專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)hiv病毒的核苷酸序列、方法及體外診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列、方法及體外診斷試劑盒，屬于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
HIV病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類(lèi)免疫缺陷病毒組。迄今為止，根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測(cè)定，全球流行的HIV可分為2型HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型內(nèi)，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進(jìn)一步分為三個(gè)組M組(主要組)、O組(外圍組)和N組(新組或非M非O組)，M組內(nèi)又可分為A-J10個(gè)亞型。在HIV-1型和HIV-2型之間，其核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反應(yīng)。早期對(duì)HIV的診斷主要是通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測(cè)中，HIV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法取得了很大的進(jìn)展，核酸檢測(cè)已經(jīng)成為了HIV實(shí)驗(yàn)室診斷的發(fā)展方向。
目前，國(guó)際公認(rèn)檢測(cè)試劑有羅氏公司生產(chǎn)的Amplicor HIV-1 Monitor Test。這種試劑采用RT-PCR-ELISA原理進(jìn)行檢測(cè)，僅使用對(duì)應(yīng)HIV gag gene的一對(duì)引物及探針，不能保證與各亞型的特異結(jié)合及引物或探針結(jié)合區(qū)域可能的突變引起的結(jié)合的變化，有文獻(xiàn)報(bào)道證明，該試劑盒存在漏檢或定量低估的現(xiàn)象。此外，該試劑盒價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本約50-80美元/人份，限制了其在國(guó)內(nèi)的普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問(wèn)題是提供一組可用于檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列。
本發(fā)明要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)成本低的檢測(cè)HIV病毒的方法。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性強(qiáng)、成本低的含有雙引物、雙探針的檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一組可用于檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的序列。
引物1正向5’-ACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3’SEQ ID No.1引物1反向5’-CTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’SEQ ID No.2探針15’-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGG-3’ SEQ ID No.3引物2正向5’-GCTTTCAGCCCAGAAGTAATACC-3’ SEQ ID No.4引物2反向5’-ATTTGCATAGCTGCTTGATGTCC-3’ SEQ ID No.5探針25’-TCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACA-3’SEQ ID No.6探針35’-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAC-3’SEQ ID No.7其中，探針1和探針2序列的5’端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端分別標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA；探針3的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
通過(guò)對(duì)所有已知的HIV-1序列進(jìn)行生物信息學(xué)方法的比對(duì)，獲得HIV-1序列中保守的核酸序列區(qū)域，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般原則(如考慮引物探針的長(zhǎng)度、融解溫度、GC含量、重復(fù)堿基數(shù)、末端堿基等)采用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)多對(duì)引物探針。將每一對(duì)引物探針與HIV-1序列進(jìn)行比對(duì)，最終采用匹配程度好的引物探針。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選我們最終使用SEQ IDNo.1至SEQ ID No.6所示的堿基序列作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的雙引物和雙探針。
一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)HIV病毒的方法，使用SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列作為雙引物和雙探針進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。該方法還包括使用病毒樣顆粒和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列作為內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物的檢測(cè)探針，將病毒樣顆粒加入到樣本中參與樣本提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)全過(guò)程的質(zhì)量控制。
