專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于治療癌癥及其它新血管生成疾病的RNAi治療劑的組合物和方法用于治療癌癥及其它新血管生成疾病的RNAi治療劑的組合物和方法本申請(qǐng)要求2005年4月12日提交的美國(guó)申請(qǐng)60/670，717的優(yōu)先權(quán)，因此其內(nèi)容全部引入作為參考。本申請(qǐng)還涉及下列申請(qǐng)它們的內(nèi)容也全部引入作為參考PCT/US03/24587,通過(guò)導(dǎo)入干擾RM下調(diào)靶基因體內(nèi)表達(dá)的方法；PCT/US2005/003857,用于治療眼睛新血管生成疾病的；PCT/US2005/003858，組合RNAi治療劑的組合物和方法。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了用于治療具有有害新血管生成(NV)的疾病的組合物和方法，該疾病常伴血管的異?；蜻^(guò)度增生和生長(zhǎng)。NV本身的發(fā)展常常具有不利后果或它可以是疾病的早期病理階段。盡管采用了新的治療性血管生成拮抗劑，包括VEGF途徑拮抗劑，但是控制NV的治療選擇還不充足且對(duì)于NV的有效治療仍存在強(qiáng)烈的和增長(zhǎng)的未滿足的臨床需要，無(wú)論是抑制疾病進(jìn)展還是逆轉(zhuǎn)有害的血管生成。由于NV也可以是正常的生物學(xué)過(guò)程，因此優(yōu)選對(duì)病理組織選擇性地完成有害NV的抑制，優(yōu)選需要將治療分子選擇性遞送至病理組織。本發(fā)明通過(guò)提供控制NV的治療克服了這個(gè)障礙，所述的治療是通過(guò)血管生成前生化途徑的選擇性抑制，包括VEGF途徑基因表達(dá)的抑制和定位于病理NV組織的抑制實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了組合物和使用組織乾向納米顆粒組合物的方法，該組合物包含聚合物綴合物且進(jìn)一步包含誘導(dǎo)RNA千擾(RNAi)的核酸分子。本發(fā)明提供了用于抑制在NV中，更優(yōu)選在VEGF途徑中起作用的各個(gè)基因或基因組合的組合物和方法。本發(fā)明的dsRM納米顆粒組合物可以單獨(dú)使用或與其它治療劑聯(lián)合使用，包括定向療法，包括VEGF途徑拮抗劑，如單克隆抗體和小分子抑制劑，和抑制EGF及其受體或PDGF及其受體或MEK或Bcr-Abl的定向療法，以及免疫治療和化療。本發(fā)明還提供了用于治療受治療者NV疾病的組合物和方法，所述疾病包括癌癥、眼病、關(guān)節(jié)炎和炎癥性疾病。發(fā)明背景最近，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的治療劑，包括Avastin和Macugen對(duì)NV疾病提供了一些益處。這些治療劑中的一些通過(guò)結(jié)合和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的作用而起作用，但是這些治療劑對(duì)于很多患者無(wú)效。臨床研究中正在評(píng)估的其它治療劑顯示它們可以通過(guò)結(jié)合和抑制VEGF的受體，或用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的這些受體所使用的"下游"蛋白的作用而提供一些益處的跡象。出現(xiàn)的這種情景意味著控制該VEGF"途徑"可以呈現(xiàn)出為一些患者提供益處的控制NV的水平。此外，對(duì)一系列小分子激酶抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)一種具有抗多種激酶蛋白、VEGF受體、PDGF受體、FLT3和Kit活性的凈皮稱(chēng)為"sunitinib"的抑制劑對(duì)NV疾病提供了更好的臨床益處。然而，這些益處對(duì)于大多數(shù)患者來(lái)說(shuō)仍然不夠，仍需要控制VEGF途徑的更好的治療方法。迄今開(kāi)發(fā)的治療劑主要是VEGF或其受體-VEGFRl和VEGFR2的拮抗劑。使用拮抗劑發(fā)生的一個(gè)問(wèn)題看來(lái)是病理組織所引起的增加VEGF產(chǎn)生的反應(yīng)。因此，改善治療性控制NV的有吸引力的方法是抑制VEGF途徑蛋白的產(chǎn)生，即下調(diào)它們的基因表達(dá)，和通過(guò)體內(nèi)遞送小干擾dsRNA寡核苷酸(siRNA)誘導(dǎo)RNA干擾來(lái)完成之。RNA干擾(RNAi)是轉(zhuǎn)錄后過(guò)程，其中雙鏈RNA以序列特異性方式抑制基因表達(dá)。RNAi過(guò)程至少以?xún)刹桨l(fā)生在第一步過(guò)程中，長(zhǎng)dsRNA被內(nèi)源核糖核酸酶切割成較短的，21-或23-核苷酸長(zhǎng)的dsRNA。在另一個(gè)第二步驟中，較小的dsRNA介導(dǎo)具有匹配序列的mRNA分子的降解和結(jié)果選擇性下調(diào)該基因的表達(dá)。這種RMi作用可以通過(guò)將較長(zhǎng)的雙鏈RNA(dsRNA)或者較短的小干擾RNA(siRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的靼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。最近，據(jù)證實(shí)RNAi還可以通過(guò)導(dǎo)入產(chǎn)生與靶基因互補(bǔ)的dsRNA的質(zhì)粒來(lái)完成。RNAi方法已經(jīng)成功用于果蠅(2°'22'23'25)/C.e/^a/7s(141516)和Zebrafish(2。)中的基因功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)。在那些模型生物中，已報(bào)道了化學(xué)合成的較短siRNA或體外轉(zhuǎn)錄的較長(zhǎng)dsRNA都可以有效抑制靼基因表達(dá)。已經(jīng)報(bào)道該方法在非人哺乳動(dòng)物和人細(xì)胞培養(yǎng)物中成功實(shí)現(xiàn)了RNAi作用(39—56)。然而，在成年動(dòng)物模型中難以觀察到RNAi作用""。這是由于幾個(gè)原因，包括長(zhǎng)雙鏈RNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以觸發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)，包括上調(diào)千擾素、引起細(xì)胞凋亡和死亡，這可能對(duì)期望的治療效果有害或有益dsRNA進(jìn)入靶細(xì)胞的效率低，特別是在動(dòng)物中；短dsRNA分子迅速?gòu)难悍置诘侥蛑校缓蚏NA分子可由核糖核酸酶活性所降解。盡管RMi在基因目標(biāo)確認(rèn)和核酸療法中具有應(yīng)用潛力，但是由于遞送入動(dòng)物疾病模型的RNAi分子的量少，這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展受到阻礙。因此顯然改善RNAi分子遞送到體內(nèi)的方法很重要。誘導(dǎo)RNAi的核酸分子的組織靶向遞送顯然也是很重要的。遞送誘導(dǎo)選擇性針對(duì)VEGF途徑基因的RNAi的核酸分子的方法將非常有益于NV疾病的治療同樣是明顯的。本發(fā)明的組合物和方法可以滿足這些需要。發(fā)明概述因此本發(fā)明的目的是利用RNAi調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程以便通過(guò)下調(diào)NV致病中所涉及的基因表達(dá)，更具體地說(shuō)是VEGF途徑中的基因來(lái)逆轉(zhuǎn)疾病過(guò)程。因此本發(fā)明的目的是提供用于抑制哺乳動(dòng)物中一種或多種VEGF途徑基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明的另一目的是提供用于治療NV疾病的組合物和方法，其通過(guò)抑制一種或多種VEGF途徑基因表達(dá)，單獨(dú)或與包括相同VEGF途徑的拮抗劑的其它藥劑聯(lián)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在達(dá)到這些目的過(guò)程中，提供了用于下調(diào)內(nèi)源VEGF途徑基因的組合物和方法，包括給哺乳動(dòng)物組織施用包含雙鏈RM分子的組合物，其中RM分子特異性降低或抑制內(nèi)源VEGF途徑基因表達(dá)。內(nèi)源基因的這種下調(diào)可以用來(lái)治療由VEGF途徑的活性？1起或加劇的疾病。該疾病可以在人類(lèi)中發(fā)生。也已經(jīng)提供了用于治療哺乳動(dòng)物中與不需要的VEGF途徑基因表達(dá)相關(guān)的疾病的方法，包括應(yīng)用包含dsRNA寡核苷酸的核酸組合物作為活性藥物成分(API)，與一種制劑結(jié)合，其中該制劑可以包含聚合物，所述的核酸組合物能夠降低VEGF途徑基因表達(dá)和抑制疾病中的NV。該疾病可以是癌癥或癌前生長(zhǎng)且組織可以是例如腎組織、乳房組織、結(jié)腸組織、前列腺組織、肺組織或卵巢組織。本文使用的"寡核普酸"和基于此的相似術(shù)語(yǔ)是指由天然存在核普酸組成的短寡聚物(oligos)以及由合成或修飾核苷酸組成的寡聚物。寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是10個(gè)或更多個(gè)核苷酸，或15、或16、或17、或18、或19、或20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，或21、或22、或23、或24個(gè)或更多個(gè)核苷酸，或25、或26、或27、或28或29、或30個(gè)或更多個(gè)核苷酸，或35個(gè)或更多個(gè)、40個(gè)或更多個(gè)、45個(gè)或更多個(gè)，至多大約50個(gè)核普酸。是siRNA的寡核苷酸可以具有15至30個(gè)之間任何數(shù)量的核苷酸。在許多實(shí)施方案中，siRNA可以具有19至27個(gè)之間任何數(shù)量的核苷酸。在許多實(shí)施方案中，siRNA可以具有兩個(gè)平端，或兩個(gè)粘性末端，或一個(gè)平端一個(gè)粘性末端。粘性末端的外突核苷酸可以在一至四個(gè)核普酸或更多的范圍內(nèi)變化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了25個(gè)堿基對(duì)的具有平端的siRNA。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸，，和"寡核苷酸，，在本文中可以同義使用。該組合物可以進(jìn)一步包含聚合載體。該聚合栽體可以包括與RM分子結(jié)合并形成納米顆粒的陽(yáng)離子聚合物。陽(yáng)離子聚合物可以是氨基酸共聚物，含有例如組氨酸和賴(lài)氨酸殘基。聚合物可以包括支化聚合物。組合物可以包含靶向合成載體。該合成載體可以包含陽(yáng)離子聚合物作為核酸栽體，親水聚合物作為立體保護(hù)材料和靶向配體作為靶細(xì)胞選擇劑。該聚合物可以包括聚乙烯亞胺或聚組氨酸-賴(lài)氨酸共聚物或化學(xué)修飾的聚賴(lài)氨酸或可以用作核酸栽體模件的其它有效的聚陽(yáng)離子載體，親水聚合物可以包括聚乙二醇或聚縮醛或聚喁唑啉，而靶向配體可以包括含RGD序列的肽或糖或糖類(lèi)似物或mAb或mAb片段，或任何其它有效的靶向部分。在這些方法的任何一種中，可以與組合物基本同時(shí)或在應(yīng)用組合物之后施加電場(chǎng)。本發(fā)明的組合物和方法包括具有與內(nèi)源VEGF途徑基因或突變內(nèi)源基因匹配的序列的dsRNA寡核苷酸，并且突變基因中至少一個(gè)突變可以在基因編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)中。在這些方法的任何一種中，內(nèi)源基因可以選自VEGF途徑基因，包括生長(zhǎng)因子基因、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶基因、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶基因、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶基因、受體基因和轉(zhuǎn)錄因子基因。所選擇的基因可以包括下組的一種或多種基因VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、RAF-a、RAF-c、AKT、Ras、NF-Kb。所選擇的基因可以包括來(lái)自與NV相關(guān)的其它生化途徑的一種或多種基因，包括HIF、EGF、EGFr、bFGF、bFGFr、PDGF和PDGFr。所選擇的基因可以包括來(lái)自與NV共同起作用的其它生化途徑的一種或多種基因，包括Her-2、c-Met、c-Myc和HGF。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)RNAi以抑制多種基因的核酸試劑，包括siRNA的混合物(siRNA-OC)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法可以基本上同時(shí)抑制多種基因或它們可以順序抑制多種基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，siRNA-OC試劑抑制三種VEGF途徑基因VEGF、VEGF受體1和VEGF受體2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基本上同時(shí)給予siRNA-OC。本發(fā)明提供了從siRNA的序列很大程度上與靶基因mRNA中的序列匹配獲得的具有基因抑制選擇性的試劑。它還提供了具有抑制VEGF途徑中不同基因的基本上相似的生理化學(xué)特性的siRNA試劑。它還提供了多半與siRNA序列無(wú)關(guān)的納米顆粒組合物。它還提供了用于治療人類(lèi)疾病，尤其是NV相關(guān)疾病的方法，所述疾病可以用多種內(nèi)源基因的抑制劑來(lái)治療。它還提供了通過(guò)在一些情況下基本上同時(shí)，而在另一些情況下順序給予的治療劑的組合來(lái)治療人類(lèi)疾病的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了治療癌癥、關(guān)節(jié)炎、失明、傳染病和炎癥性疾病的組合物和方法。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在同一治療方案中誘導(dǎo)RNAi的核酸試劑與其它治療劑，例如但不限于小分子和單克隆抗體(mAb)—起使用。根據(jù)下列詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。然而應(yīng)該理解，詳細(xì)說(shuō)明和具體的實(shí)施例，在表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，僅僅是以舉例方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)本詳細(xì)說(shuō)明，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述圖1.顯示了RGD肽配體靶向的VEGF途徑siRM納米顆粒組合物單獨(dú)或與Avastin治療聯(lián)合引起的DLD-1結(jié)腸異種移植腫瘤生長(zhǎng)的抑制。在同一治療方案中，使用VEGFR2-siRNA抑制劑和Avastin(Bevacizumab)聯(lián)合癌癥療法已經(jīng)在人結(jié)腸癌(DLD-1)異種移植肺瘤模型中觀察到更強(qiáng)的抗腫瘤功效。圖2.通過(guò)全身遞送靼向新血管系統(tǒng)的VEGFR2-siRNA納米顆粒，在每隔兩天四次重復(fù)給藥后，在結(jié)腸癌異種移植小鼠模型(DLD-1腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。RT-PCR結(jié)果說(shuō)明VEGFR2基因表達(dá)在mRNA水平上被敲減。圖3.通過(guò)全身遞送靶向新血管系統(tǒng)的人VEGFR2-siRNA納米顆粒，在每隔兩天四次重復(fù)給藥后，在結(jié)腸癌異種移植小鼠模型(DLD-1腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。免疫組織化學(xué)圖像顯示腫瘤組織中VEGFR2和CD31表達(dá)下調(diào)。圖4.盡管通過(guò)全身遞送靶向新血管系統(tǒng)的人VEGFR2-siRNA納米顆粒在結(jié)腸癌異種移植小鼠模型(DLD-1肺瘤)中證明有強(qiáng)力功效，但是在第二次遞送后24小時(shí)在小鼠血流中未觀察到顯著的IFN-oc誘導(dǎo)。圖5.通過(guò)RT-PCR和ELISA評(píng)估的，人VEGF-siRNA(19個(gè)堿基對(duì)，具有3'突出端)對(duì)于沉默hVEGF體外和體內(nèi)表達(dá)有效，在inRNA水平和蛋白水平上均如此。上面兩個(gè)圖證明在mRNA和蛋白水平都顯著敲減了hVEGF。下圖顯示了siRNA介導(dǎo)的hVEGF敲減在MCF-7/VEGF165細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植模型中的抗腫瘤活性，其中hVEGF表達(dá)在腫瘤組織中顯著下調(diào)。圖6.人VEGF-siRNA(19個(gè)堿基對(duì)，具有3'突出端)對(duì)于引起腫瘤生長(zhǎng)抑制(HNSCC1483細(xì)胞)的沉默hVEGF體內(nèi)表達(dá)有效。用電穿孔五次重復(fù)腫瘤內(nèi)遞送，7天間隔加強(qiáng)。圖7.人VEGF-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)對(duì)于沉默hVEGF體外表達(dá)更有效且比19個(gè)堿基對(duì)的siRNA更強(qiáng)。圖8.人VEGF-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)對(duì)于沉默hVEGF體外表達(dá)有效且持續(xù)時(shí)間比19個(gè)堿基對(duì)的siRNA更長(zhǎng)。圖9.人VEGFRl-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)在48小時(shí)后對(duì)于沉默hVEGFRl體外表達(dá)有效。圖10.人VEGFRl-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)在72小時(shí)后對(duì)于沉默hVEGFRl體外表達(dá)有效。圖11.人VEGFR2-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)于沉默hVEGFR2體外表達(dá)有效。圖12.使用MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系，人VEGF-siRNA(25個(gè)堿基對(duì)，平端)對(duì)于引起腫瘤生長(zhǎng)抑制的沉默hVEGF體內(nèi)表達(dá)有效。圖13.在相同治療中4吏用耙向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物阻斷血管生成途徑的概念基本結(jié)構(gòu)。圖14.在HSK鼠才莫型的眼組織中，VEGFsiRNA介導(dǎo)的VEGF表達(dá)抑制。圖15.在HSK鼠模型的眼組織中，VEGF途徑siRNA介導(dǎo)的VEGF途徑基因單獨(dú)或聯(lián)合抑制。圖16.在HSV誘導(dǎo)的眼血管生成小鼠模型中，以相同劑量測(cè)試，局部(左)或全身(右)遞送，把向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物比耙向單獨(dú)基因的任何單個(gè)siRNA更有效。圖17.