專利名稱：γ－聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ－聚谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的微生物菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
1937年Ivanovics等人首先發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的夾膜含有γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，1942年Bovarnick等人發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌屬細(xì)菌能通過發(fā)酵培養(yǎng)積累γ-PGA。1973年Troy發(fā)現(xiàn)γ-聚谷氨酸(以下簡稱γ-PGA)是Bacillus anthracis細(xì)胞夾膜的一種化學(xué)組分，它是一種水溶性的酰胺化合物，可以通過芽孢桿菌的變種來生產(chǎn)。它的結(jié)構(gòu)與眾不同，它是由單個谷氨酸分子在γ-羥基和α-氨基形成的酰胺鍵而連接成的多聚體，其結(jié)構(gòu)式如下 γ-PGA是從左旋-谷氨酸(有的菌種可不必加L-谷氨酸)經(jīng)發(fā)酵而制成，為一種全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子產(chǎn)品。γ-PGA分子量范圍從10,000～2,000,000，可以制成不同的分子量應(yīng)用于各種不同領(lǐng)域。比如1、γ-PGA具食品安全性，可作為膳食纖維、保健食品、食品增稠劑、安定劑或作為化妝品用的保濕劑；2、γ-PGA可作成水凝膠，具有極高吸水能力，可吸水達(dá)3,500倍，極適合于農(nóng)業(yè)土壤和環(huán)保產(chǎn)品之應(yīng)用；3、γ-PGA可以轉(zhuǎn)化成各種不同的金屬鹽類，具不同pH值，并有特殊多陰離子表面特性，適用于組織培養(yǎng)和許多其它食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用等。
γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢桿菌屬細(xì)菌的B.anthracis和B.licheniformisATCC 9945a、B.licheniformis ATCC 9945(以前叫B.subtilis ATCC9945)等菌株上，這類菌種培養(yǎng)和發(fā)酵時需要L-谷氨酸作營養(yǎng)原料才能積累γ-PGA，在添加大量的谷氨酸時，γ-PGA的生成量一般在20g·L-1左右。但L-谷氨酸做原料存在材料價格昂貴等不利因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種不需要谷氨酸作原料的γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ-聚谷氨酸的方法。
本發(fā)明所提供的微生物菌株是經(jīng)選育的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)產(chǎn)生菌--枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)PGA-7，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCCM 206102。該菌株以下簡稱Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102。
Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102菌株在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)有多樣性，在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂20g，自來水1L，調(diào)pH值至7.0～7.2.)平板上，當(dāng)培養(yǎng)基潮濕時，菌落濕潤、圓形、不透明，菌苔邊緣整齊，表面光滑；干燥時，菌落粗糙皺褶，中央凹陷，邊緣不規(guī)則；當(dāng)培養(yǎng)基中添加少量谷氨酸時，菌落擴展明顯，經(jīng)3天培養(yǎng)，菌落直徑達(dá)15-25mm，表面呈“木耳狀”。其生理生化特征見下表。

注+陽性，-陰性Bacillus substilis PGA-7CCTCC M 206102菌株的遺傳學(xué)特征采用16S rRNA測序進行分類學(xué)分子鑒定。菌種基因組DNA提取采用丙酮破壞細(xì)菌細(xì)胞壁膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，裂解液破除細(xì)菌細(xì)胞膜，釋放胞內(nèi)核酸，經(jīng)酚/氯仿/異戊醇去除蛋白質(zhì)及多糖，無水乙醇沉淀DNA，TE緩沖液溶解DNA。采用兩種合成的通用引物PCR擴增細(xì)菌的16S rDNA，引物如下27F5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1541R5′-AAG GAA GTG ATG CAG CCG CA-3′。PCR擴增產(chǎn)物純化后直接進行序列測定，將得到的序列送GenBank做Blast比較(測序序列的GenBank accession number為DQ415893.2)，根據(jù)GenBank中提供的基因系列，依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建進化樹進行分析，其中同源性最高菌株的是B.subtilis MA139等，同源性為99％且相似性最高，結(jié)合形態(tài)、生理生化特征以及16S rRNA系列分析的系統(tǒng)進化結(jié)果，該菌株鑒定為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌種。
用本發(fā)明所提供的Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株，在不需要添加L-谷氨酸發(fā)酵原料的搖瓶中發(fā)酵可以產(chǎn)生γ-聚谷氨酸，從而可以用其作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。
本發(fā)明所提供的用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，其特點是用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進行搖瓶發(fā)酵。所說的糖質(zhì)原料可為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等，在發(fā)酵原料中不需要添加L-谷氨酸。搖瓶發(fā)酵60-96小時，可產(chǎn)γ-PGA 10～18g/l。
利用Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的具體工藝過程如下(1)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏斜面種(Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M 206102)劃線于新配制的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，瓊脂15～22g，自來水1L，調(diào)pH值至6.8～7.4.。33-38℃培養(yǎng)12～24小時，再冷藏于4℃1～5天。