我們采用TaqMan方法，在兩端分標(biāo)記熒光與淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針結(jié)合到PCR產(chǎn)物上后，其標(biāo)記基團(tuán)被具有5′-3′外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，與淬滅基團(tuán)分離從而產(chǎn)生熒光，通過(guò)對(duì)熒光的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量。該方法提高了檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度與特異性，并且易于操作。
一種含有雙引物、雙探針的檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒，由以下試劑組成1.RNA提取試劑選自Trizol或磁珠法提取試劑中的一種，均含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒(1)Trizol含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
(2)磁珠法提取試劑包含裂解液等多種試劑，在其裂解液中含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
2.反應(yīng)液由50mM Tris(使用濃度20mM)、125mM KCl(使用濃度50mM)、10mMMgCl2(使用濃度4mM)、500ug/ml BSA(使用濃度200ug/ml)、0.375mM Sorbitol(山梨醇，使用濃度0.15mM)、0.025mM Triton(使用濃度0.01mM)、RNase抑制劑Rnasin2.5-5U/ul(使用量為5-10U/人份)，和750μM dNTP(使用濃度300μM)組成，-20℃保存。
3.酶混合物200U/ul MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(使用量為100-200U/人份)和2.5-5U/ulHotstartTaq DNA聚合酶(使用量為2-5U/人份)，-20℃保存。
酶混合物還可以為200U/ul Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶(使用量為50-100U/人份)和2.5-5U/ul Taq Plantium DNA聚合酶(使用量為2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探針混合物包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用濃度為200nM)、引物探針(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)6μM(使用濃度為200nM)和內(nèi)標(biāo)探針(SEQ ID No.7，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)3μM(使用濃度為100nM)，-20℃保存。
需要特別說(shuō)明的是，該試劑盒的核心成分為引物、探針及內(nèi)標(biāo)質(zhì)控病毒樣顆粒，其余試劑可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣選擇使用，例如作為提取RNA的試劑，可以選擇“Trizol”或“磁珠法提取試劑”；作為擴(kuò)增反應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以選擇“MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶”或“Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶”；DNA聚合酶也可以選擇“Hotstart Taq DNA聚合酶”或“Taq Plantium DNA聚合酶”。但是，當(dāng)選用“MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶”時(shí)，應(yīng)配合使用“HotstartTaq DNA聚合酶”，而選擇“Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶”時(shí)，應(yīng)配合使用“Taq PlantiumDNA聚合酶”。
在本發(fā)明中，為了達(dá)到更優(yōu)異的檢測(cè)效果，在使用Taqman方法作定量PCR時(shí)，我們還使用具有獨(dú)創(chuàng)性的內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)——病毒樣顆粒內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)進(jìn)行假陰性控制，以校正PCR效率而獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。在MS2噬菌體包膜蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)包膜蛋白與噬菌體復(fù)制酶5’端由19個(gè)堿基(19mer)組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時(shí)，將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。國(guó)外研究人員發(fā)現(xiàn)在包裝位點(diǎn)后引入非噬菌體基因序列也可以引發(fā)包裝。根據(jù)這個(gè)原理，通過(guò)重疊PCR的方法構(gòu)建內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒的重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒中只是用內(nèi)標(biāo)探針序列替換了原始序列中的檢測(cè)探針序列)?；举|(zhì)粒為pET28b(Novagen公司)，在多克隆位點(diǎn)NcoI和BamHI位點(diǎn)插入MS2噬菌體基因組81位-1769位的核酸序列(SEQID No.8)，然后在多克隆位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)插入HIV-1病毒GAG基因的335bp片段SEQ ID No.9)。
