專利名稱：編碼參與碳代謝和能量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的谷氨酸棒桿菌基因的制作方法
本申請是申請日為2000年6月23日，申請?zhí)枮?0811819.1，發(fā)明名稱為“編碼參與碳代謝和能量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的谷氨酸棒桿菌基因”的發(fā)明專利申請的分案申請。
相關(guān)申請本申請要求1999年6月25日申請的美國臨時專利申請順序號60/141031、1999年7月9日申請的美國專利臨時申請序號60/143208和1999年8月31日申請的美國專利臨時申請序號60/151572的優(yōu)先權(quán)。該申請還要求以下專利申請的優(yōu)先權(quán)1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931412.8、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931413.6、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931419.5、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931420.9、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931424.1、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931428.4、1997年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931431.4、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931433.0、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931434.9、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931510.8、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931562.0、1999年7月8日申請的德國專利申請?zhí)?9931634.1、1999年7月9日申請的德國專利申請?zhí)?9932180.9、1999年7月9日申請的德國專利申請?zhí)?9932227.9、1999年7月9日申請的德國專利申請?zhí)?9932230.9、1999年7月14日申請的德國專利申請?zhí)?9932924.9、1999年7月14日申請的德國專利申請?zhí)?9932973.7、1999年7月14日申請的德國專利申請?zhí)?9933005.0、1999年8月27日申請的德國專利申請?zhí)?9940765.7、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942076.9、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942079.3、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942086.6、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942087.4、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942088.2、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942095.5、1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942123.4和1999年9月3日申請的德國專利申請?zhí)?9942125.0。所有以上引用申請的全部內(nèi)容均特別通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
在細(xì)胞中天然發(fā)生的代謝過程的某些產(chǎn)物和副產(chǎn)物在多種工業(yè)中具有實用性，所述工業(yè)包括食品工業(yè)、飼料工業(yè)、化妝品工業(yè)和制藥業(yè)。這些分子統(tǒng)稱為“精細(xì)化學(xué)品”，包括有機酸、蛋白質(zhì)生成的和非蛋白質(zhì)生成的氨基酸、核苷酸和核苷、脂質(zhì)和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素和輔因子和酶。它們的生產(chǎn)最為方便的是通過開發(fā)用以生產(chǎn)和分泌大量的一種或多種需要分子的細(xì)菌的大規(guī)模培養(yǎng)來進(jìn)行。用于此目的的一種特別有用的生物是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，這是一種革蘭氏陽性的非致病菌。通過菌株的選擇，已經(jīng)開發(fā)了許多產(chǎn)生一系列需要化合物的突變型菌株。然而，選擇在特定分子生產(chǎn)方面改進(jìn)的菌株是一個費時且困難的過程。
發(fā)明概要本發(fā)明提供具有多種用途的新型細(xì)菌核酸分子。這些用途包括鑒定可以用來生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的微生物、調(diào)節(jié)谷氨酸棒桿菌或相關(guān)細(xì)菌產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品、定型或鑒定谷氨酸棒桿菌或相關(guān)細(xì)菌、用作谷氨酸棒桿菌基因組作圖的參比點以及用作轉(zhuǎn)化的標(biāo)記。這些新型核酸分子編碼本文中稱為糖代謝和氧化磷酸化(sugar metabolism and_oxidativephosphorylation)(SMP)蛋白的蛋白質(zhì)。
谷氨酸棒桿菌是一種革蘭氏陽性需氧菌，通常用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)種類繁多的精細(xì)化學(xué)品，也用于降解碳?xì)浠衔?例如用于處理石油溢出物)以及用于萜類化合物的氧化。因此，本發(fā)明的SMP核酸分子可以用來鑒定可以例如通過發(fā)酵過程生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的微生物。本發(fā)明SMP核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)或本發(fā)明SMP核酸分子序列的修飾，可以用以調(diào)節(jié)微生物的一種或多種精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)(例如提高各種棒桿菌或短桿菌的一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率或產(chǎn)量)。
本發(fā)明的SMP核酸也可以用來鑒定谷氨酸棒桿菌或其密切相關(guān)菌種的生物，或用來鑒定混合微生物群體中谷氨酸棒桿菌或其相關(guān)菌種存在與否。本發(fā)明提供多種谷氨酸棒桿菌基因的核酸序列；通過用跨越谷氨酸棒桿菌特有基因的區(qū)段的探針，在嚴(yán)格條件下探測特有微生物群體培養(yǎng)物或混合微生物群體培養(yǎng)物的提取的基因組DNA，人們可以確定該生物是否存在。雖然谷氨酸棒桿菌本身是非致病性的，但它與人類中的致病菌種例如白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉病原體)有關(guān)；對這類生物的檢測具有重要臨床意義。
本發(fā)明的SMP核酸分子也可以用作谷氨酸棒桿菌基因組或相關(guān)生物基因組作圖的參比點。同樣，這些分子及其變異體或其部分可以用作遺傳工程棒桿菌或短桿菌菌種的標(biāo)記。
本發(fā)明新型核酸分子編碼的SMP蛋白能夠在谷氨酸棒桿菌中例如執(zhí)行涉及碳化合物(例如糖)代謝的功能，或執(zhí)行涉及通過諸如氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子的功能。已知可得到用于谷氨酸棒桿菌的克隆載體例如Sinskey等的美國專利號4,649,119公開的克隆載體以及用于谷氨酸棒桿菌和相關(guān)短桿菌菌種(例如乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum))的遺傳操作技術(shù)(Yoshihama等，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumata等，J.Bacteriol.159306-311(1984)；和Santamaria等，J.Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))，則本發(fā)明的核酸分子可以用于這種生物的基因工程，以使其成為一種或多種精細(xì)化學(xué)品的更好或更有效的生產(chǎn)菌。這種精細(xì)化學(xué)品產(chǎn)量或生產(chǎn)效率提高可能是由于本發(fā)明基因操作的直接效應(yīng)引起的，或者可能是由這類操作的間接效應(yīng)引起的。
本發(fā)明SMP蛋白改變可能通過多種機制直接影響摻入這種改變蛋白的谷氨酸棒桿菌菌株產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。諸如糖的高能碳分子降解以及諸如NADH和FADH2的化合物通過氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為含有高能磷酸鍵的化合物可以產(chǎn)生多種化合物，這些化合物本身可能就是需要的精細(xì)化學(xué)品，如丙酮酸、ATP、NADH和許多中間體糖化合物。細(xì)胞可利用這些代謝途徑產(chǎn)生的能量分子(如ATP)和還原當(dāng)量物(如NADH或NADPH)驅(qū)動在能量上不利的反應(yīng)。這樣的不利反應(yīng)包括許多精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑。人們通過改進(jìn)細(xì)胞利用特定糖的能力(例如對編碼參與細(xì)胞降解該糖并將其轉(zhuǎn)化為能量的酶的基因進(jìn)行操作)可提高能量，以便細(xì)胞可進(jìn)行不利但卻需要的代謝反應(yīng)(例如生物合成需要精細(xì)化學(xué)品)誘變一種或多種本發(fā)明SMP基因也可能產(chǎn)生活性改變的SMP蛋白，活性改變的SMP蛋白間接影響谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生一種或多種需要精細(xì)化學(xué)品。例如，人們通過提高谷氨酸棒桿菌利用一種或多種糖的效率(從而增強所述糖轉(zhuǎn)化為有用的能量分子)、或者提高還原當(dāng)量物轉(zhuǎn)化為有用的能量分子的效率(例如通過提高氧化磷酸化效率或增強ATP合酶活性)，能夠增加這些高能化合物量，供細(xì)胞驅(qū)動通常不利的代謝過程。這樣的過程包括構(gòu)建細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及生物合成細(xì)胞生長分裂必需的化合物(例如核苷酸、氨基酸、維生素、脂質(zhì)等)(Lengeler等(1999)Biology of Prokaryotes，Thieme VerlagStuttgart，第88-109、913-918、875-899頁)。通過改進(jìn)這些工程細(xì)胞的生長和繁殖，既可提高大規(guī)模培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力，也可以提高其分裂率，這樣在發(fā)酵罐培養(yǎng)物中能夠存活更大量的細(xì)胞。至少因為存在更多的產(chǎn)生需要精細(xì)化學(xué)品的活細(xì)胞而提高產(chǎn)率、產(chǎn)量或生產(chǎn)效率。此外，細(xì)胞利用糖發(fā)酵過程產(chǎn)生的許多降解產(chǎn)物作為產(chǎn)生其它需要產(chǎn)物如精細(xì)化學(xué)品的前體或中間體。因而，由于增強了細(xì)胞代謝糖的能力，從而也可以增加供細(xì)胞其它過程用的降解產(chǎn)物數(shù)量。
本發(fā)明提供編碼本文稱為SMP蛋白的新型核酸分子，所述SMP蛋白能夠例如執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子的功能。編碼SMP蛋白的核酸分子在本文中稱為SMP核酸分子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述SMP蛋白參與碳分子及其降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞用于代謝過程的能量。這類蛋白的實例包括由表1給出基因編碼的蛋白。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及分離的核酸分子(例如cDNA、DNA或RNA)，所述分離的核酸分子包含編碼SMP蛋白或其生物活性部分的核苷酸序列，還涉及適合作為檢測或擴增SMP編碼核酸(例如DNA或mRNA)的引物或雜交探針的核酸片段。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述分離的核酸分子包含序列表奇數(shù)SEQ ID NO(如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)中所述核苷酸序列之一、或這些核苷酸序列之一的編碼區(qū)或其互補序列。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含這樣的核苷酸序列或其部分所述核苷酸序列與一種序列表奇數(shù)SEQ ID NO(如SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)核苷酸序列雜交或與其具有至少約50％、優(yōu)選至少約60％、更優(yōu)選至少約70％、80％或90％、甚至更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性。在其它優(yōu)選實施方案中，所述分離的核酸分子編碼一種序列表偶數(shù)SEQ ID NO(如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8...)氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的SMP蛋白也最好具有至少一種本文所述的SMP活性。
在另一實施方案中，所述分離的核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)或其部分，其中所述蛋白或其部分包括與本發(fā)明氨基酸序列(如具有序列表偶數(shù)SEQ ID NO的序列)足夠同源的氨基酸序列，例如與本發(fā)明的氨基酸序列足夠同源，使得所述蛋白質(zhì)或其部分保留SMP活性。最好是所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其部分保留執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌的諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能的能力。在一個實施方案中，由所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與本發(fā)明氨基酸序列(例如選自具有序列表偶數(shù)SEQ ID NO的完整的氨基酸序列)的同源性為至少約至50％、優(yōu)選至少約60％、更優(yōu)選至少約70％、80％或90％、最優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。在另一優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)是與本發(fā)明完整氨基酸序列(由序列表相應(yīng)的奇數(shù)SEQ ID NO(如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7...)中所示的可讀框編碼)基本上同源的全長谷氨酸棒桿菌蛋白質(zhì)。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述分離的核酸分子得自谷氨酸棒桿菌，并且編碼包括一個生物活性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如SMP融合蛋白)，所述生物活性結(jié)構(gòu)域與一種本發(fā)明的氨基酸序列(例如序列表中的一種偶數(shù)SEQ ID NO序列)有至少約50％或更高的同源性，并且能夠執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能，或具有表1給出的一種或多種活性，所述生物活性結(jié)構(gòu)域也包括編碼異源多肽或調(diào)節(jié)區(qū)的異源核酸序列。
在另一實施方案中，所述分離的核酸分子至少長15個核苷酸，并且在嚴(yán)格條件下與包含本發(fā)明核酸序列(例如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)的核酸分子雜交。優(yōu)選所述分離的核酸分子相當(dāng)于天然存在的核酸分子。更優(yōu)選所述分離的核酸編碼天然存在的谷氨酸棒桿菌SMP蛋白或其生物活性部分。
本發(fā)明的另一方面涉及含有本發(fā)明核酸分子的載體，例如重組表達(dá)載體，涉及已經(jīng)導(dǎo)入這類載體的宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，這樣一種宿主細(xì)胞用來通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞而生產(chǎn)SMP蛋白。然后從所述培養(yǎng)基或所述宿主細(xì)胞中分離出所述SMP蛋白。