(2)菌種的液體活化將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，接種于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基組成如下蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，自來水1L，調(diào)pH值至6.8～7.4.。液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于32-36℃往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18～36小時，搖床轉(zhuǎn)速為80-110r/m，沖程為65-75mm。
(3)搖瓶發(fā)酵按5％接種量，取1ml培養(yǎng)好的液體活化種，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成見下面的解釋)用500ml三角瓶裝，裝量20ml，于32-48℃，沖程65-80mm，轉(zhuǎn)速90-130r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)60-96小時，停止發(fā)酵。
(4)發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液經(jīng)提取工藝即得含γ-聚谷氨酸的制品。
提取含γ-聚谷氨酸的制品的工藝為常規(guī)工藝，一般包括對發(fā)酵液離心去除菌體，取其上清液用乙醇沉淀提取等步驟。
在步驟(3)中，適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基成份如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/l計算)60-120g糖質(zhì)原料、14-20g氮源、1.0-2.0g K2HPO4、0.05-0.15g MgSO4·7H2O、0.01-0.08g FeCl3·6H2O、0.1-0.2g CaCl2·2H2O、0.05-0.104g MnSO4·H2O，培養(yǎng)基于滅菌前調(diào)pH值至6.5-7.0，可用NaOH及HCl調(diào)節(jié)。其中，所述的糖質(zhì)原料可以是葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等；氮源可以是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等。
發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液可通過以下方法分析測試發(fā)酵醪液中的γ-PGA含量對發(fā)酵液離心去除菌體，取上清液測谷氨酸單體的含量；將上清液與6mol/L的鹽酸按1∶1(體積比)加入玻璃水解管中，真空封口后于110℃水解24h，然后測定水解液中谷氨酸總量；2次測得的谷氨酸之差為γ-PGA的含量。
上述對谷氨酸的分析方法可以采用氨基酸自動分析儀，或高效液相色譜儀(HPLC)，或紙層析方法進行測定。紙層析方法如下取10μl離心發(fā)酵上清液或它的水解液點樣，層析過夜，用0.5％茚三酮丙酮溶液顯色，65℃顯色10min，剪下斑點用lg/L硫酸銅洗脫液(CuSO4·5H2O∶75％乙醇＝2∶38)5mL浸泡20min以上至紙條無色，Λmax＝570nm測其OD值，與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線比較算出相應(yīng)含量，再計算發(fā)酵醪液含γ-PGA量。
本發(fā)明中最大的特點在于用一株不需要谷氨酸作原料的枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA，比以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物發(fā)酵其原料成本有較大的降低；本發(fā)明在最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件下，產(chǎn)γ-PGA最高可達(dá)18g/l。
利用谷氨酸作為發(fā)酵底物的研究，國內(nèi)外相關(guān)研究比較豐富，其產(chǎn)率相對比非谷氨酸依賴型發(fā)酵較高，但從生產(chǎn)原料角度考慮，不需谷氨酸作為發(fā)酵底物的菌株具有成本上優(yōu)勢，更具有工業(yè)化應(yīng)用前景，因此本發(fā)明可望為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA提供另一種可行方法。
具體實施例方式
下面的實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對本發(fā)明沒有限制。
下面的實施例中用到的斜面種采用如下方法培養(yǎng)Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M206102劃線于新配制的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂20g，自來水1L，調(diào)pH值至7.2.。337℃培養(yǎng)17小時，再冷藏于4℃冰箱備用。
實施例一取4℃冰箱內(nèi)保藏1天的斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/L)蛋白胨10，NaCl 10，酵母膏5，瓊脂20，pH7.0。]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下80g果糖、18gNH4Cl、1.5g K2HPO4、0.05gMgSO4·7H2O、0.01g FeCl3·6H2O、0.15g CaCl2·2H2O、0.05g MnSO4·H2O，并以NaOH及HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值(滅菌前)為6.5，120℃滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉(zhuǎn)速130r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)96小時后，搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液采用20,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，用紙層析法測定γ-PGA含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA可達(dá)到18g/L。
實施例二取4℃冰箱內(nèi)保藏2天的斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/L)蛋白胨8，NaCl 11，酵母膏6，瓊脂20，pH7.0。]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下90g蔗糖、20g(NH4)2SO4、1.0g K2HPO4、0.06g MgSO4·7H2O、0.01g FeCl3·6H2O、0.15g CaCl2·2H2O、0.05g MnSO4·H2O，并以NaOH及HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值(滅菌前)為6.5，120℃滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉(zhuǎn)速120r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)90小時后，搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液采用20,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，用紙層析法測定γ-PGA含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA可達(dá)到16.2g/L。