MS2噬菌體基因組81位-1769位的核酸序列(SEQ ID No.8)ATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTACCCTTGATAGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCTCTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGTGGGTCATCGTGGGGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCCCTGTAAGCCAAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAGGGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCACAACTCGCGACGCAAACCATTGCGCTCGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAAAGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGATATCCAGGGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAACATCAAGTTAGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGATATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTATCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGGGAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGTAACATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAATCTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCTCTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAHIV-1病毒GAG基因的335bp片段(SEQ ID No.9)TCTCCAAGGGCAAATGGTACATCAGCCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTGGTAGAAGAGAAGGCTTTTAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGGCCCCCTCAAAGCCGACAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGCTAAAAGATTCAGGCCCCCTCAAAGCCGACATAGGCTACA
TCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAAATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTAACCTGCAGGAACAAATAGCATGGATGACGGGTAACC用本領(lǐng)域常規(guī)方法將測(cè)序結(jié)果證明正確的大腸桿菌克隆進(jìn)行大量表達(dá)。參考文獻(xiàn)見(jiàn)含人甲胎蛋白mRNA部分序列的耐核糖核酸酶病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(dá)，中華肝臟病雜志，2005年04期。接種內(nèi)標(biāo)質(zhì)?？寺∨囵B(yǎng)過(guò)夜，1∶100轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。培養(yǎng)20小時(shí)后離心菌體，超聲破菌，離心收集上清，DNASE/RNASE 37℃消化2小時(shí)，電泳。將收集的上清加入0.6G/ML氯化銫，進(jìn)行超速離心純化病毒樣顆粒，45000RPM×20小時(shí)。按照每管400UL進(jìn)行取樣分離，取小樣電泳，合并有病毒樣顆粒的管進(jìn)行超聲處理液進(jìn)行透析。再進(jìn)行一次超離純化。將透析液中加入0.6G/ML氯化銫，56300RPM×20小時(shí)。再按照每管400UL進(jìn)行取樣分離，取小樣電泳，合并有病毒樣顆粒的管進(jìn)行超聲處理，處理液進(jìn)行透析即得到了純化的病毒樣顆粒。將純化后的病毒樣顆粒進(jìn)行定量，保存在20mM Tris(美國(guó)Sigma公司)pH 8.8；50mM KCl(美國(guó)Sigma公司)；4mM MgCl2(美國(guó)Sigma公司)溶液中，濃度為5*1012拷貝/ml)，使用濃度為1000拷貝/ml。
我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的對(duì)病毒樣顆粒內(nèi)的核酸序列進(jìn)行修飾，改變HIV-1檢測(cè)序列中探針結(jié)合位點(diǎn)的序列，從而將內(nèi)標(biāo)質(zhì)控的序列與目的片段區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而構(gòu)建相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物。病毒樣顆粒具有以下特點(diǎn)(1)在正常人陰性血清中45℃，放置3天都能保持穩(wěn)定，符合生物材料運(yùn)送的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)；(2)病毒樣顆粒能夠?qū)NASEA和DNASEI有很好的耐受性；(3)無(wú)傳染性。
