、fl附y(tǒng)和SPOl啟動(dòng)子。例如，用于革蘭氏陰性微生，寸旦不限于，cos、toc、,/77-teZ、/a"http://7/7-/flc、/"c/g、T7、T5、T3、-、//r、廳、SP6、入-PR或X孔。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括一種或多種終止序列(例如，轉(zhuǎn)錄終止序列)。術(shù)語(yǔ)"終止序列"包括用于終止mRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。終止序列(或者串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子)還可以用于穩(wěn)定mRNA例如以抵抗核酸酶(例如，通過(guò)向mRNA加入結(jié)構(gòu))。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括允許檢測(cè)含有所述序列的載體的序列(例如，可檢測(cè)的和/或選擇標(biāo)記)，例如，編碼抗生素抗性序列或者克服營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變的基因，例如，吵C、藥物標(biāo)記、熒光標(biāo)記，和/或比色標(biāo)記(例如，/"cZ/(5-半乳糖苷酶)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)或者轉(zhuǎn)錄成人工RBS的序列。術(shù)語(yǔ)"人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)"包括mRNA分子(例如，DNA內(nèi)編碼的)內(nèi)核糖體結(jié)合(例如，以啟動(dòng)翻譯)的位點(diǎn)，其與天然RBS(例如，天然存在的基因中發(fā)現(xiàn)的RBS)相差至少一個(gè)核苷酸。優(yōu)選的人工RBS包才舌約5畫(huà)6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30或更多個(gè)核苷酸,其約1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-15或更多核苷酸與天然RBS(例如，目的基因的天然RBS)不同。本發(fā)明還描述了包括如本文所述的核酸分子(例如，基因或者包含所述基因的重組核酸分子)的載體(例如，重組載體)。術(shù)語(yǔ)"重組載體"包括已經(jīng)經(jīng)改變、修飾或者工程化的載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、病毒、勦?；蛘咂渌兓暮怂彷d體)，所述改變、修飾或者工程化使得該載體比該重組載體所來(lái)源的原有或者天然核酸分子含有更多、更少或者不同的核酸序列。優(yōu)選地，重組載體包括生物合成酶編碼基因或者包括所述基因的重組核酸分子，其有效連接到調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子序列、終止子序列和/或人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，如本文所定義。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組載體包括增強(qiáng)細(xì)菌中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制-增強(qiáng)序列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)制增強(qiáng)序列在大腸桿菌或者谷氨酸棒桿菌中發(fā)揮功能。在另一實(shí)施方案中，復(fù)制增強(qiáng)序列來(lái)自pBR322。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組載體包括抗生素抗性序列。術(shù)語(yǔ)"抗生素抗性序列"包括促進(jìn)或者賦予宿主生物(例如，棒桿菌)的抗生素抗性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素抗性序列選自C"《氯霉素抗性)序列、fe"四環(huán)素抗性)序列、W附(紅霉素抗性)序列、WM(新霉素抗性)序列、Afl/J(卡那霉素抗性)序列和S/7"(大觀霉素抗性)序列。本發(fā)明的重組載體還可以包括同源重組序列(例如，設(shè)計(jì)用于允許目的基因重組到宿主生物的染色體的序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將還明白載體的設(shè)計(jì)可以根據(jù)諸如待遺傳工程化的微生物的選擇、目的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平等等定制。如本文所用的"坎貝爾進(jìn)"(Campbellin)指最初宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，其中完整環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如質(zhì)粒)已經(jīng)通過(guò)單次同源重組事件(雜交進(jìn)(crossin)事件)整合到染色體中，并且有效導(dǎo)致所述環(huán)狀DNA分子的線性化形式插入到染色體的第一個(gè)DNA序列中，該第一個(gè)DNA序列與所述環(huán)狀DNA分子的第一個(gè)DNA序列同源。"被坎貝爾進(jìn)"(Campbelledin)指已經(jīng)整合到"坎貝爾進(jìn)"轉(zhuǎn)化體的染色體中的線性化DNA序列。"坎貝爾進(jìn)"含有第一個(gè)同源DNA序列的副本，其每個(gè)拷貝包括并且圍繞一個(gè)拷貝的同源重組交換點(diǎn)。該名稱來(lái)自AlanCampbell教授，他首次提出了該類型的重組。如本文所用的"坎貝爾出"(Campbellout)指"坎貝爾進(jìn)"轉(zhuǎn)化體的后代細(xì)胞，其中在"坎貝爾進(jìn)"DNA的線性化插入的DNA上所含的第二個(gè)DNA序列和與所述線性化插入片段的第二個(gè)DNA序列同源的染色體來(lái)源的第二個(gè)DNA序列之間發(fā)生了第二次同源重組事件(雜交出(crossout)事件)，該第二次重組事件導(dǎo)致缺失(投下)一部分整合的DNA序列，但是重要地，還導(dǎo)致一部分(這可以小至單個(gè)堿基)整合的被坎貝爾進(jìn)的DNA保留在染色體中，從而與最初的宿主細(xì)胞相比，"坎貝爾出"細(xì)胞在染色體中含有一個(gè)或多個(gè)有意的改變(例如，單個(gè)堿基替換、多個(gè)堿基替換、插入異源基因或者DNA序列，插入額外一個(gè)或多個(gè)拷貝的同源基因或者經(jīng)修飾的同源基因，或者插入包含一個(gè)以上的這些上述所列實(shí)例的DNA序列)。"坎貝爾出"細(xì)胞或者林系通常但不必須，通過(guò)對(duì)"被坎貝爾進(jìn)"DNA序列，如枯草芽孢桿菌基因的一部分(希望拋棄該部分)的基因進(jìn)行反選擇得到，所述基因當(dāng)在存在約5%到10%蔗糖下生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)是致死的。使用或不使用反選擇，通過(guò)使用任何可篩選的表型篩選所希望的細(xì)胞，可以得到或者鑒定希望的"坎貝爾出，，細(xì)胞，所述表型為諸如但不限于，菌落形態(tài)、菌落顏色、存在或不存在抗生素抗性、(通過(guò)聚合sm式反應(yīng))存在或不存在給定的DNA序列、存在或不存在營(yíng)養(yǎng)缺陷型、存在或不存在酶、菌落核酸雜交、抗體篩選，等等。術(shù)語(yǔ)"坎貝爾進(jìn)"和"坎貝爾出，，還可以在多種時(shí)態(tài)中用作動(dòng)詞來(lái)指上述方法?？梢岳斫鈱?dǎo)致"坎貝爾進(jìn)，，或"坎貝爾出，，的同源重組事件可以在同源DNA序列內(nèi)的DNA堿基范圍內(nèi)發(fā)生，并且因?yàn)橥葱蛄袑?duì)于該范圍的至少部分是相互相同的，所以通常不可能精確地指出哪里發(fā)生了交換事件。換句話說(shuō)，不可能精確地指出哪個(gè)序列最初來(lái)自插入的DNA，哪個(gè)最初來(lái)自染色體DNA。此外，第一個(gè)同源DNA序列和第二個(gè)同源DNA序列通常通過(guò)部分非同源區(qū)域分開(kāi)，并且該非同源區(qū)域保持放置在"坎貝爾出，，細(xì)胞的染色體內(nèi)。為了實(shí)用，在谷氨酸棒桿菌中，通常第一個(gè)和第二個(gè)同源DNA序列長(zhǎng)為至少約200個(gè)威基對(duì)，并且可以長(zhǎng)達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)，然而，可以安排步驟使用更短或更長(zhǎng)序列。