通過(guò)局部和全身給予VEGF途徑siRNA混合物實(shí)現(xiàn)的在HSK鼠模型的眼組織中的血管生成抑制的比較。圖18.VEGF途徑siRNA混合物介導(dǎo)的HSK鼠模型眼組織的病理抑制的藥效作用。圖19.誘導(dǎo)疾病后第17天或第14天，給予VEGF途徑siRNA混合物，灌注/平面封固測(cè)定，在視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型的眼組織中引起的血管生成抑制。圖20.乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物證明在缺氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)小鼠模型中非常有效的抗血管生成活性。圖21.乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物證明在缺氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(R0P)小鼠模型中具有非常有效的抗血管生成活性。圖22.用不同載體以不同給藥途徑，乾向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA混合物顯著抑制眼睛血管生成。配體定向納米顆粒介導(dǎo)IP遞送。圖23.用于siRNA遞送的自動(dòng)裝配納米顆粒。當(dāng)預(yù)先制備的RGD-PEG-PEI綴合物水溶液與siRNA水溶液混合時(shí)，納米顆粒會(huì)如前所述自動(dòng)裝配。納米顆粒大小相對(duì)均勻，從50nm至100nm。圖24.使用標(biāo)記的siRNA有效載荷(左)和表達(dá)螢光素酶報(bào)道基因的質(zhì)粒(右)有效載荷證明了靶向新血管系統(tǒng)的siRNA納米顆粒的腫瘤靶向性能。圖25.耙向新血管系統(tǒng)的VEGFR2-siRM納米顆粒，在每隔兩天四次重復(fù)給藥后在神經(jīng)母細(xì)胞瘤同基因小鼠模型(N2A腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。圖26.乾向新血管系統(tǒng)的VEGFR2-siRNA納米顆粒，在每隔兩天五次重復(fù)給藥后在腎癌異種移植小鼠模型(786-0腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。圖27.靶向新血管系統(tǒng)的VEGFR2-siRNA納米顆粒，在每隔兩天四次重復(fù)給藥后，在結(jié)腸癌異種移植小鼠模型(DLD-1腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。該研究中使用三種不同劑量。圖28.耙向新血管系統(tǒng)的VEGFR2-siRNA納米顆粒，在每隔兩天四次重復(fù)給藥后，在結(jié)腸癌異種移植小鼠模型(DLD-1腫瘤)中證明有強(qiáng)力功效。給予每公斤紐gVEGFR2的劑量產(chǎn)生與每公斤5mg相同的抗腫瘤功效。圖29.從同雙功能活化PEG、RGD-2C肽、含多胺的試劑和dsRNA混合物的原料開(kāi)始生產(chǎn)RGD-聚合物綴合物和納米顆粒-siRNA制劑的工藝流程圖。圖30.使用靜態(tài)混合器從兩種溶液-包括聚合物綴合物的聚合物溶液和包括三種dsRNA試劑的siRNA、溶液開(kāi)始制備納米顆粒-siRNA制劑。詳細(xì)i兌明本發(fā)明提供了治療NV疾病的組合物和方法，其典型的特征為多種蛋白和異常超表達(dá)的致病基因和致病蛋白的多種機(jī)能失常的屬性。本發(fā)明提供了核酸試劑，如siRNA寡核苷酸，其激活RNA干擾(RNAi)并且是以序列特異性方式進(jìn)行的基因表達(dá)的高度選擇性抑制劑。本發(fā)明提供了通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白活性，包括降低蛋白表達(dá)水平和蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾來(lái)抑制NV。在癌癥中，腫瘤發(fā)生過(guò)程被認(rèn)為是癌基因、血管生成因子、生長(zhǎng)因子和突變的腫瘤抑制劑異常超表達(dá)的結(jié)果，即使其它蛋白的低表達(dá)也起關(guān)鍵作用。增加的證據(jù)支持siRNA分子能夠在體內(nèi)和體外"敲減"致癌基因，引起顯著的抗腫瘤作用的觀念。利用特異性靶向人VEGF途徑基因序列的siRNA的腫瘤內(nèi)遞送，本發(fā)明的組合物和方法證明在MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-435細(xì)胞和1483細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植腫瘤才莫型中基本上敲減了人VEGF，實(shí)現(xiàn)了40-80%的腫瘤生長(zhǎng)抑制。認(rèn)識(shí)到VEGF途徑基因表達(dá)的抑制誘導(dǎo)改變腫瘤內(nèi)微血管系統(tǒng)和激活腫瘤細(xì)胞凋亡的抗血管生成作用并可以提高細(xì)胞毒性化療藥物的功效。然而，為了實(shí)現(xiàn)抗血管生成劑和化療藥物的顯著提高的抗腫瘤功效，高效遞送方法是必要的，以便局部腫瘤組織中蓄積的藥物濃度升高，且在很多情況下通過(guò)全身給藥。本發(fā)明人描述了一種確認(rèn)藥物靶的方法，其確定哪些耙控制疾病途徑，并因此驗(yàn)證藥物開(kāi)發(fā)成果(參見(jiàn)PCT/US02/31554)。本發(fā)明人還描述了適于將核酸遞送入動(dòng)物組織的技術(shù)。參見(jiàn)WO01/47496,因此其內(nèi)容全部引入作為參考。這些方法能夠給予核酸并達(dá)到與"金標(biāo)準(zhǔn)"核酸遞送試劑相比顯著(例如，七倍)的功效提高。因此，該方法提供了核酸在組織中的強(qiáng)活性，包括候選靶蛋白的活性。這個(gè)平臺(tái)是確認(rèn)組織中候選基因的有效工具。此外，本發(fā)明人使用這些方法實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物組織中的基因沉默，這是確認(rèn)候選耙基因和作為治療方式非常期望的。最近，已證明雙鏈RM通過(guò)被稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)的現(xiàn)象誘導(dǎo)基因特異性沉默。盡管仍未完全了解RNAi的機(jī)制，但是早期結(jié)果提示RNAi作用可以在體外在各種細(xì)胞類(lèi)型，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。以靶mRNA為目標(biāo)的雙鏈RNA引起靼的降解，由此引起相應(yīng)基因的沉默。大的雙鏈RNA被RM酶III樣活性包括酶Dicer切割成21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的較小片段。這些較短的片段稱(chēng)為siRNA(小干擾RNA)，被認(rèn)為介導(dǎo)mRNA的切割。盡管不久之前已在C,e/egs/2s和其它低等生物中研究了RMi機(jī)制引起的基因下調(diào)，但是僅僅最近才證明了它在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的有效性。最近使用螢火蟲(chóng)螢光素酶基因報(bào)道系統(tǒng)在小鼠中證明了RNAi作用。為了開(kāi)發(fā)用于核酸療法治療人類(lèi)疾病的研究和臨床應(yīng)用的體內(nèi)基因抑制的RNAi技術(shù)平臺(tái)，本發(fā)明人在小鼠疾病模型中進(jìn)行了幾項(xiàng)體內(nèi)研究。在那些實(shí)驗(yàn)中，將靶向腫瘤相關(guān)配體(人VEGF)或受體(小鼠VEGFR2)的siRNA或dsRNA遞送至帶有異種移植的人MCF-7衍生腫瘤或人MDA-MB-435肺瘤的棵鼠中。我們首次能夠證明RNAi可以有效地體內(nèi)沉默腫瘤細(xì)胞中的靼基因，以及結(jié)果腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。本發(fā)明人使用抑制VEGF途徑基因的dsRNA寡核苷酸首次獲得了用于治療各種NV疾病的治療組合物和方法。這里詳細(xì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的最大范圍。A.用于VEGF途徑基因抑制的有效siRNA本發(fā)明提供了靶向和抑制VEGF途徑基因序列的具有各種物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的核酸試劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用了被稱(chēng)為siRNA的核酸試劑，包括19個(gè)堿基對(duì)的dsRNA,具有3'突出端以及25個(gè)堿基對(duì)的dsRNA,具有平端。發(fā)現(xiàn)具有25個(gè)堿基對(duì)的dsRNA,平端的本發(fā)明的siRNA是一些最有效的抑制劑且其中的一些抑制持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。另外，非天然存在的化學(xué)類(lèi)似物的摻入在本發(fā)明中有用，包括RNA的2'-0-甲基核糖類(lèi)似物。DNA和RNA嵌合寡核苷酸，及核酸寡核普酸的其它化學(xué)類(lèi)似物。siRNA有義鏈中有和沒(méi)有2'-0-甲基核糖和靶向人VEGF序列的25個(gè)堿基對(duì)的siRNA提供了強(qiáng)烈和持久的抑制作用，在MCF-7/VEGF165細(xì)胞中和在生長(zhǎng)于動(dòng)物中的腫瘤內(nèi)達(dá)到70-80%。MCF-7/VEGF165細(xì)胞培養(yǎng)物中的這種抑制作用持續(xù)了5天。本發(fā)明提供的一個(gè)方面是靶向人基因及其編碼序列的siRNA也靶向其它哺乳動(dòng)物物種，如其它的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、小鼠和大鼠，但是不限于這些物種。siRNA。本發(fā)明提供了許多其它形式的靼向VEGF途徑基因的siRNA,本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解其它的形式。a.人VEGF特異性siRM:25個(gè)堿基對(duì)，平端hVEGF-25-si醒-a:有義鏈5'-r(CCUGAUGAGAUCGAGUACAUCUUCA)-3'反義鏈5'-r(UGAAGAUGUACUCGAUCUCAUCAGG)-3'。hVEGF-25-siRNA-b:有義鏈-r(GAGAGAUGAGCUUCCUACAGCACAA)-3'反義鏈5'-r(UUGUGCUGUAGGAAGCUCAUCUCUC)-3'。固GF-25-siRNA-c.'有義鏈5'-r(CACAACAAAUGUGAAUGCAGACCAA)"^反義鏈5'-r(UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG)-3'19個(gè)堿基對(duì)，在3'具有兩個(gè)核苷酸(TT)突出端hVEGF165-r(UCGAGACCCUGGUGGACAUTT)-3'b.人VEGF受體1特異性siRNA:25個(gè)堿基對(duì)，平端hVEGFRl-25-siRNA-a，有義鏈5'-r(GCCAACAUAUUCUACAGUGUUCUUA)-3'反義鏈-r(UAAGAACACUGUAGAAUAUGUUGGC)-3'hVEGFRl-25-siRNA-b，有義鏈-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3'反義鏈5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)-3'19個(gè)堿基對(duì)，具有兩個(gè)3'(TT)核普酸突出端VEGFRl(FLT)-GGAGAGGACCUGAAACUGUTTc.人VEGF受體2特異性siRNA:25個(gè)堿基對(duì)，平端hVEGFR2-25-siRM-a，有義鏈-r(CCUCUUCUGUAAGACACUCACAAUU)-3'反義鏈5'-r(AAUUGUGAGUGUCUUACAGAAGAGG)-3'固GFR2-25-siRNA-b，有義鏈-r(CCCUUGAGUCCAAUCACACAAUUAA)-3'反義鏈-r(UUAAU腦GUGAUUGGACUCAAGGG)-3'跳GFR2-25-siRNA-c，有義鏈5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'反義鏈5'-r(AAAGGCAUCUGCUUCAAUCACUUGG)-3'19個(gè)堿基對(duì)，具有兩個(gè)3'(TT)核苷酸突出端hVEGFR2(KDR)5'-CAGUAAGCGAAAGAGCCGGTT-3'25個(gè)堿基對(duì)的寡siRNA可以靶向來(lái)自人和小鼠的相應(yīng)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇25個(gè)堿基對(duì)siRNA序列面向相應(yīng)的raRNA序歹ij,包括人VEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGFR-a、PDGFR-J5和EGFR基因。選擇的序列不僅對(duì)人基因是特異性的，而且對(duì)相應(yīng)的小鼠基因也是特異性的，如面向人VEGFmRNA的序列也面向小鼠VEGFmRNA。25個(gè)堿基對(duì)的寡siRNA對(duì)小鼠異種移植腫瘤研究很有用，因?yàn)榭闺狭龉πб蕾?lài)于腫瘤組織中人和小鼠基因的敲減。例如，用靶向人和小鼠VEGFmRNA序列的寡siRNA敲減腫瘤細(xì)胞(人來(lái)源)和內(nèi)皮細(xì)胞(小鼠來(lái)源)的VEGF表達(dá)將提供更好的抗腫瘤功效。同時(shí)，用耙向來(lái)自試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠或猴子)和人基因這兩種基因的寡siRNA的毒性研究將很有用，因?yàn)闇y(cè)試了實(shí)際藥物的藥劑毒理學(xué)和過(guò)大的藥理學(xué)。下列序列是耙向人和小鼠基因的VEGF、VEGFR2、VEGFR1、PDGFR-a、PDGFR-P和EGFRmRNA的25個(gè)堿基對(duì)的寡siRNA序列，它們中的一些還可以耙向它們的猴子和狗對(duì)應(yīng)序列。^/^7乂、V、處、義處、錄凝、游MCiz;A^序/i/W25個(gè)^差考W哪尸"'腿'mhVEGF25-1:有義，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3,;反義，5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGF25-2:有義，5'-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3,;反義，5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGF25-3:有義，5'-CAGCUUGAGUUAAACGAACGUACUU-3,;反義，5'-AAGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUG-3'mhVEGF25-4:有義，5'-CCAUGCCAAGUGGUCCCAGGCUGCA-3';反義，5'-TGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGG-3'mhVEGF25-4:有義，5'-CACAUAGGAGAGAUGAGCUUCCUCA-3,;反義，5'-UGAGGAAGCUCAUCUCUCCUAUGUG-3，乾力人;^V、葳M67^/Z7^^y^/i/種MCWs/^VJm跳GFR225.-l:有義，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3反義-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3m固GFR225'-2:有義，5'-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3反義5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3mh雷FR225.-3:有義，-CUCAUGGUGA腦UGGAAUUCUGCA-3反義-UGCAGAAUUCCACAAUCACCAUGAG-3m跳GFR225.-4:有義，-GAGCAUGGAAGAGGAUUCUGGACUC-.3反義5'-GAGUCCAGAAUCCTC匿CAUGCTC-■3m固GFR225.-5:有義，-CAGAACAGUAAGCGAAAGAGCCGGC-.3反義-GCCGGCUC,CGCUUACUG匿UG-■3mhVEGFR225--6:有義，5'-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA--3反義5'-UGAGAUGCUCCAAGGUCAGGAAGUC--3mhVEGFR225-7:有義，-CCUGACCUUGGAGCAUCUCAUCUGU--3反義-ACAGAUGAGAUGCUCCAAGGUCAGG-■3mhVEGFR225-8:有義，-GCUAAGGGCAUGGAG匿UUGGCAU--3反義5'一AUGCCAAGAACUCCAUGCCCUUAGC--3乾命乂和V、^^W^7zz^^^/y^^5"個(gè)喊JJ^^M6^Ws/AW一緊mhVEGFR125-l:有義，-CACGCUGUUUAUUGAAAGAGUCACA-3';反義5'-UGUGACUC麗CAAUAAACAGCGUG-■3'mhVEGFR125--2:有義，5'-CGCUG腦AUUGAAAGAGUCACAGA-'3';反義-UCUGUGACUC畫(huà)CAAUAAACAGCG-mhVEGFR125--3:有義，-CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU-■3';反義-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCCUUG-■3'mhVEGFR125-■4:有義，-CCAACUACCUCAAGAGCAAACGUGA-3';反義-UCACGUUUGCUCUUGAGGUAGUUGG-.3'mhVEGFR125-■5:有義，-CUACCUCAAGAGCAAACGUGACUUA-■3。反義-UAAGUCACG畫(huà)GCUCUUGAGGUAG-■3'mhVEGFR125-.6:有義，5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-■3。反義5'-AGGUCCCGAUGAAUGCAC麗CUGG-■3'mhVEGFR125-'7:有義，-CAUUCAUCGGGACCUGGCAGCGAGA-■3。反義5'-UCUCGCUGCCAGGUCCCGAUGAAUG-3'mhVEGFR125-■8:有義，5'-CAUCGGGACCUGGCAGCGAGAAACA-■3';反義-UG畫(huà)CUCGCUGCCAGGUCCCGAUG-.3'mhVEGFR125-,9:有義，5'-GAGCCUGGAAAGAAUCAAAACC麗-反義5'-AAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGCUC-■3'mhVEGFR125-■10:有義，-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA-■3。反義-UCAAAGG謂UGA匿UUUCCAGGC-■3'mhVEGFR125-.11:有義，5'-GCCUGGAAAGAAUCAAAACCUUUGA--3。反義5'-UCAAAGGUUUUGAUUCUUUCCAGGC--3'mhVEGFR125--12:有義，5'-CUGAACUGAG國(guó)AAAAGGCACCCA-畫(huà)3。