為確定最佳內(nèi)標(biāo)摻入量，我們將未知濃度的病毒樣顆粒進(jìn)行做10倍系列稀釋后(106-13稀釋)采用VIC標(biāo)記的探針(SEQ ID No.7)進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品為采用分光光度計(jì)定量的內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA，做實(shí)時(shí)PCR。以7500 Real Time PCR System(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件50℃ 30分鐘94℃，3分鐘；95℃，10秒60℃，45秒(50cycles)，測(cè)得病毒樣顆粒濃度為5*1012拷貝/ml。再以三份不同濃度的樣品(HIV 4000IU/ml、HIV 40000IU/ml和HIV 2000000IU/ml)與不同稀釋度的內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒(103、104、105、106和107)進(jìn)行棋盤(pán)法PCR，然后以科華公司的磁珠法提取試劑(上?？迫A生物工程股份有限公司的HBV-HCV-HIV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(KHB PCR HBV-HCV-HIV-02(科研用))中的磁珠法提取試劑)提取核酸，進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示1000拷貝/ml的病毒樣顆粒作為內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物加入到樣本中是最佳的。
核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)在于引物探針和目標(biāo)序列的匹配。由于HIV-1的核酸序列變異度較大，采用一對(duì)引物探針不能覆蓋所有的亞型，必然會(huì)造成漏檢。我們發(fā)明的雙特異探針檢測(cè)試劑盒采用了兩對(duì)引物探針從而最大可能的避免了漏檢。與單探針檢測(cè)試劑盒相比，我們發(fā)明的雙探針檢測(cè)試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高，假陰性率低，檢測(cè)特異性好的特點(diǎn)。雙探針檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)下限大約在125IU/ml，可以檢測(cè)出M族的A-H亞型和O族，在檢測(cè)中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的國(guó)內(nèi)流行株A，B，C，D，F(xiàn)，G，CRF01-AE，CRF07-BC，CRF08-BC的分型血清時(shí)，所有國(guó)內(nèi)流行株均能檢出。在檢測(cè)HIV-1陰性樣本和其他病毒樣本時(shí)具有100％的特異性，沒(méi)有非特異的擴(kuò)增。在進(jìn)行60份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與單探針檢測(cè)試劑盒相比，我們發(fā)明的雙探針檢測(cè)試劑盒具有更好的檢測(cè)率(60份中檢出50份陽(yáng)性，剩余的10份陰性結(jié)果采用公認(rèn)的AmplicorHIV-1 Monitor v1.5 test檢測(cè)證明為陰性)。
本發(fā)明的有益效果是我們發(fā)明的一組新的HIV檢測(cè)序列和試劑盒可以檢測(cè)出M族的A-H亞型和O族，比目前市售商品試劑盒檢測(cè)范圍廣；方法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，對(duì)操作人員要求不高；檢測(cè)下限低至125IU/ml；采用雙探針雙引物體系對(duì)各種HIV-1亞型都能良好準(zhǔn)確的定量，保證了對(duì)各種型別的亞型都能結(jié)合到及能適應(yīng)結(jié)合部位可能的突變變化，從而準(zhǔn)確定量；成本低廉，相對(duì)于進(jìn)口試劑盒50-80美元/人份的成本，我們發(fā)明的試劑盒成本僅為10-20元人民幣/人份。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)-步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為本發(fā)明檢測(cè)下限結(jié)果圖A為采用探針1和引物對(duì)1體系時(shí)的檢測(cè)下限結(jié)果，B為采用探針2和引物對(duì)2體系時(shí)的檢測(cè)下限結(jié)果。
圖2為特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.檢測(cè)HIV病毒的引物和探針序列委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成引物1正向5’-ACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3’ SEQ ID No.1
引物1反向5’-CTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’SEQ ID No.2探針15’-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGG-3’ SEQ ID No.3引物2正向5’-GCTTTCAGCCCAGAAGTAATACC-3’ SEQ ID No.4引物2反向5’-ATTTGCATAGCTGCTTGATGTCC-3’ SEQ ID No.5探針25’-TCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACA-3’SEQ ID No.6探針35’-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAC-3’SEQ ID No.7其中，探針1和探針2序列的5’端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端分別標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA；探針3的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
實(shí)施例2.檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒1一.組成1.RNA提取試劑選自Trizol或磁珠法提取試劑中的一種，均含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒(1)Trizol購(gòu)于Invitrogen公司，含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