例如，第一個(gè)和第二個(gè)同源序列的長(zhǎng)度可以為約500到2000個(gè)堿基，并且通過(guò)將第一個(gè)和第二個(gè)同源序列安排為大約相同長(zhǎng)度，優(yōu)選相差少于200個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選兩者較短的為較長(zhǎng)者威基對(duì)長(zhǎng)度的至少70%,可以方便從"坎貝爾進(jìn)"得到"坎貝爾出"。通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為限制。將本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容引入本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:M2014菌抹的產(chǎn)生將谷氨酸棒桿菌菌林ATCC13032用DNAA(也稱作pH273)(SEQIDNO:l)轉(zhuǎn)化并"被坎貝爾進(jìn)"以產(chǎn)生"坎貝爾進(jìn)"菌林。圖2顯示了質(zhì)粒pH273的示意圖。然后將"坎貝爾進(jìn)，，菌林"坎貝爾出，，以產(chǎn)生"坎貝爾出，，菌林M440,其含有編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶(/^/i/^的基因。所得的高絲氨酸脫氫酶蛋白質(zhì)包括氨基酸改變，其中S393改變?yōu)镕393(稱作〃s^S393F)。隨后將菌林M440用DNAB(也稱作pH373)(SEQIDNO:2)轉(zhuǎn)化得到"坎貝爾進(jìn)"菌林。圖3描繪了質(zhì)粒pH373的示意圖。然后將"坎貝爾進(jìn)"菌林"坎貝爾出，，以產(chǎn)生"坎貝爾出"菌林M603,其含有編碼反饋抗性天冬氨酸激酶(Js/^r)(/"C編碼)的基因。在所得的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中，T311改變?yōu)?311(稱作LysCT31U)。發(fā)現(xiàn)菌抹M603產(chǎn)生約17.4mM賴氨酸，而ATCC13032菌林不產(chǎn)生可測(cè)量量的賴氨酸。此外，M603菌林產(chǎn)生約0.5mM高絲氨酸，相比ATCC13032菌林不產(chǎn)生可測(cè)量的量，如表2中概述。^2:芽#J7rC7^m2;^Af6。3/^的葛纟扇^、0-乙脫差豸^^凝、f絲絲艦麟量菌林高絲氨酸(mM)O-乙醜基高絲氨酸(mM)甲硫氨酸(mM)賴氨酸(mM)ATCC130320.00.40.00.0M6030.50.70.017.4用DNAC(也稱作pH304，其示意圖在圖4描繪)(SEQIDNO:3)轉(zhuǎn)化菌林M603,得到"坎貝爾進(jìn)"菌抹，其然后被"坎貝爾出"得到"坎貝爾出"菌林M690。M690菌抹含有metH基因(也稱作P497附43:離游Af6W和M6卯,^^葛^威^、O-乙瘋差葛^^^、f碗^凝和鷹減凌時(shí)量<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>隨后如下誘變M6卯菌抹將生長(zhǎng)在BHI培養(yǎng)基(BECTONDICKINSON)中的M603過(guò)夜培養(yǎng)物用50mM檸檬酸緩沖液pH5.5洗滌，在30。C用N-曱基-N-亞硝基胍(50mM檸檬酸緩沖液pH5.5中10mg/ml)處理20分鐘。處理后，細(xì)胞用50mM檸檬酸緩沖液pH5.5再次洗滌并平板接種在含有下面成分的培養(yǎng)基中(所有提到的量都是對(duì)500ml培養(yǎng)基計(jì)算)10g(NH4)2S04;0.5gKH2P04;0.5gK2HP04;0.125gMgS04*7H20;21gMOPS;50mgCaCl2;15mg原兒茶酸；0.5mg生物素；1mg硫胺素；和5g/lD，L誦乙硫氨酸(SIGMACHEMICALS,CATALOG#E5139)，用KOH調(diào)節(jié)到pH7.0。此外，培養(yǎng)基含有0.5ml^:量金屬溶液，其組成為10g/1FeS04*7H20;1g/1MnS04*H20;0.1g/1ZnS04*7H20;0.02g/1CuS04;和0.002g/1NiCl2*6H20，所有都溶解在0.1MHC1中。通過(guò)過(guò)濾對(duì)最終培養(yǎng)基除菌并向培養(yǎng)基中加入40ml無(wú)菌的50%葡萄糖溶液(40ml)和無(wú)菌瓊脂至1.5%終濃度。將最終的含有瓊脂的培養(yǎng)基倒入瓊脂板中并標(biāo)記為最小乙硫氨酸培養(yǎng)基。將誘變的菌林在平板(最小乙硫氨酸)上涂布并在30。C培育3-7天。分離生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的克隆并在相同的最小乙硫氨酸培養(yǎng)基上再次劃線培養(yǎng)。選擇一些克隆用于甲硫氨酸生產(chǎn)分析。如下分析甲硫氨酸生產(chǎn)。菌林在CM瓊脂培養(yǎng)基上30。C下生長(zhǎng)兩天，該培養(yǎng)基含有10g/1D-葡萄糖，2.5g/1NaCl;2g/1尿素；10g/1Bacto蛋白胨(DIFCO);5g/1酵母提取物(DIFCO);5g/1牛肉膏(DIFCO);22g/1瓊脂(DIFCO);其在約121。C高壓滅菌20分鐘。菌林生長(zhǎng)后，刮去細(xì)胞并重懸浮在0.15MNaCl中。對(duì)于主要培養(yǎng)物，將刮去細(xì)胞的懸浮液以600nm的起始OD與0.5g固體和高壓滅菌的CaC03(RIEDELDEHAEN)—起加入1.5到10ml培養(yǎng)基II(見(jiàn)下文)中，并在沒(méi)有擋板的100ml搖瓶中在有軌搖動(dòng)平臺(tái)上以約200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)30。C下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)基II含有40g/l蔗糖；60g/l來(lái)自糖蜜的總糖(根據(jù)糖含量計(jì)算)；10g/1(NH4)2S04;0.4g/IMgS04*7H20;0.6g/1KH2P04;0.3mg/1硫胺素女HC1;1mg/1生物素；2mg/lFeS04;和2mg/1MnS04。將培養(yǎng)基用NH4OH調(diào)節(jié)到pH7.8并在約120°C高壓滅菌約20分鐘。高壓滅菌并冷卻后，加入來(lái)自過(guò)濾除菌貯存液(200pg/ml)的維生素B12(氰鈷胺素)(SIGMACHEMICALS)至100照/1的終濃度。從培養(yǎng)基取樣品并測(cè)定氨基酸含量。使用Agilent氨基酸方法在Agilent1100系列LC系統(tǒng)HPLC(SeriesLCSystemHPLC)上測(cè)定產(chǎn)生的氬基酸，包括甲硫氨酸。用鄰苯二醛對(duì)樣品的前置柱衍生允許在HypersilAA-柱(AGILENT)上分離后定量所產(chǎn)生的氨基酸。分離甲硫氨酸滴定度為M690中至少兩倍的克隆。用于其他實(shí)驗(yàn)中的一種此類克隆命名為M1179并且在2005年5月18日保藏在DSMZ菌林保藏中心，菌抹保藏號(hào)為DSM17322。將該菌林的氨基酸產(chǎn)量與菌林M6卯的相比較，如下面的表4概述。表4:菌株M690和M1197產(chǎn)生的高絲氨酸、0-乙?；呓z氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的量<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>將菌株M1179用DNAF(也稱作pH399，其示意圖在圖5描繪)(SEQIDNO:4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生"坎貝爾進(jìn)"菌林，其隨后被"坎貝爾出"得到菌抹M1494。該菌林在高絲氨酸激酶的基因中含有突變，其導(dǎo)致所得的高絲氨酸激酶中氨基酸從T190改變?yōu)锳l卯(稱作HskTl卯A)。將菌林M1494產(chǎn)生的>#^酸產(chǎn)量與菌林M1197的產(chǎn)量比較，如下面的表5概述。45..霧辨It/"/97和M"W/^^吝魚(yú)凌虔、0-乙脫差吝^(guò)扇^、f^;減^和橫我虔^量<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>將菌林M1494用DNAD(也稱作pH484，其示意圖在圖6描繪)(SEQIDNO:5)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生"坎貝爾進(jìn)"菌林，其隨后被"坎貝爾出"得到M1990菌林。