本發(fā)明的再一方面涉及其中已經(jīng)導(dǎo)入SMP基因或改變SMP基因的遺傳改變的微生物。在一個實施方案中，通過導(dǎo)入作為轉(zhuǎn)基因的編碼野生型或突變型SMP序列的本發(fā)明核酸分子，已經(jīng)改變了所述微生物的基因組。在另一實施方案中，所述微生物基因組內(nèi)的內(nèi)源SMP基因通過與改變的SMP基因同源重組而已經(jīng)被改變，例如功能性斷裂。在另一實施方案中，微生物中內(nèi)源的或所引入的SMP基因通過一個或多個點突變、缺失或倒位而被改變，但仍編碼功能性SMP蛋白。在再一實施方案中，微生物中SMP基因的一個或多個調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子、阻抑蛋白或誘導(dǎo)物)已經(jīng)被改變(例如通過缺失、截短、倒位或點突變)，使得所述SMP基因的表達(dá)得到調(diào)節(jié)。在一個優(yōu)選實施方案，所述微生物屬于棒桿菌屬或短桿菌屬，特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。在一個優(yōu)選實施方案中，所述微生物也用于生產(chǎn)需要化合物，例如氨基酸，特別優(yōu)選賴氨酸。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定受試者中是否存在白喉棒桿菌或其活動情況的方法。該方法包括檢測受試者體內(nèi)的一種或多種本發(fā)明的核酸序列或氨基酸序列(例如序列表SEQ ID NO 1-782序列)，由此檢測所述受試者體內(nèi)是否存在白喉棒桿菌或其活動情況。
本發(fā)明的又一方面涉及分離的SMP蛋白或其部分，例如生物活性部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離SMP蛋白或其部分能夠執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能。在另一優(yōu)選實施方案中，所述分離的SMP蛋白或其部分與本發(fā)明的氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ IDNO序列)足夠同源，使得所述蛋白質(zhì)或其部分保留執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能的能力。
本發(fā)明也提供SMP蛋白的分離制劑。在優(yōu)選實施方案中，所述SMP蛋白包含本發(fā)明的氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及與本發(fā)明的完整氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)(由序列表中相應(yīng)的奇數(shù)SEQ IDNO可讀框編碼)基本上同源的分離的全長蛋白質(zhì)。在再一實施方案中，所述蛋白質(zhì)與本發(fā)明的完整氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ IDNO序列)的同源性為至少約至50％、優(yōu)選至少約60％、更優(yōu)選至少約70％、80％或90％、最優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。在其它實施方案中，所述分離的SMP蛋白包含與本發(fā)明的一種氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)的同源性至少約50％或更高的氨基酸序列，并且能夠執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能，或具有表1給出的一種或多種活性。
或者，所述分離的SMP蛋白可以包含這樣的核苷酸序列編碼的氨基酸序列所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與序列表中一種奇數(shù)SEQ IDNO核苷酸序列雜交，或與序列表中一種奇數(shù)SEQ ID NO核苷酸序列的同源性至少約至50％、優(yōu)選至少約60％、更優(yōu)選至少約70％、80％或90％、最優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％或更高。也優(yōu)選SMP蛋白的優(yōu)選形式也具有本文所述一種或多種SMP生物活性。
所述SMP多肽或其生物活性部分可以與一種非SMP多肽有效連接，形成融合蛋白。在優(yōu)選實施方案中，這種融合蛋白具有不同于單獨的所述SMP蛋白的活性。在其它優(yōu)選實施方案中，這種融合蛋白執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)的功能。在特別優(yōu)選的實施方案中，這種融合蛋白整合到宿主細(xì)胞中，調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的需要化合物產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供用于篩選調(diào)節(jié)SMP蛋白活性的分子的方法，所述分子通過與SMP蛋白本身相互作用，或者通過與所述SMP蛋白的底物或結(jié)合配偶體相互作用，或者通過調(diào)節(jié)本發(fā)明SMP核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯，調(diào)節(jié)SMP蛋白活性。
本發(fā)明的另一方面涉及用于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的方法。該方法包括培養(yǎng)包含指導(dǎo)本發(fā)明SMP核酸分子表達(dá)的載體的細(xì)胞，使得可生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法還包括獲得含這種載體的細(xì)胞的步驟，其中用指導(dǎo)SMP核酸表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在另一優(yōu)選實施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)物中回收所述精細(xì)化學(xué)品的步驟。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞得自棒桿菌屬或短桿菌屬，或選自表3中所述的菌株。
本發(fā)明的另一方面涉及用于調(diào)節(jié)由微生物生產(chǎn)分子的方法。這類方法包括使所述細(xì)胞與調(diào)節(jié)SMP蛋白活性或SMP蛋白表達(dá)的因子接觸，使得細(xì)胞相關(guān)活性相對于在缺乏所述因子時的所述活性而言被改變。在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的一種或多種谷氨酸棒桿菌碳代謝途徑，或調(diào)節(jié)所述細(xì)胞通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量，使得改進(jìn)這種微生物生產(chǎn)需要精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率或產(chǎn)率。調(diào)節(jié)SMP蛋白活性的因子可以是刺激SMP蛋白活性或SMP核酸表達(dá)的因子。刺激SMP蛋白活性或SMP核酸表達(dá)的因子的實例包括小分子、活性SMP蛋白和已導(dǎo)入所述細(xì)胞的編碼SMP蛋白的核酸。抑制SMP活性或表達(dá)的因子的實例包括小分子和反義SMP核酸分子。
本發(fā)明的另一方面涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞的需要化合物產(chǎn)率的方法，所述方法包括將野生型或突變型SMP基因?qū)爰?xì)胞中，或者保留在單獨的質(zhì)粒上或整合到宿主細(xì)胞的基因組中。如果整合到基因組中，則這種整合可以是隨機的，或它可以通過同源重組而發(fā)生，使得所述天然基因被所導(dǎo)入的拷貝取代，導(dǎo)致所調(diào)節(jié)的細(xì)胞產(chǎn)生所述需要化合物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述產(chǎn)率提高。在另一優(yōu)選實施方案中，所述化學(xué)品是一種精細(xì)化學(xué)品。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述精細(xì)化學(xué)品是一種氨基酸。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸是L-賴氨酸。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供SMP核酸分子和SMP蛋白分子，所述分子參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生能量分子。本發(fā)明的分子可以用于調(diào)節(jié)微生物例如谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，這可以產(chǎn)生直接影響(例如過量表達(dá)或優(yōu)化糖酵解途徑蛋白對改良谷氨酸棒桿菌的例如丙酮酸的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率有直接影響)，或可以產(chǎn)生間接影響，間接影響仍然使需要化合物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率提高(例如調(diào)節(jié)參與氧化磷酸化的蛋白導(dǎo)致供細(xì)胞完成必要代謝過程和其它細(xì)胞功能(如核酸和蛋白質(zhì)生物合成以及轉(zhuǎn)錄和翻譯)的能量改變)。以下進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的各個方面。
I.精細(xì)化學(xué)品術(shù)語“精細(xì)化學(xué)品”是本領(lǐng)域公知的，包括由生物產(chǎn)生的在各種工業(yè)(例如但不限于制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)和化妝品工業(yè))上具有多種應(yīng)用的分子。這類化合物包括有機酸，例如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸；蛋白質(zhì)生成的和非形成蛋白質(zhì)的氨基酸；嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸(如描述于例如Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相關(guān)化合物，載于Biotechnology，第6卷，第561-612頁，Rehm等編著，VCHWeinheim以及其中含有的參考文獻(xiàn))；脂質(zhì)、飽和和不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)；二元醇(例如丙二醇和丁二醇)；糖類(例如透明質(zhì)酸和海藻糖)；芳族化合物(例如芳香胺、香草醛和靛藍(lán))；維生素和輔因子(如描述于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，“維生素”，第443-613頁(1996)VCHWeinheim以及其中的參考文獻(xiàn)；和Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，于1994年9月1-3日在馬來西亞Penang舉行，AOCS Press，(1995))；酶；聚酮化合物(Cane等(1998)Science 28263-68)；和Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086以及其中的參考文獻(xiàn)介紹的所有其它化合物。以下進(jìn)一步詳細(xì)描述這些精細(xì)化學(xué)品中的某些的代謝和應(yīng)用。
A.氨基酸代謝和應(yīng)用氨基酸是所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，因此是所有生物正常細(xì)胞功能必不可少的。術(shù)語“氨基酸”是本領(lǐng)域已知的。形成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，用作蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，在蛋白質(zhì)中它們通過肽鍵連接；而非形成蛋白質(zhì)的氨基酸(已知數(shù)百種所述氨基酸)通常不存在于蛋白質(zhì)中(參見Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemitry，第A2卷，第57-97頁VCHWeinheim(1985))。氨基酸可以具有D-或L-光學(xué)構(gòu)型，雖然L-氨基酸一般是天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的唯一類型。20種形成蛋白質(zhì)的氨基酸在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的各生物合成和降解途徑已充分表征(參見例如Stryer，L.Biochemistry，第3版，第578-590頁(1988))?！氨匦琛卑被?組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)如此命名，是因為它們的生物合成復(fù)雜，一般是營養(yǎng)上需要的，所述“必需”氨基酸容易通過簡單的生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其余11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸)。高等動物的確保留了合成這些氨基酸中的某些氨基酸的能力，但必需氨基酸必需從飲食中供應(yīng)，以便進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成。
除了這些氨基酸在蛋白質(zhì)生物合成中的功能外，這些氨基酸自身還是令人感興趣的化學(xué)品，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中許多氨基酸在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、化妝品工業(yè)、農(nóng)業(yè)和制藥業(yè)中具有各種用途。賴氨酸不僅是人類營養(yǎng)的重要氨基酸，而且也是單胃動物(例如家禽和豬)營養(yǎng)的重要氨基酸。谷氨酸最常用作調(diào)味添加劑(谷氨酸一鈉，MSG)，并且在食品工業(yè)廣泛使用，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸都用于制藥業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸在制藥業(yè)和化妝品工業(yè)上有價值。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的飼料添加劑。(Leuchtenberger，W.(1996)氨基酸-生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用，載于Rehm等(編著)Biotechnology，第6卷，第14a章，第466-502頁，VCHWeinheim)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些氨基酸可用作合成合成氨基酸和蛋白質(zhì)的前體，例如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥基色氨酸以及Ulmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第A2卷，第57-97頁，VCHWeinheim，1985中介紹的其它合成氨基酸和蛋白質(zhì)。
已經(jīng)充分表征了這些氨基酸在能夠生產(chǎn)這些天然氨基酸的生物(例如細(xì)菌)中的生物合成(有關(guān)細(xì)菌氨基酸生物合成及其調(diào)節(jié)的綜述參見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通過檸檬酸循環(huán)中的中間體α-酮戊二酸的還原性胺化合成谷氨酸。隨后由谷氨酸分別產(chǎn)生谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸。絲氨酸的生物合成是一個三步驟過程，以3-磷酸甘油酸(糖酵解中間體)開始，在氧化、轉(zhuǎn)氨基作用和水解步驟后，產(chǎn)生這種氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都由絲氨酸產(chǎn)生，前者通過高半胱氨酸和絲氨酸縮合而產(chǎn)生，而后者通過在一個由絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中將側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移至四氫葉酸而產(chǎn)生。苯丙氨酸和酪氨酸由糖酵解和戊糖磷酸途徑前體4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇丙酮酸開始的9步驟生物合成途徑合成，這兩種氨基酸的生物合成途徑反在合成預(yù)苯酸后的最后兩個步驟不同。色氨酸也由這兩種起始分子產(chǎn)生，但其合成是一個11步驟途徑。酪氨酸也可以在一個由苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸都是糖酵解終產(chǎn)物-丙酮酸的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸由檸檬酸循環(huán)的中間體草酰乙酸生成。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都是通過天冬氨酸的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。異亮氨酸由蘇氨酸生成。一個復(fù)雜的9步驟途徑由一種活化糖即5-磷酸核糖-1-焦磷酸產(chǎn)生組氨酸。
超出細(xì)胞蛋白質(zhì)合成需求的氨基酸不能被貯存，而是被降解，為細(xì)胞的主要代謝途徑提供中間體(有關(guān)綜述參見Stryer，L.Biochemistry，第3版，第21章，“氨基酸降解和尿素循環(huán)”，第495-516頁(1988))。雖然細(xì)胞能夠?qū)⒉恍枰陌被徂D(zhuǎn)化為有用的代謝中間體，但就能量、前體分子以及合成氨基酸所必需的酶而言，氨基酸生產(chǎn)是昂貴的。因此，氨基酸生物合成受反饋抑制是不奇怪的，在反饋抑制中，特定氨基酸的存在起減慢或完全終止其自身產(chǎn)生的作用(有關(guān)氨基酸生物合成途徑中的反饋機制的綜述，參見Stryer，L.Biochemistry，第3版，第24章，“氨基酸和血紅素的生物合成”，第575-600頁(1988))。因此，任何特定氨基酸的輸出受細(xì)胞中存在的氨基酸量的限制。