(2)磁珠法提取試劑包含裂解液等多種試劑，購(gòu)于上?？迫A生物工程股份有限公司；在其裂解液中含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
2.反應(yīng)液由50mM Tris(使用濃度20mM)、125mM KCl(使用濃度50mM)、10mMMgCl2(使用濃度4mM)、500ug/ml BSA(使用濃度200ug/ml)、0.375mM Sorbitol(使用濃度0.15mM)、0.025mM Triton(使用濃度0.01mM)、RNase抑制劑Rnasin 2.5-5U/ul(購(gòu)于美國(guó)Promega公司，使用量為5-10U/人份)，和750μM dNTP(使用濃度300μM)組成，-20℃保存。
3.酶混合物200U/ul MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)于美國(guó)Promega公司，使用量為100-200U/人份)和2.5-5U/ul HotstartTaq DNA聚合酶(購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，使用量為2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探針混合物包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用濃度為200nM)、引物探針(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)6μM(使用濃度為200nM)和內(nèi)標(biāo)探針(SEQ ID No.7，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)3μM(使用濃度為100nM)，均委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，-20℃保存。
病毒樣顆粒RNA的制備方法簡(jiǎn)述如下基本質(zhì)粒為pET28b(Novagen公司)，在多克隆位點(diǎn)NcoI和BamHI位點(diǎn)插入MS2噬菌體基因組81位-1769位的核酸序列(SEQ IDNo.8)，然后在多克隆位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)插入HIV-1病毒GAG基因的335bp片段(SEQ ID No.9)。用本領(lǐng)域常規(guī)方法將測(cè)序結(jié)果證明正確的大腸桿菌克隆進(jìn)行大量表達(dá)。接種內(nèi)標(biāo)質(zhì)?？寺∨囵B(yǎng)過(guò)夜，1∶100轉(zhuǎn)接后繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。培養(yǎng)20小時(shí)后離心菌體，超聲破菌，離心收集上清，DNase/RNase 37℃消化2小時(shí)，電泳。將收集的上清加入0.6g/ml氯化銫，進(jìn)行超速離心純化病毒樣顆粒，45000rpm×20小時(shí)。按照每管400ul進(jìn)行取樣分離，取小樣電泳，合并有病毒樣顆粒的管進(jìn)行超聲處理液進(jìn)行透析。再進(jìn)行一次超離純化。將透析液中加入0.6g/ml氯化銫，56300rpm×20小時(shí)。再按照每管400ul進(jìn)行取樣分離，取小樣電泳，合并有病毒樣顆粒的管進(jìn)行超聲處理，處理液進(jìn)行透析即得到了純化的病毒樣顆粒。將純化后的病毒樣顆粒進(jìn)行定量。
二.使用方法在30ul反應(yīng)體系中，加入反應(yīng)液12ul，酶混合物2ul，引物探針混合物1ul，提取的RNA樣本15ul(采用Trizol法或磁珠法提取得到，見(jiàn)實(shí)施例4)。
試劑盒1的反應(yīng)條件為以7500Real Time PCR System(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件42℃ 30分鐘95℃，3分鐘；95℃，10秒，55℃，20秒，72℃，30秒(5cycles)；95℃，15秒 60℃，45秒(50cycles)。
實(shí)施例3.檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒2一.組成1.RNA提取試劑選自Trizol或磁珠法提取試劑中的一種，均含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒(1)Trizol購(gòu)于Invitrogen公司，含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
(2)磁珠法提取試劑包含裂解液等多種試劑，購(gòu)于上?？迫A生物工程股份有限公司；在其裂解液中含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法參考公開(kāi)文獻(xiàn)，4℃保存。
2.反應(yīng)液由50mM Tris(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度20mM)、125mM KCl(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度50mM)、10mM MgCl2(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度4mM)、500ug/ml BSA(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度200ug/ml)、0.375mMSorbitol(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度0.15mM)、0.025mM Triton(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用濃度0.01mM)、RNase抑制劑Rnasin 2.5-5U/ul(購(gòu)于美國(guó)Promega公司，使用量為5-10U/人份)和750μM dNTP(購(gòu)于美國(guó)Promega公司，使用濃度300μM)組成，-20℃保存。
3.酶混合物200U/ul Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)于Invitrogen公司，使用量為50-100U/人份)和2.5-5U/ul Taq Plantium DNA聚合酶(購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，使用量為2-5U/人份)，-20℃保存。