M1990菌林過(guò)表達(dá)附WY等位基因，使用groES-啟動(dòng)子和EFTU(延伸因子Tu)-啟動(dòng)子(稱作P497P1284w"r)(P497Pi284的序列在SEQIDNO:6中顯示)。將菌林M1494的氬基酸產(chǎn)量與菌林M1990的產(chǎn)量相比，如下面表6中概述。霧禱A/7^^和Af"卯/^^吝^(guò)^^、0-乙瘋差葛^處^、f^r肩鑀^^虞減^W量<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>(mM)M149418.30.22.550.1M199018.20.35.648.9將菌林M1990用DNAE(也稱作pH491，其示意圖在圖7描繪)(SEQIDNO:7)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生"坎貝爾進(jìn)"菌林，其隨后被"坎貝爾出"得到"坎貝爾出"菌抹M2014。M2014菌林過(guò)表達(dá)/we"等位基因，使用超氧化物歧化酶啟動(dòng)子(稱作P3U9we")。將菌林M2014的氨基酸產(chǎn)量與菌林M2014的產(chǎn)量相比，如下面表7中概述。^7:蘿禱M/^^和ikf/9",i^葛^我^、0-乙瘋差豸^^^、f碗我^和^^^^量菌林高絲氨酸(mM)O-乙耽基高絲氨酸(mM)甲硫氨酸(mM)賴氨酸(mM)M19卯18.20.35.648.9M201412.31.25.749.2實(shí)施例2.谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型向曱硫氨酸中摻入二曱基二硫醚為了確定谷氨酸棒桿菌是否能夠向曱硫氨酸中摻入DMDS，構(gòu)建了M2014中的附"F缺失(實(shí)施例1中描述)。將M2014用質(zhì)粒pOM86(圖9)(SEQIDNO:8)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生"坎貝爾進(jìn)"菌林。然后將"坎貝爾進(jìn)"菌林"坎貝爾出"得到稱作OM63的"坎貝爾出"菌林。為了確定該甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型OM63是否可以利用DMDS合成甲硫氨酸，通過(guò)測(cè)量600nm的OD，測(cè)定OM63和親本M2014的試管培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。培養(yǎng)物生長(zhǎng)在無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基(配方見(jiàn)下文)、補(bǔ)充甲硫氨酸的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基或者補(bǔ)充不同量的DMDS(Aldrich目錄號(hào)32，041-2)的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基中。設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)用于確定DMDS是否可以穿過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)就被還原成甲硫醇，并且隨后被MetY或MetB或者另一種酶如MetC用作底物與O-乙酰基-高絲氨酸一起直接形成L-甲硫氨酸。還設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)以測(cè)定DMDS對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性(如果存在)。如表8中所示，谷氨酸棒桿菌附WF營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以利用DMDS作為生長(zhǎng)的底物，并因此用于甲硫氨酸生產(chǎn)。此外，在含有補(bǔ)充0.02%、0.04%或0.06%DMDS的5ml無(wú)曱硫氨酸培養(yǎng)基的試管中，所有菌林的光密度都是相似的。含有補(bǔ)充0.08%或0.1%DMDS的5ml無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管具有很少的生長(zhǎng)或者沒(méi)有生長(zhǎng)，可能是由于DMDS在這些濃度下的毒性。最后，如所預(yù)期的，沒(méi)有DMDS的無(wú)曱硫氨酸培養(yǎng)基維持M2014的生長(zhǎng)，但不維持OM63的生長(zhǎng)。表8.在補(bǔ)充或者沒(méi)有補(bǔ)充甲硫氨酸或者二甲基二硫醚(DMDS)的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基中30。C生長(zhǎng)36小時(shí)的谷氨酸棒桿菌士官培養(yǎng)物在600nm下的光密度<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>試管培養(yǎng)物在金屬蓋周圍用石蠟?zāi)っ芊?。無(wú)曱疏氨酸的培養(yǎng)基補(bǔ)充40mg/1甲石克氨酸的無(wú)Met培養(yǎng)基。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明DMDS可以被吸收并且被谷氨酸棒桿菌還原裂解成曱硫醇并且進(jìn)入甲硫氨酸途徑以維持曱硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)。備選地，DMDS是O-乙?；?高絲氨酸硫化氬解酶或者O-O-琥珀酰-高絲氨酸疏化氫解酶或者另一種酶的直接底物。換句話說(shuō)，可能一種酶催化DMDS的還原裂解和摻入到甲硫氨酸中。無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基-l升100mlDifcoTM甲硫氨酸測(cè)定培養(yǎng)基(MethionineAssayMedium)(105g/l)100ml10xSpizizen鹽*6ml葡萄糖(50%)4ml"4B，，溶液"100mg蘇氨酸40mg半胱氨酸785mldH205ml2%CaCl2**4B溶液硫胺素(BO-0.25mg/ml氰鈷胺素(812)-50ng/ml生物素-50mMKPO4pH=7.0中28ng/ml鹽酸吡噴醇-1.25mg/ml10xSpizizen鹽*20g/1硫酸銨I74g/1磷酸氫二鉀(三水合物)60g/1砩酸二氫鉀(無(wú)7JC)10g/1檸檬酸鈉2g/1硫酸鎂(七水合物)高壓滅菌后，加入3.5ml0.4%FeCl3*6H20和lml微量營(yíng)養(yǎng)素溶液1M效量營(yíng)養(yǎng)素溶液-l升0.15gNa2Mo04'2H202.5gH3B030.7gCuS04*5H201.6gMnCl2'4H200.3gZnS04'7H20通過(guò)包含約15到20g/L瓊脂，可以制備該培養(yǎng)基的固體形式。這可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟完成，如向約750ml水中加入20g瓊脂，高壓滅菌，并且在仍然熔化時(shí)，以無(wú)菌貯存液加入上面列出的成分。實(shí)施例3.開(kāi)發(fā)DMDS向谷氨酸棒桿菌的遞送系統(tǒng)以摻入到甲硫氨酸中如上面討論的，DMDS如果以高于約0.06%的量直接加入到液體培養(yǎng)物中，那么是有毒的。為了克服該問(wèn)題，尋找將允許DMDS隨時(shí)間向溶液中緩慢釋放的遞送系統(tǒng)。AmberliteXAD4是珠化的大孔聚苯乙烯樹(shù)脂，下文中稱作"XAD4"，將其選擇作為遞送系統(tǒng)，是因?yàn)樗嵌栊缘?，能夠吸附小的疏水有機(jī)化合物，能夠被水濕潤(rùn)，并且具有高的表面積和小的孔徑。進(jìn)行試管實(shí)驗(yàn)以便確定可以被XAD4吸附并且仍然允許生長(zhǎng)的DMDS的最大量。為此，使用5ml培養(yǎng)基對(duì)OM63和M2014進(jìn)行試管實(shí)驗(yàn)。每個(gè)試管含有100jil的XAD4的50。/?；鞈乙?v/v)和無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基、補(bǔ)充甲硫氨酸的無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基或者補(bǔ)充不同量的DMDS的無(wú)曱硫氨酸的培養(yǎng)基。通過(guò)向用爭(zhēng)〉開(kāi)的配合金屬蓋蓋住的無(wú)菌20mMx20mMx150mM試管中加入5ml無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基，準(zhǔn)備試管測(cè)定。