實施例三取4℃冰箱內(nèi)保藏3天的斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/L)蛋白胨12，NaCl 9，酵母膏4，瓊脂20，pH7.0。]，用接種針將上述斜面上約1cm2面積的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到新配置的發(fā)酵培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下60g葡萄糖、20g NH4NO3、1.0g K2HPO4、0.01gMgSO4·7H2O、0.05g FeCl3·6H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.104g MnSO4·H2O，并以NaOH及HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值(滅菌前)為7.0，120℃滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于65mm沖程、轉(zhuǎn)速90r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)60小時后，搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液采用20,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，用紙層析法測定γ-PGA含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA可達(dá)到12.6g/L。
權(quán)利要求
1.一種γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌，其特征在于該菌株是經(jīng)選育的枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)PGA-7 CCTCC M206102。
2.一種γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于用枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)PGA-7CCTCC M206102做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進行搖瓶發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的糖質(zhì)原料為葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于所說的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的工藝過程為(1)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏斜面種(Bacillus substilis PGA-7 CCTCC M206102)劃線于新配制的LB斜面上，LB斜面組成如下蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，瓊脂15～22g，自來水1L，調(diào)pH值至6.8～7.4，33-38℃培養(yǎng)12～24小時，再冷藏于4℃ 1～5天；(2)菌種的液體活化將上述斜面上1cm2面積的菌種刮下，接種于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基組成如下蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl 9～11g，自來水1L，調(diào)pH值至6.8～7.4，液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于32-36℃往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)18～36小時，搖床轉(zhuǎn)速為80-110r/m，沖程為65-75mm；(3)搖瓶發(fā)酵按5％接種量，取1ml培養(yǎng)好的液體活化種，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基用500ml三角瓶裝，裝量20ml，于32-48℃，沖程65-80mm，轉(zhuǎn)速90-130r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)60-96小時，停止發(fā)酵；(4)發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液經(jīng)提取工藝即得含γ-聚谷氨酸的制品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征是在步驟(3)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成份按每升培養(yǎng)基所含克重計算為60-120g糖質(zhì)原料、14-20g氮源、1.0-2.0gK2HPO4、0.05-0.15g MgSO4·7H2O、0.01-0.08g FeCl3·6H2O、0.1-0.2g CaCl2·2H2O、0.05-0.104gMnSO4·H2O，滅菌前調(diào)pH值至6.5-7.0。
全文摘要
本發(fā)明提供一種γ－聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ－聚谷氨酸的方法，所提供的微生物菌株是經(jīng)選育的γ－聚谷氨酸(γ－PGA)產(chǎn)生菌——枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)PGA－7 CCTCC M 206102。其生產(chǎn)γ－聚谷氨酸的方法，是用Bacillus substilis CCTCC M 206102做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵原料中不需要添加L－谷氨酸，這比以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物發(fā)酵，其原料成本有較大的降低；本發(fā)明在最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件下，產(chǎn)γ－PGA最高可達(dá)18g/l，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號C12P13/14GK1932007SQ200610122640
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月9日
發(fā)明者施慶珊, 李誠斌, 歐陽友生, 陳儀本, 疏秀林, 謝小保, 黃小茉 申請人:廣東省微生物研究所