4.引物和探針混合物包括引物序列(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)6μM(使用濃度為200nM)、引物探針(SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)6μM(使用濃度為200nM)和內(nèi)標(biāo)探針(SEQ ID No.7，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA)3μM(使用濃度為100nM)，均委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，-20℃保存。
二.使用方法在30ul反應(yīng)體系中，加入反應(yīng)液12ul，酶混合物2ul，引物探針混合物1ul，提取的RNA樣本15ul(采用Trizol法或磁珠法提取得到，見(jiàn)實(shí)施例4)。
以7500Real Time PCR System(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件50℃ 25分鐘95℃，3分鐘；95℃，10秒，55℃，20秒，72℃，30秒(5cycles)；95℃，15秒 60℃，45秒(50cycles)。
實(shí)施例4.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一.材料采用的標(biāo)準(zhǔn)品為來(lái)自于NIBSC(英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)化及控制研究所)的HIV-1國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(1*103IU/ml)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)(含M族A-H亞型，N族，O族和陰性血清)，60份病人血清來(lái)自于地壇醫(yī)院和佑安醫(yī)院。
二.方法1.提取RNA可根據(jù)操作習(xí)慣采用實(shí)施例2和實(shí)施例3兩種試劑盒中的任何一種(1)Trizol法提取RNA取高壓滅菌的1.5ml離心管，每管加入300ul Trizol(購(gòu)于Invitrogen公司)，然后分別加入100ul樣本，100ul水做為陰性對(duì)照，吸頭反復(fù)吹打混勻，然后加入預(yù)冷100ul氯仿，顛倒混勻；13,000rpm，離心15分鐘；取滅菌離心管，每管加入200ul預(yù)冷異丙醇，取上述上層液相加入異丙醇管中，顛倒混勻；13,000rpm，離心15分鐘，吸頭吸去上清，加入300ul預(yù)冷的75％乙醇，顛倒洗滌，13,000rpm，離心10分鐘，用吸頭吸去上清，50℃，干燥5分鐘，加入DEPC水30ul溶解RNA。
(2)采用上海科華生物工程股份有限公司的磁珠法提取試劑提取核酸A在96孔板中每孔加入20ul去抑制劑，加入樣本100ul，加入裂解液100ul；B在科華公司的核酸提取儀上進(jìn)行第一步反應(yīng)加熱裂解；C在其他5快板中分別加入磁珠溶液100ul、洗滌液A 200ul、B 200ul、C 200ul以及洗脫液60ul；D等待第一步結(jié)束后放入第二塊板(加入了磁珠溶液)吸附磁珠；E再重新放入第一塊板將磁珠和裂解的樣本雜交；F洗滌磁珠，洗滌液A 200ul、B 200ul、C 200ul各一次；G洗脫核酸于洗脫液60ul中。
2.檢測(cè)可根據(jù)操作習(xí)慣采用實(shí)施例2和實(shí)施例3兩種試劑盒中的任何一種，檢測(cè)方法見(jiàn)實(shí)施例2和實(shí)施例3。
三.結(jié)果將60份臨床樣本加入病毒樣顆粒后進(jìn)行核酸提取后，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示采用雙探針檢測(cè)體系具有更好的檢出率。
表1 60份臨床樣本的檢測(cè)臨床檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例4.靈敏度試驗(yàn)一.方法將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蛧?guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)一起采用科華公司的磁珠法提取試劑提取核酸(提取方法同實(shí)施例3)，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。提取的樣本見(jiàn)表2
表2提取樣本列表

二.結(jié)果結(jié)果顯示雙探針檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度為125IU/ml左右，見(jiàn)圖1和表3所示。
表3采用雙探針體系時(shí)的檢測(cè)下限結(jié)果

實(shí)施例5.特異性試驗(yàn)一.方法國(guó)際血清型盤(pán)進(jìn)行型特異性檢測(cè)。提取擴(kuò)增方法同實(shí)施例4。
二.結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示采用雙探針檢測(cè)體系時(shí)可以檢測(cè)出M族的A-H亞型和O族，但是采用單探針體系時(shí)M族有亞型漏檢，N族和O族不能檢出。
綜上所述，我們發(fā)明的一組新的HIV檢測(cè)序列和試劑盒比國(guó)內(nèi)外HIV-1核酸檢測(cè)試劑盒具有明顯的優(yōu)越性，適合國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)使用。
序列表<110>衛(wèi)生部北京醫(yī)院<120>快速檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列、方法及體外診斷試劑盒<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>1acatcaagca gccatgcaaa t 21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>2ctatgtcact tccccttggt tctct 25<210>3<211>28<212>DNA<213>人工合成