向每個(gè)試管中加入100pl的XAD4在水(50%v/v)中的無(wú)菌混懸液。對(duì)試管接種在含有BHI培養(yǎng)基(BactoTM腦心浸液(BrainHeartInfusion)(Becton，DickinsonandCompany,Sparks,MD))的試管中過(guò)夜生長(zhǎng)的細(xì)胞，然后旋轉(zhuǎn)并用無(wú)曱硫氨酸的培養(yǎng)基沖洗兩次。將細(xì)胞以50%起始體積重懸浮在無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基中。細(xì)胞混懸液(5pl)用作每個(gè)試管的接種物。細(xì)胞接種后，向每個(gè)試管以所示的濃度(v/v)加入DMDS。將試管在平臺(tái)搖床上以200rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)在30。C下培養(yǎng)24-48小時(shí)。使用GenesysTM2分光光度計(jì)，通過(guò)600nm下的光密度測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)。如表9中所示，在含有補(bǔ)充0.1%、0.2%、0.3%或0.4%DMDS的無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基的試管中，所有菌株的光密度都相當(dāng)類似。補(bǔ)充0.5%DMDS的試管對(duì)OM63生長(zhǎng)顯示出負(fù)作用，然而，該水平的DMDS似乎被M2014耐受?？傊瑢MDS吸附到XAD4小珠上允許更多的DMDS被加到谷氨酸棒桿菌的液體試管培養(yǎng)物中。足夠的DMDS從小珠釋放，允許甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的完全生長(zhǎng)。表9在有或者沒(méi)有所示量的DMDS的無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基1中在XAD42存在下于30C生長(zhǎng)42小時(shí)的OM63和M2014在600nm的交密度<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>1無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基2每個(gè)試管含有5ml培養(yǎng)基加上100^AmberliteXAD4的50%混懸液?？紫堵?0.5mlAnl。接種試管后加入DMDS。接種物-細(xì)胞在含有BHI的試管中過(guò)夜生長(zhǎng)，然后旋轉(zhuǎn)并用無(wú)Met的培養(yǎng)基沖洗兩次。將細(xì)胞以50%的起始體積重懸浮。將該細(xì)胞混懸液(5叫用作每個(gè)試管的接種物。此外，僅僅XAD4對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的不利效果。如所預(yù)期的，含有無(wú)DMDS的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管支持M2014的生長(zhǎng)，但是不支持OM63的生長(zhǎng)。含有補(bǔ)充40mg/1曱疏氨酸但是沒(méi)有DMDS的無(wú)曱硫氨酸培養(yǎng)基的試管對(duì)于M2014導(dǎo)致類似的最終光密度，但是比對(duì)OM63所預(yù)期的光密度要低。這可能是由于XAD4吸附一些補(bǔ)充的曱硫氨酸，從而限制OM63細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施例4.氣態(tài)DMDS可以支持曱硫氨酸合成和OM101(J附e訪,z/w^F)的生長(zhǎng)以前已經(jīng)表明DMDS的類似物二甲基二硒醚(DMDSe)在氣態(tài)對(duì)微生物是有毒的，但是可以用于選擇缺少O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶的突變體(Brzywczy，J.，和Paszewski，A.(1994)9:1335-1342和Treichler,H.J"""/.(1978)在FEMSSymposiumNo.5，pp177-199,R.HutterWeds，AcademicPress,NewYork)。^!尋DMDSe作為液滴導(dǎo)入培#^蓋的底面得到約5fiM的終濃度(如果DMDSe的完全供給擴(kuò)散到瓊脂并溶解在其中)。然而，沒(méi)有提到化合物DMDS，并且通過(guò)氣態(tài)擴(kuò)散是否可以提供足夠水平的DMDS用于生長(zhǎng)(與類似物抑制相反)不是顯而易見(jiàn)的。為了比較，在上面實(shí)施例1-3的液體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，DMDS的濃度為約10mM(例如對(duì)于0.1%的情況)或者比上述參考文獻(xiàn)中DMDSe高約2000倍。然而，氣態(tài)DMDS的遞送可以防止用液體DMDS看到的毒性。為了測(cè)試該可能性，將約108個(gè)細(xì)胞的OM101(z/;^詔，J附CF)的菌苔沖洗至相對(duì)無(wú)甲硫氨酸，并接種在含有約25ml瓊脂培養(yǎng)基的無(wú)曱硫氨酸的瓊脂板上。DMDS通過(guò)在平板中心點(diǎn)樣50fil或者通過(guò)在平板中心的瓊脂中切一個(gè)孔并在孔中放置50piDMDS進(jìn)行遞送。如果DMDS擴(kuò)散到平板各處，那么終濃度將為約25mM。對(duì)照平板接受細(xì)胞菌苔，但是無(wú)DMDS。將平板一起放置在比這堆平板稍大的密封的聚丙烯塑料盒中，并在30。C培養(yǎng)48-60小時(shí)。用DMDS在菌苔上直接點(diǎn)樣的平板具有從液體DMDS點(diǎn)樣處約30mm的殺滅區(qū)，但是平板的剩余部分均勻覆蓋生長(zhǎng)菌苔。含有置于孔中的液體DMDS的平板沒(méi)有殺滅區(qū)，而是均勻覆蓋在整個(gè)平板的生長(zhǎng)菌苔，包括平板周圍和直到中心孔。通常，當(dāng)將需要的營(yíng)養(yǎng)物置于營(yíng)養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷菌苔中央時(shí)，見(jiàn)到生長(zhǎng)梯度，在營(yíng)養(yǎng)物最近處發(fā)生最快速生長(zhǎng)。最后，沒(méi)有加入DMDS但是與接受DMDS的平板置于相同的密封塑料盒的對(duì)照平板得到OM101生長(zhǎng)的完整菌苔。這些觀察提示谷氨酸棒桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)可以通過(guò)氣態(tài)DMDS的擴(kuò)散維持。為了證明氣態(tài)轉(zhuǎn)移，進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中從以前涂布OM101菌苔的無(wú)甲石克氨酸的平板的瓊脂中心切出環(huán)形(25x25x5mm)孔。在這些孔中放置無(wú)菌紅色聚丙烯螺旋帽((20x20x5mm)，其來(lái)自Sarstedt(No.62.554.002))圓錐形管，其用作50jil液體DMDS的杯子。該方法確保:液體DMDS不與細(xì)胞直接接觸并且僅僅通過(guò)氣態(tài)擴(kuò)散到達(dá)細(xì)胞，因?yàn)镈MDS不通過(guò)聚丙烯快速擴(kuò)散。將平板在30。C下包在氣密塑料盒中培育。用于該實(shí)驗(yàn)的對(duì)照平板是涂布OM101菌荅的無(wú)曱硫氨酸的平板并且在單獨(dú)密閉的塑料盒中不存在DMDS下于3(TC培育。2天后，觀察到完全的細(xì)菌菌苔覆蓋具有含有液體DMDS的無(wú)菌蓋的平板，并且在單獨(dú)容器中缺少DMDS的對(duì)照平板沒(méi)有顯示生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)一^明液體DMDS的直接接觸對(duì)于對(duì)OMIOI的毒性是必需的，并且相比，氣態(tài)DMDS是無(wú)毒的并且仍然可以被OM101用于生長(zhǎng)，并且因此用于甲硫氨酸合成。從而，在發(fā)酵罐中，可以將DMDS以氣態(tài)遞送到細(xì)胞中以便克服DMDS在液態(tài)下對(duì)細(xì)胞的毒性。這可以通過(guò)蒸發(fā)或者沸騰DMDS并將DMDS蒸汽泵入發(fā)酵容器中，或者通過(guò)經(jīng)由液體DMDS在它的途徑上鼓空氣或氧氣泡到發(fā)酵容器來(lái)完成。實(shí)施例5.AmetEAmetH菌林的構(gòu)建構(gòu)建缺失附C五和we/好的谷氨酸棒桿菌菌株。將M2014用質(zhì)粒pH469(圖IO)(SEQIDNO:9)轉(zhuǎn)化得到"坎貝爾進(jìn)"菌林。