B.維生素、輔因子和營養(yǎng)藥的代謝和應(yīng)用維生素、輔因子和營養(yǎng)藥構(gòu)成高等動物已經(jīng)喪失合成能力并且因此必須攝入的另外一組分子，但是它們?nèi)菀子善渌锢缂?xì)菌合成。這些分子或者本身是生物活性物質(zhì)，或者是可以用作用作電子載體或多種代謝途徑的中間體的生物活性物質(zhì)的前體。這些化合物除了具有營養(yǎng)價值外，也具有作為著色劑、抗氧化劑和催化劑或其它加工助劑的重要工業(yè)價值。(有關(guān)這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的概述，參見例如Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“維生素”，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996)。術(shù)語“維生素”是本領(lǐng)域公知的，包括生物正常功能需要、但生物自身不能合成的營養(yǎng)物。維生素類可以包括輔因子和營養(yǎng)藥化合物。用語“輔因子”包括發(fā)生正常酶活性所需的非蛋白性化合物。這類化合物可以是有機化合物或無機化合物；本發(fā)明的輔因子分子最好是有機分子。術(shù)語“營養(yǎng)藥”包括在植物和動物、特別是人類中具有健康益處的食品添加劑。這類分子的實例是維生素、抗氧化劑以及某些脂質(zhì)(例如多不飽和脂肪酸)。
已經(jīng)大量表征了這些分子在能夠生產(chǎn)其的生物例如細(xì)菌中的生物合成(Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，“維生素”第443-613頁，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley & Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederationof Scientific and Technological Associations in Malaysia，and the Societyfor Free Radical Research-Asia，于1994年9月1-3日在馬來西亞Penang舉行，AOCS PressChampaign，IL X，374S)。
通過將嘧啶和噻唑部分化學(xué)偶聯(lián)，產(chǎn)生硫胺素(維生素B1)。核黃素(維生素B2)由鳥苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黃素進(jìn)而用來合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。統(tǒng)稱為“維生素B6”的化合物家族(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛-5’-磷酸以及商業(yè)上使用的鹽酸吡哆醇)都是具有共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸((R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可以通過化學(xué)合成或者通過發(fā)酵生產(chǎn)。泛酸生物合成中的最后的步驟由ATP驅(qū)動的β-丙氨酸和泛解酸縮合組成。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化為泛解酸、β-丙氨酸和縮合為泛酸的生物合成步驟的酶是已知的。代謝活性形式的泛酸是輔酶A，其生物合成以5個酶促步驟進(jìn)行。泛酸、吡哆醛-5’-磷酸、半胱氨酸和ATP是輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的生成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(前維生素B5)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)和輔酶A的產(chǎn)生。
已經(jīng)詳細(xì)研究了微生物中由前體分子庚二酰輔酶A開始的生物素生物合成，并且已經(jīng)鑒定出所涉及的若干基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多相應(yīng)的蛋白質(zhì)也參與鐵簇合成，并且是nifS類蛋白質(zhì)的成員。硫辛酸衍生自辛酸，用作能量代謝中的輔酶，在能量代謝中它成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的一部分。葉酸類是一類葉酸衍生物的物質(zhì)，葉酸又衍生自L-谷氨酸、對氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已經(jīng)在某些微生物中詳細(xì)地研究了葉酸及其衍生物的生物合成，所述生物合成起始于代謝中間體鳥苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和對氨基苯甲酸。
類咕啉(例如鈷胺素、特別是維生素B12)和卟啉屬于一類特征為四吡咯環(huán)系的化學(xué)物質(zhì)。維生素B12的生物合成足夠復(fù)雜，以致尚未被完全鑒定，但現(xiàn)在已知許多所涉及的酶和底物。煙酸和煙酰胺是吡啶衍生物，也稱為“尼克酸”。煙酸是重要的輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其還原形式的前體。
這些化合物的大規(guī)模生產(chǎn)一直主要依靠無細(xì)胞化學(xué)合成，盡管這些化學(xué)品中的某些也已經(jīng)通過大規(guī)模微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)，例如核黃素、維生素B6、泛酸和生物素。僅維生素B12由于其合成的復(fù)雜性通過發(fā)酵生產(chǎn)。體外方法花費大量原料和時間，通常費用巨大。
C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和應(yīng)用嘌呤和嘧啶代謝基因及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)是腫瘤疾病和病毒感染的重要的治療靶。用語“嘌呤”或“嘧啶”包括含氮堿基，它們是核酸、輔酶和核苷酸的組分。術(shù)語“核苷酸”包括核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單元，它們由一個含氮堿基、一個戊糖(在RNA的情況下，所述糖是核糖；在DNA的情況下，所述糖是D-脫氧核糖)和磷酸構(gòu)成。用語“核苷”包括用作核苷酸前體、但缺乏核苷酸所具有的磷酸部分的分子。通過抑制這些分子的生物合成或抑制其形成核酸分子的轉(zhuǎn)化，有可能抑制RNA和DNA的合成；通過以靶向癌細(xì)胞的方式抑制這種活性，可以抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。另外，有不形成核酸分子、而是用作能量貯存(即AMP)或用作輔酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
幾個出版物已經(jīng)描述了通過影響嘌呤和/或嘧啶代謝，將這些化學(xué)物質(zhì)用于這些醫(yī)學(xué)適應(yīng)征(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)“作為化療藥的嘧啶和嘌呤從頭生物合成的有效抑制劑”，Med.Res.Reviews 10505-548)。對參與嘌呤和嘧啶代謝的酶的研究一直集中于可以用作例如用作免疫抑制劑或抗增殖藥的新藥的開發(fā)(Smith，J.L.，(1995)“核苷酸合成中的酶”，Curr.Opin.Struct.Biol.5752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23877-902)。然而，嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸具有其它用途用作幾種精細(xì)化學(xué)品(例如硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、葉酸或核黃素)生物合成的中間體、用作細(xì)胞的能量載體(例如ATP或GTP)和用于化學(xué)品自身，通常用作增味劑(例如IMP或GMP)或用于若干醫(yī)藥用途(參見例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotides andRelated Compounds in Biotechnology，第6卷，Rehm等編著，VCHWeinheim，第561-612頁)。此外，參與嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代謝的酶越來越多地用作開發(fā)用于保護(hù)作物的化學(xué)品的靶，所述化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。
已經(jīng)鑒定了這些化合物在細(xì)菌中的代謝(有關(guān)綜述參見例如Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)“嘌呤核苷酸的從頭生物合成”，載于Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，第42卷，Academic Press，第259-287頁；和Michal，G.(1999)“核苷酸和核苷”，載于Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，第8章，Wiley紐約)。嘌呤代謝一直是廣泛研究的主題，并且對于細(xì)胞的正常功能是必不可少的。在高等動物中嘌呤代謝受損可以引起嚴(yán)重的疾病，例如痛風(fēng)。嘌呤核苷酸由核糖-5-磷酸開始合成，通過中間體化合物肌苷-5’-磷酸(IMP)的一系列步驟，導(dǎo)致鳥苷-5’-一磷酸(GMP)或腺苷-5’-一磷酸(AMP)的產(chǎn)生，由GMP或AMP容易生成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量貯存物，因此其降解為細(xì)胞中的許多不同生物化學(xué)過程提供能量。嘧啶生物合成通過由核糖-5-磷酸形成尿嘧啶-5’-一磷酸(UMP)而進(jìn)行。UMP進(jìn)而轉(zhuǎn)化為胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式在一步還原反應(yīng)中產(chǎn)生，從所述核苷酸的二磷酸核糖形式還原反應(yīng)為所述核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。在磷酸化后，這些分子能夠參與DNA合成。
D.海藻糖的代謝和應(yīng)用海藻糖由以α，α-1，1-連接的兩分子葡萄糖組成。海藻糖在食品工業(yè)中通常用作甜味劑，即用于干燥食品或冷凍食品和飲料中的一種添加劑。然而，它在制藥業(yè)、化妝品工業(yè)和生物技術(shù)工業(yè)中也具有許多應(yīng)用(參見例如Nishimoto等，(1998)美國專利號5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2293-314；和Shiosaka，M.(1997)J.Japan 17297-102)。海藻糖由許多微生物通過酶產(chǎn)生，并且天然釋放到周圍介質(zhì)中，可以用本領(lǐng)域已知的方法從所述周圍介質(zhì)中收集海藻糖。
II.糖和碳分子的利用以及氧化磷酸化碳是形成所有有機化合物的重要元素，因此它不僅是谷氨酸棒桿菌生長分裂的營養(yǎng)要求，而且也是該微生物過量產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的營養(yǎng)要求。諸如單糖、雙糖或多糖的糖類是特別優(yōu)良的碳源，所以標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基通常含有一種或多種以下糖葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1987)第A9卷，“酶”，VCHWeinheim)。另一方面，更多的復(fù)合型糖可以用于所述培養(yǎng)基，例如糖蜜或糖精制中的其它副產(chǎn)品。可使用所述糖以外的其它化合物作為替代碳源，包括醇類(例如乙醇或甲醇)、鏈烷類、糖醇、脂肪酸和有機酸(例如醋酸或乳酸)。關(guān)于碳源以及培養(yǎng)微生物對它們的利用的綜述，參見Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1987)第A9卷，“酶”，VCHWeinheim；Stoppok，E.和Buchholz，K.(1996)“發(fā)酵使用的糖型原料”，載于Biotechnology(Rehm，H.J.編著)第6卷，VCHWeinheim，第5-29頁；Rehm，H.J.(1980)IndustrielleMikrobiologie，SpringerBerlin；Bartholomew，W.H.和Reiman，H.B.(1979)，發(fā)酵工藝經(jīng)濟(jì)學(xué)，載于Peppler，H.J.和Perlman，D.編著，Microbial Technology第2版，第2卷，第18章，Academic Press紐約；以及Kockova-Kratachvilova，A.(1981)工業(yè)微生物的特征，載于Rehm，H.J.和Reed，G.編著，Handbook of Biotechnology，第1卷，第1章，Verlag ChemieWeiheim。
在這些富含能量的碳分子吸收入細(xì)胞后，必須進(jìn)行加工處理，使其能夠被一種主要糖代謝途徑降解。這種途徑直接產(chǎn)生有用的降解產(chǎn)物，例如5-磷酸核糖和磷酸烯醇丙酮酸，磷酸烯醇丙酮酸隨后可轉(zhuǎn)化為丙酮酸。3種最重要的細(xì)菌糖代謝途徑包括Embdeh-Meyerhoff-Pamas(EMP)途徑(也稱為糖酵解途徑或二磷酸果糖途徑)、己糖一磷酸(HMP)途徑(也稱為戊糖旁路途徑或磷酸戊糖途徑)和Entner-Doudoroff(ED)途徑(綜述參見Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas ofBiochemistry and Molecualr Biology，Wiley紐約和Stryer，L.(1988)Biochemistry，第13-19章，F(xiàn)reeman紐約，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。
EMP途徑使己糖分子轉(zhuǎn)化為丙酮酸，該過程產(chǎn)生2分子ATP和2分子NADH。以葡萄糖-1-磷酸(可以從培養(yǎng)基中直接吸收，或者可以由糖元、淀粉或纖維素產(chǎn)生)為原料，使葡萄糖分子異構(gòu)化為果糖-6-磷酸，使其磷酸化，裂解成2個三碳分子甘油醛-3-磷酸。在脫氫化、磷酸化和連續(xù)重排后，獲得丙酮酸。
HMP途徑使葡萄糖轉(zhuǎn)化為還原當(dāng)量物如NADPH，而且產(chǎn)生戊糖和四糖化合物，它們是許多其它代謝途徑必須的中間體和前體。在HMP途徑中，葡萄糖-6-磷酸通過2個連續(xù)脫氫酶反應(yīng)(它還釋放2分子NADPH)和1個羧基化步驟轉(zhuǎn)化為核酮糖-5-磷酸。核酮糖-5-磷酸也可以轉(zhuǎn)化為木酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸；前者可經(jīng)過一系列生化步驟轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸可進(jìn)入EMP途徑，而后者通常用作細(xì)胞它生物合成途徑的中間體。
ED途徑以化合物葡萄糖或葡糖酸開始，它隨后磷酸化以及脫氫化形成2-脫氫-3-脫氧-6-P-葡糖酸。葡糖醛酸和半乳糖醛酸也可以通過更復(fù)雜的生化途徑轉(zhuǎn)化為2-脫氫-3-脫氧-6-P-葡糖酸。該產(chǎn)物分子隨后裂解為甘油醛-3-P和丙酮酸；甘油醛-3-P本身也可以轉(zhuǎn)化為丙酮酸。
EMP和HMP途徑共有許多特征，包括中間體和酶。EMP途徑提供ATP量最多，但是它不產(chǎn)生核糖-5-磷酸，核糖-5-磷酸是例如核酸生物合成的重要前體，也不產(chǎn)生赤蘚糖-4-磷酸，赤蘚糖對氨基酸生物合成是重要的。因此只能利用葡萄糖EMP途徑的微生物不能在葡萄糖作為唯一碳源的簡單培養(yǎng)基上生長。這種微生物稱為苛求菌，其生長需要加入復(fù)合有機化合物，例如見于酵母提取物的復(fù)合有機化合物。
相反，HMP途徑產(chǎn)生核酸和氨基酸生物合成二者必需的全部前體，卻只產(chǎn)生EMP途徑一半的ATP能量。HMP途徑也產(chǎn)生NADPH，NADPH可以用于生物合成途徑中的還原反應(yīng)。然而，HMP途徑不直接產(chǎn)生丙酮酸，所以，這些微生物還必須具有EMP途徑的這一部分。所以，無數(shù)微生物、尤其是兼性厭氧菌已經(jīng)進(jìn)化而具有這兩種途徑，這不是意外的。
ED途徑目前只見于細(xì)菌。盡管該途徑在前體形成的反方向上與人HMP途徑部分有關(guān)，但是ED途徑通過醛縮酶裂解3-酮基脫氧-6-磷酸葡糖酸直接形成丙酮酸鹽。ED途徑可以獨立存在，為大多數(shù)嚴(yán)格厭氧微生物所利用。最終結(jié)果類似于HMP途徑，但是只有當(dāng)碳原子轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽而不是前體分子時，才產(chǎn)生1摩爾ATP。
通過以上任一途徑產(chǎn)生的丙酮酸分子能夠很容易地通過Krebs循環(huán)(也稱為檸檬酸循環(huán)、檸檬酸循環(huán)或三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán)))轉(zhuǎn)化為能量。在Krebs循環(huán)中，首先丙酮酸脫羧，產(chǎn)生1分子NADH、1分子乙酰CoA和1分子二氧化碳。乙酰CoA的乙?；S后與4碳單位的草酰乙酸(oxaolacetate)反應(yīng)，形成6碳有機酸檸檬酸。脫水而且再釋放2分子二氧化碳。最后，又產(chǎn)生草酰乙酸而且可以再用作乙?；荏w，至此完成循環(huán)。TCA循環(huán)中的中間體氧化釋放的電子轉(zhuǎn)移給NAD+，產(chǎn)生NADH。