<400>3accatcaatg aggaagctgc agaatggg 28<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>4gctttcagcc cagaagtaat acc23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>5atttgcatag ctgcttgatg tcc23<210>6<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>6tcagcattat cagaaggagc caccccaca 29
<210>7<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>7tcaggccccc tcaaagccga c 21<210>8<211>1689<212>DNA<213>MS2噬菌體基因組81位-1769位的核酸序列<400>8atggctatcg ctgtaggtag ccggaattcc attcctagga ggtttgacct gtgcgagctt60ttagtaccct tgatagggag aacgagacct tcgtcccctc cgttcgcgtt tacgcggacg120gtgagactga agataactca ttctctttaa aatatcgttc gaactggact cccggtcgtt180ttaactcgac tggggccaaa acgaaacagt ggcactaccc ctctccgtat tcacgggggg240cgttaagtgt cacatcgata gatcaaggtg cctacaagcg aagtgggtca tcgtggggtc300gcccgtacga ggagaaagcc ggtttcggct tctccctcga cgcacgctcc tgctacagcc360tcttccctgt aagccaaaac ttgacttaca tcgaagtgcc gcagaacgtt gcgaaccggg420
cgtcgaccga agtcctgcaa aaggtcaccc agggtaattt taaccttggt gttgctttag480cagaggccag gtcgacagcc tcacaactcg cgacgcaaac cattgcgctc gtgaaggcgt540acactgccgc tcgtcgcggt aattggcgcc aggcgctccg ctaccttgcc ctaaacgaag600atcgaaagtt tcgatcaaaa cacgtggccg gcaggtggtt ggagttgcag ttcggttggt660taccactaat gagtgatatc cagggtgcat atgagatgct tacgaaggtt caccttcaag720agtttcttcc tatgagagcc gtacgtcagg tcggtactaa catcaagtta gatggccgtc780tgtcgtatcc agctgcaaac ttccagacaa cgtgcaacat atcgcgacgt atcgtgatat840ggttttacat aaacgatgca cgtttggcat ggttgtcgtc tctaggtatc ttgaacccac900taggtatagt gtgggaaaag gtgcctttct cattcgttgt cgactggctc ctacctgtag960gtaacatgct cgagggcctt acggcccccg tgggatgctc ctacatgtca ggaacagtta1020ctgacgtaat aacgggtgag tccatcataa gcgttgacgc tccctacggg tggactgtgg1080agagacaggg cactgctaag gcccaaatct cagccatgca tcgaggggta caatccgtat1140ggccaacaac tggcgcgtac gtaaagtctc ctttctcgat ggtccatacc ttagatgcgt1200tagcattaat caggcaacgg ctctctagat agagccctca accggagttt gaagcatggc1260ttctaacttt actcagttcg ttctcgtcga caatggcgga actggcgacg tgactgtcgc1320
cccaagcaac ttcgctaacg gggtcgctga atggatcagc tctaactcgc gttcacaggc1380ttacaaagta acctgtagcg ttcgtcagag ctctgcgcag aatcgcaaat acaccatcaa1440agtcgaggtg cctaaagtgg caacccagac tgttggtggt gtagagcttc ctgtagccgc1500atggcgttcg tacttaaata tggaactaac cattccaatt ttcgctacga attccgactg1560cgagcttatt gttaaggcaa tgcaaggtct cctaaaagat ggaaacccga ttccctcagc1620aatcgcagca aactccggca tctactaata gacgccggcc attcaaacat gaggattacc1680catgtcgaa1689<210>9<211>335<212>DNA<213>HIV-1病毒GAG基因的335bp片段<400>9tctccaaggg caaatggtac atcagcccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa60agtggtagaa gagaaggctt ttagcccaga agtaataccc atgttttcag gccccctcaa120agccgacaga tttaaacacc atgctaaaca cagtgggggg acatcaagca gccatgcaaa180tgctaaaaga ttcaggcccc ctcaaagccg acataggcta catccagtgc atgcagggcc240
tattgcacca ggccaaatga gagaaccaag gggaagtgac atagcaggaa ctactagtaa300cctgcaggaa caaatagcat ggatgacggg taacc 33權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7所示堿基序列。