然后將"坎貝爾進(jìn)"菌林"坎貝爾出，，得到"坎貝爾出"菌林OM228C-2，其含有we必缺失。然后將OM228C-2用質(zhì)粒pH300(圖11)(SEQIDNO:10)轉(zhuǎn)化得到"坎貝爾進(jìn)，，菌林。然后將該"坎貝爾進(jìn)"菌林"坎貝爾出，，得到"坎貝爾出"菌林OM246C,該菌林含有A附W五和A附W好。如所預(yù)期的，雙缺失菌抹的兩種分離菌OM246C-l和OM246C-2是曱硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型并且在試管培養(yǎng)中在糖蜜培養(yǎng)基中不產(chǎn)生甲硫氨酸。實(shí)施例6.MetY負(fù)責(zé)催化甲硫醇與O-乙?；?高絲氨酸之間的反應(yīng)以產(chǎn)生甲硫氨酸的主要酶促活性因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)導(dǎo)提出MetB(Flavin,M.和S.Slaughter1967.祝oc/h附.132:400-405;Kanzaki,H.etal.1987./.必/oc/^柳.163:105-112;Kiene，R.P.etal.1999.j/p/.五wv/fvm.MicrM"/.65:4549-4558)或MetZ(Yamagata，S.1971./Bi》c^附.(Tokyo)70:1035)可以參與曱硫醇摻入，所以用含有A附C5等位基因的OM63衍生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定涉及谷氨酸棒桿菌中甲硫醇摻入的酶。如上面闡明的，谷氨酸棒桿菌可以通過(guò)甲疏醇將二曱基二硫醚(DMDS)直接摻入到曱硫氨酸中。在實(shí)施例3中，確定DMDS如果以小于約0.06%的量直接加入到液體培養(yǎng)基中，那么可以被細(xì)胞耐受，然而，如果在遞送系統(tǒng)如吸附劑AmberliteTMXAD4存在下加入，那么加入液體培養(yǎng)物的DMDS的量可以在觀察到毒性之前增力口5倍。用甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型OM63(A附WF)進(jìn)行"概念證明"實(shí)驗(yàn)，表明谷氨酸棒桿菌可以利用DMDS維持A/MWF甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步鑒定哪些酶涉及谷氨酸棒桿菌中甲硫醇向甲硫氨酸的摻入，對(duì)在we戰(zhàn)中含有缺失的菌株測(cè)試它們?cè)贒MDS存在下生長(zhǎng)的能力。在含有100jalAmberliteXAD4的50%混懸液和無(wú)曱硫氨酸的培養(yǎng)基或者補(bǔ)充不同量的DMDS的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)OM101C(A/w"F，A附e/J8)、實(shí)施例4中描述的OM246c(A附"F，A附"巧、OM63(Aw"F)，和M2014,OM101C(A附"F，A附e迅)來(lái)自用H216轉(zhuǎn)化的OM63,H216含有與pSH315(HwangBJ，"dJ丑""e"》/.2002Mar;lM(5):l"7-86)相同的附e必缺失等位基因以缺失附e訪。如表10所示，在含有補(bǔ)充0.1或者0.2%DMDS的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管中，所有菌林的光密度都是相似的。除了OM101C之夕卜，所有菌林都能夠在補(bǔ)充0.4%MDS的無(wú)曱硫氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，OM101C在0.3%DMDS下顯示出生長(zhǎng)抑制。僅僅菌林OM246C能夠在0.5%DMDS存在下生長(zhǎng)。這些結(jié)果一起表明，MetB、MetH/MetE和MetF對(duì)于曱硫醇向甲硫氨酸的摻入不是必需的。因此，MetY對(duì)于允許DMDS向甲硫氨酸的摻入的酶促活性AA夠的。4J汰^長(zhǎng)4試l5^弄^"摩^"量的Diktt)51^^/w&r/ZteX42M2存在T射尤f(wàn)碗扇^培祟差'OAf63、OM7WC、OM2"C和M20"在6卯w附菌株親本基因型DMDSDMDSDMDSDMDSDMDSDMDSmet0%.0.1%.0.2%.0.3%0.4%0.5%，_mg/1OM63M2014Jm^F0.03.03.91,50.12.40.03.33.42.11.60.13.0OM101OM63zTw^F0.02.53.11.60.050.021.9CzT/we訪0.02.73.90.80.030.012.1OM246M2014Jme必0.04.34.23.33.63.13.9_Jwg^T0.04.53.83.63.22,44.3M2014黃本4.34.44.03.81.30,074.44.]4.34.23.52.30.034.7i無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基。2每個(gè)試管含有5ml培養(yǎng)基加上100nlXAD4的50°/?；鞈乙?。加入XAD4和DMDS之后接種試管。接種物-細(xì)胞在含有BHI的試管中過(guò)夜生長(zhǎng)，然后旋轉(zhuǎn)并用無(wú)Met的培養(yǎng)基沖洗兩次。將細(xì)胞以50%起始體積重懸浮。5pl細(xì)胞懸浮液用作每個(gè)試管的接種物。實(shí)施例7.鑒定MetY為具有O-乙酰基高絲氨酸甲硫醇硫化氫解酶活性的酶這里我們直接表明MetY而不是MetB是O-乙?；呓z氨酸甲硫醇硫化氬解酶活性必需和足夠的酶。用含有w"F、/we訪和/wC缺失的不同組合的M2014衍生物進(jìn)行試管實(shí)驗(yàn)。菌林在具有AmberliteTMXAD4小珠和有或者沒(méi)有200mg/1DMDS或者100mg/1甲硫氨酸的無(wú)甲疏氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。接種物為每個(gè)試管約5xl()S個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在平臺(tái)搖床上30。C下生長(zhǎng)60小時(shí)，在OD6(M)下測(cè)量細(xì)胞密度。如表11所示，DMDS可以維持甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型OM63(A附WF)和OM101(A附CF,Awe訪)的生長(zhǎng)，然而，DMDS不維持含有附^y缺失的任何曱硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型如OM158或OM174的生長(zhǎng)。通過(guò)用質(zhì)粒pH215(SEQIDNO:ll)轉(zhuǎn)化OM63得到"坎貝爾進(jìn)，，菌抹構(gòu)建OM158。SEQIDNO:ll中顯示的核斷列是pH215中缺失的附^y基因的區(qū)域，從附"y的起始密碼子——?dú)埢?-3延伸到的終止密碼子——?dú)埢?12-914。該缺失周圍的兩個(gè)堿基是殘基609-610。然后將該"坎貝爾進(jìn)"菌林"坎貝爾出"得到"坎貝爾出"菌抹OM158,其含有A附WF，A附"F。通過(guò)用質(zhì)粒pH215轉(zhuǎn)化OM101得到"坎貝爾進(jìn)"菌抹，構(gòu)建OM174。然后將"坎貝爾進(jìn)，，菌林"坎貝爾出"得到"坎貝爾出，，菌抹OM174,其含有A附WF，A附W5，A附^y。圖8顯示了使用質(zhì)粒pH215缺失柳CF的部分之前(8A)和之后(8B)，在/weJ區(qū)域中谷氨酸棒桿菌染色體的結(jié)構(gòu)。該數(shù)據(jù)表明MetY是負(fù)責(zé)O-乙?；呓z氨酸甲硫醇硫化氫解酶活性的唯一酶，并且MetB或MetC都不含有足夠水平的該酶促活性以在這些條件下生長(zhǎng)。表ll.有或者沒(méi)有0.2%DMDS和AmberliteXAD4下在試管中無(wú)曱硫氨酸的培養(yǎng)基中30"C生長(zhǎng)60小時(shí)的菌株的OD6。o<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實(shí)施例8.谷氨酸棒桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌林中甲硫氨酸生產(chǎn)的效率一旦確定A附WF或A附e必AwW/f谷氨酸棒桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以利用DMDS合成甲硫氨酸，重要的是測(cè)定曱硫氨酸生產(chǎn)效率。進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，其中比較OM246C和M2014。