反義5'-UGGGUGCC畫(huà)UAAACUGAG匿AG--3'mhVEGFR125-■13:有義，5'-GAACUGAG畫(huà)AAAAGGCACCCAGC--3';反義5'-GCUGGGUGCC畫(huà)UAAACUCAG畫(huà)--3'乾/^7乂;^V、薦a^個(gè)礎(chǔ)差^f^mhPDGFRa25-1:有義，5'-GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA-3';反義-UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC-3,mhPDGFRa25'-2:有義，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-'3';反義-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-m固GFRa25.-3:有義，-CUCACCUGGGGCCACAUUUGAACAU-3';反義5'-AUG匿AAAUGUGGCCCCAGGUGAG-■3'mhPDGFRa25--4:有義，-CUUGCUGGGAGCCUGCACCAAGUCA-'3';反義5'-UGACUUGGUGCAGGCUCCCAGCAAG-mhPDGFRa25.-5:有義，5'-GA匿UAC畫(huà)CUACAAUAAGAUCA-'3';反義-UGAUCUUAUUGUAGAAAGUAGAAUC-mhPDGFRa25--6:有義，5'-CAGAGACUGAGCGCUGACAGUGGCU-3、反義5'-AGCCACUGUCUGCGCUCAGUCUCUG-mhPDGFRa25--7:有義，-GACCUGGGCAAGAGGAACAGACACA-3';反義5'-UGUGUCUGUUCCUCUUGCCCAGGUC-3'mhPDGFRa25'-8:有義，-CCACCUUCAUCAAGAGAGAGGACGA-3';反義5'-UCGUCCUCUCUCUUGAUGAAGGUGG-3'mhPDGFRa25--9:有義，-UAUGGAUUAAGCCGGUCCCAACCUGU-3。反義5'-ACAGGUUGGGACCGGCUUAAUCCAUA-3'乾/^乂希小篇戶(hù)"6T^-/^"個(gè)虞X^s/iWmhPDGFRB25'-1:有義，-CUGCAGAGACCUCAAAAGGUGUCCA-'3、反義-UGGACACCUUUUGAGGUCUCUGCAG-mhPDGFRB25.-2:有義，5'-CAGAGACCUCAAAAGGUGUCCACGU-3';反義5'-ACGUGGACACC畫(huà)UGAGGUCUCUG國(guó)■3'mhPDGFRB25.-3:有義，-GUGGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGG-■3';反義5'-CCAGGAUGGCUGAGAUCACCACCAC-■3'mhPDGFRB25.-4:有義，5'-GGUGGUGAUCUCAGCCAUCCUGGCC-.3。反義-GGCCAGGAUGGCUGAGAUCACCACC-■3'mhPDGFRB25.-5:有義，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU--3。反義5'-AGUCACAGAUC雨ACCAGCUUGCC--3'mhPDGFRB25--6:有義，-GCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACUU畫(huà).3';<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>mhEGFR-.7:有義，5'--CGAUGUCUACAUGAUCAUGGUCAAGU-3';反義:-ACUUGACCAUGAUCAUGUAGACAUCG-3'mhEGFR--8:有義，5'.-CUACAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGG-3'，反義:-CCAGCACUUGACCAUGAUCAUGUAG-3zmhEGFR畫(huà)■9:有義，5'--CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA);反義:5'-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'mhEGFR畫(huà)-10:有義，5'.-GGAUGAAAGAAUGCAUUUGCCAAGU-3';反義-ACUUGGCAAAUGCA匿麗CAUCC-3,mhEGFR-11:有義，5'--GACAACCCUGACUACCAGCAGGACU-3';反義-AGUCCUGCUGGUAGUCAGGGUUGUdmhEGFR--12:有義，畫(huà)CC匿雨AAGACCAUCCAGGAGGU-3';反義5'-ACCUCCUGGAUGGUC畫(huà)AAGAAGG-3,另一個(gè)實(shí)施方案是以相同藥物有效載荷使用這些寡聚物的組合。當(dāng)靼向疾病過(guò)程中所涉及的三種或更多種基因的三種或更多種那些25個(gè)堿基對(duì)的siRM被包裝在同一納米顆粒中并通過(guò)相同給藥途徑(或不同途徑)遞送時(shí)，治療更有效，因?yàn)槎喾N基因表達(dá)的敲減可以有效阻斷特定的致腫瘤途徑。可以利用這里應(yīng)用的相同總原則進(jìn)一步使用下列組命。25個(gè)堿基對(duì)的寡siRNA的組合可以獲得更有效的治療(多乾向)功效，它們中的每一種都可以靶向人和小鼠的相應(yīng)基因人K^尸途徑VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物A:mhVEGF25-l:有義，-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3。反義-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3,mhVEGFR125-3:有義，-CAAGGAGGGCCUCUGAUGGUGAUGU-3,;反義-ACAUCACCAUCAGAGGCCCUCC麗-3'mhVEGFR225-l:有義，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3,;反義5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物B:mhVEGF25-l:有義，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3';反義5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3'mhVEGFR125-6:有義，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-3,;反義-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3,mhVEGFR225-2:有義，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA"^;反義5'-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3,VEGF-VEGFR1-VEGFR2混合物C:mhVEGF25-2:有義，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACID;反義5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR125-6:有義，5'-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-3/;反義-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-3,mhVEGFR225-2:有義，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3';反義-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3'與分別靼向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的25個(gè)堿基對(duì)的寡siRNA的很多其它組合，每種組分以相同或不同的比例組成可以達(dá)到最好的抗血管生成功效。么和J^尸途徑VEGF-VEGFR2-EGFR混合物A:mhVEGF25-1:有義，5'-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-3,;反義5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-3,mhVEGFR225-1:有義，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3';反義5'-A腦GCCCGC,ACGGUCCGUAGG-3,mhEGFR-l:有義，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3';反義5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGF-VEGFR2-EGFR混合物B:mhVEGF25-l:有義，-CAAGAUCCGCAGACGUGUAAAUGUU-■3'反義5'-AACAUUUACACGUCUGCGGAUCUUG-■3'm固GFR225-2:有義，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA--3'反義-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-.3'mhEGFR-5:有義，-CAAAGUGCCUAUCAAGUGGAUGGCA--3'反義5'一UGCCAUCCACUUGAUAGGCAC醫(yī)G--3'VEGF-VEGFR2-EGFR混合物C:mhVEGF25-2:有義，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU-3,;反義5'-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC-3'mhVEGFR225-2:有義，-CUCAUGUCUGUUCUCAAGAUCCUCA-3';反義-UGAGGAUCUUGAGAACAGACAUGAG-3,mhEGFR-9:有義，-CAUGAUCAUGGUCAAGUGCUGGAUGA-3,;反義-UCAUCCAGCACUUGACCAUGAUCAUG-3'用耙向那三種基因的其它序列以不同組成和相同或不同比例的寡siRM可以產(chǎn)生很多其它組合。義乾々MC尸"C尸和^F途逸；VEGFR2-PDGFRa-EGFR混合物A:mhVEGFR225-l:有義，-CCUACGGACCGUIMAGCGGGCCAAU-S';反義-A腦GCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3,mhPDGFRa25-l:有義，-GAAGAUAAUGACUCACCUGGGGCCA-3,;反義5'-UGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUCUUC-3'mhEGFR-l:有義，5'-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAd;反義5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR1-VEGFR2--PDGFRa--EGFR混合物B:mhVEGFR125-6:有義，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU-反義-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-mhVEGFR225-l:有義，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-反義-AUUGGCCCGC陽(yáng)ACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2:有義，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-反義-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-3'mhEGFR-l:有義，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-反義-CUUUCUCACC匿UGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRa-EGFR混合物C:mhVEGFR225-l:有義，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3/反義5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRa25-2:有義，-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-3,反義-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAU訓(xùn)C-3'mhEGFR-12:有義，-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU-3'反義-ACCUCCUGGAUGGUC麗AAGAAGG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物A:mhVEGFR225-l:有義，-CCUACGGACCG■AGCGGGCCAAU-3,;反義5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'mhPDGFRB25-5:有義，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-3,;反義-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCdmhEGFR-1:有義，V-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3,;反義-CU匿UCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物B:m固GFR225-l:m訓(xùn)GFRB25-10:mhEGFR-l:有義，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3'反義5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3'有義，-CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA-3'反義5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG-3'有義，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-3'反義5'-CUUUCUCACCUUCUGGGAUCCAGAG-3'VEGFR2-PDGFRb-EGFR混合物C:mhVEGFR225-l:有義，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3';反義-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-3,mhPDGFRB25-5:有義，5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-3';反義-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCdmhEGFR-12:有義，5'-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU-3,;反義-ACCUCCUGGAUGGUC畫(huà)AAGAAGG-3'用耙向那三種基因的其它序列以不同組成和相同或不同比例的寡siRNA可以產(chǎn)生4艮多其它組合。還可以用三個(gè)以上序列進(jìn)行組合VEGFR2-PDGFRab-EGFR混合物A:mhVEGFR225.-1:有義，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-3、反義-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG-'3'mhPDGFRa25.-2:有義，5'-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU-■3';反義5'-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAUUAUC-■3'mhPDGFRb25--5:有義，5'-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU-■3。反義-AGUCACAGAUCUUGACCAGCUUGCC-mhEGFR-l:有義，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG-反義5'-C畫(huà)CUCACCUUCUGGGAUCCAGAG--3'VEGFR1-VEGFR2-PDGFRb-EGFR-VEGF混合物A:mhVEGFR125--6:有義，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU--3、反義-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-mhVEGFR225--1:有義，5'-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU-反義5'-AUUGGCCCGCUUAACGGUCCGUAGG--3'mhPDGFRB25-.10:有義，5'--CAUGCCUCCGACGAGAUCUAUGAGA-3';反義5'-UCUCAUAGAUCUCGUCGGAGGCAUG--3'3'mhEGFR-l:有義，-CUCUGGAUCCCAGAAGGUGAGAAAG--3。反義5'-C酬CUCACCUUCUGGGAUCCAGAG--3'mhVEGF25-2:有義，-GCAGCUUGAGUUAAACGAACGUACU--3';反義，-AGUACGUUCGUUUAACUCAAGCUGC--3'VEGFR卜VEGFR2--PDGFRb-EGFR-VEGF混合物C:m跳GFR125-6:有義，-CCAGAAAGUGCAUUCAUCGGGACCU--3';反義-AGGUCCCGAUGAAUGCACUUUCUGG-畫(huà)3'mhVEGFR225-1:有義，-CCUACGGACCGUUAAGCGGGCCAAU--3';反義-AUUGGCCCGCU狙CGGUCCGUAGG--3'mhPDGFRa25-,2:有義，-GAUAAUGACUCACCUGGGGCCACAU--3';反義-AUGUGGCCCCAGGUGAGUCAU訓(xùn)C--3'mhPDGFRB25-.5:有義，-GGCAAGCUGGUCAAGAUCUGUGACU--3';反義-AGUCACAGA歸UGACCAG，GCC--3'mhEGFR-12:有義，-CCUUCUUAAAGACCAUCCAGGAGGU--3';反義-ACCUCCUGGAUGGUC訓(xùn)AAGAAGG.-3'mhVEGF25-2:有義，-GCAGC麗AGUUAAACGAACGUACU--3';反義，-AGUACGUUCG畫(huà)AACUCAAGCUGC.畫(huà)3'B.組合的VEGF途徑基因抑制本發(fā)明的抑制NV的組合物和方法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中考慮了很多因素。首先，NV疾病是復(fù)雜的并且是多種蛋白和異常超表達(dá)的致病基因和致病蛋白的多種機(jī)能失常的結(jié)果。其次，激活RNA干涉(RNAi)的核酸試劑是以序列特異性方式進(jìn)行的基因表達(dá)的高選擇性抑制劑。第三，調(diào)節(jié)蛋白活性對(duì)NV的抑制可以通過(guò)很多方法實(shí)現(xiàn)，包括蛋白功能的抑制(拮抗劑)、蛋白功能的刺激(激動(dòng)劑)、蛋白表達(dá)水平的降低和蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾。NV疾病的治療理想地需要復(fù)雜的治療作用以有效關(guān)閉對(duì)疾病進(jìn)展關(guān)鍵性的特定生物學(xué)途徑，包括同時(shí)阻斷配體及其受體的功能，同時(shí)阻斷受體活性和下游信號(hào)蛋白并且同時(shí)阻斷途徑的冗余元件。這就是NV疾病和和VEGF途徑的情況。然而，對(duì)于兩三種或更多種蛋白具有選擇性的單一試劑的鑒定是困難的并且即使不是不可能，也經(jīng)常不切實(shí)際。為了克服這個(gè)困難，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中使用藥物的組合已經(jīng)多少有點(diǎn)兒趨勢(shì)。在腫瘤學(xué)應(yīng)用中，聯(lián)合化療已經(jīng)獲得了顯著的抗癌功效。一個(gè)實(shí)例是使用多西紫杉醇、異環(huán)磷酰胺和順鈿聯(lián)合療法來(lái)治療伴有從前列腺癌的多發(fā)性骨轉(zhuǎn)移的口咽癌(2)。在其它治療方面，另一個(gè)實(shí)例是使用皮質(zhì)類(lèi)固醇、甲硝唑和萬(wàn)古霉素聯(lián)合治療潰瘍性結(jié)腸炎(3)。對(duì)于控制不完全的2型糖尿病的治療，評(píng)估了向格列美脲和二曱雙胍聯(lián)合治療增加羅格列酮的功效和安全性(4)。盡管那些臨床研究已經(jīng)證明了顯著的治療功效，但是由于它們不同的起始來(lái)源、不同的制造方法和不同的化學(xué)性能，較高劑量的毒性和長(zhǎng)期的安全性始終是主要關(guān)心的問(wèn)題。為了克服這些問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)方面是使用siRNA寡核苷酸基因抑制劑提供獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，用在同一治療中靶向多種致病基因的siRNA的組合而獲得聯(lián)合作用。本發(fā)明提供的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是全部siRNA寡核苷酸在化學(xué)和藥理學(xué)上非常相似并且可以來(lái)自相同的起始來(lái)源和相同的制造方法的結(jié)果。本發(fā)明提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是多種siRNA寡核苷酸可以配制為單個(gè)制劑，如納米顆粒制劑。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是組合siRNA試劑，以便獲得多種VEGF途徑基因的特異性和選擇性抑制并且因此達(dá)到抑制NV疾病和更好的臨床益處。本發(fā)明提供了^f艮多siRNA靶向組合，包括以下組合靶向VEGF本身連同其受體包括VEGFRl(Fltl)和VEGFR2(KDR)、平行生長(zhǎng)因子包括PDGF和EGF及其受體、下游信號(hào)因子包括RAF和AKT、和轉(zhuǎn)錄因子包括NFKB，以及它們的組合。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是抑制VEGF及其兩個(gè)受體VEGFR1(Fltl)和VEGFR2(KDR)的siRNA的組合。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是抑制VEGF及其受體、PDGF及其受體和EGF及其受體的siRNA的組合。再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是抑制VEGF及其受體和下游信號(hào)的siRNA的組合。dsRNA寡核苷酸可以聯(lián)合作為治療NV疾病的治療劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，它們可以混合在一起成為混合物，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們可以通過(guò)相同途徑或通過(guò)不同途徑和制劑順序地給予，和在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一些作為混合物給予，一些順序地給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)獲知實(shí)現(xiàn)治療NV疾病的siRNA的其它組合和它們的組合方法。C.組合的VEGF途徑拮抗劑和基因抑制疾病是復(fù)雜的并且常常涉及多種病理過(guò)程以及疾病癥狀嚴(yán)重程度的不同，且經(jīng)常是一個(gè)患者與另一個(gè)患者之間的不同。很多疾病由致病或疾病控制基因的異常超表達(dá)，或由外來(lái)傳染性生物所引起，或二者皆有。疾病進(jìn)展、隨時(shí)間推移產(chǎn)生對(duì)治療的反應(yīng)降低和耐藥性也限制單一治療或方式的臨床益處?？朔@類(lèi)限制的一種方法是通過(guò)治療和藥物的聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是將siRNA試劑與其它藥劑組合，以便達(dá)到強(qiáng)烈、持久和穩(wěn)固抑制NV疾病和優(yōu)異的臨床益處。本發(fā)明提供了siRNA試劑連同其它藥劑的多種組合，包括VEGF本身及其受體的治療性siRNA與VEGF本身及其受體的拮抗劑(如Avastin)的組合。本發(fā)明還提供了治療性siRNA試劑與口服有效的激酶抑制劑(如SU11248)的組合。本發(fā)明還提供了治療性siRNA試劑與免疫療法的聯(lián)合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是將siRM與抗增殖劑組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)獲知實(shí)現(xiàn)治療NV疾病的siRNA試劑和其它藥劑的其它組合。D.制劑和給藥基于合成試劑開(kāi)發(fā)可靼向組織的核酸遞送系統(tǒng)方面的近來(lái)努力已經(jīng)產(chǎn)生了有前景的結(jié)果。作為穩(wěn)固、有效的遞送系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)具有多層次的選擇性，即選擇性定位于疾病組織和選擇性抑制驅(qū)動(dòng)病理學(xué)的生化途徑。此外，當(dāng)前最有效的療法需要"多靶向"治療劑，即具有多種活性機(jī)制、阻斷多余病理學(xué)途徑的由設(shè)計(jì)者設(shè)計(jì)的"dirty"藥物。一確的亞細(xì)胞區(qū)室的"靈敏的(smart)"納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含可靶向組織的遞送、具有三個(gè)附加性能的siRNAdsRM寡核苷酸的制劑。這些性能是核酸結(jié)合成可將siRM釋放入細(xì)胞質(zhì)的核心、保護(hù)核酸不受非特異性相互作用和提供細(xì)胞攝取的組織靶向。沒(méi)有一種材料在一個(gè)分子中具有所有的這些所需性能。本發(fā)明提供了使用三種材料的模塊式綴合物以組合和集合所需的多種性能的組合物和方法。它們可以被設(shè)計(jì)和合成以合并各種性能，然后與siRNA有效載荷混合形成納米顆粒。根據(jù)這些實(shí)施方案，一種優(yōu)選實(shí)施方案包括靶向新血管系統(tǒng)的模塊式聚合物綴合物，其通過(guò)將對(duì)那些細(xì)胞具有特異性的肽配體與保護(hù)性聚合物的一端偶聯(lián)，在其另一端與核酸的陽(yáng)離子載體偶聯(lián)而形成。這種聚合物綴合物具有三個(gè)功能域，有時(shí)稱(chēng)為三功能聚合物(TFP)。這種綴合物的模塊式設(shè)計(jì)允許每種成分單獨(dú)地替換和優(yōu)化。一種可供選擇的方法是在預(yù)先形成的納米顆粒上附著表面涂層。立體聚合物涂層吸附到聚合物上是自限性的；一旦立體層開(kāi)始形成，它將阻止進(jìn)一步添加聚合物。本發(fā)明的組合物和方法允許優(yōu)化三種功能中的每一種，基本上與另外兩種功能無(wú)關(guān)的有效方法。核酸核心顆凈立的形成揮其生物活性的方式。應(yīng)對(duì)具有合成材料的核酸治療劑的這種挑戰(zhàn)的努力包括使用開(kāi)發(fā)作為體外DNA轉(zhuǎn)染試劑的單純陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚合物復(fù)合物。很快發(fā)現(xiàn)使核酸進(jìn)入細(xì)胞并且獲得生物活性是極其困難的。例如，實(shí)現(xiàn)用于轉(zhuǎn)運(yùn)的穩(wěn)定核酸包裝是可能的，但并非總是容易與將核酸釋放入細(xì)胞核，或在siRNA的情況下將其釋放入細(xì)胞質(zhì)的需要達(dá)成一致。而且，很多體外有效的陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚合物當(dāng)給予體內(nèi)時(shí)不保持活性，不幸的是其原因大部分仍然未知，為開(kāi)發(fā)在體內(nèi)有活性的復(fù)合物提供的預(yù)測(cè)價(jià)值很少。對(duì)研究RNA的興趣已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落在后頭，直到現(xiàn)在對(duì)siRNA的興趣才剛剛迸發(fā)。盡管如此，肺組織常?？梢杂捎贒NA復(fù)合物的靜脈內(nèi)給藥而被轉(zhuǎn)染。當(dāng)將siRNA用作有效栽荷時(shí)，已觀察到相似的生物活性。最近的研究已鑒定到一類(lèi)陽(yáng)離子聚合物，其由看來(lái)具有寬泛能力的確定多肽結(jié)構(gòu)組成?？梢院铣删哂邪€性和支化型的確定結(jié)構(gòu)的表明它們具有與幾種類(lèi)型核酸，包括質(zhì)粒和DNA或RNA寡核苷酸一致的活性。此類(lèi)陽(yáng)離子聚合物的成功看來(lái)起因于合并特異性結(jié)構(gòu)包括分支，和使用強(qiáng)和弱堿的混合物以形成具有混合陽(yáng)離子性能的聚合物的設(shè)計(jì)。這個(gè)特殊類(lèi)別的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的可生物降解性質(zhì)，其完全由天然氨基酸構(gòu)建而成，即使是非天然分支。由于具有至少兩種性能的聚合物可用于優(yōu)化，因此用于與siRNA形成有效的核心復(fù)合物的材料的繼續(xù)開(kāi)發(fā)可以精化并集中于進(jìn)一步改善平衡穩(wěn)定性和胞質(zhì)釋放。優(yōu)化的形成核心的聚合物可以用作其余功能的基礎(chǔ)。保護(hù)性立體涂層具有類(lèi)似細(xì)胞外膜的外脂雙層的均勻脂質(zhì)體可以被迅速識(shí)別并從血液中清除。然而，與病毒顆粒不同，納米技術(shù)可以使用寬范圍的合成聚合物化學(xué)。已證明親水聚合物，如PEG和聚縮醛和聚噁唑啉可在膠體藥物遞送系統(tǒng)表面上有效形成"立體"保護(hù)層，無(wú)論是脂質(zhì)體、聚合物還是靜電納米顆粒，從而減少?gòu)难褐械拿庖咔宄Ｊ紫乳_(kāi)發(fā)了使用該立體PEG層并最廣泛地研究了立體穩(wěn)定脂質(zhì)體。除了立體聚合物涂層外，本發(fā)明還提供了可供選擇的方法，如表面電荷的化學(xué)還原?？臻g障礙和生物學(xué)結(jié)果源自物理性能，而非化學(xué)性能的證據(jù)是強(qiáng)有力的。已經(jīng)報(bào)道了幾種其它的親水聚合物作為PEG的替換物。對(duì)空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的物理研究為聚合物層的物理性能提供了強(qiáng)大的機(jī)械論基礎(chǔ)并可以用于在其它類(lèi)型顆粒上完成相似涂層。然而，盡管物理研究已經(jīng)顯示在具有核酸的聚合物復(fù)合物表面上形成了相似聚合物層，并荻得了相似的生物學(xué)特性，但是現(xiàn)在我們?nèi)匀狈ψ銐虻男畔⑦@種物理性能用于精確預(yù)測(cè)期望的生物學(xué)特性，防止從血液中免疫清除。高深的研究是構(gòu)建納米顆粒復(fù)合物，它們的物理性能變化是可控的，隨后確定它們的生物學(xué)特性。根據(jù)這許多的脂質(zhì)體研究，很清楚對(duì)生物活性具有最大影響的物理性能可以通過(guò)合成兩種聚合物和接枝密度規(guī)格不一的綴合物基質(zhì)而獲得。注意盡管表面立體層作用歸因于物理性能，但是最佳的綴合化學(xué)仍然取決于立體聚合物和與其偶聯(lián)的栽體的特異性化學(xué)性質(zhì)。形成具有表面立體聚合物層的納米顆粒的方法也是關(guān)聯(lián)參數(shù)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了使立體聚合物與栽體聚合物偶聯(lián)以得到綴合物的方法，該綴合物與核酸自動(dòng)裝配形成具有立體聚合物表面層的納米顆粒。另一個(gè)實(shí)施方案是在預(yù)先形成的納米顆粒上附著表面涂層。表面立體層的自動(dòng)裝配形成依賴(lài)于所述栽體聚合物與有效載荷的相互作用，而不是依賴(lài)于穿透形成的立體層與顆粒表面反應(yīng)。在這種情況下，立體聚合物對(duì)栽體聚合物結(jié)合核酸有效載荷的能力的作用可能對(duì)顆粒形成具有不良影響，并因此對(duì)表面立體層具有不良影響。如果這種情況發(fā)生的話，載體上的立體聚合物的接枝密度將會(huì)已超過(guò)它的最大限度，或接枝的結(jié)構(gòu)性質(zhì)還不夠。靶向特定組織的表面暴露的配體納米顆粒選擇性到達(dá)乾細(xì)胞內(nèi)部的能力在于它誘導(dǎo)特異性受體介導(dǎo)的攝取的能力。本發(fā)明通過(guò)具有結(jié)合特異性的暴露配體而提供。盡管已經(jīng)廣泛研究了靶向膠體遞送系統(tǒng)的很多類(lèi)型的配體，但是很多依賴(lài)于抗體。二十多年前，這種想法被擴(kuò)展將抗體與脂質(zhì)體，通常稱(chēng)為免疫脂質(zhì)體的表面偶聯(lián)。在配體密度的影響中出現(xiàn)了一個(gè)重要的參數(shù)。廣泛的研究在體外獲得了良好的成功，但是僅僅最近才開(kāi)始在體內(nèi)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，現(xiàn)在到達(dá)了遞送小分子藥物的臨床開(kāi)發(fā)階段?？贵w傾向于滿足用作配體的很多要求，包括良好的結(jié)合選擇性和用于幾乎任何受體的近乎常規(guī)的制備方法和蛋白偶聯(lián)方法的寬泛適用性，而不考慮納米顆粒的類(lèi)型。單克隆抗體甚至顯示出穿過(guò)血腦屏障的效用跡象。另一方面，它們不理想。作為靶向配體，抗體是很大的蛋白，約150Kd。這使得綴合難以產(chǎn)生特定的取向，除非可以引入額外的Cys氨基酸殘基，或可以鑒定用于化學(xué)偶聯(lián)的其它獨(dú)特位點(diǎn)。截短的形成可用于減小尺寸，但是可以發(fā)生親和力喪失，如對(duì)于"scFV"構(gòu)建而言?？贵w的另一個(gè)麻煩的特性是它們的生物活性眾多，很多在與抗原結(jié)合無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)域中傳達(dá)，其是它們?cè)诓溉閯?dòng)物免疫系統(tǒng)中作用的一部分。可以充分發(fā)揮這些免疫活性，而且它們還可以干擾納米顆粒立體層避免免疫清除的作用。也已考慮是天然配體的其它蛋白靶向納米顆粒，如針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的轉(zhuǎn)鐵蛋白和因子VII以及因子VIIa蛋白以及它們的片段。這些活性劑可以是良好的候選者，但是它們的成功使用需要相當(dāng)大的努力以鑒定特異性偶聯(lián)化學(xué)，不喪失結(jié)合活性的偶聯(lián)，和暴露于顆粒上，而不再引入免疫清除。一類(lèi)優(yōu)選的配體是對(duì)內(nèi)在化受體具有強(qiáng)選擇性結(jié)合親和力的小分子量化合物。研究已經(jīng)評(píng)估了天然代謝產(chǎn)物如維生素像葉酸和維生素Bl，多糖像小麥胚芽凝集素或e-選擇蛋白的唾液酸Lewis51,和肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域像整聯(lián)蛋白的RGD。肽提供了一類(lèi)多用途的配體，因?yàn)槭删w展示文庫(kù)可用于篩選天然或非天然序列，甚至用體內(nèi)淘選方法。這種噬菌體展示方法可以允許保留在一端未配對(duì)的Cys殘基，以便于偶聯(lián)而無(wú)論什么序列。最近使用RGD肽將納米顆粒靶向遞送至新血管系統(tǒng)的體內(nèi)成功表明這種方法可以非常有效滿足有效配體的主要要求不干擾配體結(jié)合或誘導(dǎo)免疫清除，而卻使選擇性受體介導(dǎo)的乾細(xì)胞的攝取成為可能的特異性化學(xué)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD-2C肽配體綴合物。RGD-2C配體提供了定位于新血管系統(tǒng)以及腫瘤新血管系統(tǒng)附近的肺瘤細(xì)胞，含有核酸的納米顆粒的胞內(nèi)內(nèi)在化和給出核酸的有效生物活性的核酸的釋放。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括兩種或多種配體的配體綴合物的混合物，或兩種或多種配體的綴合物。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD肽配體與因子VII蛋白或它們的肽片段或化學(xué)類(lèi)似物的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD肽配體與配體結(jié)合e-選擇蛋白的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD肽配體與apoE蛋白或它們的肽片段或化學(xué)類(lèi)似物的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD肽配體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合配體如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、卟啉、bFGF和EGF的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括三種或多種這些配體的混合物。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括載體的一個(gè)結(jié)構(gòu)域中兩種或多種配體和所述載體的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域中多胺試劑的綴合物。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括配體綴合物的混合物。該配體綴合物的混合物可以包含與同一載體試劑，和任選與該載體的同一結(jié)構(gòu)域綴合的配體，或配體綴合物的混合物可以包含與不同載體試劑，或任選與載體試劑的不同結(jié)構(gòu)域綴合的配體。配體綴合物的混合物可以進(jìn)一步包含保護(hù)劑、融合劑或栽體試劑，如PEG或聚縮醛或pH敏感性聚合物或多胺或組氨酸-賴(lài)氨酸共聚物。本發(fā)明的組合物和方法提供了RNAi的給藥，包括聚合物、聚合物綴合物、脂質(zhì)、膠束、自動(dòng)裝配膠體、納米顆粒、空間穩(wěn)定的納米顆?；蚺潴w定向的納米顆粒。W001/49324中所述類(lèi)型的靶向合成載體可以用于誘導(dǎo)RNAi的本發(fā)明核酸的全身遞送，其特此全部引入作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備和使用PEI-PEG-RGD(聚乙烯亞胺-聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)合成栽體，例如在W001/49324的實(shí)施例53和56中的。該載體通過(guò)靜脈注射用來(lái)全身遞送RNAi,體分子。例如，該載體可能具有由核心復(fù)合物組成的內(nèi)殼層，該復(fù)合物包含RNAi和至少一種形成復(fù)合物的試劑。