專利名稱：一種人類重大病原菌-霍亂弧菌快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人類重大病原菌一霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的快速 檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步涉及使用霍亂弧菌快速檢測(cè)的試劑盒快速檢測(cè)霍亂弧 菌的方法。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌(V. cholerae)是引起烈性傳染病霍亂的病原體，二千多年 前已有記載。自1817年以來，已發(fā)生過7次世界性霍亂大流行，前6次 均由霍亂弧菌古典生物型引起，1961年開始的第7次大流行由霍亂弧菌 El Tor生物型引起。1992年一個(gè)新的流行株0139(B節(jié)gal依沿孟加拉彎的 印度和孟加拉一些城市出現(xiàn)，并很快傳遍亞洲，這是首次由非Ol群霍亂 弧菌引起的流行霍亂是由霍亂弧菌引起的一種烈性腸道傳染病，經(jīng)口感 染。感染霍亂弧菌的病人主要臨床表現(xiàn)為腹瀉及嘔吐等。嚴(yán)重的可發(fā)生劇 烈的吐瀉，排大量米湯樣大便，容易造成嚴(yán)重失水，肌肉痙攣，甚至循環(huán) 衰竭而死亡?？梢哉f霍亂弧菌是細(xì)菌中對(duì)人類健康安全危害最大的種類之 --，此菌引起的霍亂為我國的甲類法定傳染病。另外，非01群霍亂弧菌 還是中國對(duì)蝦，長(zhǎng)毛對(duì)蝦等對(duì)蝦的爛眼病，鰻脫粘病的病原體，給水產(chǎn)養(yǎng) 殖業(yè)帶來較大的危害。霍亂弧菌引起的霍亂及其它病具有暴發(fā)快、流行廣、 死亡率高等特點(diǎn)，由于細(xì)菌極易對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此對(duì)霍亂弧菌病 應(yīng)以預(yù)防為主，而這主要依賴于早期的快速檢測(cè)。目前對(duì)弧菌的檢測(cè)技術(shù) 主要包括傳統(tǒng)的TCBS培養(yǎng)及進(jìn)一步的形態(tài)及生理生化鑒定法、免疫學(xué) 方法(主要有單克隆抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA))、免疫電鏡 技術(shù)、分子生物學(xué)方法(主要有分子雜交技術(shù)、限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài) (RELP))等。這些檢測(cè)方法有些對(duì)技術(shù)條件要求髙，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。有些 所需的材料制備麻煩，費(fèi)用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，因此 廣大醫(yī)務(wù)人員和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主箏握的技術(shù)難度很大，很難推廣，限制了這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
早期快速檢測(cè)人類重大病原菌一霍亂弧菌是目前預(yù)防霍亂暴發(fā)流行 的主要措施和水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)減少損失的有效途徑，因此，簡(jiǎn)便快速、 特異性好又靈敏度高的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法是廣大醫(yī)務(wù)工作者和水 產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))，是上 世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)，由于具有 快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快就被應(yīng)用千實(shí) 踐中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用霍亂弧菌16S-23S rRNA間區(qū)基因保守序列設(shè)計(jì) 的一對(duì)引物，建立霍亂弧菌PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提 供一種人類重大病原菌一霍亂弧菌的快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑 盒可批量生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高；可用亍人類 烈性傳染病霍亂的臨床檢測(cè),也可用于水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌 跟蹤檢測(cè)，也還可以用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用 價(jià)值。
本發(fā)明的主要原理為試劑A和B將樣品中的細(xì)菌進(jìn)行裂解，釋放出 細(xì)菌DN入試劑C和D為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)試劑，通過試劑D中所含 的霍亂弧菌特異DNA片斷引物和試劑C中的熱聚合酶等成分，對(duì)樣品釋 放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，由于我們?cè)O(shè)計(jì)的引物為霍亂弧菌所特有. 因此，如果樣品中含有霍亂弧菌，那么它的DNA的特異片斷在經(jīng)過擴(kuò)增 后,濃度將達(dá)到1()Smol(克分子)以上，這樣，在電泳和溴化乙錠染色后，紫 外光檢測(cè)就可以探測(cè)到一定分子量的目的條帶。卸果沒有霍亂弧菌,則不 能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該人類重大病原菌 - 霍亂 弧菌的檢測(cè)試劑盒，由如下試劑組成