每個(gè)搖瓶含有20ml糖蜜培養(yǎng)基和800pl的AmberliteTMXAD4的50%混懸液，有或沒(méi)有0.4%DMDS。如表12中所示，沒(méi)有DMDS的OM246C幾乎沒(méi)有積累甲硫氨酸。相反，具有DMDS的OM246C積累約0，3g/l曱硫氨酸。從而，曱硫氨酸的產(chǎn)生從O-乙?；?高絲氨酸直接向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)變發(fā)生，繞過(guò)了高半胱氨酸。最重要的是，在DMDS存在下生長(zhǎng)的OM246C的甲硫氨酸滴定度的凈增加斷然確定當(dāng)存在DMDS時(shí)，可以通過(guò)在曱硫氨酸合成的最后步驟中有缺陷的谷氨酸棒桿菌突變體產(chǎn)生甲硫氨酸。對(duì)照菌林M2014在DMDS存在或不存在下積累相似的氨基酸鐠。有趣的是，在M2014中，DMDS稍稍刺激甲硫氨酸產(chǎn)量從約0.5g/1到約0.7g/l。這可通過(guò)DMDS的摻入與從常規(guī)的甲硫氨酸生物合成途徑產(chǎn)生曱硫氨酸組合的累加效應(yīng)解釋。^".l-戈者發(fā)^"汰^^D3/i)^^4潛,培祟J^^^長(zhǎng)的M20^/和O-Ac-菌林DMDSGly+HsehseMetlieLysOD'60020140pi0.00.0,.2L.65.40.50.02.6334.40.40.02.93480pi0.10.01.41.03.60.70.02.5304.30.60.02.538OM246C0pi5.33.00.70.70.30.00.11.8321.10.00.21.73080fil0.01.74.60.40.03.232_0.21.3_4.30.20.03.435i糖蜜培養(yǎng)基補(bǔ)充l。/o酵母提取物、生物素、BpB12、B6和100mg/1蘇氨酸。2每個(gè)搖瓶含有20ml培養(yǎng)基加上800filXAD4的50%混懸液。加入XAD4和80nlDMDS(有或沒(méi)有)后接種搖瓶。加入的DMDS的終濃度為0.4%v/v。接種物-細(xì)胞在含有BHI的試管中過(guò)夜生長(zhǎng)，然后旋轉(zhuǎn)并用無(wú)Met的培養(yǎng)基沖洗兩次。將細(xì)胞以50%的起始體積重懸浮。將100nl細(xì)胞懸浮液用作每個(gè)搖瓶的接種物。3氨基酸以g/1報(bào)告。實(shí)施例9.DMDS向谷氨酸棒桿菌遞送以摻入到曱硫氨酸的遞送系統(tǒng)的進(jìn)一步研發(fā)為了進(jìn)一步研究DMDS的潛在遞送系統(tǒng)(除了AmberliteTMXAD4之外)，研究了重白礦油(Sigma目錄號(hào)400-5)和植物油、油菜油。因?yàn)橛褪鞘杷?，所以它們將能夠溶解DMDS和潛在允許DMDS緩釋到水性培養(yǎng)基中。向含有5ml有或者沒(méi)有100mg/1甲硫氨酸的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管中加入含有不同量的溶解DMDS的油(0.5ml)。在平臺(tái)搖床中30。C培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)量含有O、0.2、0.4、0.8和1,2。/。終濃度DMDS的培養(yǎng)基的光密度。如表13中所示，在含有高達(dá)0.4。/oDMDS的試管中發(fā)生OM246C的生長(zhǎng)，而在含有溶解于礦物油中高達(dá)0.8%DMDS的試管中發(fā)生M2014的生長(zhǎng)。然而，光密度與含有無(wú)礦物油的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)物的光密度相比小于一半。與允許細(xì)胞生長(zhǎng)的AmberliteTMXAD4相比，礦物油中DMDS的最大量對(duì)于M2014稍高(0.8°/。對(duì)0.4%),但是對(duì)于OM63是相似的(0.4%對(duì)0.4%)。當(dāng)測(cè)試油菜油作為遞送系統(tǒng)時(shí)，觀察到相似的結(jié)果；然而，僅僅油菜油對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的消極作用沒(méi)有礦物油大(表14)。在這些油存在下生長(zhǎng)的減弱可能部分是由于在試管培養(yǎng)中缺少足夠的通氣、細(xì)胞膜的破壞或者這兩者的組合。然而，顯然油可以用作發(fā)酵中DMDS的遞送系統(tǒng)。來(lái)自動(dòng)物、礦物、化學(xué)或者植物來(lái)源的油或者其組合可以用于DMDS向細(xì)胞的遞送。其他可能的遞送系統(tǒng)包括合成油、有機(jī)溶劑、氯碳化合物、氟碳化合物，或者氯氟碳化合物。額外的方法將是受控的DMDS進(jìn)料，其向細(xì)胞提供低于毒性水平的穩(wěn)態(tài)水平。選擇DMDS抗性的谷氨酸棒桿菌菌林將還減輕DMDS毒性組織。最后，利用內(nèi)在更抗DMDS毒性的宿主種類將也減輕該問(wèn)題。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例10.菌抹改良大腸桿菌附e必基因已經(jīng)被突變或者進(jìn)化成利用甲硫醇(wo2004/076659A2)。使用甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，例如，缺少M(fèi)etE和MetH或MetF的甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，但是在選擇培養(yǎng)基中使用DMDS而不是甲硫醇，可以進(jìn)行類似的選擇步驟。從而，可以通過(guò)用甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型開(kāi)始，并且在缺少甲硫氨酸但是含有DMDS的基本培養(yǎng)基上選擇生長(zhǎng)或者更快的生長(zhǎng)，并且使用或者不使用化學(xué)品、誘變、放射或者增變等位基因，選擇具有將DMDS摻入甲硫氨酸能力更大的微生物，所述甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型例如可以產(chǎn)生O-乙?；呓z氨酸或者O-琥珀酰高絲氨酸，但是不能利用高絲氨酸。該類型的選擇可以集中在特定基因，如附e訪基因、基因、/w"C基因或附"/基因(AugerWa/"2002Micn^/o/ogy148:507-518)，通過(guò)將所述基因插入質(zhì)粒上并將該質(zhì)粒導(dǎo)入缺少(通過(guò)缺失或者誘變)摻入DMDS的內(nèi)在能力的菌林中，并進(jìn)行如上述的選擇來(lái)進(jìn)行該所述類型的選擇。此類經(jīng)選擇的微生物的后代，或者從此類經(jīng)選擇的微生物分離的基因也可以用于構(gòu)建或者衍生甲硫氨酸生產(chǎn)菌林。實(shí)施例11.如果提供O-乙酰基高絲氨酸硫化氬解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，大腸桿菌可以將DMDS代謝成甲疏氨酸將大腸桿菌曱硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型CGSC3592(附CF6力和RY714B、MM294的/we必;:7V^(M柳"jy衍生物(也稱作ATCC33625)和CGSC6315OwdL4/，^n，s"/7E"，AmMW7)用pH357(SEQIDNO:13;表達(dá)谷氨酸棒桿菌附C和附"X的質(zhì)粒)，pH309(SEQIDNO:14;表達(dá)谷氨酸棒桿菌附"y的質(zhì)粒)，或者pCLIK轉(zhuǎn)化，pCLIK是與pH357和pH309有關(guān)的空載體，在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制(SEQIDNO:15)。在豐富培養(yǎng)基(LuriaBroth瓊脂)上選擇對(duì)25mg/L硫酸卡那霉素的抗性。將6種轉(zhuǎn)化體平板接種在無(wú)甲疏氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上，在瓊脂中心切出一個(gè)孔，向孔中加入50微升DMDS，并如實(shí)施例4中所述的在30。C溫育平板。用pH309或pH357轉(zhuǎn)化的兩種菌林在該平板上生長(zhǎng)，但是用空載體pCLIK轉(zhuǎn)化的菌抹都不能生長(zhǎng)，表明附e,y對(duì)于大腸桿菌利用DMDS合成曱硫氨酸是必需的和足夠的。這些結(jié)果還支持如下觀點(diǎn)MetY具有O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶和O-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶活性，因?yàn)槔鏡Y714B/pH309依賴于大腸桿菌MetA酶，已知其主要產(chǎn)生O-琥珀酰高絲氨酸。