該栽體還可能含有融合部分，其可以包含固定于核心復(fù)合物的殼層，或可以直接摻入核心復(fù)合物。該載體可以進(jìn)一步具有穩(wěn)定載體和降低與蛋白和細(xì)胞的非特異性結(jié)合的外殼部分。外殼部分可以包含親水聚合物，和/或可以固定于融合部分。外殼部分可以固定于核心復(fù)合物。該栽體可以含有增強(qiáng)載體與耙組織和細(xì)胞群結(jié)合的靶向部分。合適的靶向部分是本領(lǐng)域已知的并且在W001/49324中有詳細(xì)描迷。a,含有^Y7尸途逸"^VJ^i^/Hfe/^韻^^"在^刺備本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了抗VEGF途徑siRNA短dsRNA分子的RGD介導(dǎo)的配體定向的納米顆粒制劑的組合物和方法。圖29和30顯示了制備含有siRNA的RGD-2C介導(dǎo)的組織靼向納米顆粒的方法。該靶向配體，含有肽(ACRGDMFGCA)的RGD與立體聚合物如聚乙二醇或具有相似特性的其它聚合物綴合。這種配體-立體聚合物綴合物進(jìn)一步與聚陽(yáng)離子如聚乙烯亞胺或其它有效材料如組氨酸-賴(lài)氨酸共聚物綴合。該綴合物可以是共價(jià)或非共價(jià)鍵，且共價(jià)鍵可以是不可切割的或它們可以是可切割的，如通過(guò)水解或通過(guò)還原劑。該綴合物可以用異雙功能聚合物來(lái)制備，如市場(chǎng)上可買(mǎi)到的NHS-PEG-VS試劑(Nektar)或?yàn)橹圃於鴾?zhǔn)備的異雙功能試劑，或用同雙功能聚合物，如市場(chǎng)上可買(mǎi)到的NHS-PEG-NHS試劑(RappPolymere)或?yàn)橹圃於鴾?zhǔn)備的同雙功能試劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括使用同雙功能NHS-PEG-NHS試劑，如可從RAPPPolymere購(gòu)得的試劑，首先與通過(guò)固相合成制備的RGD-2C肽偶聯(lián)，和隨后與含有多胺的聚合物，如市場(chǎng)上可買(mǎi)到的PEI或通過(guò)固相合成制備的組氨酸-賴(lài)氨酸共聚物偶聯(lián)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括RGD-PEG-多胺綴合物與多胺聚合物，如PEI或組氨酸-賴(lài)氨酸共聚物的第一組合，和所述聚合物混合物與dsRNA寡核苷酸的第二混合物的第二組合。一種包含下列物質(zhì)的溶液與一種包含核酸的溶液以期望比例混合以獲得含有siRNA的納米顆粒所述物質(zhì)是聚合物綴合物，或聚合物綴合物與其它聚合物、脂質(zhì)或膠束的聚合物，如包含配體或立體聚合物或融合劑的材料，和在一個(gè)實(shí)施方案中所述核酸是靶向感興趣的特異性基因的siRNA。在這個(gè)實(shí)施方案中，納米顆粒由分層的納米顆粒自動(dòng)裝配形成，包括聚合物綴合物和核酸混合。帶負(fù)電荷的核酸和聚合物綴合物的帶正電荷區(qū)段之間的非共價(jià)靜電相互作用驅(qū)動(dòng)導(dǎo)致納米顆粒形成的自動(dòng)裝配過(guò)程。這個(gè)過(guò)程包括兩種溶液的簡(jiǎn)單混合，其中含有核酸的一種溶液被添加至含有聚合物綴合物的另一種溶液中，隨后或同時(shí)進(jìn)行攪拌。在一個(gè)實(shí)施方案中，混合物中帶正電荷的組分和帶負(fù)電荷的組分積來(lái)確定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這兩種溶液在使用混合器具如靜態(tài)混合器(圖30)的連續(xù)流動(dòng)條件下混合。在這個(gè)實(shí)施方案中，兩種或多種溶液以產(chǎn)生一定比例的溶液的速率和壓力引入靜態(tài)混合器，其中溶液流在靜態(tài)混合器內(nèi)部得到混合?；旌掀骺赡芤云叫谢蜻B續(xù)的方式排列布置。E.組合制劑和電場(chǎng)對(duì)于某些應(yīng)用，可以在施加或者不施加電場(chǎng)的情況下給予RNAi。這可以用于例如，通過(guò)直接注射入例如腫瘤組織和直接注射進(jìn)入血管生成組織或具有新血管系統(tǒng)的組織或其附近來(lái)遞送本發(fā)明的RNAi分子。siMA可以存在于合適的藥物載體，例如鹽水溶液或緩沖鹽水溶液中。通過(guò)參考下列實(shí)施例，由此一般描述的本發(fā)明將更容易被理解，這些實(shí)施例作為例證提供并且不意欲限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:聯(lián)合使用靼向VEGFR2的siRNA雙鏈和抗VEGF的Bevacizumab(Avastin)抑制腫瘤生長(zhǎng)。材料和方法試劑Avastin、抗VEGF的單克隆抗體(25mg/ml，Genetech);針對(duì)小鼠VEGFR2的siRNA，序列[(a)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC;(b)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA);針對(duì)螢光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5克2，2，2，三溴乙醇和1.5ml叔戊醇(Cat#T4840-2，Cat#24048-6，Aldrich)于100ml蒸館水，St.Louis,MO]中制成的Avertin。小鼠無(wú)胸腺雌性棵鼠，5至6周齡，購(gòu)自TAC0NIC并常規(guī)籠養(yǎng)。所有研究均遵循國(guó)家研究委員會(huì)生命科學(xué)委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源管理委員會(huì)的方針。馬里蘭Rockville的生物醫(yī)學(xué)研究所的動(dòng)物設(shè)備由美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理協(xié)會(huì)完全認(rèn)可。細(xì)胞結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1(CCL-221，ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、lOmMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉、10。/。胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。步驟1)收荻接近融合的DLD-1細(xì)胞并重懸于無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基中。2)用Avertin0.4ml/小鼠腹膜內(nèi)注射麻醉小鼠。3)0.lml無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基中的1億個(gè)細(xì)胞左側(cè)皮下注射到小鼠背部，建立異種移植腫瘤模型。4)接種腫瘤細(xì)胞后五天，用測(cè)徑器測(cè)量生長(zhǎng)腫瘤的大小。然后將小鼠隨機(jī)分成6組，每組8只。5)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和劑量方案如下。6)與RPP形成復(fù)合物后，通過(guò)尾靜脈注射遞送siRNA。表I.抗血管生成siRNA/mAb治療DLD-1腫瘤模型的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>結(jié)果與討論1.攜帶VEGFR2特異性siRNAdsRNA的RGD配體定向的納米顆粒本身在以?xún)H僅2mg/kgsiRNA的量重復(fù)全身靜脈內(nèi)給藥(圖l)后能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制。2.這種基于siRNA的抗血管生成活性(靶向VEGFR2)能夠增強(qiáng)VEGF單克隆抗體(mAb)介導(dǎo)的抗血管生成，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖1)。3.盡管許多生化途徑對(duì)于惡性腫瘤形成可能獨(dú)立或共同起決定性作用，但是大家公認(rèn)，新血管生成是很多類(lèi)型癌癥生長(zhǎng)的關(guān)鍵。因此新血管生成過(guò)程自然已經(jīng)成為對(duì)于腫瘤藥物開(kāi)發(fā)最多的靶向范圍之一。在參與新血管生成的許多因子當(dāng)中，據(jù)信VEGF是重要的控制因子并且是能夠獲得如同Avastin所達(dá)到的臨床益處的治療效果的因子，Avastin是抗VEGF的單克隆抗體和被證明抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)。NV靶向VEGFsiRM基因抑制的組合當(dāng)以組合方案給予時(shí)，顯示出對(duì)拮抗劑治療是輔助性的跡象。4.該實(shí)施例顯示了使用基因抑制劑和用拮抗劑如mAb抑制劑在同一治療方案中改善治療結(jié)果的巨大益處。5.RT-PCR結(jié)果直接證明用納米顆粒遞送的VEGFR2特異性siRNA治療的腫瘤樣品中的VEGFR2mRNA水平與未經(jīng)治療的腫瘤中的表達(dá)水平相比被顯著下調(diào)(圖2)。6.免疫組織化學(xué)(IHC分析)表明已經(jīng)發(fā)生了是新血管系統(tǒng)標(biāo)記的VEGFR2和CD31的蛋白水平敲減(圖3)。7.對(duì)來(lái)自納米顆粒/VEGFR2siRM單獨(dú)治療，和與Avastin組合治療的血液樣品中IFN-a活性的ELISA測(cè)定沒(méi)有顯示任何顯著(可檢測(cè))的IFN活性上調(diào)或誘導(dǎo)(圖4)，表明NV的抑制和腫瘤生長(zhǎng)的抑制不是由于非特異性干擾素介導(dǎo)的作用?？偨Y(jié)這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明，因?yàn)樗峁┝擞眯「蓴_dsRNA寡核苷酸基因抑制劑與單克隆抗體(mAb)組合在同一治療方案中治療癌癥的組合物和方法，其中該抑制劑抑制致病基因的表達(dá)和致病蛋白的生物學(xué)功能，導(dǎo)致治療功效增強(qiáng)。此外，該實(shí)施例提供了同時(shí)阻斷配體(例如VEGF)及其受體(例如VEGFR2)以提供有效抑制特定生物學(xué)途徑(例如血管生成途徑)，由此提供抑制疾病進(jìn)展的治療的例證。因此，由兩種有效的靼向生物抑制劑RNAi和mAb提供的抑制活性的聯(lián)合應(yīng)用是有效治療NV疾病包括癌癥的方法。實(shí)施例2:siRNA介導(dǎo)的體外和體內(nèi)VEGF沉默人VEGF165特異性siRNA通過(guò)Lipofectamine轉(zhuǎn)染進(jìn)入MCF-7/VEGF165細(xì)胞(hVEGF超表達(dá))，導(dǎo)致細(xì)胞中hVEGFmRNA的敲減(圖2上圖)。使用電穿孔法，hVEGF165特異性siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7/VEGF165細(xì)胞，導(dǎo)致如ELISA分析確定的hVEGF表達(dá)的下調(diào)。當(dāng)hVEGF165特異性siRNA通過(guò)腫瘤內(nèi)給藥重復(fù)遞送時(shí)，MCF-7/VEGF165細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。當(dāng)收集腫瘤組織用于測(cè)試hVEGFmRNA表達(dá)時(shí)，進(jìn)一步確*〖人了這種抑制，其導(dǎo)致基于RT-PCR分析的顯著下調(diào)。使用相同的hVEGF165特異性siRNA，我們用頭和頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC，1483細(xì)胞)異種移植模型也能證明腫瘤生長(zhǎng)抑制，通過(guò)以七天間隔腫瘤內(nèi)5次重復(fù)給藥。每次注射需要含10Pg特異性siRNA的15至30W無(wú)RNA酶的水溶液。實(shí)施例3:25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA比常規(guī)具有3'突出端的19個(gè)堿基對(duì)的siRNA在沉默靶基因表達(dá)方面更有效在一項(xiàng)體外siRM轉(zhuǎn)染研究中，使用電穿孔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，用25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA(hVEGF-25-siRNA-a、hVEGF-25-siRNA-b、hVEGF-25-siRNA-c、Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的19個(gè)堿基對(duì)的siRNA(hVEGF-siRNA-a、GFP-siRNA-a)轉(zhuǎn)染超表達(dá)人VEGF(hVEGF)的MCF/165乳腺癌細(xì)胞。將4xl(T個(gè)MCF7/165細(xì)胞重懸于與5PgsiRNA混合的200WsiP0RTsiRNA電穿孔緩沖液(Ambion)中，然后4吏用ElectroSquarePoratorECM830(BTX，F(xiàn)isherScientific)進(jìn)行電穿孔處理。電穿孔參數(shù)是電壓500v;脈沖持續(xù)時(shí)間60脈沖數(shù)2;脈沖間隔1秒。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以5xl04個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至24孔板中，并在含5%0)2的37X:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后"小時(shí)，從每個(gè)孔收獲培養(yǎng)基并使用商業(yè)hVEGFELISA試劑盒(R&DSystems)測(cè)定培養(yǎng)基中人VEGF蛋白的濃度。我們觀察到在25個(gè)堿基對(duì)的hVEGF-siRNA處理的細(xì)胞中比在常規(guī)19個(gè)堿基對(duì)的hVEGFsiRM處理的細(xì)胞中顯著更強(qiáng)的hVEGF靼基因抑制。在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，與用常規(guī)19個(gè)堿基對(duì)的hVEGF-siRNA-a轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的大約60。/。hVEGF蛋白減少相比，用25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈hVEGF-25-siRNA分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的hVEGF蛋白減少75%以上。在相同的siRNA轉(zhuǎn)染條件下，非特異性序列對(duì)照25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA(Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的常規(guī)GFP-siRNA都不影響VEGF表達(dá)(圖7)。實(shí)施例4:25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA介導(dǎo)延長(zhǎng)的靶基因沉默在另一項(xiàng)體外siRNA轉(zhuǎn)染研究中，使用電穿孔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，用25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA(hVEGF-25-siRNA-a、hVEGF-25-siRNA-b、hVEGF-25-siRM-c、Luc-25-siRNA)或具有3'突出端的19個(gè)堿基對(duì)的siRNA(hVEGF-siRNA-a、GFP-siRNA-a)轉(zhuǎn)染超表達(dá)人VEGF(hVEGF)的MCF/165乳腺癌細(xì)胞。將4xl(T個(gè)MCF7/165細(xì)胞重懸于與2Pg或5jugsiRNA混合的200WsiPORTsiRNA電穿孔緩沖液(Ambion)中，然后使用ElectroSquarePoratorECM830(BTX，F(xiàn)isherScientific)進(jìn)行電穿孔處理。電穿孔參數(shù)是電壓500v;脈沖持續(xù)時(shí)間60脈沖數(shù)2;脈沖間隔1秒。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以5xl04個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至24孔板中，并在含5%0)2的37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120小時(shí)，從每孔收獲培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。使用商業(yè)hVEGFELISA試劑盒(R&D)測(cè)定在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲的培養(yǎng)基中人VEGF蛋白的濃度。用在各個(gè)非特異性對(duì)照siRM處理的細(xì)胞中測(cè)定的hVEGF蛋白水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化siRNA介導(dǎo)的hVEGF敲減。我們觀察到在測(cè)試的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在25個(gè)堿基對(duì)的hVEGF-siRM處理的細(xì)胞中比在常規(guī)19個(gè)堿基對(duì)的hVEGFsiRNA處理的細(xì)胞中顯著更強(qiáng)和延長(zhǎng)的hVEGF靶基因抑制。在siRNA處理后120小時(shí)，與用5Pg常規(guī)19個(gè)堿基對(duì)的hVEGF-siRM-a轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到的低于20%hVEGF蛋白減少相比，用5的25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈hVEGF-25-siRNA分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的hVEGF蛋白仍減少60%以上。我們還觀察到25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈hVEGF-25-siRNA分子產(chǎn)生的劑量依賴(lài)性siRNA介導(dǎo)的hVEGF基因抑制。基于我們的觀察，25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈hVEGF-25-siRNA分子不僅給出更強(qiáng)的靶VEGF基因抑制，而且還引起顯著更長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的有效靶VEGF基因抑制。例如，與使用5Pg常規(guī)19個(gè)堿基對(duì)的hVEGFsiRNA實(shí)現(xiàn)的僅48小時(shí)的60%以上hVEGF蛋白減少相比，使用25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈hVEGFsiRNA實(shí)現(xiàn)了至少120小時(shí)的60%以上蛋白減少。因此，25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA是可以導(dǎo)致更顯著治療功效的更有效的乾基因抑制劑。