(a) DNA提取試劑含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B,
試劑A:含有NaCl 0. l-0.3M、 pH8. 0的三羥基甲基氨基甲烷
1-100mM、 pH8.0的乙二胺四乙酸O. 1-10mM和V/V濃度為0-20%的曲 拉通X-100;
試劑B:含有濃度為l-10mg/ml的溶菌酵和pH8. 0、濃度為1-lOOmM 的三羥基甲基氨基甲烷； (b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑:包括反應(yīng)預(yù)混試劑C和反應(yīng)引物試劑D，
試劑C:含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、熱聚合酶和滅菌雙蒸 水，含量分別為2. 5-5. Om、 0. 5-2. 5個(gè)單位和18-35. 5Ml;
試劑D:包括特異引物對(duì)VcF和VcR、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合 物)及MgCU含量分別為0. 2-l幽和0. 2-1MM、 20-'200MM及0. 5-lOmM; (c)電泳和顯色試劑,包括試劑E和試劑F,
試劑E:為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和 乙二胺四乙酸,濃度分別為0. 04M和0. 001M;
試劑F:含W/V為0. 8-2%的瓊脂糖和0. 5-20化/ml溴化乙錠；
試劑D中的特異引物對(duì)VcF和VcR為進(jìn)行PCR反應(yīng)的特異引物和 必需成分，
Vc'F特指5'-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG， VcR特指5'-AGTCACTTAACCATACAACCCG。 每管反應(yīng)試劑的最佳組成為試劑C:5. Om 10 x PCRBuffer, 0. 5WTaqE (濃度5U/Pl), 35. 5WddH20,試劑D:4. 0,NTP(2. 5mM each), 3, 0WMgCl2 (25mM),10pM VcF， 10pM VcR。
試劑A為DNA提取緩沖液,為DM的提取提供適宜的緩沖環(huán)境并抑 制DM的降解;試劑B為細(xì)胞裂解試劑，使細(xì)菌裂解并釋放出DNA;試 劑C為PCR反應(yīng)預(yù)混試劑，為PCK反應(yīng)試劑的主要成分之一，試劑D為 PCR引物試劑，也是PCR反應(yīng)的主要成分,包含有本試劑盒最為關(guān)鍵的 特異引物VcF和VcR。試劑E為50倍TAE(電泳緩沖液)，為樣品電泳提 供合適的pH值、離子強(qiáng)度等的緩沖體系,試劑F為電泳介質(zhì)瓊脂糖十 顯色劑渙化乙錠。
使用快速檢測(cè)霍亂弧菌的試劑盒快速檢測(cè)霍亂弧菌的方法，依次按 下列步驟
(a) 樣品處理:取0. 1-0. 5克樣品,用100-400W試劑A懸浮樣品，并將樣 品充分混勻；10000-12000g離心2-5分鐘，棄上清；
(b) DNA提取用100-300m試劑A再次懸浮沉淀，并加入20- IOOW試劑B 混勻，室溫放置2分鐘以上,再在沸水浴中保溫1-IO分鐘,使細(xì)胞完全破 裂,釋放出DNA; 10000-12000g離心8-10分鐘，取上清并加入上清體積2 倍即240-800m的無水乙醇沉淀DNA;室溫放置5-10分鐘， 0000-12000g離心3-8分鐘；去上清，7596乙醇洗滌一次，讓乙醇徹底揮 發(fā),將沉淀溶于10-滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液；
(c) PCK擴(kuò)增以0. 5-im提取的DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的模板;取 2卜42W試劑C與4-8W試劑D混合;在熱循環(huán)儀上對(duì)提取的DNA模板 進(jìn)行擴(kuò)增，通過94'C-98'C解鏈2-5分鐘；然后用93-95'C變性30秒-1分 鐘,58-62'C復(fù)性30秒-1分鐘，72'C延伸30秒-1.5分鐘,如此循環(huán)30-35次， 最后在72'C保溫8-10分鐘,將霍亂弧菌的特異片斷增加到108mol以上；
(d) 電泳和顯色檢測(cè):取5-10Ml擴(kuò)增后的樣品，與2-6WV/V為0. 25%的溴 酚藍(lán)混合,W/V為0. 8-1. 2%的瓊脂糖電泳和顯色,在紫外光下檢測(cè)是否 有一條300核苷酸對(duì)的條帶,如果有一條300核苷酸對(duì)的條帶,說明樣品 有霍亂弧菌感染或污染,反之則沒有。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
基于核酸的檢測(cè)技術(shù),包括DNA探針和PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技 術(shù))，相對(duì)其它的弧菌病原檢測(cè)技術(shù)和其它的病原檢測(cè)技術(shù)而言,本方法有 )L個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn):首先，該方法檢測(cè)十分快速，3-4小時(shí)即可得知檢測(cè)結(jié)果, 而其它方法則至少需要3天或一個(gè)星期以上;其次，該方法檢測(cè)靈敏度極 高,檢測(cè)下限低至IO個(gè)左右的細(xì)菌，其它方法必須要有一定時(shí)間的純培養(yǎng) 增殖達(dá)到105后才能進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明可用于人類烈性傳染病霍亂的臨床 檢測(cè)，也可用于檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的受霍亂弧菌感染的情 況，也還可以監(jiān)測(cè)各種環(huán)境中的病原霍亂弧菌，還可以檢測(cè)各種水產(chǎn)品或 醫(yī)用器具是否受霍亂弧菌污染。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)例是進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的說明，不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1:
按以下配方制作快速檢測(cè)霍亂弧菌的試劑盒
試劑A:O, 1M NaCl， lOmM Tris. CI (pH8. 0〉， ImM EDTA(pH8. 0)， 5%Tritou X-100 ;
試劑B: 10mg/見l溶菌酶，lOmM Tris. CI (pH8. 0);
試劑C: 5. 0P1 10 x PCR Buffer, 0. 5plTaqE (濃度5U/W), 35. 5 ;
試劑D:4. 0WdNTP(2. 5mM each), 3. 0WMgCl2 (25mM)， 10pM VcF, 10pM VcR;
試劑E: 50x TAE ;
試劑F:瓊脂糖(1%)+溴化乙錠(0.5化/ml)。
按照以下程序進(jìn)行操作
1.樣品處理和DMA的提取:取蝦組織約0.1-0.5克，在樣品中加入 400m試劑A，滅菌牙簽搗碎，12000g離心2分鐘，棄上清，用350H1試劑A 和50H1試劑B重新懸浮沉淀,混勻。室溫放置5分純100'C水浴5分鐘， 冷卻至室溫。12000g離心10分鐘，取上清,加入800W無水乙醇,室溫放 置5分鐘,徹底去上清,75W乙醇洗滌一次,讓乙醇揮發(fā),將沉淀溶于 滅菌雙蒸水，即為DNA提取液。
2. 霍亂弧菌的特異片斷擴(kuò)增
在一管試劑C中加入1I4DNA提取瓶再加入試劑D， lOOOOg離心 :30秒,在PCR熱循環(huán)反應(yīng)儀上進(jìn)行如下反應(yīng)
94'C加熱變性4分鐘；然后在95'C解鏈1分鐘,58*0復(fù)性45秒,72'C延 伸30秒，共循環(huán)35次；在72'C保溫8分鐘后停止反應(yīng)u
3. 電泳和顯色檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，取5-10W反應(yīng)液，與4H1 V/V為 0. 2596溴酚藍(lán)混合,用W/V為1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下檢測(cè)，如果有--條300核苷酸對(duì)的條帶，說明樣品有霍亂弧菌感染或污染；反之則沒有。
實(shí)施例2:
按以下配方制作快速檢測(cè)霍亂弧菌的試劑盒
試劑A: 0. 3M NaCl， 10mM Tris. Cl (pH8. 0), lraM EDTA (pH8. 0) ， 5%Triton X-100:試劑B: 5mg/ml溶菌酶，10mM Tris, Cl (pH8. 0);
試劑C: 2. 10 xPCR Buffer, 0.25WTaqE (濃度5U/Hl), 35. 5WddH2O; 試劑D: 2. 0ixldNTP(2. 5mM each), 1. 5mMgCl2 (25mM)，
10pM VcF， 10pM VcR; 試劑E: 50 x TAE;
試劑F:瓊脂糖(1.2%)+溴化乙錠(0.8Pg/ml)。
按照以下程序進(jìn)行操作
1.樣品處理和DNA的提取:取魚組織約0.1-0.5克，在樣品中加入 試劑A,滅菌牙簽搗碎，12000g離心2分鐘，棄上清,用150JU試劑A 和試劑B重新懸浮沉淀,混勻。室溫放置5分鐘，100℃水浴5分鐘， 冷卻至室溫。12000g離心10分鐘，取上清,加入400W無水乙醇，室溫放 置5分鐘,徹底去上清,75%乙醇洗滌一次,讓乙醇揮發(fā)，將沉淀溶于 滅菌雙蒸水，即為DNA提取液。
2. 霍亂弧菌的特異片斷擴(kuò)增
在一管試劑C中加入1WDNA提取瓶再加入試劑D， 10000g離心 30秒，在PCR熱循環(huán)反應(yīng)儀上進(jìn)行如下反應(yīng)
94℃加熱變性3分鐘；然后在95"C解鏈45秒，58℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒,共循環(huán)30次；在72℃保溫8分鐘后停止反應(yīng)。
3. 電泳和顯色檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，取5-反應(yīng)液，與V/V為 0. 25%溴酚藍(lán)混合,用W/V為1. 2W瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下檢測(cè)，如果有 一條300核苷酸對(duì)的條帶,說明樣品有霍亂弧菌感染或污染；反之則沒 有。
權(quán)利要求
1.一種人類重大病原菌-霍亂弧菌的快速檢測(cè)試劑盒，由如下試劑組成(a)DNA提取試劑含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B，試劑A含有NaCl 0.1-0.3M、pH8.0的三羥基甲基氨基甲烷1-100mM、pH8.0的乙二胺四乙酸0.1-10mM和V/V濃度為0-20％的曲拉通X-100；試劑B含有濃度為1-10mg/ml的溶菌酶和pH8.0、濃度為1-100mM的三羥基甲基氨基甲烷；(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑含有反應(yīng)預(yù)混試劑C和反應(yīng)引物試劑D，試劑C含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、熱聚合酶和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5-5.0μl、0.5-2.5個(gè)單位和18-35.5μl；試劑D含有特異引物對(duì)VcF和VcR、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)及MgCl2，含量分別為0.2-1μM和0.2-1μM、20-200μM及0.5-10mM；(c)電泳和顯色試劑，含試劑E和試劑F，試劑E為50倍電泳緩沖液，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑F含W/V為0.8-2％的瓊脂糖和0.5-20μg/ml溴化乙錠；所述VcF特指5′-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG；所述VcR特指5′-AGTCACTTAACCATACAACCCG。