從而，大腸桿菌如果被如本文所述的工程化，那么能夠輸入DMDS，將其還原，并摻入到曱硫氨酸中。因?yàn)榇竽c桿菌和谷氨酸棒桿菌是不密切相關(guān)的生物，而都具有該能力，所以我們預(yù)期多種生物都具有該能力，并且可以將多種生物工程化以使用DMDS作為進(jìn)料化合物之一產(chǎn)生甲硫氨酸。實(shí)施例12.反饋抗性O(shè)-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的選擇為了通過(guò)生物合成產(chǎn)生甲硫氨酸，希望使用反饋抗性O(shè)-乙?；呓z氨酸石克化氫解酶和/或者o-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶。在許多生物中，這些酶被曱硫氨^饋抑制。例如，谷氨酸棒桿菌中的MetY(O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶)被甲硫氨l饋抑制，甲硫氨酸對(duì)于甲硫氨酸合成M生產(chǎn)的。已經(jīng)描述了推測(cè)抗甲疏氨酸抑制的突變形式的MetY(WO2004/108894A2)，但是這些形式可能不是提高甲硫氨酸生物合成的最好的形式。從而，仍然需要MetY的合適的反饋抗性形式。因?yàn)樵诒疚囊呀?jīng)表明MetY是可以賦予在DMDS上生長(zhǎng)的酶，所以開(kāi)發(fā)了如下用于選擇有用的w^F等位基因的新方案。將缺少M(fèi)etF或MetE和MetH并且任選還缺少M(fèi)etY、MetB和/或MetC,但是經(jīng)工程化以相對(duì)高O-乙?；呓z氨酸合成的谷氨酸棒桿菌菌林(例如，OM174(JwWF，J附^fi，J柳"F)或OM246C(J附e必，zf附e^0)(美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/700,699，2005年7月18日申請(qǐng)，標(biāo)題"MethionineProducingRecombinantMicroorganism，，)用表達(dá)MetY的質(zhì)舉立如pH357或pH309轉(zhuǎn)化。通過(guò)質(zhì)粒pH357或pH309產(chǎn)生的MetY,所得的菌林可以在含有DMDS的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。用甲硫氨酸類似物，如a-甲基曱硫氨酸、硒基蛋氨酸、正亮氨酸、四氟甲硫氨酸、甲硫氨酸異羥肝酸酯(Methioninehydroxamate)、乙硫氨酸、S國(guó)甲基半胱氨酸等等篩選抑制該菌林生長(zhǎng)的甲硫氨酸類似物。在一些情況中，抑制該菌抹生長(zhǎng)的類似物通過(guò)MetY的假反饋抑制進(jìn)行抑制。換句話說(shuō)，該類似物將結(jié)合MetY上的甲疏氨酸結(jié)合位點(diǎn)，并且抑制所述酶的活性。選擇抗所述類似物的突變體(用或不用誘變)將導(dǎo)致MetY的變體，其抗所述類似物的結(jié)合和甲硫氨酸。從此類突變體候選物分離質(zhì)粒DNA并再轉(zhuǎn)化到幼稚的未突變的宿主菌林中，并且確定該類似物抗性表型是否由所引入的質(zhì)粒編碼。通過(guò)該篩選的質(zhì)粒將含有一種或多種突變，它們的一些將賦予所希望的對(duì)甲硫氨酸的反饋抗性。上述產(chǎn)生和鑒定反饋抗性O(shè)-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶變體的方案還適于分離反饋抗性O(shè)-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶變體。該方法是類似的，但M始生物產(chǎn)生O-琥珀酰高絲氨酸而不是O-乙?；呓z氨酸作為中間體，并且該質(zhì)粒編碼O-琥珀酰高絲氨酸石?；瘹褰饷付皇荗-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶。換句話說(shuō)，該質(zhì)粒含有附WZ基因而不是附e"基因。上述對(duì)反饋抗性MetY或MetZ的選擇也可以在不同于谷氨酸棒桿菌的生物中進(jìn)行。例如，如上面的實(shí)施例11中所示，大腸桿菌RY714B/pH309或大腸桿菌CGSC3592/pH357等也可以在具有DMDS的無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而此類菌林也可以用于通過(guò)在含有DMDS的無(wú)曱硫氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并選擇對(duì)甲硫氨酸類似物的抗性，選擇所希望的MetY變體。因?yàn)榇竽c桿菌MetA對(duì)于甲硫氨酸和一些類似物如a-曱基甲硫氨酸的抑制也是敏感的(UsudaY，KurahashiO"五wW腦.2005June;71(6):3228-34)，所以通過(guò)使用大腸桿菌附e"-突變林，并例如用pH357提供反饋抗性MetA或MetX,或者使用已經(jīng)選擇對(duì)該類似物產(chǎn)生抗性的附^4等位基因，可以增強(qiáng)所希望的附"r等位基因的選擇。一般地，該方法將可以用于多種細(xì)菌、酵母、真菌、古細(xì)菌和植物。等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同方案。此類等同方案意在被下面的權(quán)利要求包括。權(quán)利要求1.產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括在甲基封端的硫醚化合物存在下培養(yǎng)產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述甲基封端的硫醚化合物選自二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫、二曱基四硫和硫醚的更高分子量的聚合物，其末端被曱基封端。3.產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括在二甲基二硫醚(DMDS)存在下培養(yǎng)產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中DMDS以0.02%或者更高濃度存在于培養(yǎng)物中。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中DMDS以0.06%或者更高濃度存在于培養(yǎng)物中。6.產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其包括在緩釋二甲基二硫醚(DMDS)遞送系統(tǒng)存在下培養(yǎng)產(chǎn)生曱硫氨酸的微生物，從而產(chǎn)生曱硫氨酸。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)是AmberliteTMXAD4.8.權(quán)利要求7的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)在培養(yǎng)物中以0.1%或者更高水平釋放DMDS。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)在培養(yǎng)物中以0.3%或者更高水平釋放DMDS。10.權(quán)利要求6的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)包含與水不溶混但是溶解DMDS的液體。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)包含選自動(dòng)物油、礦物油、化學(xué)油、植物油、合成油、有機(jī)溶劑、氯碳化合物、氟碳化合物、氯氟碳化合物或者其組合的液體。12.權(quán)利要求6的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)是緩慢受控的DMDS進(jìn)料。13.權(quán)利要求6的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)是DMDS通過(guò)DMDS可滲透的膜流動(dòng)或者擴(kuò)散。14.權(quán)利要求6的方法，其中所述緩釋DMDS遞送系統(tǒng)包含以氣態(tài)輸送DMDS。15.權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)蒸發(fā)或者沸騰液體DMDS產(chǎn)生氣態(tài)DMDS.16.權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)經(jīng)由液體DMDS鼓空氣或者氧氣泡產(chǎn)生氣態(tài)DMDS。