呼吸過程中，NADH電子轉(zhuǎn)移給氧分子或其它終末電子受體。該過程由呼吸鏈催化，呼吸鏈?zhǔn)前?nèi)在蛋白和膜結(jié)合蛋白的電子傳遞體系。該系統(tǒng)有兩個基本作用第一，接受電子供體的電子并將其轉(zhuǎn)移給電子受體，第二，通過合成ATP保存電子轉(zhuǎn)移釋放的部分能量。已知若干種氧化還原酶和電子轉(zhuǎn)運蛋白參與該過程，包括NADH脫氫酶、含黃素電子載體、鐵硫蛋白和細(xì)胞色素。NADH脫氫酶位于質(zhì)膜的胞質(zhì)面，它將氫原子從NADH轉(zhuǎn)移給黃素蛋白，然后接受NADH的電子。黃素蛋白是一組具有黃素輔基的電子載體，當(dāng)它接受和轉(zhuǎn)移電子時交替還原和氧化。已知3種黃素參與這些反應(yīng)核黃素、黃素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)。鐵硫蛋白含有一簇鐵原子和硫原子，它們不與血紅素鍵合，但是仍然能夠參與脫水和再水化反應(yīng)。琥珀酸脫氫酶和順烏頭酸酶是典型的鐵硫蛋白；其鐵硫復(fù)合物作為整個電子傳遞鏈的組成部分起接受和轉(zhuǎn)移電子的作用。細(xì)胞色素是含有鐵卟啉環(huán)(血紅素)的蛋白。有許多不同類型的細(xì)胞色素，它們的還原電位不同。在功能上，這些細(xì)胞色素構(gòu)成其中電子可以轉(zhuǎn)移給正還原電位不斷遞增的其它細(xì)胞色素的途徑。已知的其它類型非蛋白電子載體有脂溶性醌(例如輔酶Q)。這些分子也起氫原子受體和電子供體的作用。
呼吸鏈發(fā)揮作用產(chǎn)生跨細(xì)胞膜質(zhì)子梯度，產(chǎn)生質(zhì)子動力。細(xì)胞利用這種力通過跨膜酶ATP合酶合成ATP。ATP酶是一種多蛋白的復(fù)合物，其中H+分子經(jīng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運使細(xì)胞內(nèi)亞單位物理性旋轉(zhuǎn)，伴隨著ADP磷酸化形成ATP(綜述參見Fillingame，R.H.和Divall，S.(1999)Novartis Found.Symp.221218-229，229-234)。
非己糖碳底物也可以用作細(xì)胞的碳源和能量源。這種底物首先轉(zhuǎn)化為葡糖異生途徑的己糖，其中細(xì)胞首先合成葡萄糖，然后降解產(chǎn)生能量。該反應(yīng)的原料是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，磷酸烯醇丙酮酸是一種糖酵解途徑的重要中間體。PEP可以由糖以外的底物形成，例如醋酸，或者通過草酰乙酸(本身為TCA循環(huán)的中間體)脫羧形成。逆轉(zhuǎn)糖酵解途徑(利用不同于原始糖酵解途徑的級聯(lián)酶)可以形成葡萄糖-6-磷酸。丙酮酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖需要利用6個高能磷酸鍵，而糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸僅產(chǎn)生2個ATP。然而，葡萄糖完全氧化(糖酵解、丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA、檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化)產(chǎn)生36-38個ATP，這樣進(jìn)行葡糖異生凈損失的高能磷酸鍵通過氧化葡萄糖產(chǎn)生這樣的高能磷酸鍵而總體上增加，從而得到補償。
III.本發(fā)明的元件和方法本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)了本文稱為SMP核酸和蛋白分子的新型分子，所述SMP分子參與谷氨酸棒桿菌的糖轉(zhuǎn)化為有用的降解產(chǎn)物和能量(例如ATP)，或者通過其它過程如氧化磷酸化產(chǎn)生有用的富含能量的分子(例如ATP)。在一個實施方案中，SMP分子參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)。在一個優(yōu)選實施方案中，參與谷氨酸棒桿菌碳代謝和產(chǎn)生能量的本發(fā)明SMP分子活性對該生物產(chǎn)生需要精細(xì)化學(xué)品產(chǎn)生影響。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)本發(fā)明SMP分子的活性，使得本發(fā)明SMP蛋白參與的谷氨酸棒桿菌代謝途徑和能量途徑在產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率上受到調(diào)節(jié)，這直接或者間接調(diào)節(jié)谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生需要精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。
用語“SMP蛋白”或“SMP多肽”包括能夠執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳水化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量的功能的蛋白質(zhì)。SMP蛋白實例包括由表1給出的SMP基因編碼的蛋白質(zhì)以及由奇數(shù)SEQ ID NO編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語“SMP基因”或“SMP核酸序列”包括編碼SMP蛋白的核酸序列，該核酸序列由一個編碼區(qū)以及相應(yīng)的非翻譯5’和3’序列區(qū)組成。SMP蛋白的實例包括表1給出的蛋白。術(shù)語“產(chǎn)量”或“生產(chǎn)能力”是本領(lǐng)域公知的，包括在給定時間和給定發(fā)酵體積內(nèi)獲得的發(fā)酵產(chǎn)物(例如需要精細(xì)化學(xué)品)濃度(例如每小時每升的kg產(chǎn)物)。術(shù)語“生產(chǎn)效率”包括達(dá)到特定生產(chǎn)水平所需的時間(例如細(xì)胞達(dá)到特定精細(xì)化學(xué)品產(chǎn)出率需要多長時間)。術(shù)語“產(chǎn)率”或“產(chǎn)物/碳產(chǎn)率”是本領(lǐng)域公知的，包括碳源轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(即精細(xì)化學(xué)品)的效率。這通常表示為例如每kg碳源的kg產(chǎn)物。通過增加所述化合物的產(chǎn)率或產(chǎn)量，可增加該化合物在給定時間、給定量培養(yǎng)物中的回收分子數(shù)量或有效回收分子數(shù)量。術(shù)語“生物合成”或“生物合成途徑”是本領(lǐng)域公知的，包括細(xì)胞以可能為多步驟、高度調(diào)節(jié)的過程從中間體化合物開始合成化合物、最好是有機化合物。術(shù)語“降解”或“降解途徑”是本領(lǐng)域公知的，包括細(xì)胞以可能為多步驟、高度調(diào)節(jié)的過程將化合物、最好是有機化合物分解為降解產(chǎn)物(一般而言，是較小或復(fù)雜度較低的分子)。術(shù)語“降解產(chǎn)物”是本領(lǐng)域公知的，包括化合物的分解產(chǎn)物。所述產(chǎn)物本身可能在細(xì)胞生物合成其它化合物時用作必需的前體(起點)或中間體分子。用語“代謝”是本領(lǐng)域公知的，包括生物體內(nèi)發(fā)生的全部生物化學(xué)反應(yīng)。特定化合物的代謝(例如諸如甘氨酸的氨基酸的代謝)則包括細(xì)胞中與該化合物有關(guān)的全部生物合成、修飾和降解途徑。
在另一實施方案中，本發(fā)明的SMP分子能夠調(diào)節(jié)微生物例如谷氨酸棒桿菌中需要分子例如精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生。本發(fā)明SMP蛋白改變可能通過多種機制直接影響摻入這種改變蛋白的谷氨酸棒桿菌菌株產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。降解高能碳分子如糖和通過氧化磷酸化使化合物如NADH和FADH2轉(zhuǎn)化為更有用的形式可產(chǎn)生許多化合物，這些化合物本身可能就是需要的精細(xì)化學(xué)品，例如丙酮酸、ATP、NADH和多種中間體糖化合物。進(jìn)而，細(xì)胞可利用這些代謝途徑產(chǎn)生的能量分子(如ATP)和還原當(dāng)量物(如NADH或NADPH)驅(qū)動在能量上不利的反應(yīng)。這樣的不利反應(yīng)包括許多精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑。人們通過改進(jìn)細(xì)胞利用特定糖的能力(例如操作編碼參與所述細(xì)胞降解并轉(zhuǎn)化該糖為能量的酶的基因)可提高能量，以便細(xì)胞可進(jìn)行不利但卻是需要的代謝反應(yīng)(例如生物合成需要精細(xì)化學(xué)品)誘變一種或多種本發(fā)明SMP基因也可能產(chǎn)生活性改變的SMP蛋白，活性改變的SMP蛋白間接影響谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生一種或多種需要精細(xì)化學(xué)品。例如，人們通過提高利用一種或多種糖的效率(從而增強所述糖轉(zhuǎn)化為有用的能量分子)、或者提高還原當(dāng)量物轉(zhuǎn)化為有用的能量分子的效率(例如通過提高氧化磷酸化效率或增強ATP合酶活性)能夠增加這些高能化合物量，供細(xì)胞驅(qū)動通常不利的代謝過程。這樣的過程包括構(gòu)建細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及生物合成細(xì)胞生長分裂必需的化合物(例如核苷酸、氨基酸、維生素、脂質(zhì)等)(Lengeler等(1999)Biologyof Prokaryotes，Thieme VerlagStuttgart，第88-109、913-918、875-899頁)。通過改進(jìn)這些工程細(xì)胞的生長和繁殖，既可提高大規(guī)模培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力，也可以提高其分裂率，這樣更大量的細(xì)胞能夠在發(fā)酵罐培養(yǎng)物中存活。至少因為存在更多的產(chǎn)生所需精細(xì)化學(xué)品的活細(xì)胞而提高產(chǎn)率、產(chǎn)量或生產(chǎn)效率。此外，糖代謝產(chǎn)生大量降解和中間體化合物為整個細(xì)胞其它生物合成途徑的必需前體和中間體。例如許多氨基酸直接由通常產(chǎn)生自糖酵解或TCA循環(huán)的化合物合成(例如絲氨酸由糖酵解中間體3-磷酸甘油酸合成)。因而，通過增強了糖轉(zhuǎn)化為有用能量分子的效率，也可以增加有用的降解產(chǎn)物數(shù)量。
本發(fā)明的分離的核酸序列包含在谷氨酸棒桿菌菌株的基因組中，所述菌株可通過美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，保藏號為ATCC13032。所述分離的谷氨酸棒桿菌SMP DNA的核苷酸序列和谷氨酸棒桿菌SMP蛋白的預(yù)測氨基酸序列分別示于序列表奇數(shù)SEQ ID NO和偶數(shù)SEQ ID NO中。進(jìn)行計算機分析，將這些核苷酸序列分類和/或鑒定為編碼具有參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子的功能的蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明也涉及所具有的氨基酸與本發(fā)明氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)基本上同源的蛋白質(zhì)。本文所用的所具有的氨基酸序列與選定氨基酸序列基本上同源的蛋白質(zhì)，與所選定氨基酸序列(例如所述完整的所選定氨基酸序列)至少約50％同源。所具有的氨基酸序列與選定氨基酸序列基本上同源的蛋白質(zhì)，也可以與所選定氨基酸序列有至少約50-60％、優(yōu)選至少約60-70％、更優(yōu)選至少約70-80％、80-90％或90-95％、最優(yōu)選至少約96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
本發(fā)明的SMP蛋白或其生物活性部分或片段可以參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)，或具有表1給出的一種或多種活性。
在以下小節(jié)中更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個方面。
A.分離的核酸分子本發(fā)明的一個方面涉及編碼SMP多肽或其生物活性部分的分離的核酸分子、以及適合用作鑒定或擴增SMP編碼核酸(例如SMP DNA)的雜交探針或引物的核酸片段。本文所用的術(shù)語“核酸分子”將是指包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及采用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。該術(shù)語也包括位于基因編碼區(qū)3’端和5’端的非翻譯序列編碼區(qū)5’端上游的至少約100個核苷酸的序列和基因編碼區(qū)3’端下游至少約20個核苷酸的序列。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA?！胺蛛x的”核酸分子是與所述核酸天然來源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。最好是“分離的”核酸分子不含所述核酸來源生物的基因組DNA中天然鄰接所述核酸的序列(即位于所述核酸5’端和3’端的序列)。例如，在各種實施方案中，分離的SMP核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述核酸來源的細(xì)胞(如谷氨酸棒桿菌細(xì)胞)的基因組DNA中天然鄰接所述核酸分子的核苷酸序列。此外，“分離的”核酸分子，例如DNA分子，可以基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)，或當(dāng)通過重組技術(shù)培養(yǎng)時不含培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子(例如具有序列表奇數(shù)SEQ ID NO核苷酸序列的核酸分子)或其部分可以用標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息來分離。例如，可以用序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列之一的全部序列或部分序列作為雜交探針，采用用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如，描述于以下文獻(xiàn)的技術(shù)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，從谷氨酸棒桿菌文庫中分離出谷氨酸棒桿菌SMP DNA。此外，包含本發(fā)明核酸序列(例如奇數(shù)SEQ ID NO)之一的全部或部分序列的核酸分子，可以采用基于該序列設(shè)計的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離(例如，包含本發(fā)明核酸序列之一(如序列表奇數(shù)SEQ ID NO)的全部或部分序列的核酸分子可以采用基于所述序列的設(shè)計的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來分離)。例如，可以從正常的內(nèi)皮細(xì)胞分離mRNA(例如通過Chirgwin等(1979)Biochemistry 185294-5299的硫氰酸胍抽取法)，然后用反轉(zhuǎn)錄酶(例如莫洛尼MLV反轉(zhuǎn)錄酶，可得自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反轉(zhuǎn)錄酶，可得自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，F(xiàn)L)制備DNA?？梢曰谛蛄斜碇兴镜暮塑账嵝蛄兄唬O(shè)計用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增的合成寡核苷酸引物。用cDNA或者基因組DNA作為模板，用合適的寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增技術(shù)，可以擴增本發(fā)明的核酸。將如此擴增的核酸克隆到合適的載體中，并且通過DNA序列分析進(jìn)行鑒定。此外，對應(yīng)于SMP核苷酸序列的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如用自動DNA合成儀來制備。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含一種序列表中所示的核苷酸序列。序列表所示本發(fā)明核酸序列相當(dāng)于本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌SMP DNA。該DNA包含編碼SMP蛋白的序列(即序列表各奇數(shù)SEQ ID NO所示的“編碼區(qū)”)以及5’非翻譯序列和3’非翻譯序列，所述非翻譯序列也示于序列表奇數(shù)SEQ ID NO中。或者，所述核酸分子可以僅包含序列表任一核酸序列的編碼區(qū)。
為了進(jìn)行這種應(yīng)用，人們知道，序列表中所示的每種核酸序列和氨基酸序列具有標(biāo)識性RXA、RXN或RXS編號，所述編號具有后接5位數(shù)字的標(biāo)識符RXA、RXN或RXS(即RXA01626、RXN00043或RXS0735)。每種所述核酸序列包含至多三個部分一個5’上游區(qū)、一個編碼區(qū)和一個下游區(qū)。這三個區(qū)中的每個區(qū)通過相同的RXA、RXN或RXS標(biāo)識符來鑒別，以避免混淆。敘述“序列表奇數(shù)序列之一”則是指序列表任一核酸序列，它也可以根據(jù)其不同的RXA、RXN或RXS標(biāo)識符來區(qū)分。這些序列中的每個序列的編碼區(qū)被翻譯為相應(yīng)的氨基酸序列，所述氨基酸序列也示于序列表中，作為緊接相應(yīng)核酸序列之后的偶數(shù)SEQ ID NO。例如，RXA02735的編碼區(qū)示于SEQ ID NO1中，而其編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中。本發(fā)明核酸分子的序列根據(jù)與它們所編碼的氨基酸分子相同的RXA、RXN或RXS標(biāo)識符來鑒別，使得可以容易地將它們相聯(lián)系。例如，名為RXA00042的氨基酸序列是RXA00042核酸分子的核苷酸序列編碼區(qū)翻譯的。RXA、RXN和RXS核苷酸序列和氨基酸序列與其指定的SEQ ID NO之間的對應(yīng)關(guān)系見表1。