附加信息包括(1)Luc-25-siRNA具有(有義鏈5'-rGGAACCGCUGGAGAGCAACUGCAUA-3'和反義鏈5'-rCCUUGGCGACCUCUCGUUGACGUAU-3，)的序列；(2)hVEGF-siRNA-a具有(有義鏈5'_rUCGAGACCCUGGUGGACAUdTT-3'和反義鏈5'-rAUGUCCACCAGGGUCUCGAdTT-30的序列；(3)GFP-siRNA具有(有義鏈5,-^GCUGACCCUGAAGUUCAUCdTT-3,和反義鏈5'-rGAUGAACUUCAGGGUCAGCdTT-30的序列；(4)hVEGFR2-25-siRNA-c:5'-r(CCAAGUGAUUGAAGCAGAUGCCUUU)-3'。實(shí)施例5:25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA有效敲減人VEGFRl和VEGFR2體外表達(dá)三種特異性靶向人VEGFR1的25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siMA通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后96小時(shí)通過(guò)ELISA試驗(yàn)測(cè)定膜結(jié)合VEGFR1和VEGFR1的游離胞外片段。與兩種其它siRNA相比，VEGFRl-siRNA雙螺旋a表現(xiàn)最強(qiáng)的VEGFR1沉默活性，這是對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞裂解物蛋白和游離片段二者而言(圖9和10)。當(dāng)使用相同方法評(píng)估三種靶向人VEGFR2基因的25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)全部三個(gè)雙螺旋在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和72小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示有效的沉默活性(圖11)。實(shí)施例6:25個(gè)堿基對(duì)的平端雙鏈siRNA在MDA-MB-435異種移植腫瘤中介導(dǎo)強(qiáng)的抗胂瘤功效使用已知具有VEGF和bFGF蛋白高表達(dá)的MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系，耙向人VEGF165基因序列的25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的siRNA雙螺旋在每5天三次重復(fù)腫瘤內(nèi)給予lOpg(圖12)后，顯示強(qiáng)烈的腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。實(shí)施例7:靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR1基因的siRM混合物比僅僅靶向那些基因之一的siRNA單獨(dú)任何一個(gè)在HSV誘導(dǎo)的眼新血管生成模型中更有效最近，我們證明了在動(dòng)物疾病模型中以相同劑量，含有靶向VEGF、VEGFR1和VEGFR2的siRNA的siRNA混合物可以達(dá)到比僅僅靼向那些基因之一的siRNA更有效的抗血管生成功效。4吏用這種方法，我們能夠有效阻斷對(duì)病理性血管生成起關(guān)鍵作用的VEGF途徑(圖13)。含有大量具潛在生物活性的含CpG基序的HSVDNA可以誘導(dǎo)有效的血管生成因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)并且用抗體中和VEGF使HSV誘導(dǎo)的血管生成減到最少。也建立了便利的模型，其中具生物活性的含CpG寡核苷酸(ODN)也顯示通過(guò)誘導(dǎo)VEGF來(lái)誘導(dǎo)新血管生成。在本研究中使用這個(gè)模型以評(píng)估RNA干擾(RNAi)抑制VEGF表達(dá)和應(yīng)答性的治療潛力。試浙硫代磷酸0DN由DennisM.Klinman(生物制劑的評(píng)估和研究(BiologiesEvaluationandResearch)，食品與藥品管理局，Washington,DC)友情提供。此研究中使用的刺激性O(shè)DN的序列是1466TCAACGTTGA和1555，GCTAGACGTTAGCGT。使用ODN1466和1555的等摩爾混合物進(jìn)行了隨后的研究。^為、f設(shè)#RNAi耙向三種mVEGF途徑因子-mVEGFA和兩種mVEGF受體(mVEGFRl和mVEGFR2)。對(duì)于每個(gè)基因靼，兩個(gè)耙序列分配于相同mRNA上的不同位置。設(shè)計(jì)與上述乾序列對(duì)應(yīng)的siRNA。根據(jù)Tuschl提出的指導(dǎo)方針設(shè)計(jì)這些siRNA14，15。由Qiagen(巴倫西亞，CA)合成設(shè)計(jì)的siRM(有義鏈和反義鏈的雙螺旋)。所有的siRM是3'端具有兩個(gè)核苷酸(TT)突出端的21個(gè)核苷酸長(zhǎng)的雙鏈寡RNA。mVEGFA的靶序列是(a)AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG和(b)AACGATGAAGCCCTGGAGTGC。mVEGFRl的耙序列是(a)AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG和(b)AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC。mVEGFR2的靭^序列是(a)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC和(b)ATGCGGCGGTGGTGACAGTA。無(wú)關(guān)siRM對(duì)照的合成，^使用各自針對(duì)LacZ和螢火蟲(chóng)螢光素酶的兩個(gè)靶序列。它們是LacZ(a)AACAGTTGCGCAGCCTGAATG和(b)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC，LUC(a)AAGCTATGAAACGATATGGGC和(b)AACCGCTGGAGAGCAACTGCA.4吏用針對(duì)各個(gè)siRNA的a和b的等摩爾混合物進(jìn)行了隨后的研究。V、處5至6周齡雌性BALB/c小鼠(H-2d)購(gòu)自HarlanSprague-Dawley(Indianapolis,IN)并常規(guī)籠養(yǎng)。所有研究均遵循國(guó)家研究委員會(huì)生命科學(xué)委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源管理委員會(huì)的方針。田納西州大學(xué)(Knoxville，TN)的動(dòng)物設(shè)備被美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理協(xié)會(huì)完全認(rèn)可。病善所有步驟中均使用HSV-1毒林RE(由亞拉巴馬大學(xué)(Mobile,AL)的RobertLausch博士友情提供)。病毒生長(zhǎng)在Vero細(xì)胞單層(目錄號(hào)CCL81;美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA)中，滴定并以等份保存在-80X:直至使用。為了測(cè)試RNAi的體外功效，使用下列細(xì)胞系。使用RAW264.7yNO細(xì)胞(CRL-2278，ATCC)測(cè)試了siVEGFA特異性敲減在這些細(xì)胞中自發(fā)表達(dá)的VEGFA基因的效率。將細(xì)胞鋪在六孔平板上含有10%胎牛血清的RPMI中，在5%C02、37*€下培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞植板后一天，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)用不同濃度的siVEGFA或siLuc(分別以O(shè)、0，1、0.5、1.0或2.0ml/孔)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。二十四小時(shí)后，從這些細(xì)胞中提取RNA用于逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶RNA提取和RT-PCR。使用SVR細(xì)胞(CRL-2280，ATCC)測(cè)試了siVEGFRl特異性敲減在這些細(xì)胞中組成型表達(dá)的VEGFR1基因的效率。將細(xì)胞鋪在六孔平板上含有5%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，在5%C02、37。C下培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞植板后一天，使用Lipofectamine2000，用不同濃度的siVEGFRl或siLuc(分別以0、0.1、0.5或1.0ml/孔)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。四十八小時(shí)后，從這些細(xì)胞中提取RM用于RSPCR以檢測(cè)VEGFR1(參見(jiàn)RNA提取和DNA模板特異性PCR)(RS-PCR)。用表達(dá)mVEGFR2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(CRL-l573，ATCC)，用于檢測(cè)外源mVEGFR2的敲減。將細(xì)胞鋪在六孔平板上含有5%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，在5%C02、37'C下培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞植板后一天，使用Lipofectamine2000，用質(zhì)粒pCI-VEGFR2(0.2ml/孔)和siVEGFR2(a、b、a—b)或siLuc(分別0、0.1、0.5或1.0Pg/孔)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。四十八小時(shí)后，從這些細(xì)胞中提取RNA用于RS-PCR以檢測(cè)VEGFR2。>#應(yīng)微炎試驗(yàn)這項(xiàng)研究中使用的角膜微袋試驗(yàn)遵守Kenyon及其同事的實(shí)驗(yàn)方案。插入角膜的小丸通過(guò)以下方法制備混合已知量的CpG0DN、硫糖鋁(10mg,BulchMeditec，Vaerlose，丹麥)和在乙醇中的7jC分子(hydron)聚合物(120mg/1ml乙醇；InterferonSciences,NewBrunswick,NJ)，并將混合物涂在15mm2合成網(wǎng)格片(SefarAmerica,Inc.,KansasCity,M0)上。令混合物風(fēng)干并將網(wǎng)格的纖維拉斷，產(chǎn)生含CpG0DN的小丸。在立體顯微鏡(LeicaMicrosyte邁s，Wetzlar，德國(guó))下制造微袋(每組四眼)并將含CpGODN的小丸插入微袋中。在小丸移植后第4天和第7天使用帶有立體顯微鏡的測(cè)徑器(BiomedicalResearchInstruments,Rockville，MD)評(píng)估血管生成。領(lǐng)情源自朝向角膜中心的角膜緣血管環(huán)的新血管的長(zhǎng)度和以時(shí)鐘小時(shí)計(jì)呈現(xiàn)的新血管的寬度。在這種情況下，每時(shí)鐘小時(shí)等于30°。根據(jù)用于橢圓的公式計(jì)算血管生成面積。的沐力迷送小丸移植后第4天和第7天都監(jiān)測(cè)角膜緣。在小丸移植后第4天，與對(duì)照siLacZ得到的結(jié)果相比全部三種測(cè)試siRNA導(dǎo)致角膜新血管生成的顯著抑制(p<0.05)。三種測(cè)試的siRNA的組合是最有效的抑制劑，提供新血管生成減少大約60%(p<0.01)。全1迷送乾/^F^,途逸差萄^s/iW//趟^C/^謬爭(zhēng)^新j6會(huì)^4樹(shù)為了測(cè)試乾向各個(gè)siRNA的抗血管生成作用和全身siRNA遞送效率，在小丸移植后6和24小時(shí)，給具有含CpGODN的微袋的小鼠靜脈注射單劑量的40[ig含有siVEGFA、siVEGFRl、siVEGFR2或三者混合物的siRNA，或?qū)φ誷iLacZ。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用聚合物("Targetran，，)，其在對(duì)腫瘤血管生成的早先研究顯示促進(jìn)siRNA的血管外遞送。在小丸移植后第4天和第7天，測(cè)定血管生成的程度。在小丸移植后第4天，各個(gè)使用的試劑與siLacZ治療組相比誘導(dǎo)顯著的新血管生成抑制(p<0.05)。如局部給藥觀察到的，三種測(cè)試試劑的混合物提供了最有效的抑制(平均抑制40%,p<0.01)。在另外的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)比較懸浮于聚合物或在PBS中給出的測(cè)試混合物的抗新血管生成活性來(lái)評(píng)估聚合物載體的作用。這些實(shí)驗(yàn)揭示了聚合物載體的使用比使用PBS栽體時(shí)顯然導(dǎo)致更有效的抗新血管生成，盡管結(jié)果僅在試驗(yàn)早期是顯著的(p<0.05)。結(jié)果證明通過(guò)靜脈注射給予耙向VEGF系統(tǒng)基因的siRNA可以控制眼新血管生成并且使用RGD介導(dǎo)的dsRNA納米顆粒遞送增強(qiáng)了治療作用的功效。為了確定全身遞送siRNA的有效抗血管生成劑量，在小丸移植后6和24小時(shí)，給具有含CpGODN的微袋的小鼠靜脈注射單劑量的10、20、40、8tmg含有siVEGFA、siVEGFRl和siVEGFR2混合物的siRNA，或具有TargeTran載體的對(duì)照siLuc。給予siRNA以劑量依賴(lài)性方式抑制了CpG誘導(dǎo)的血管生成。奸對(duì)P^尸途徑差廚的s/及W在^^模f^村浴^^^早先的研究已經(jīng)表明VEGF是誘導(dǎo)HSK模型中HSV特異性血管生成的關(guān)鍵血管生成因子。為了評(píng)估給予靶向VEGF途徑基因的siRNA是否抑制HSK的發(fā)展，劃破小鼠的角膜并用1.105HSV-1RE感染。然后在病毒感染后第l和3天，給予小鼠具有聚合物載體的單劑量的10Pg(結(jié)膜下注射進(jìn)行局部遞送)或4Qjxg(尾靜脈注射進(jìn)行全身遞送)siRNA的混合物(siVEGFA、siVEGFRl和siVEGFR2的等摩爾混合物)。如圖4所示，用靶向VEGF途徑基因的siRNA局部或全身處理的小鼠與用siLuc對(duì)照處理的動(dòng)物相比，血管生成和HSK的嚴(yán)重性顯著降低(p<0.05)。雖然80%siLuc對(duì)照處理的眼睛產(chǎn)生了臨床上明顯的損害(在腹膜內(nèi)注射第10天，得分2或更高)，但是用靶向VEGF途徑基因的siRNA處理的眼睛僅有42%(局部遞送)或50%(全身遞送)產(chǎn)生了這樣的損害。此外，到腹膜內(nèi)注射第10天，12只對(duì)照眼睛有9只的血管生成得分大于6，但是用針對(duì)VEGF途徑基因的siRNA經(jīng)局部或全身遞送處理的小鼠的12只眼睛中僅有5只如此。這些結(jié)果綜合在一起表明給予針對(duì)VEGF途徑基因的siRNA通過(guò)抑制血管生成減輕了HSK的發(fā)展。實(shí)施例8:在ROP眼新血管生成模型中非常有效的抗血管生成劑-耙向VEGF、VEGFR1和VEGFR1基因的siRNA混合物眼睛中的新血管生成與各種病癥有關(guān)，常常引起視力嚴(yán)重喪失并最終失明。在這些病癥當(dāng)中，糖尿病視網(wǎng)膜病(DR)、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、視網(wǎng)膜靜脈閉塞(RVO)和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)是普遍的。刺激因子和抑制因子的不平衡導(dǎo)致新血管生成(NV)并且血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是引起血管通透、擴(kuò)張和內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖的刺激因子的最重要的因子"'。RNA干擾(RNAi)是寬范圍生物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程，由序列與靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)啟動(dòng)。在這個(gè)實(shí)施例中，乾向VEGF途徑的小干擾dsRNA寡核苷酸(siRNA)用于抑制由氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病所誘導(dǎo)的NV。材料和方法siRNA的i殳計(jì)和合成siRNA由Intradigm公司友情提供。三種mVEGF途徑因子-mVEGFA和兩種mVEGF受體(mVEGFRl和mVEGFR2);故RNAi靶向并被稱(chēng)為siMix。靶向螢光素酶的siRNA被稱(chēng)為siLuc作為對(duì)照。氣誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新血管生成的小鼠模型我們使用的模型(Smith等[2])模仿早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。在出生后第七天(P7)，將小鼠和它們的養(yǎng)育母親置于密封培養(yǎng)箱(自己的產(chǎn)品)，以氧和空氣的混合物通風(fēng)至75口t2%的最終氧部分。每天至少三次檢查氧含量。在P12，將小鼠放回室內(nèi)空氣中。在P17處死動(dòng)物。小鼠C57BL/6小鼠購(gòu)自廣州醫(yī)學(xué)院和廣州中醫(yī)藥大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有研究均遵循國(guó)家研究委員會(huì)生命科學(xué)委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源管理委員會(huì)的方針。siRNA的體內(nèi)遞送對(duì)于局部遞送，在P12和P13將siMix(每只眼4^g/2W)結(jié)膜下或脈絡(luò)膜內(nèi)遞送入左眼并(每只眼4^g/2m)在深度麻醉下用32-規(guī)格Hamilton注射器(HamiltonCo，Revo，NV)將siLuc注入右目艮。對(duì)于全身給藥，將siRNA(每只小鼠15Pg/5(mi)與RGD-PEG-PEI聚合物綴合物制劑(TargeTran)混合并在P12和P13通過(guò)腹膜內(nèi)遞送。視網(wǎng)膜血管造影術(shù)w在P17如以前描述的通過(guò)用含50mg/ml熒光素標(biāo)記的右旋糖酐的氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌注處死動(dòng)物。摘出兩只眼睛并在10%緩沖甲醛中室溫下固定0.5-1小時(shí)。切開(kāi)前段并小心取出感覺(jué)神經(jīng)視網(wǎng)膜。放射狀切割視網(wǎng)膜并平放于甘油中，光感受器朝向下。在視網(wǎng)膜上放置蓋玻片并用指甲油密封。用熒光顯微術(shù)檢查視網(wǎng)膜的完整標(biāo)本。用softImage-ProPlus(MediaCybernetics,USA)測(cè)量視網(wǎng)膜NV的面積。冷凍切片[5]取出眼睛并在最佳切割溫度埋封膠(MilesDiagnostics)中冷凍。用生物素化GSA對(duì)眼睛冷凍切片(lOMffl)進(jìn)行組織化學(xué)染色。將栽玻片在曱醇/11202中在4"C下孵育IO分鐘，用0.05MTris緩沖鹽水(TBS)，pH7.6洗滌，并在10°/。正常牛血清中孵育30分鐘。將載玻片與生物素化GSA在37X:孵育1小時(shí)，用0.05MTBS漂洗后，將它們用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(VectorLaboratories)在室溫下孵育45分鐘。