17.權(quán)利要求l、2、3或6的方法，其中所述產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物屬于棒桿菌屬。18.權(quán)利要求l、2、3或6的方法，其中產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物是谷氨酸棒桿菌。19.權(quán)利要求l、2、3或6的方法，其中產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、酵母和古細(xì)菌。20.權(quán)利要求l、2、3或6的方法，其中產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物的至少一種曱硫氨酸生物合成酶被失調(diào)。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸石?；瘹浣饷富騉-琥珀酰高絲氨酸硫化氬解酶。22.權(quán)利要求l、2、3或6的方法，其中產(chǎn)生甲硫氨酸的微生物的至少兩種甲石充氨酸生物合成酶被失調(diào)。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶或高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶和被失調(diào)的高絲氨酸脫氫酶。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸石危化氫解酶和被失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶或者被失調(diào)的O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和被失調(diào)的高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶。25.產(chǎn)生甲石危氨酸的方法，其包括在二甲基二硫醚(DMDS)的存在下培養(yǎng)具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑的微生物，從而產(chǎn)生甲硫氨酸。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述微生物屬于棒桿菌屬。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述孩t生物是谷氨酸棒桿菌。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述孩t生物屬于埃希氏菌屬。29.權(quán)利要求25的方法，其中所述微生物選自革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、酵母和古細(xì)菌。30.權(quán)利要求25的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸石?；瘹浣饷富騉-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶。31.權(quán)利要求25的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶或高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶和被失調(diào)的高絲氨酸脫氫酶。32.權(quán)利要求25的方法，其中所述微生物具有被失調(diào)的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶和被失調(diào)的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶或者被失調(diào)的O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和被失調(diào)的高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶。33.權(quán)利要求25的方法，其還包括分離甲硫氨酸的步驟。34.包含根據(jù)權(quán)利要求33的分離的甲疏氨酸的組合物。35.根據(jù)上面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法合成的含有曱硫氨酸的產(chǎn)品。36.用于在二甲基二硫醚(DMDS)存在下產(chǎn)生甲硫氨酸的重組微生物，所述微生物具有失調(diào)的甲硫氨酸生物合成途徑。37.權(quán)利要求36的微生物，其屬于棒桿菌屬。38.權(quán)利要求37的微生物，其是谷氨酸棒桿菌。39.權(quán)利要求36的微生物，其屬于埃希氏菌屬。40.提高DMDS的利用以進(jìn)行甲疏氨酸生產(chǎn)的方法，其包括在缺少甲硫氨酸但是含有DMDS的基本培養(yǎng)基上選擇生長(zhǎng)或者較快生長(zhǎng)的甲疏氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。41.權(quán)利要求40的選擇方法得到的微生物或者所述微生物的后代。42.從自權(quán)利要求40的選擇方法得到的微生物得到的分離的基因。43.鑒定編碼抗甲硫氨^饋抑制的O-乙酰基高絲氨酸疏化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的突變等位基因的方法，其包括a)將依賴于DMDS的生物和質(zhì)粒編碼的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶以在無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生物與抑制所述生物生長(zhǎng)的曱硫氨酸類似物接觸，b)選擇所述生物的抗所述類似物的突變變體，c)分離所述突變變體，其中所述抗性表型由所述質(zhì)粒編碼，和d)測(cè)定所述質(zhì)粒的相關(guān)部分的DNA序列以鑒定在所述O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的編碼區(qū)中具有被改變序列的突變質(zhì)粒，從而鑒定編碼抗甲硫氨^饋抑制的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸石克化氫解酶的突變等位基因。44.權(quán)利要求44的方法，其中所述生物缺少甲硫氨酸合酶(MetE和MetH)或者亞甲基四氫葉酸還原酶(MetF)，并且所述無(wú)甲硫氨酸的培養(yǎng)基含有二甲基二硫醚(DMDS)。45.權(quán)利要求43或44的方法，其中所述生物是谷氨酸棒桿菌菌林。46.權(quán)利要求43或44的方法，其中所述生物是大腸桿菌菌抹。47.通過(guò)權(quán)利要求43的方法分離的突變的O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶。48.含有通過(guò)權(quán)利要求43的方法分離的突變的O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶或者O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的生物。全文摘要本發(fā)明描述了用于產(chǎn)生甲硫氨酸的改進(jìn)方法和生物。本發(fā)明闡明ΔmetF生物或者ΔmetEΔmetH生物，例如谷氨酸棒桿菌或者大腸桿菌的突變體可以使用甲基封端的硫醚來(lái)源，如二甲基二硫醚(DMDS)作為硫和甲基的來(lái)源以合成甲硫氨酸，避免了對(duì)MetH/MetE和MetF活性的需要和還原硫酸鹽的需要。本發(fā)明還描述了涉及MetY(也稱作MetZ)作為將甲基封端的硫醚來(lái)源如DMDS摻入到甲硫氨酸的酶的數(shù)據(jù)。谷氨酸棒桿菌的ΔmetFΔmetB菌株可以使用甲基封端的硫醚來(lái)源如DMDS作為硫醚和甲基的來(lái)源。此外，通過(guò)加入甲基封端的硫醚來(lái)源如DMDS，提高了過(guò)量產(chǎn)生O-乙?；呓z氨酸的工程化原養(yǎng)型生物的甲硫氨酸產(chǎn)量。文檔編號(hào)C12P13/12GK101223280SQ200680026206公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2006年7月18日優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日發(fā)明者A·赫羅爾德,C·克洛普羅格,H·施羅德,M·K·威廉姆斯,O·策爾德?tīng)?R·R·約庫(kù)姆,S·哈夫納申請(qǐng)人:巴斯福股份公司