本發(fā)明的若干基因是“F標(biāo)志基因”。F標(biāo)志基因包括表1所示的在RXA標(biāo)識符之前具有一個“F”的基因。例如，如表1所示稱為“F RXA01312”的SEQ ID NO11是一種F標(biāo)志基因，SEQ ID NO29、33和39(在表1中分別稱為“F RXA02803”，“F RXA02854”，“FRXA01365”)也是如此。
在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子不包括表2中編輯的核酸分子。就dapD基因而言，該基因的序列公布于Wehrmann，A.等(1998)J.Bacteriol.180(12)3159-3165中。然而，本申請發(fā)明人獲得的序列顯著長于所公布的形式。認(rèn)為所述公布形式是因為不正確的起始密碼子，因此僅代表真實編碼區(qū)的一個片段。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含一種本發(fā)明核苷酸序列(例如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)的互補序列的核酸分子或其部分。與一種本發(fā)明核苷酸序列的互補的核酸分子是與序列表中所示的核苷酸序列之一(例如奇數(shù)SEQ ID NO序列)足夠互補、使得可以與本發(fā)明核苷酸序列之一雜交并因此形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。
在再一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含這樣的核苷酸序列或其部分所述核苷酸序列與本發(fā)明核苷酸序列(例如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優(yōu)選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優(yōu)選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高。本發(fā)明也包括上述數(shù)值之間的范圍和標(biāo)識數(shù)值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，包括采用任何組合的上述值作為上限和/或下限的標(biāo)識值范圍。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與本發(fā)明的核苷酸序列之一雜交、例如在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列或其部分。
此外，本發(fā)明的核酸分子可以僅包含序列表中一種奇數(shù)SEQ IDNO序列編碼區(qū)的一部分，例如可以用作探針或引物的片段或編碼SMP蛋白的生物活性部分的片段。根據(jù)從谷氨酸棒桿菌克隆SMP基因而測定的核苷酸序列，使得可以制備用于鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型或生物中的SMP同系物以及其它棒桿菌或相關(guān)菌種的SMP同系物的探針或引物。所述探針/引物通常包含基本純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含一種核苷酸序列區(qū)，所述核苷酸序列區(qū)在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核苷酸序列之一(如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)的有義鏈、這些序列之一的反義序列或其天然存在的突變體的至少約12個、優(yōu)選約25個、更優(yōu)選約40個、50個或75個連續(xù)核苷酸雜交。基于本發(fā)明核苷酸序列的引物可以用于PCR反應(yīng)中，以克隆SMP同系物。基于所述SMP核苷酸序列的探針可以用來檢測編碼同一蛋白或同源蛋白的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在優(yōu)選實施方案中，所述探針還包含與其連接的一個標(biāo)記基團(tuán)，例如所述標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。這類探針可以用作診斷試驗試劑盒的一部分，以鑒定異常表達(dá)SMP蛋白的細(xì)胞，例如通過測定細(xì)胞樣品中SMP編碼核酸的水平，例如檢測SMP mRNA水平或檢測基因組SMP基因是否突變或缺失。
在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼一種包含與本發(fā)明氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)足夠同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分，使得所述蛋白質(zhì)或其部分保留參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子((例如ATP)的能力。本文所用的用語“足夠同源”是指這樣一種蛋白質(zhì)或其部分所述蛋白質(zhì)或其部分所具有的氨基酸序列包含最小數(shù)目的與本發(fā)明氨基酸序列相同或等同(例如所具有的側(cè)鏈與序列表偶數(shù)SEQID NO序列中的氨基酸殘基相似的氨基酸殘基)氨基酸殘基，使得所述蛋白質(zhì)或其部分能夠參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)。本文所述的這類糖代謝途徑或能量產(chǎn)生系統(tǒng)的蛋白成員可能在一種或多種精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)和分泌方面起作用。在本文中也描述了這類活性的實例。因此，“SMP蛋白的功能”直接或者間接地影響一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。SMP蛋白活性實例見表1。
在另一實施方案中，所述蛋白質(zhì)與本發(fā)明的完整氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)的同源性為至少約50-60％，優(yōu)選至少約60-70％，更優(yōu)選至少約70-80％、80-90％、90-95％，最優(yōu)選至少約96％、97％、98％、99％或更高。
本發(fā)明SMP核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)的部分最好是一種所述SMP蛋白的生物活性部分。本文所用的術(shù)語“SMP蛋白的生物活性部分”包括參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和產(chǎn)能途徑的SMP蛋白的部分，例如結(jié)構(gòu)域/基序，或具有表1給出的一種活性。為了確定SMP蛋白或其生物活性部分是否可以參與谷氨酸棒桿菌碳化合物代謝和產(chǎn)生富含能量的分子，可以進(jìn)行酶活性的測定。這類測定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，如實施例部分的實施例8中詳細(xì)描述的。
如下制備其它編碼SMP蛋白生物活性部分的核酸片段分離一種本發(fā)明氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)的一部分，表達(dá)所述SMP蛋白或肽的編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))，并且評價所述SMP蛋白或肽的編碼部分的活性。
本發(fā)明還包括由于遺傳密碼的簡并性而不同于本發(fā)明一種核苷酸序列(例如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)(和其部分)并因此編碼與本發(fā)明核苷酸序列所編碼蛋白相同的SMP蛋白的核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子所具有的核苷酸序列編碼具有序列表中所示氨基酸序列(例如偶數(shù)SEQ ID NO)的蛋白質(zhì)。在再一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼與本發(fā)明氨基酸序列(由序列表奇數(shù)SEQID NO中所示的可讀框編碼)基本上同源的全長谷氨酸棒桿菌蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在一個實施方案中，本發(fā)明序列不包括現(xiàn)有技術(shù)的序列，例如在本發(fā)明之前就獲得的表2或4所示的Genbank序列。在一個實施方案中，本發(fā)明包括與本發(fā)明的核苷酸序列或氨基酸序列具有的同一性百分比大于現(xiàn)有技術(shù)的序列(例如表2或4中敘述的Genbank序列(或由這種序列編碼的蛋白質(zhì)))的同一性百分比的核苷酸序列和氨基酸序列。例如，本發(fā)明包括與名為RXA00014(SEQ IDNO41)的核苷酸序列的同一性大于58％和/或至少為58％的核苷酸序列；與名為RXA00195(SEQ ID NO399)的核苷酸序列的同一性大于％和/或至少為％的核苷酸序列；以及與名為RXA00196(SEQ ID NO401)的核苷酸序列的同一性大于42％和/或至少為42％的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過檢測任何給定的本發(fā)明序列三個最高命中每個的表4所示的GAP計算的同一性百分比分?jǐn)?shù)，并且用100％減去最高GAP計算的同一性百分比，能夠計算出所述給定的本發(fā)明序列同一性百分比的下限。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會知道，本發(fā)明也包括同一性百分比大于如此計算的下限(例如至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優(yōu)選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優(yōu)選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高)的核酸序列和氨基酸序列。
除了序列表奇數(shù)SEQ ID NO中所示的谷氨酸棒桿菌SMP核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在群體(例如谷氨酸棒桿菌群體)中可能存在導(dǎo)致SMP蛋白氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。由于自然變異，這類所述SMP基因中的遺傳多態(tài)性可能存在于群體的個體中。本文所用的術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼SMP蛋白、最好是谷氨酸棒桿菌SMP蛋白的可讀框的核酸分子。這類自然變異通常導(dǎo)致所述SMP基因核苷酸序列中1-5％的變異。由于自然變異的結(jié)果并且不改變SMP蛋白功能活性的任何或所有這類核苷酸變異和所產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)相當(dāng)于本發(fā)明谷氨酸棒桿菌SMP DNA的天然變異體和非谷氨酸棒桿菌同系物的核酸分子與本文所公開的谷氨酸棒桿菌SMP核酸的同源性，采用所述谷氨酸棒桿菌DNA或其部分作為雜交探針在嚴(yán)格雜交條件下按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，可以分離出所述核酸分子。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子至少15個核苷酸長，并且在嚴(yán)格條件下與包含序列表奇數(shù)SEQ ID NO核苷酸序列的核酸分子雜交。在一個實施方案中，所述核酸的長度至少為30個、50個、100個、250個或更多個核苷酸。本文所用的術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”意在描述相互之間至少60％同源的核苷酸序列通常保留相互雜交的雜交和洗滌條件。最好是所述條件使得相互之間同源性為至少約65％、更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約75％或更高的序列通常保持相互雜交。這類嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以在Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴(yán)格雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于約45℃雜交，然后在0.2×SSC，0.1％ SDS中于50-65℃進(jìn)行一次或多次洗滌。最好是在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核苷酸序列雜交的本發(fā)明的分離核酸分子相當(dāng)于天然存在的核酸分子。本文所用的“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(例如編碼天然蛋白質(zhì))的RNA或DNA分子。在一個實施方案中，所述核酸編碼一種天然谷氨酸棒桿菌SMP蛋白。
除了在群體中可能存在的所述SMP序列的天然存在的變異體外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道，可以通過在本發(fā)明核苷酸序列中進(jìn)行突變而導(dǎo)入改變，由此導(dǎo)致所編碼SMP蛋白的氨基酸序列改變，而不改變所述SMP蛋白的功能能力。例如，可以在本發(fā)明核苷酸中進(jìn)行導(dǎo)致在“非必需”氨基酸殘基上氨基酸取代的核苷酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢栽谒鯯MP蛋白的野生型序列(例如序列表偶數(shù)SEQID NO)中被改變、而不改變所述SMP蛋白活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是SMP蛋白活性需要的。然而，其它氨基酸殘基(例如在具有SMP活性的結(jié)構(gòu)域中不保守或僅半保守的殘基)可能不是活性必需的，因此可能適合改變而不改變SMP活性。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼SMP蛋白的核酸分子，所述SMP蛋白的SMP活性非必需氨基酸殘基改變。這類SMP蛋白在氨基酸序列上不同于序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列，但仍保留至少一種本文所述的SMP活性。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與本發(fā)明氨基酸序列至少約50％同源的氨基酸序列，并且能夠參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和生物合成高能化合物，或具有表1給出的一種或多種活性。最好是所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與序列表中一種偶數(shù)SEQ IDNO氨基酸序列至少約50-60％同源，更優(yōu)選與這些序列之一至少約60-70％同源，更優(yōu)選與這些序列之一至少約70-80％、80-90％、90-95％同源，最優(yōu)選與一種本發(fā)明的氨基酸序列至少約96％、97％、98％或99％同源。
為了確定兩種氨基酸序列(例如一種本發(fā)明的氨基酸序列和其突變體)或兩種核酸的同源性百分比，進(jìn)行最佳比較的序列對比(例如可以在一種蛋白質(zhì)或核酸的序列引入空位，以與另一種蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)行最佳序列對比)。然后比較對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)一個序列(如一種本發(fā)明的氨基酸序列)中的一個位置被另一個序列(例如所述氨基酸序列的突變體)中相應(yīng)位置的同一氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則所述兩種分子在該位置是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。這兩個序列之間的同源性百分比是所述序列共享相同位置數(shù)的函數(shù)(即同源性百分比＝相同位置數(shù)/位置總數(shù)×100)。
編碼與本發(fā)明蛋白序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)同源的SMP蛋白的分離的核酸分子可以通過以下步驟構(gòu)建在本發(fā)明的核苷酸序列中，導(dǎo)入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，使得在所編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)入一個或多個氨基酸取代、添加或缺失?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的突變，將突變導(dǎo)入一種本發(fā)明的核苷酸序列中。最好是在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲兴霭被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代的氨基酸取代。在本領(lǐng)域中已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基類別。這些類別包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，SMP蛋白中預(yù)測的非必需氨基酸殘基最好被來自同一側(cè)鏈類別的另一種氨基酸殘基取代?；蛘?，在另一實施方案中，可以沿所有或部分SMP編碼序列隨機導(dǎo)入突變，例如通過飽和誘變導(dǎo)入突變，并且可以根據(jù)本文所述的SMP活性對所產(chǎn)生的突變體進(jìn)行篩選，以鑒定保留SMP活性的突變體。對序列表奇數(shù)SEQ ID NO之一的核苷酸序列誘變后，可以重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)，然后可以采用例如本文所述的測定(參見實施例部分的實施例8)測定所述蛋白質(zhì)的活性。