2.一種檢測(cè)HIV病毒的方法，其特征在于使用SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的堿基序列作為雙引物和雙探針進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)HIV病毒的方法，其特征在于還使用病毒樣顆粒和探針序列SEQ ID No.7作為內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)進(jìn)行假陰性控制。
4.一種含有雙引物、雙探針的檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒，由以下試劑組成(一)RNA提取試劑選自Trizol或磁珠法提取試劑中的一種，均含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒；(1)Trizol含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，4℃保存；(2)磁珠法提取試劑在其裂解液中含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，4℃保存；(二)反應(yīng)液由50mM Tris、125mM KCl、10mM MgCl2、500ug/ml BSA、0.375mMSorbitol、0.025mM Triton、RNase抑制劑Rnasin 2.5-5U/ul和750μM dNTP組成，-20℃保存；(三)酶混合物200U/ul MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和2.5-5U/ul HotstartTaq DNA聚合酶，-20℃保存；(四)引物和探針混合物包括引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，6μM、引物探針SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，6μM和內(nèi)標(biāo)探針SEQ ID No.7，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，3μM，-20℃保存。
5.一種含有雙引物、雙探針的檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒，由以下試劑組成(一)RNA提取試劑選自Trizol或磁珠法提取試劑中的一種，均含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒(1)Trizol含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，4℃保存；(2)磁珠法提取試劑在其裂解液中含有1000拷貝/ml內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒，4℃保存；(二)反應(yīng)液由50mM Tris、125mM KCl、10mM MgCl2、500ug/ml BSA、0.375mMSorbitol、0.025mM Triton、RNase抑制劑Rnasin 2.5-5U/ul和750μM dNTP組成，-20℃保存；(三)酶混合物200U/ul Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶和2.5-5U/ul Taq PlantiumDNA聚合酶，-20℃保存；(四)引物和探針混合物包括引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQID No.5，6μM、引物探針SEQ ID No.3和SEQ ID No.6，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，6μM和內(nèi)標(biāo)探針SEQ ID No.7，5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)VIC，3’端熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，3μM，-20℃保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種含有雙引物、雙探針的檢測(cè)HIV病毒的體外診斷試劑盒，其特征在于所述內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒通過(guò)以下方法制得基本質(zhì)粒為pET28b，在多克隆位點(diǎn)NcoI和BamHI位點(diǎn)插入MS2噬菌體基因組81位-1769位的核酸序列SEQ ID No.8，然后在多克隆位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)插入HIV-1病毒GAG基因的335bp片段SEQ IDNo.9，用大腸桿菌表達(dá)并純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列、方法及體外診斷試劑盒，屬于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。一組檢測(cè)HIV病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ IDNo.1至SEQ ID No.7所示堿基序列。本發(fā)明的有益效果是我們發(fā)明的一組新的HIV檢測(cè)序列和試劑盒可以檢測(cè)出M族的A－H亞型和O族，比目前市售商品試劑盒檢測(cè)范圍廣；方法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，對(duì)操作人員要求不高；檢測(cè)下限低至125IU/ml；采用雙探針雙引物體系對(duì)各種HIV－1亞型都能良好準(zhǔn)確的定量，保證了對(duì)各種型別的亞型都能結(jié)合到及能適應(yīng)結(jié)合部位可能的突變變化，從而準(zhǔn)確定量；成本低廉，相對(duì)于進(jìn)口試劑盒50－80美元/人份的成本，我們發(fā)明的試劑盒成本僅為10－20元人民幣/人份。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1940090SQ20061011361
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2006年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月9日
發(fā)明者李金明, 黃杰, 王露楠, 鄧巍, 楊昌梅, 孟雙, 申子瑜 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院