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種人類重大病原菌一霍亂弧菌的快速檢測(cè) 試劑盒，其特征是每管反應(yīng)試劑的配方為5. 0H110倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩 沖液，2. 5單位熱聚合酶,35. 514滅菌雙蒸水4. 5 mMdNTP， 3. 0|il 25mM MgC.2， 10pM VcF, 10pM VcR。
3. —種使用權(quán)利要求1中所述的試劑盒快速檢測(cè)霍亂弧菌的方法，依次按 下列步驟U)按照下列配方配制試劑 試劑A:含有NaCl 0. 1-0. 3M、 pH8. 0的三羥基甲基氨基甲烷1-lOOrnM、pH8. 0的乙二胺四乙酸0. l-10mM和V/V濃度為0-20%的曲拉通X-100; 試劑B'.含有濃度為1-10mg/ml的溶菌酶和pH8. 0、濃度為1-lOOmM的 三羥基甲基氨基甲烷；試劑C:含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、熱聚合酶和滅菌雙蒸水,含 量分別為2. 5-5. 0W、 0. 5-2. 5個(gè)單位和18-35. ; 試劑D:含有特異引物對(duì)VcF5'-TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG和VcR 5'-AGTCACTTAACCATACAACCCG、 dNTP (四種脫氧核苷酸的混合物) 及MgCl2，含量分別為0. 2-1 MM和0. 2-1 MM 、 20-200HM及0. 5-lOmM; 試劑E:為50倍電泳緩沖液，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0. 04M和0. 001M; 試劑F:含W/V為0. 8-2%的瓊脂糖和0. 5-20^g/ml溴化乙錠； (2)按照下列步驟依次進(jìn)行檢測(cè)(a) 樣品處理:取0. 1-0. 5克樣品，用100-40(^1試劑A懸浮樣品，并將樣 品充分混勻；10000-12000g離心2-5分鐘，棄上清；(b) DNA提取用100-300W試劑A再次懸浮沉淀，并加入20-100^1試劑B 混勻，室溫放置2分鐘以上,再在沸水浴中保溫1-10分鐘,使細(xì)胞完全破 裂,釋放出DNA; 10000-12000g離心8-10分鐘,取上清并加入上清體積2' 倍即240-800m的無水乙醇沉淀DNA;室溫放置5-10分鐘， 10000-12000g離心3-8分鐘,去上清,75%乙醇洗滌一次，讓乙醉徹底揮 發(fā)，將沉淀溶于10-滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液；(.c)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增以O(shè). 5-1H1提取的DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增 的模板;取21-42KI試劑C與4-8W試劑D混合;在熱循環(huán)儀上對(duì)提取的 DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,通過94t)-98t'解鏈2-5分鐘；然后用93-95'C變性 30秒-1分鐘，58^62t復(fù)性30秒-1分純72'C延伸30秒-1.5分鐘,如此循 環(huán)30-35次,最后在72'C保溫8-10分鐘,將霍亂弧菌的特異片斷增加到 108mol以上；(d)電泳和顯色檢測(cè):取5-10W擴(kuò)增后的樣品，與2-6WV/V為0. 25%的漠 酚藍(lán)混合，W/V為0. 8-1. 2%的瓊脂糖電泳和顯色,在紫外光下檢測(cè)是否 有一條300核苷酸對(duì)的條帶,如果有一條300核苷酸對(duì)的條帶,說明樣品 有霍亂弧菌感染或污染,反之則沒有。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人類重大病原菌—霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒及檢測(cè)方法是以霍亂弧菌16S-23SrRNA間區(qū)基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為主體而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對(duì)人類的病原菌—霍亂弧菌的特異性DNA片斷進(jìn)行定性檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高；可用于人類烈性腸道傳染病霍亂的臨床檢測(cè)，也用于水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌跟蹤檢測(cè)，還可以用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101200757SQ20061012427
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者周銀環(huán), 孫成波 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)