除了上述編碼SMP蛋白的核酸分子外，本發(fā)明的另一方面涉及反義的分離的核酸分子?！胺戳x”核酸包括與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈DNA的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸可以與有義核酸形成氫鍵。所述反義核酸與完整的SMP編碼鏈或僅與其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子是編碼SMP蛋白的核苷酸序列編碼鏈的“編碼區(qū)”的反義核酸分子。術(shù)語“編碼區(qū)”是指包含被翻譯為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)(例如SEQ ID NO3(RXA01626)的完整編碼區(qū)包含核苷酸1-345)。在另一實施方案中，所述反義核酸分子是編碼SMP的核苷酸序列編碼鏈“非編碼區(qū)”的反義核酸分子。術(shù)語“非編碼區(qū)”是指鄰接所述編碼區(qū)、不被翻譯為氨基酸的5’序列和3’序列(即也稱為5’和3’非翻譯區(qū))。
已知本文公開的編碼SMP的編碼鏈序列(例如序列表奇數(shù)SEQ IDNO中所示的序列)，因此可以依照Waston和Crick堿基配對原則，設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。所述反義核酸分子可以與SMP mRNA的完整編碼區(qū)互補，但更優(yōu)選是僅與SMP mRNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義的寡核苷酸。例如，所述反義寡核苷酸可以與SMP mRNA翻譯起始位點周圍的區(qū)段互補。例如，所述反義寡核苷酸可以例如約5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個或50個核苷酸長?？梢圆捎没瘜W(xué)合成以及采用本領(lǐng)域已知的方法的酶連接反應(yīng)，構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可以用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸(如反義寡核苷酸)，所述修飾的核苷酸設(shè)計用以增加所述分子生物學(xué)穩(wěn)定性或增加所述反義核酸和有義核酸之間所形成的雙鏈體物理穩(wěn)定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物以及吖啶取代的核苷酸?？梢杂脕懋a(chǎn)生所述反義核酸的修飾的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。另一方面，可以采用已經(jīng)以反義方向亞克隆了一種核酸(即由所插入的核酸轉(zhuǎn)錄出的RNA將具有所感興趣的靶核酸的反義方向，在以下小節(jié)中進(jìn)一步描述)的表達(dá)載體，用生物學(xué)方法產(chǎn)生所述反義核酸。
通常將本發(fā)明的反義核酸分子給予細(xì)胞或使其原位產(chǎn)生，使得它們與編碼SMP蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，以由此抑制所述蛋白的表達(dá)，例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制表達(dá)?？梢越柚Ｒ?guī)的核苷酸互補性進(jìn)行雜交，以形成穩(wěn)定的雙鏈體，或例如在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子的情況下，通過雙螺旋主溝中的特異性相互作用而進(jìn)行雜交?？梢詫λ龇戳x分子進(jìn)行修飾，使得它例如通過使所述反義核酸分子與結(jié)合于細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體連接，而特異性地結(jié)合于所選定細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原?？梢杂帽疚拿枋龅妮d體將所述反義核酸分子傳遞至細(xì)胞。為了獲得足夠胞內(nèi)濃度的所述反義分子，優(yōu)選其中所述反義核酸分子置于強原核生物、病毒或真核生物啟動子控制之下的載體構(gòu)建物。
在再一實施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補RNA形成特定的雙鏈雜交體，其中與通常的β單位相反，所述鏈互相平行(Gaultier等(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。所述反義核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在又一實施方案中，本發(fā)明的反義核酸是一種核酶。核酶是具有核糖核酸酶的催化性RNA分子，它們能夠切割與其具有互補區(qū)的單鏈核酸，例如mRNA。因此，可以用核酶(例如錘頭核酶(描述于Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591)來催化切割SMP mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此抑制SMP mRNA的翻譯?？梢愿鶕?jù)本文公開的SMP cDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO.3(RXA01626)，設(shè)計對SMP編碼核酸具有特異性的核酶。例如，構(gòu)建一種四膜蟲屬(Tetrahymena)L-19 IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列與SMP編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互補。參見例如Cech等的美國專利號4,987,071和Cech等的美國專利號5,116,742?；蛘撸梢杂肧MP mRNA，從RNA分子庫中選擇具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見例如Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418。
另一方面，通過靶向與SMP核苷酸調(diào)節(jié)區(qū)(例如SMP啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，以形成阻止靶細(xì)胞中SMP基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)，可以抑制SMP基因的表達(dá)。一般參見Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
B.重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及含編碼SMP蛋白(或其部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，質(zhì)粒是指其中可以連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中可以將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體((例如非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入到宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其有效連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“表達(dá)載體”，一般而言，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒形式的載體。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最使用的載體形式。然而，本發(fā)明包括這類其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們發(fā)揮等同的功能。
本發(fā)明重組表達(dá)載體包含適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明核酸的形式的本發(fā)明核酸，這是指所述重組表達(dá)載體包括根據(jù)用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的一個或多個調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列有效連接于待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體中，“有效連接的”是指將所感興趣的核苷酸序列以允許所述核苷酸序列表達(dá)的方式(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時在所述宿主細(xì)胞中)連接于所述調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強子和其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列、以及僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)所述核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列是例如啟動子，例如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet、lpp-、lac-、lpp-lac、lacIq、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SPO2、λ-PR-或λPL，它們優(yōu)選用于細(xì)菌中。其它調(diào)節(jié)序列是例如酵母和真菌的啟動子，例如ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH；植物啟動子，例如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白啟動子或菜豆蛋白啟動子。也可以使用人工啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，所述表達(dá)載體的設(shè)計取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、需要蛋白的表達(dá)水平等的因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，由此產(chǎn)生由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或肽(例如SMP蛋白、突變形式的SMP蛋白、融合蛋白等)。
可以設(shè)計本發(fā)明的重組表達(dá)載體用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)SMP蛋白。例如，可以在以下細(xì)胞中表達(dá)SMP基因細(xì)菌細(xì)胞例如谷氨酸棒桿菌、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母和其它真菌細(xì)胞(參見Romanos，M.A.等(1992)“酵母中的外源基因表達(dá)綜述”，Yeast 8423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等(1991)“在絲狀真菌中的異源基因表達(dá)”，載于More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure編著，第396-428頁Academic PressSan Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)，“用于絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體的開發(fā)”，載于Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等編著，第1-28頁，Cambridge University PressCambridge)、藻類和多細(xì)胞植物細(xì)胞(參見Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)“高效根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的擬南芥(Arabidopsis thaliana)和子葉外植體的轉(zhuǎn)化”Plant Cell Rep.583-586)或哺乳動物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有進(jìn)一步的描述。或者，所述重組表達(dá)載體可以在體外例如用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在原核生物中表達(dá)蛋白最常用含有指導(dǎo)融合蛋白或者非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體來進(jìn)行。融合載體將多個氨基酸加至其中所編碼蛋白上，通常加至所述重組蛋白的氨基末端，但也加至C末端，或在所述蛋白質(zhì)中的合適區(qū)中融合。這類融合載體通常具有三個作用1)增加重組蛋白的表達(dá)；2)增加所述重組蛋白的溶解性；和3)通過用作親和純化中的配體而有助于所述重組蛋白的純化。通常，在融合表達(dá)載體中，在融合部分和重組蛋白的接點處引入一個蛋白酶切割位點，以使得能夠在純化所述融合蛋白后將重組蛋白與融合部分開。這類酶及其相關(guān)的識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。
典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或A蛋白與靶重組蛋白融合。在一個實施方案中，將所述SMP蛋白的編碼序列克隆到pGEX表達(dá)載體中，以產(chǎn)生編碼融合蛋白的載體，所述融合蛋白從N末端至C末端包含GST-凝血酶切割位點-X蛋白。所述融合蛋白可以用谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂通過親和層析純化。不與GST融合的重組SMP蛋白可以通過用凝血酶切割所述融合蛋白進(jìn)行回收。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實例包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19，pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、pBdC1和pET 11d(Studier等，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)60-89；和Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.Elsevier紐約IBSN 0 444 904018)。pTrc載體靶基因的表達(dá)依賴于雜種trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。pET11d載體的靶基因的表達(dá)依賴于通過共同表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7 gnl)T7 gn10-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。這種病毒聚合酶由含有l(wèi)acUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的T7 gnl基因的居留(resident)λ原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)供應(yīng)。關(guān)于其它細(xì)菌變種的轉(zhuǎn)化，可以選擇合適的載體。例如，已知質(zhì)粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361可用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌屬(Streptomyces)，質(zhì)粒pUB110、pC194或pBD214適用于轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種。用于將遺傳信息轉(zhuǎn)移到棒桿菌屬的幾種質(zhì)粒包括pHM1519、pBL1、pSA77或pAJ667(Pouwels等編著(1985)CloningVectors.Elsevier紐約IBSN 0444 904018)。
使重組蛋白表達(dá)最大化的一種策略是在蛋白酶剪切所述重組蛋白能力受損的宿主細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白(Gottesman，S.，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Californiia(1990)119-128)。另一種策略是改變待插入到表達(dá)載體中的核酸的核酸序列，使得每個氨基酸的各個密碼子是在選定用于表達(dá)的細(xì)菌(例如谷氨酸棒桿菌)中優(yōu)先使用的密碼子(Wada等(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。這種本發(fā)明核酸序列的改變可以用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)進(jìn)行。