用0.05MTBS洗滌10分鐘后，將載玻片用二氨基聯(lián)苯胺孵育得到褐色反應(yīng)產(chǎn)物并用曙紅復(fù)染色，用Cytoseal封固。為了進(jìn)行定量評(píng)定，貫穿全眼切10貤連續(xù)切片，并從含有虹膜的第一個(gè)切片開(kāi)始，延伸至含虹膜的另一側(cè)眼睛的最后一個(gè)切片，每十個(gè)切片用GSA染色并將共15個(gè)切片染色。用顯微鏡檢查GSA染色的切片，使用數(shù)字彩色攝像機(jī)將圖像數(shù)字化。使用Image-ProPlus軟件(MediaCybernetics,SilverSpring,MD，USA)描繪視網(wǎng)膜表面上GSA染色的細(xì)胞并測(cè)量它們的面積。對(duì)于局部注射，將每只眼的總測(cè)量值用作單個(gè)實(shí)驗(yàn)值。對(duì)于全身注射，將小鼠兩只眼的平均測(cè)量值用作單個(gè)實(shí)驗(yàn)值。RT-PCR在P14和P17，處死小鼠并用TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))從4見(jiàn)網(wǎng)膜中提取總RNA。以260與280nm之比定量總RNA并通過(guò)cDNA合成試劑盒(Fermentas，美國(guó))將2^gRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。用RT-PCR擴(kuò)增RT產(chǎn)生的編碼VEGF、VEGFR1、VEGFR2和卩-肌動(dòng)蛋白(作為RNA完整性的對(duì)照和內(nèi)標(biāo))的cDNA。用im有義和反義序列和2.5UTaq聚合酶實(shí)施1.5WcDNA的擴(kuò)增。寡核苷酸引物序列是mVEGF(430bp)□正向5'-GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG-3'□反向5'-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagetgectegccttg-3'口mVEGFRl(404bp)□正向5'-GTCAGCTGCTGGGACACCGCGGTCTTGCCT-37□反向-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattecgc-3'□mVEGFR2(485bp)□正向5'-TGGCTGGTCAAACAGCTCATC-3'□反向5'-CTCATCCAAGGGCAATTCATC-3'-口口p-肌動(dòng)蛋白(232bp)□正向5'-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3'□反向5'-CATCTCCTGCTGAAGTCTAGAGC—。VEGF和VEGF1、VEGF2的ELISA在P14和P17，處死小鼠并迅速在水上摘取^L網(wǎng)膜。將樣品在細(xì)胞溶解緩沖液(哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解試劑盒，BiotechnologyDepartmentBioBasidInc，加拿大)中混勻并隨后以12，000rpm離心SO分鐘。通過(guò)BCA蛋白質(zhì)定量分析試劑盒(SheneryBiocolorBioscience&TechnolgyCompany,中國(guó))分析上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將樣品稀釋至1mg/ml的終濃度。分別使用Q廳UkineM小鼠VEGF、sVEGFRl和sVEGFR2免疫測(cè)定試劑盒(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)測(cè)定VEGF、VEGFR1和VEGFR2的水平。分析每組和每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的6至12個(gè)組織樣品。結(jié)果與討論炎^:^j6營(yíng)造參^定"A^考說(shuō)/^處^T^^V^正常P17小鼠的視網(wǎng)膜既有淺血管層又有從視神經(jīng)延伸到外周的深血管層(通過(guò)連通血管相連)。暴露于氧過(guò)多的P17對(duì)照小鼠的視網(wǎng)膜在灌注和未灌注視網(wǎng)膜之間接合處含有從視網(wǎng)膜表面伸出的許多新血管叢(高熒光素)。結(jié)膜下注射siLuc或siMix后，視網(wǎng)膜也具有許多NV，但面積沒(méi)有明顯差異。然而，脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射siMix后，NV面積明顯小于對(duì)照。遞迎視河應(yīng)^邀歡#定#對(duì)si^^生成)來(lái)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)定。P17含氧量正常的小鼠的視網(wǎng)膜具有淺表、中間、深層血管并且在ILM之前不含內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)歷了氧過(guò)多的P17小鼠的視網(wǎng)膜在表面上含有多重新血管叢，一些延伸到玻璃體中。經(jīng)結(jié)膜下注射siLuc或siMix治療的小鼠的^L網(wǎng)膜的NV面積沒(méi)有差異。與注射siluc相比，脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射siMix后NV的面積明顯減小。脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射siRNA后VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的水平降低為了確定針對(duì)VEGF途徑基因的siRNA治療是否可降低VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的水平，在P14和P17在脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射siRNA后，收集視網(wǎng)膜。通過(guò)RT-PCR測(cè)定了mRNA水平。與用siLuc治療的對(duì)照視網(wǎng)膜相比，在用針對(duì)VEGF途徑基因的siMix治療的視網(wǎng)膜中VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA的表達(dá)降低(p<0.05)。脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)施用siRNA后，VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低為了評(píng)估靶向VEGF途徑基因的siRNA治療是否減少VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，在P14和P17使用ELISA測(cè)定了siRNA治療的視網(wǎng)膜中的VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白質(zhì)。如表1和2所示，與給予siLuc的對(duì)照相比，在接受了siMix的小鼠中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白質(zhì)水平降低。氧和營(yíng)養(yǎng)素供需不平衡是誘導(dǎo)VEGF上調(diào)的新血管生成的啟動(dòng)因素。VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞的有效的促細(xì)胞分裂因子；它還可誘導(dǎo)血管通透和擴(kuò)張。這些生物活性通過(guò)使VEGF與高親和力跨膜自動(dòng)磷酸化酪氨酸激酶受體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)[5]。已經(jīng)鑒定了三種不同的VEGF受體，即VEGFR1(fms樣酪氨酸激酶-1或Flt-l)、VEGFR2(含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體或KDR)和VEGFR3(fms樣酪氨酸激酶-4或Flt-4)。VEGFR1和VEGFR2主要在血管上表達(dá)，VEGFR3在淋巴內(nèi)皮上表達(dá)[6]。與視網(wǎng)膜新血管生成相關(guān)的VEGF脈絡(luò)膜內(nèi)和視網(wǎng)膜內(nèi)水平增加不僅存在于動(dòng)物模型中，而且存在于缺血性視網(wǎng)膜病患者中。這些數(shù)據(jù)表明VEGF信號(hào)是治療視網(wǎng)膜新血管生成的良好目標(biāo)[5]。氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜病在世界上被普遍認(rèn)可。EricAP等[7]報(bào)道了缺氧后6至12小時(shí)之間VEGF的mRNA水平顯著提高并保持升高數(shù)日，然后隨視網(wǎng)膜病逆轉(zhuǎn)向基線降低。因此為了在上調(diào)前干擾VEGF的合成，我們?cè)赑12和P13遞送了siRNA。完整標(biāo)本和冷凍切片的結(jié)果證明了脈絡(luò)膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射siMix治療的視網(wǎng)膜的NV面積小于注射siLuc。即，siMix顯然可以抑制^L網(wǎng)膜的NV。為了系統(tǒng)地研究其機(jī)理，檢查了在P14和P17-見(jiàn)網(wǎng)膜的VEGF、VEGFR1和VEGFR2表達(dá)，mRNA和蛋白質(zhì)水平比siLuc對(duì)照低。這些提示了siMix是通過(guò)抑制VEGF途徑基因來(lái)抑制視網(wǎng)膜的NV。然而結(jié)膜下注射后沒(méi)有明顯差異，因此結(jié)論是它在局部尚未達(dá)到有效濃度。脈絡(luò)膜內(nèi)注射后玻璃體中有高濃度的siRNA存在和siRNA被轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜新血管內(nèi)皮細(xì)胞中。但是這種注射可引起眼內(nèi)出血和眼內(nèi)炎等。腹膜內(nèi)注射相對(duì)安全和siRNA可通過(guò)豐富的腹腔毛細(xì)血管被吸收入血液。但是siRM容易在非特異性器官，包括肝、肺和脾中被捕集。因此如何提高siRNA轉(zhuǎn)染效率是非常重要的。載體TargeTran由聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列(RGD)組成。PEI與siRNA磷酸酯中的負(fù)電荷結(jié)合。RGD基序已經(jīng)被鑒定為活化內(nèi)皮細(xì)胞的整聯(lián)蛋白配體。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)許多不同的整聯(lián)蛋白，整聯(lián)蛋白ctvl33和ct5P1已被證明在血管生成過(guò)程中是重要的。這兩種整聯(lián)蛋白都是具有暴露的RDG三肽部分的基質(zhì)蛋白的受體并且在血管生成過(guò)程中在活化內(nèi)皮細(xì)胞上最為突出。因此Targetran的應(yīng)用可以提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率。KimB等w報(bào)道了結(jié)膜下和靜脈注射siMix可以抑制小鼠中CPG誘導(dǎo)的角膜新血管生成。它還可以應(yīng)用于其它的新血管疾病。實(shí)施例9:配體定向的納米顆粒siRNA可以通過(guò)全身給藥特異性遞送入腫瘤這種自我裝配siRNA納米顆粒當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)注射全身給藥時(shí)，表現(xiàn)出新血管靶向性能。已經(jīng)用螢光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)揭示了這種siRNA納米顆粒系統(tǒng)的腫瘤特異性靶向能力。實(shí)施例10:配體定向的納米顆粒siRNA是在小鼠同基因模型(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤)中證實(shí)的有效的抗腫瘤劑使用靜脈給藥的靶向納米顆粒系統(tǒng)進(jìn)行siRNA的腫瘤靶向遞送是使用包裝于RGD-PEG-PEI納米顆粒中的熒光標(biāo)記siRNA證明的。V、處^9t模型雌性棵鼠(6-8周齡)得自Taconic(Germantown,NY)，關(guān)在具有可隨意利用的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物食物和水的頂部有濾光器的籠子中，和12小時(shí)光照/黑暗周期。實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家法規(guī)進(jìn)行并且得到當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在小鼠肋腹部接種1x1(^個(gè)N2A細(xì)胞誘導(dǎo)皮下N2A腫瘤。在腫瘤體積大約0.5-1cn^時(shí)，小鼠通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)注射0.2ml溶液而接受納米叢或游離siRNA。以游離形式或作為PEI-或RGD-PEG-PEI納米顆粒注射40pg熒光標(biāo)記的siRNA。注射后一個(gè)小時(shí)，解剖組織并用適于熒光的解剖顯微鏡檢查。用配備有數(shù)碼相機(jī)并與PC運(yùn)行的MagnaFire2.0照相機(jī)軟件(Optronics,Goleta，CA)連接的OlympusSZX12熒光顯微鏡進(jìn)行組織的顯微鏡檢查。對(duì)每種組織以相同的膝光時(shí)間拍攝照片。結(jié)果通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)注射游離的熒光標(biāo)記siRNA在肺、肝或腫瘤組織中沒(méi)顯示任何顯著的蓄積。使用PEI-納米顆粒遞送的SiRNA顯示在肺組織中蓄積最多，隨后是在肝臟和腫瘤中。使用RGD-PEG-PEI納米顆粒遞送的siRNA顯示在腫瘤組織中蓄積水平最高。與PEI-納米顆粒相比，在肺中蓄積大大降低且在肝臟中蓄積甚微。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了使用RGD-PEG-PEI納米顆粒對(duì)siRNA的腫瘤靶向遞送。4吏用含有以VEGFR2為目標(biāo)的siRNA的腫瘤靶向納米顆粒制劑研究了RNAi介導(dǎo)的腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的抑制。通過(guò)靜脈注射納米顆粒制劑治療帶有皮下腫瘤的小鼠，每次注射的劑量為""gsiRNA。每隔兩天重復(fù)注射并評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)和與用對(duì)照制劑治療的動(dòng)物相比較。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，評(píng)估血管生成的抑制。雌性棵鼠(6-8周齡)得自Taconic(Germantown，NY)，關(guān)在具有可隨意利用的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物食物和水的頂部有濾光器的籠子中，和12小時(shí)光照/黑暗周期。試驗(yàn)根據(jù)國(guó)家法規(guī)進(jìn)行并且得到當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在小鼠肋腹部接種1x10e個(gè)N2A細(xì)胞誘導(dǎo)皮下MA腫瘤。在腫瘤體積大約0.5-1cm3時(shí)，小鼠通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)注射0.2ml溶液而接受納米叢或游離siRNA。含有siRNA的納米顆粒制劑通過(guò)siRNA溶液與聚合物溶液以給定的N/P比例簡(jiǎn)單混合來(lái)制備。對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)抑制研究，在接種腫瘤細(xì)胞后7天，當(dāng)腫瘤變得可觸知時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。治療包括通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)給予每只小鼠含有4(mgsiRNA的RPP-納米叢，每3天一次。由不知曉治療分配的觀察者使用數(shù)字測(cè)徑器每隔一定時(shí)間測(cè)量肺瘤生長(zhǎng)。每個(gè)測(cè)量結(jié)果由以大約相隔90度的兩個(gè)方向角度的腫瘤直徑組成。以0.52x最長(zhǎng)直徑x最短直徑2計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，切除腫瘤組織和周?chē)钠つw并置于顯微術(shù)載玻片上。使用上面對(duì)于熒光組織測(cè)量所述的Olympus顯微鏡和照相機(jī)設(shè)備，通過(guò)顯微術(shù)進(jìn)行血管形成和血管生成的組織檢查。透射組織以顯現(xiàn)皮膚中的血管且如上所述拍攝數(shù)字圖像并保存。此后立即進(jìn)行組織的快速冷凍用于Western印跡分析。結(jié)果對(duì)于用含有VEGFR2siRNA的納米顆粒制劑治療的動(dòng)物觀察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。用非特異性siRNA治療的動(dòng)物與未經(jīng)治療的動(dòng)物相比沒(méi)有顯示出任何實(shí)質(zhì)上的腫瘤生長(zhǎng)抑制。在腫瘤組織周?chē)^察到顯著的血管生長(zhǎng)抑制，表明了在VEGFR2-siRNA治療的小鼠中發(fā)生血管生成抑制。用對(duì)照siRNA治療的小鼠顯示出與未經(jīng)治療的動(dòng)物相似的血管生長(zhǎng)。從不同治療組的動(dòng)物收集的腫瘤裂解物的Western印跡分析顯示出在VEGFR2-siRNA治療的動(dòng)物中VEGFR2大幅度減少，而在對(duì)照siRNA治療的動(dòng)物中沒(méi)有觀察到VEGFR2減少。這些實(shí)驗(yàn)清楚地證明靜脈內(nèi)給予的siRNA遞送入腫瘤組織。使用786-0異種移植腫瘤模型研究了包裝于RGD-PEG-PEI納米顆粒中的VEGFR2siRNA抑制腎細(xì)胞癌模型中的腫瘤生長(zhǎng)的有效性。這個(gè)研究使用了類(lèi)似于實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)步驟。簡(jiǎn)言之，雌性棵鼠(6-8周齡)得自Taconic(Germantown，NY)。通過(guò)在小鼠肋腹部接種5x106個(gè)786-0細(xì)胞誘導(dǎo)皮下786-0腫瘤。在腫瘤體積達(dá)到大約100mm3時(shí)，經(jīng)由尾靜脈靜脈內(nèi)注射含有VEGFR2-siRNA的RGD-PEG-PEI納米顆粒的溶液而開(kāi)始治療。對(duì)照治療組接受有含非特異性siRNA的納米顆?；螓}水。重復(fù)治療數(shù)日，每隔兩天注射一次。如實(shí)施例7所述每隔兩天測(cè)量一次腫瘤體積。結(jié)果對(duì)于用VEGFR2siRNA納米顆粒制劑治療的動(dòng)物觀察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。對(duì)于用對(duì)照siRNA納米顆粒治療的動(dòng)物沒(méi)有觀察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明由肺瘤靶向納米顆粒制劑遞送的VEGFR2siRNA可以實(shí)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制。將配體定向的siRNA納米顆粒全身給予皮下接種N2A膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的C57小鼠模型，用于評(píng)價(jià)VEGF敲減對(duì)腫瘤血管生成活性的影響。雌性棵鼠(6-8周齡)得自Taconic(Germantown，NY),關(guān)在具有可隨意利用的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物食物和水的頂部有濾光器的籠子中，和12小時(shí)光照/黑暗周期。實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家法規(guī)進(jìn)行并且得到當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在小鼠肋腹部接種1x1(r個(gè)N2A細(xì)胞誘導(dǎo)皮下N2A胂瘤。在腫瘤體積大約0.5-1cm3時(shí)，小鼠通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)注射0.2ml溶液而接受納米叢或游離siRNA。以N/P比為2如上制備納米叢溶液。對(duì)于組織分布實(shí)驗(yàn)，以游離形式或作為P-或RPP-納米叢注射40mg熒光標(biāo)記的siRNA。注射后一個(gè)小時(shí)，解剖組織并用適于熒光的解剖顯微鏡檢查。用配備有數(shù)碼相機(jī)并與PC運(yùn)行的MagnaFire2.0照相機(jī)軟件(Optronics,Goleta，CA)連接的OlympusSZX12熒光顯微鏡進(jìn)行組織的顯微鏡檢查。對(duì)每種組織以相同的曝光時(shí)間拍攝照片。在共同遞送實(shí)驗(yàn)中，將質(zhì)粒和siRNA以1:IOO摩爾比混合，分別(40mgpLuc與13mgsiRNA)，和在順序遞送實(shí)驗(yàn)中，首先遞送40mg質(zhì)粒，2小時(shí)后繼之以40mgsiRNA(1:300摩爾比)。注射納米叢后24小時(shí)，解剖組織、稱(chēng)重并放入含磁珠的2ml管(Q-Biogene，Carlsbad,CA)的水冷報(bào)道裂解緩沖液(Promega)。用FastprepFP120磁性勻漿器(Q-Biogene)均化組織并4吏用螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)在Monolight2010光度計(jì)(AnalyticalLuminescenceLaboratory)上測(cè)定樣品的報(bào)道酶活性。在腫瘤生長(zhǎng)抑制研究中，在接種腫瘤細(xì)胞后7天，當(dāng)腫瘤變得可觸知時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。治療包括通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)給予每只小鼠含有40mgsiRNA的RPP-納米叢，每3天一次。由不知曉治療分配的觀察者使用數(shù)字測(cè)徑器每隔一定時(shí)間測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。每個(gè)測(cè)量結(jié)果由以相隔90度的兩個(gè)方向角度的腫瘤直徑組成。以O(shè).52x最長(zhǎng)直徑x最短直徑2計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死動(dòng)物，切除腫瘤組織和周?chē)钠つw并置于顯微術(shù)載玻片上。使用上面對(duì)于熒光組織測(cè)定所述的Olympus顯微鏡和照相機(jī)設(shè)備，通過(guò)顯微術(shù)進(jìn)行血管形成和血管生成的組織檢查。透射組織以顯現(xiàn)皮膚中的血管且如上所述拍攝數(shù)字圖像并保存。此后立即進(jìn)行組織的快速冷凍用于Western印跡分析。siRNARPP-納米叢引起的腫瘤生長(zhǎng)抑制。給小鼠接種N2A腫瘤細(xì)胞，不進(jìn)行治療或以每只小鼠40mg的劑量，每3天通過(guò)尾靜脈注射含有siLacZ或siVEGFR2的RPP-納米叢進(jìn)行。在腫瘤變得可觸知(20mm"的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始治療。只有VEGFR2序列特異性siRNA抑制了腫瘤生長(zhǎng)，而與未經(jīng)治療的對(duì)照(n-5)相比，用LacZsiRNA治療沒(méi)有影響腫瘤生長(zhǎng)速率。實(shí)施例11:配體定向的納米顆粒siRNA是在異種移植腫瘤模型(腎癌)中證實(shí)的有效的抗腫瘤劑還在腎癌小鼠異種移植模型中測(cè)試了配體定向的siRNA納米顆粒。用與實(shí)施例10相同的原料和相同的方法制備siRNA納米顆粒，使用相同遞送途徑遞送siRNA納米顆粒。每組六只動(dòng)物，使用2mg/kg劑量以三天間隔重復(fù)遞送五次。觀察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。實(shí)施例12:配體定向的納米顆粒siRNA是在異種移植腫瘤模型(結(jié)腸癌)中證實(shí)的有效的抗腫瘤劑使用靶向VEGFR2基因的siRNA納米顆粒，我們進(jìn)一步測(cè)試了在人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1的小鼠異種移植模型中的抗腫瘤功效。材料和方法試劑Avastin、抗VEGF的單克隆抗體(25mg/ml，Genetech);針對(duì)VEGFR2的siRNA，序列(附錄l);針對(duì)螢光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5g2，2，2-三溴乙醇和1.5ml叔戊醇(Cat并T4840-2，Cat#24048-6，Aldricli)溶于100ml蒸餾水，St.Louis，M0〗中制成的Avertin。小鼠無(wú)胸腺雌性棵鼠，5至6周齡購(gòu)自TAC0NIC0和按照常規(guī)籠養(yǎng)。所有研究均遵循國(guó)家研究委員會(huì)生命科學(xué)委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源管理委員會(huì)的方針。馬里蘭Rockville的生物醫(yī)學(xué)研究所的動(dòng)物設(shè)備由美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理協(xié)會(huì)充分認(rèn)可。細(xì)胞結(jié)腸癌細(xì)胞系，DLD-1(CCL-221，ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄雄、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。試劑Avastin、抗VEGF的單克隆抗體(25mg/ml，Genetech);針對(duì)VEGFR2的siRNA，序列(附錄l);針對(duì)螢光素酶的siRNA(Qiagen);由1.5g2，2，2-三溴乙醇和1.5ni1叔戊醇(Cat#T4840-2，Cat#24048-6Aldrich)溶于100ml蒸餾水，St.Louis,M0]中制成的Avertin。小鼠無(wú)胸腺雌性棵鼠，5至6周齡購(gòu)自TACONIC()和按照常規(guī)籠養(yǎng)。所有研究均遵循國(guó)家研究委員會(huì)生命科學(xué)委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源管理委員會(huì)的方針。馬里蘭Rockville的生物醫(yī)學(xué)研究所的動(dòng)物設(shè)備由美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理協(xié)會(huì)充分認(rèn)可。細(xì)胞結(jié)腸癌細(xì)胞系，DLD-1(CCL-221,ATCC)在含2mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。步驟1)收獲接近融合的DLD-1細(xì)胞并重懸于無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基中。2)用Avertin0.4ml/小鼠腹膜內(nèi)注射麻醉小鼠。3)0.lml無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基中的1億個(gè)細(xì)胞左側(cè)皮下注射到小鼠背部，建立異種移植腫瘤模型。4)接種腫瘤細(xì)胞后5天，用測(cè)徑器測(cè)量生長(zhǎng)腫瘤的大小。然后對(duì)小鼠隨機(jī)分組，每組7只。應(yīng)用三種不同的劑量方案分別為1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg。盡管4mg/kg的高劑量表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗肺瘤活性，但是三個(gè)治療組之間沒(méi)有顯著差異。使用不同的比較，發(fā)現(xiàn)4mg/kg高劑量的siRNA納米顆粒顯示出比5mg/kgAvastin治療更強(qiáng)的抗胂瘤功效。參考文獻(xiàn)1.PeterA，Campochiaro.Retinalandchoroidalneovascularization.JCellPhysiol,2000,184:301-10.2.SmithLE，WesolowskiE，MclellanA，etal.Oxygen-inducedretinopathyinthemouse.InvestOphthalmolVisSci,1994,35:101-11.3.3D'AmatoRWesolowskiE，SmithLE.Microscopicvisualizationoftheretinabyangiographywithhigh-molecular-weightfluorescein-labeleddextransinthemouse.MicrovascRes1993;46:135~42.4.Jikuishen,Rebeccasamul，JoelleZimmer,etal.DeficiencyofNeuropilin2SuppressesVEGF-InducedRetinalNV.Molecularmedicine,2004,10:12-18.5.UnsoeldAS,JunkerB，Mazitschek民etal.LocalinjectionofreceptortyrosinekinaseinhibitorMAE87reducesretinalneovascularizationinmice.MolVis,2004,10:468-75.6.ClaussM.MolecularbiologyoftheVEGFandVEGFreceptorfamily.SeminThrombHemost,2000，26:561-9.7.EricAP，RobertLA，EliotDF,etal.Vascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactorexpressioninamousemodelofretinalneovascularization.Proc.Natl.Acad.Sci,1995,92:905-9.8.LuP.Y.etal.，KeystoneSymposia^MolecularTargetsforCancerTherapy,(2003,p219.XuJ.etal.，GeneSuppression.(2003).9.Lu,Patricketal.，(2002),CancerGe"e77era;乂Vol.10，Supplement1,Oil.10.Li^PatrickYetal."(2003),Cw/re/(9/^"/o/"Mo/ecw/"/*7Terapewrfcj,5(3):225-234.11.CogoniC.etal"(2000),GewesZ)ev10:638-643.12.GuruT.，(2000),iVo/we404:804-808.13.HammondSMetal.，(2001),A^we及evGe2:110-119.14.NapoliCetal.，(19卯)，f/a"fCe//2:279-289.15.JorgensenRAetal.,(1996),尸/a"fA4b/所o/,31:957-973.16.IngelbrechtIetal.，(1994),iVocMrt/JcW^SW91:10502-10506.17.CogoniCetal"fiWBO乂15:3153-3163.18.PalauquiJCetal.，(1998)，16:47384745.19.GuoSetal.,(1995),Ce//,81:611>620.20.FireAetal.，(1998),W。加re391:806-811.21.TimmonsL.etal.，(1998),iStowre395:854.22.TimmonsLetal"(2001),263:103-112.23.HunterCP,(2000)，Cwre"/10:R137-R140.24.TabaraHetal.，(1998),>SWe"ce282:430~431.25.KamathRSetal"(2000),5!'o/ogy2:2.1-2.10.26.GrishokAetal"(2000),5Wewce287:2494-2497.27.SharpPAetal.,(2000)，Sc!'ewce287:2431-2433.28.SharpPA，(2001),Ge"wZ)ev15:4854卯.29.KennerdellJRetal"(1998).Ce〃95:1017-1026.30.KennerdellJRetal.，(2000),AtowreB/otec/z18:896-898.31.DzitoyevaSetal,(2001),Mo/尸^c/h'a^76(6):665-670.32.WorbyCAetal"(2001)，Aug14，2001(95):PL1.33.SchmidAetal.，(2002)，7Vewcfe腸,/25(2):71-74.)34.HamiltonA.J.etal.,(1999),5We"ce286:950-952.35.HammondSetal.,(2000),胸眺，404:293-298.36.ZamorePDetal.,(2000),CeW101:25-33.37.HutvagnerG改al"(2002),C釘C^"Gewe"cs<&Z)eve/o戸eW12:225-232.38.BernsteinEetal"(2001)，Atowe409:363-366.39.NykanenAetal.，(2001)，Ce〃107:309-321.40.LipardiCetal"(2001),Ce〃107:297-307.41.KettingRFetal"(1999),Ce99:13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20.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中一條RNA鏈(有義鏈)具有序列5'-r(CCCUCGCCGGAAGUUGUAUGGUUAA)-3'和另一條RNA鏈(反義鏈)具有序列5'-r(UUAACCAUACAACUUCCGGCGAGGG)-3'。21.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中一條RNA鏈(有義鏈)具有序列5'-r(CCUCAAGAGCAAACGUGACUUAUUU)-3'和另一條RNA鏈(反義鏈)具有序列5'-r(AAAUAAGUCACGUUUGCUCUUGAGG)-。22.根據(jù)權(quán)利要求18-20的組合物，其中在siRNA治療24小時(shí)后，該RNA干擾導(dǎo)致siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VEGFR1蛋白水平降低75%以上。23.根據(jù)權(quán)利要求18-20的組合物，其中在siRNA治療120小時(shí)后，該RM干擾導(dǎo)致siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VEGFR1蛋白水平降低60%以上。23.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，包含至少三個(gè)25聚體的寡siRNA，且其中所述寡siRNA抑制hVEGF、hVEGFRl和hVEGFR2的表達(dá)。24.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，包含至少三個(gè)寡siRNA，且其中所述寡siRNA抑制選自hVEGF、hEGF和hPDGF及其受體的三種基因的表達(dá)。25.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述核酸試劑是靶向合成載體。26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述載體靶向腫瘤新血管結(jié)構(gòu)。27.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述載體包含靶向肽，同雙功能活化PEG接頭和含多胺的試劑。28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中所述靶向肽是RGD肽。29.根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其中所述載體是由同雙功能活化PEG、RGD-2C肽、含多胺的試劑和siRNA分子的混合物制備的自動(dòng)裝配載體。30.根據(jù)任一在前權(quán)利要求的組合物，進(jìn)一步包含抑制與有害或不當(dāng)新血管生成相關(guān)的基因途徑的功能的非核酸治療劑。31.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中所述治療劑是單克隆抗體。32.根據(jù)權(quán)利要求31的組合物，其中所述抗體與VEGF結(jié)合。33.—種治療受治療者中與有害或不當(dāng)新血管生成相關(guān)的疾病的方法，包括給所述受治療者施用根據(jù)任一在前權(quán)利要求的組合物。34.—種治療受治療者中與有害或不當(dāng)新血管生成相關(guān)的疾病的方法，包括給所述受治療者聯(lián)合施用根據(jù)權(quán)利要求l-29任一項(xiàng)的組合物和抑制與有害或不當(dāng)新血管生成相關(guān)的基因途徑的功能的非核酸治療劑。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述治療劑是單克隆抗體。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述抗體與VEGF結(jié)合。37.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中所述新血管生成處于腫瘤組織、眼隔室或關(guān)節(jié)組織中。全文摘要提供了治療疾病的組合物和方法，所述疾病涉及有害的新血管生成(NV)。本發(fā)明提供了通過(guò)選擇性抑制血管生成前生化途徑來(lái)控制NV的治療，包括VEGF途徑基因表達(dá)的抑制和定位于病理NV組織的抑制。提供了靶向組織的納米顆粒組合物，其包含聚合物綴合物和誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的核酸分子。本發(fā)明的納米顆粒組合物可以單獨(dú)使用或與其它治療劑如VEGF途徑拮抗劑聯(lián)合使用。該組合物和方法可以用于治療NV疾病，如癌癥、眼病、關(guān)節(jié)炎和炎癥性疾病。文檔編號(hào)C12N15/113GK101277704SQ200680019011公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年4月12日優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日發(fā)明者F·Y·謝,J·許,M·C·伍德,P·V·斯加里亞,P·楊路,Q·Q·唐,Q·周,R·施弗勒斯,Y·劉申請(qǐng)人:因特拉迪格姆公司