在另一實施方案中，所述SMP蛋白表達(dá)載體是一種酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等(1987)Embo J.6229-234)、2μ、pAG-1、Yep6、Yep13、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。適用于其它真菌例如絲狀真菌的載體以及載體構(gòu)建方法包括在以下文獻(xiàn)中詳述的載體和方法van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“用于絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和載體的開發(fā)”，載于Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等編著，第1-28頁，Cambridge University PressCambridge，和Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.Elsevier紐約(IBSN 0444 904018)。
另一方面，本發(fā)明的SMP蛋白可以用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在另一實施方案中，本發(fā)明的SMP蛋白可以在單細(xì)胞植物細(xì)胞(例如藻類)或在高等植物(例如種子植物，諸如作物)的植物細(xì)胞中表達(dá)。植物表達(dá)載體的實例包括詳述于以下文獻(xiàn)中的表達(dá)載體Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“在左邊界附近具有選擇標(biāo)記的新型植物雙元載體”，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“用于植物轉(zhuǎn)化的雙元農(nóng)桿菌載體”，Nucl.Acid.Res.128711-8721，并且包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51(Pouwels等編著(1985)Cloning Vectors.Elsevier紐約IBSN 0444904018)。
在再一實施方案中，本發(fā)明的核酸用哺乳動物表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6187-195)。當(dāng)用于哺乳動物細(xì)胞中時，所述表達(dá)載體的控制功能通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，常用的啟動子得自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對于用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的其它合適的表達(dá)系統(tǒng)，參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual.第2版的第16和17章，Cold Spring HarborLab oratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一實施方案中，重組哺乳動物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)所述核酸優(yōu)先在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)(例如用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達(dá)所述核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括清蛋白啟動子(肝特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1268-277)、淋巴(lymphoid)特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)、特別是T細(xì)胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji等(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33741-748)、神經(jīng)元特異性啟動子(例如神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS865473-5477)、胰腺特異性啟動子(Edlund等(1985)Science 230912-916)和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利號4,873,316和歐洲專利申請?zhí)?64,166)。也包括發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動子，例如鼠類hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science 249374-379)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。
本發(fā)明還提供包含以反義方向克隆到表達(dá)載體中的本發(fā)明DNA分子的重組表達(dá)載體。亦即所述DNA分子與調(diào)節(jié)序列有效地連接，其連接方式提供SMP mRNA的反義RNA分子的表達(dá)(通過轉(zhuǎn)錄所述DNA分子)?？梢赃x擇有效連接于反義方向克隆的核酸、指導(dǎo)在多種細(xì)胞類型中連續(xù)表達(dá)所述反義RNA分子的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或者可以選擇指導(dǎo)組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)反義RNA的調(diào)節(jié)序列。反義表達(dá)載體可以為重組載體、噬菌?；驕p毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制之下產(chǎn)生，其活性可以由所述載體所導(dǎo)入的細(xì)胞類型決定。對于使用反義基因的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的討論，參見Weintraub，H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA，Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986。
本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用。不言而喻，這種術(shù)語不僅是指特定的題述細(xì)胞，而且也指這種細(xì)胞的子代或潛在的子代。因為在連續(xù)世代中由于突變或者環(huán)境影響而可能發(fā)生某些修飾，所以這類子代事實上可能與親代細(xì)胞不完全相同，但仍包括在本文所述的術(shù)語范圍內(nèi)。
宿主細(xì)胞可以是任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，SMP蛋白可以在細(xì)菌細(xì)胞例如谷氨酸棒桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。與谷氨酸棒桿菌相關(guān)的、可以方便地用作本發(fā)明核酸和蛋白分子的宿主細(xì)胞的微生物示于表3。
可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，將載體DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”、“接合”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指本領(lǐng)域公知的用于將外源核酸(如線性DNA或RNA(如線性化載體或不包括載體的基因構(gòu)建物)或載體形式的核酸(例如質(zhì)粒、噬菌體、尾感器(phasmid)、噬菌粒(phagemid)、轉(zhuǎn)座子或其它DNA))導(dǎo)入宿主細(xì)胞的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可以在Sambrook等(MolecularCloningA Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它實驗手冊中找到。
關(guān)于哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分細(xì)胞可以將外源DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合子，通常將編碼選擇標(biāo)記(如抗生素抗性)的基因與目的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對藥物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的選擇標(biāo)記。可以將編碼選擇標(biāo)記的核酸在編碼SMP蛋白的同一載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或者可以將其在單獨的載體上導(dǎo)入。可以通過藥物選擇鑒定所導(dǎo)入核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如已經(jīng)摻入選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。
為了獲得同源重組微生物，制備含有至少一部分SMP基因的載體，在所述SMP基因部分中已經(jīng)引入缺失、添加或取代以由此改變(例如功能性破壞)所述SMP基因。最好該SMP基因是谷氨酸棒桿菌SMP基因，但它可以是來自相關(guān)細(xì)菌或甚至哺乳動物、酵母或昆蟲來源的同系物。在一個優(yōu)選實施方案中，設(shè)計所述載體，使得在同源重組后，所述內(nèi)源SMP基因被功能性破壞(即不再編碼功能性蛋白；也稱為“敲除”載體)?；蛘?，可以設(shè)計所述載體，使得在同源重組后，所述內(nèi)源SMP基因被突變或者被改變，但仍編碼功能性蛋白(例如可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)，以由此改變所述內(nèi)源SMP蛋白的表達(dá))。在所述同源重組載體中，所述SMP基因的改變部分在其5’端和3’端鄰接另一種SMP基因的核酸，使得能夠在所述載體所攜帶的外源SMP基因和微生物中的內(nèi)源SMP基因之間發(fā)生同源重組。所述另一種側(cè)翼SMP核酸具有足以與內(nèi)源基因成功同源重組的長度。通常，在所述載體中包含數(shù)千堿基的側(cè)翼DNA(5’端以及3’端)(有關(guān)同源重組載體的描述，參見例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503)。將所述載體導(dǎo)入微生物中(例如通過電穿孔)，然后用本領(lǐng)域已知的技術(shù)選擇其中所導(dǎo)入的SMP基因與內(nèi)源SMP基因同源重組的細(xì)胞。
在另一實施方案中，可以產(chǎn)生含有選定系統(tǒng)的重組微生物，所述選定系統(tǒng)提供受調(diào)節(jié)的所導(dǎo)入基因的表達(dá)。例如，在載體上包含在置于lac操縱子控制之下的SMP基因，允許所述SMP基因僅在IPTG存在時表達(dá)。這類調(diào)節(jié)系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的。
在另一實施方案中，破壞宿主細(xì)胞中的內(nèi)源SMP基因(例如通過同源重組或本領(lǐng)域已知的其它遺傳方法)，使得不發(fā)生其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。在另一實施方案中，通過一個或多個點突變、缺失或倒位，已經(jīng)改變了宿主細(xì)胞中內(nèi)源的或所導(dǎo)入的SMP基因，但它仍編碼功能性SMP蛋白。在再一實施方案中，改變了微生物中SMP基因的一個或多個調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子、阻抑蛋白或誘導(dǎo)物)(例如通過缺失、截短、倒位或點突變)，使得調(diào)節(jié)所述SMP基因的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，含有一種以上的所述SMP基因和蛋白修飾的宿主細(xì)胞可以采用本發(fā)明的方法容易地產(chǎn)生，并且包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如培養(yǎng)物中的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞)可以用來產(chǎn)生(即表達(dá))SMP蛋白。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)SMP蛋白的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼SMP蛋白的重組表達(dá)載體，或在其基因組中導(dǎo)入了編碼野生型或改變的SMP蛋白的基因)，直至產(chǎn)生SMP蛋白。在另一實施方案中，所述方法還包括從培養(yǎng)基中或從宿主細(xì)胞中分離SMP蛋白。
C.分離的SMP蛋白本發(fā)明的另一方面涉及分離的SMP蛋白及其生物活性部分?！胺蛛x的”或“純化的”蛋白或其生物活性部分當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含細(xì)胞物質(zhì)，或在化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。用語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括其中SMP蛋白質(zhì)與細(xì)胞中天然產(chǎn)生或重組產(chǎn)生的細(xì)胞組分分離的SMP蛋白制備物。在一個實施方案中，用語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括所含有的非SMP蛋白(本文中也稱為“污染蛋白”)低于約30％(以干重計)、更優(yōu)選低于20％、再更優(yōu)選低于約10％、最優(yōu)選低于約5％的SMP蛋白制備物。當(dāng)重組產(chǎn)生所述SMP蛋白或其生物活性部分時，其最好也基本不含培養(yǎng)基。即培養(yǎng)基少于約20％，更優(yōu)選少于約10％，最優(yōu)選少于約5％的蛋白制備物量。用語“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)”包括其中SMP蛋白與涉及所述蛋白合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)分離的SMP蛋白制備物。在一個實施方案中，術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)”包括所具有的化學(xué)前體或非SMP化學(xué)物質(zhì)低于約30％(以干重計)、更優(yōu)選低于20％、再更優(yōu)選低于約10％、最優(yōu)選低于約5％的SMP蛋白制備物。在優(yōu)選實施方案中，分離的蛋白質(zhì)或其生物活性部分沒有來自獲得所述SMP蛋白的同一生物的污染蛋白。通常，這類蛋白通過在微生物例如谷氨酸棒桿菌中表達(dá)例如谷氨酸棒桿菌SMP蛋白來產(chǎn)生。
本發(fā)明的分離的SMP蛋白或其部分可參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝，或產(chǎn)生用于驅(qū)動不利代謝途徑的能量化合物(例如通過氧化磷酸化)，或具有表1所述的一種或多種活性。在優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)或其部分包含與本發(fā)明氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)足夠同源的氨基酸序列，使得所述蛋白質(zhì)或其部分保留執(zhí)行參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子的能力。所述蛋白的所述部分最好是本文所述的生物活性部分。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的SMP蛋白具有序列表中一個偶數(shù)SEQ ID NO中所示的氨基酸序列。在再一優(yōu)選實施方案中，所述SMP蛋白具有在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明核苷酸序列(例如序列表奇數(shù)SEQ ID NO序列)雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。在又一優(yōu)選實施方案中，所述SMP蛋白具有由下述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列或其部分，其中所述核苷酸序列與一種本發(fā)明核酸序列的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優(yōu)選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優(yōu)選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高。本發(fā)明也包括上述數(shù)值之間的范圍和標(biāo)識數(shù)值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，包括采用任何組合的上述值作為上限和/或下限的標(biāo)識值范圍。本發(fā)明優(yōu)選的SMP蛋白也最好具有本文所述的至少一種SMP活性。例如，本發(fā)明的優(yōu)選SMP蛋白包括由與一種本發(fā)明核酸序列雜交、例如在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，并且可以參與谷氨酸棒桿菌諸如糖的碳化合物代謝和通過諸如氧化磷酸化的過程產(chǎn)生能量分子(例如ATP)，或者具有表1給出的一種或多種活性。
在其它實施方案中，所述SMP蛋白與一種本發(fā)明的氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO序列)基本上同源，并且保留本發(fā)明氨基酸序列之一的蛋白的功能活性，但由于天然變異或誘變在氨基酸序列有所不同，如以上I小節(jié)中詳細(xì)描述的。因此，在另一實施方案中，所述SMP蛋白是這樣一種蛋白質(zhì)所述蛋白質(zhì)所包含的氨基酸序列與一種本發(fā)明的完整氨基酸序列的同源性為至少約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％，優(yōu)選至少約61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％，更優(yōu)選至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％、或91％、92％、93％、94％，甚至更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％、99％或更高，并且具有本文所述的至少一種SMP活性。本發(fā)明也包括上述數(shù)值之間的范圍和標(biāo)識數(shù)值(例如70-90％相同或80-95％相同)。例如，包括采用任何組合的上述值作為上限和/或下限的標(biāo)識值范圍。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及與一種本發(fā)明的完整氨基酸序列基本上同源的全長的谷氨酸棒桿菌蛋白。
SMP蛋白的生物活性部分包括包含衍生自SMP蛋白氨基酸序列(例如序列表偶數(shù)SEQ ID NO的氨基酸序列)的氨基酸序列、或與SMP蛋白同源的蛋白氨基酸序列的肽，其包含的氨基酸少于全長SMP蛋白或與SMP蛋白同源的全長蛋白質(zhì)并且具有至少一種SMP蛋白活性。通常，生物活性部分(肽，例如長度例如為5個、10個、15個、20個、30個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、50個、100個或更多個氨基酸的肽)包含具有至少一種SMP蛋白的活性的結(jié)構(gòu)域或基序。此外，其中所述蛋白質(zhì)的其它區(qū)缺失的其它生物活性部分可以通過重組技術(shù)制備，并且根據(jù)本文所述的一種或多種活性進(jìn)行評價。最好是SMP蛋白的生物活性部分包含具有生物活性的一個或多個選定結(jié)構(gòu)域/基序或其部分。
SMP蛋白最好通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，將編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子克隆到表達(dá)載體(如上所述)中，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主(如上所述)，然后在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述SMP蛋白。然后可以通過合適的純化方案，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，從所述細(xì)胞中分離出所述SMP蛋白。作為重組表達(dá)的替代方法，可以用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)，化學(xué)合成SMP蛋白、多肽或肽。此外，可以例如采用通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、利用本發(fā)明的SMP蛋白或其片段產(chǎn)生的抗SMP抗體，從所述細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞)中分離天然SMP蛋白。
本發(fā)明也提供SMP嵌合蛋白或融合蛋白。本文所用的SMP“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含與非SMP多肽有效連接的SMP多肽?！癝MP多肽”是指具有相當(dāng)于SMP蛋白的氨基酸序列的多肽，而“非SMP多肽”是指所具有的氨基酸序列相當(dāng)于與所述SMP蛋白基本上不同源的蛋白質(zhì)的多肽，例如不同于所述SMP蛋白并且得自同一生物或不同生物的蛋白質(zhì)。在所述融合蛋白中，術(shù)語“有效連接的”是指所述SMP多肽和所述非SMP多肽彼此按讀框融合。所述非SMP多肽可以融合至所述SMP多肽的N末端或C末端。例如，在一種實施方案中，所述融合蛋白是其中SMP序列融合至GST序列的C末端的GST-SMP融合蛋白。這類融合蛋白可以便于純化重組SMP蛋白。在另一實施方案中，所述融合蛋白是在N末端含有一個異源信號序列的SMP蛋白。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動物宿主細(xì)胞中)，可以通過利用異源信號序列增加SMP蛋白的表達(dá)和/或分泌。
最好是本發(fā)明的SMP嵌合蛋白或融合蛋白采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。例如，依照常規(guī)技術(shù)，例如通過利用平端或交錯切口末端進(jìn)行連接、進(jìn)行限制性酶消化以提供合適的末端、合適的時候補平粘端、進(jìn)行堿性磷酸酶處理以避免不希望有的連接，然后進(jìn)行酶連接，將編碼不同多肽序列的DNA片段符合讀框地連接在一起。在另一實施方案中，通過常規(guī)技術(shù)，包括自動DNA合成儀，可以合成所述融合基因?；蛘撸捎缅^定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴增，所述錨定引物在兩個連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補突出端，隨后將其退火并重新擴增，產(chǎn)生嵌合基因序列(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編著，John Wiley & Sons1992)。此外，許多表達(dá)載體是市售的，已經(jīng)編碼一個融合部分(例如GST多肽)。可以將SMP編碼核酸克隆到這樣一種表達(dá)載體中，使得所述融合部分與所述SMP蛋白符合讀框地融合。
通過對所述SMP蛋白進(jìn)行誘變，例如離散的點突變或截短，可以產(chǎn)生所述SMP蛋白的同系物。本文所用的術(shù)語“同系物”是指用作所述SMP蛋白活性的激動劑或拮抗劑的所述SMP蛋白的變異形式。SMP蛋白的激動劑可以基本上保留所述SMP蛋白的相同生物活性或一個亞類的生物活性。SMP蛋白的拮抗劑通過例如競爭性結(jié)合包括SMP蛋白的糖分子代謝級聯(lián)或能量產(chǎn)生途徑的下游或上游成員，可以抑制天然形式SMP蛋白的一種或多種活性。
在一個替代實施方案中，通過篩選具有SMP蛋白激動劑或拮抗劑活性的所述SMP蛋白的突變體例如截短突變體的組合文庫，可以鑒定出所述SMP蛋白的同系物。在一個實施方案中，通過在核酸水平上進(jìn)行聯(lián)合誘變，產(chǎn)生SMP變異體的一個花斑文庫，所述花斑文庫由一個花斑基因文庫編碼。通過例如酶法將合成的寡核苷酸混合物連接到基因序列中，使得一組簡并的潛在SMP序列可作用單個多肽表達(dá)，或者作為其中含有一組SMP序列的一組較大的融合蛋白表達(dá)(例如用于噬菌體展示)，可以獲得SMP變異體花斑文庫。有多種方法可以用來由簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在的SMP同系物文庫。可以在自動DNA合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將所述合成基因連接到合適的表達(dá)載體中。應(yīng)用一組簡并基因，使得可以在一種混合物中提供所有編碼一組所需潛在SMP序列的序列。合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，所述SMP蛋白編碼的片段的文庫可以用來產(chǎn)生SMP片段的花斑群體，用來篩選和隨后選擇SMP蛋白的同系物。在一個實施方案中，如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫在每個分子大約僅發(fā)生一個缺口的條件下用核酸酶處理SMP編碼序列的雙鏈PCR片段，使所述雙鏈DNA變性，使所述DNA復(fù)性形成可以包括不同缺口產(chǎn)物的有義/反義對的雙鏈DNA，通過用S1核酸酶處理從重新形成的雙鏈體中去除單鏈部分，然后將所產(chǎn)生的片段文庫連接到表達(dá)載體中。用這種方法，可以得到一個表達(dá)文庫，所述表達(dá)文庫編碼各種大小的所述SMP蛋白的N末端片段、C末端片段和內(nèi)部片段。
本領(lǐng)域已知幾種技術(shù)用于篩選通過點突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物、以及篩選cDNA文庫尋找具有選定特性的基因產(chǎn)物。這類技術(shù)適用于快速篩選通過組合誘變SMP同系物產(chǎn)生的基因文庫。適合于高通量分析、用于篩選大基因文庫的最為廣泛使用的技術(shù)，包括將所述基因文庫克隆到復(fù)制型表達(dá)載體中，用所產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，并且使所述組合基因在所需活性的檢測有助于載體分離的條件下表達(dá)，而所述載體編碼其基因產(chǎn)物被檢測的基因。循環(huán)總體誘變(REM)是一種提高文庫中功能型突變體頻率的新技術(shù)，可以與鑒定SMP同系物的篩選測定結(jié)合使用(Arkin和Yourvan (1992)PNAS897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
在另一實施方案中，可以采用本領(lǐng)域中眾所周知的方法，用基于細(xì)胞的測定來分析花斑SMP文庫。
D.本發(fā)明的應(yīng)用和方法本文所述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物、融合蛋白、引物、載體和宿主細(xì)胞可以用于一種或多種以下方法中鑒定谷氨酸棒桿菌和相關(guān)生物；與谷氨酸棒桿菌相關(guān)的生物的基因組作圖；鑒定和定位目的谷氨酸棒桿菌序列；進(jìn)化研究；測定功能所需的SMP蛋白區(qū)；調(diào)節(jié)SMP蛋白活性；調(diào)節(jié)一種或多種糖代謝；調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生高能分子(即ATP、NADPH)；以及調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生需要化合物(例如精細(xì)化學(xué)品)。
本發(fā)明的SMP核酸分子具有多種用途。首先，它們可以用來鑒定谷氨酸棒桿菌和其密切相關(guān)的菌種。此外，它們可以用來鑒定微生物混合群體中是否谷氨酸棒桿菌和其相關(guān)菌種。本發(fā)明提供許多谷氨酸棒桿菌基因的核酸序列；通過在嚴(yán)格條件下用跨越谷氨酸棒桿菌特有基因區(qū)域的探針，探測一種微生物群體和混合微生物群體培養(yǎng)物所提取的基因組DNA，從而人們可以確定是否存在谷氨酸桿菌。
雖然谷氨酸棒桿菌自身是非致病性的，但它與致病菌種例如白喉棒桿菌相關(guān)。白喉棒桿菌是白喉病原體，白喉是一種涉及局部和系統(tǒng)病理學(xué)的快速發(fā)展的急性發(fā)熱性感染。在這種疾病中，局部病變發(fā)生于上呼吸道，而且涉及上皮細(xì)胞壞死性損傷；白喉棒桿菌分泌毒素，毒素從局部病變彌散至機體的遠(yuǎn)處易感組織。因為抑制各種組織的蛋白質(zhì)合成而發(fā)生變性，導(dǎo)致白喉系統(tǒng)病理學(xué)，所述組織包括心臟、肌肉、外周神經(jīng)、腎上腺、腎臟、肝臟和脾。白喉在世界許多地區(qū)包括非洲、亞洲、歐洲東部和前蘇聯(lián)許多獨立州中發(fā)病率一直很高。自從1990年以來，在后兩個地區(qū)的一次白喉流行導(dǎo)致5,000人死亡。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定受試者體內(nèi)是否存在白喉棒桿菌或其活動情況的方法。這種方法包括鑒定受試者體內(nèi)一種或多種本發(fā)明核酸序列或氨基酸序列(例如分別為序列表奇數(shù)或偶數(shù)SEQ ID NO中所示的序列)，由此檢測所述受試者體內(nèi)是否存在谷氨酸棒桿菌或活動情況。谷氨酸棒桿菌和白喉棒桿菌是相關(guān)細(xì)菌，谷氨酸棒桿菌中的許多核酸和蛋白質(zhì)分子與白喉棒桿菌的核酸和蛋白質(zhì)分子同源，因此可以用來檢測受試者體內(nèi)的白喉棒桿菌。
本發(fā)明的核酸分子和蛋白質(zhì)分子也可以用作基因組特定區(qū)的標(biāo)記。這不僅可應(yīng)用于基因組作圖中，也可應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌蛋白的功能研究。例如，為了鑒定基因組中特定谷氨酸棒桿菌DNA結(jié)合蛋白所結(jié)合的區(qū)域，可以將谷氨酸棒桿菌基因組消化，然后將片段與所述DNA結(jié)合蛋白一起溫育。結(jié)合所述蛋白的片段可以另外用本發(fā)明的核酸分子來探測，最好是用可容易檢測的標(biāo)記來探測；這種核酸分子與所述基因組片段的結(jié)合使得能夠?qū)⑺鲜銎味ㄎ恢凉劝彼岚魲U菌的基因組圖譜上，并且當(dāng)用不同酶進(jìn)行多次時，有助于所述蛋白所結(jié)合的核酸序列的快速測定。此外，本發(fā)明的核酸分子可能與相關(guān)菌種的序列具有足夠的同源性，因此這些核酸分子可以用作在相關(guān)細(xì)菌例如乳發(fā)酵短桿菌中構(gòu)建基因組圖譜的標(biāo)記。
本發(fā)明的SMP核酸分子也可用于進(jìn)化研究和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。本發(fā)明分子參與的代謝和能量釋放過程為各種各樣的原核生物和真核生物細(xì)胞所利用；通過比較本發(fā)明核酸分子序列與編碼其它生物的相似酶的核酸分子序列，可以評價生物的進(jìn)化相關(guān)性。同樣，這種比較允許評價所述序列的哪些區(qū)保守的、哪些區(qū)不保守，這有助于確定酶功能所必需的蛋白區(qū)。這種類型的測定對于蛋白質(zhì)工程研究是有價值的，并且可以給出蛋白質(zhì)在誘變方面可以耐受而不喪失功能的指標(biāo)。
對本發(fā)明的SMP核酸分子的操作可以導(dǎo)致產(chǎn)生功能上不同于野生型SMP蛋白的SMP蛋白。這些蛋白質(zhì)可能效率方面或活性方面得到改進(jìn)，在細(xì)胞中的存在數(shù)量可能大于通常的數(shù)量，或可能效率或活性降低。
本發(fā)明提供篩選方法，用于篩選通過與蛋白質(zhì)自身或所述SMP蛋白的底物或者結(jié)合配偶體相互作用、或者通過調(diào)節(jié)本發(fā)明SMP核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯而調(diào)節(jié)SMP蛋白活性的分子。在這類方法中，使表達(dá)一種或多種本發(fā)明SMP蛋白的微生物與一種或多種試驗化合物接觸，并且評價每種試驗化合物對所述SMP蛋白活性或表達(dá)水平的影響。
本發(fā)明SMP蛋白改變可以通過多種機制直接影響摻入這種改變蛋白的谷氨酸棒桿菌菌株產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/和生產(chǎn)效率。諸如糖的高能碳分子降解以及諸如NADH和FADH2的化合物通過氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為更有用的形式可以產(chǎn)生多種化合物，這些化合物本身可能就是需要的精細(xì)化學(xué)品，如丙酮酸、ATP、NADH和多種中間體糖化合物。進(jìn)而，細(xì)胞可利用這些代謝途徑產(chǎn)生的能量分子(如ATP)和還原當(dāng)量物(如NADH或NADPH)驅(qū)動在能量上不利的反應(yīng)。這樣的不利反應(yīng)包括許多精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑。人們通過改進(jìn)細(xì)胞利用特定糖的能力(例如操作編碼參與所述細(xì)胞降解轉(zhuǎn)化糖為能量的酶的基因)，可提高能量，以便細(xì)胞可進(jìn)行不利但是仍然需要的代謝反應(yīng)(例如生物合成需要精細(xì)化學(xué)品)。
此外，對參與糖利用的一個或多個途徑的進(jìn)行調(diào)節(jié)可優(yōu)化轉(zhuǎn)化糖分子含有的能量，以便產(chǎn)生一種或多種需要的精細(xì)化學(xué)品。例如通過降低參與例如葡糖異生的酶活性，可以獲得更多供細(xì)胞驅(qū)動所需生化反應(yīng)(例如精細(xì)化學(xué)品生物合成)的ATP。此外，也可以調(diào)節(jié)糖的總體能量分子產(chǎn)生以保證細(xì)胞由每個糖分子產(chǎn)生的能量最大化。無效的糖利用可能產(chǎn)生過量的二氧化碳和過量的能量，過量的能量可能產(chǎn)生無用的代謝循環(huán)。通過改進(jìn)糖分子代謝，細(xì)胞應(yīng)能夠更有效地行使功能，而需要較少的碳分子。這也應(yīng)可以獲得改進(jìn)的精細(xì)化學(xué)品糖分子比(提高碳產(chǎn)率)，而且可以減少百大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)這種工程谷氨酸棒桿菌中必須加入培養(yǎng)基中的糖量。
誘變一種或多種本發(fā)明SMP基因也可能產(chǎn)生活性改變的SMP蛋白，活性改變的SMP蛋白間接影響谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生一種或多種需要精細(xì)化學(xué)品。例如，人們通過提高谷氨酸棒桿菌利用一種或多種糖的效率(從而增強所述糖轉(zhuǎn)化為有用的能量分子)、或者提高還原當(dāng)量物轉(zhuǎn)化為有用的能量分子的效率(例如通過提高氧化磷酸化效率或增強ATP合酶活性)，能夠增加這些高能化合物量，供細(xì)胞驅(qū)動通常不利的代謝過程。這樣的不利過程包括構(gòu)建細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及生物合成細(xì)胞生長分裂必需的化合物(例如核苷酸、氨基酸、維生素、脂質(zhì)等)(Lengeler等(1999)Biology of Prokaryotes，Thieme VerlagStuttgart，第88-109、913-918、875-899頁)。通過改進(jìn)這些工程細(xì)胞的生長和繁殖，既可提高大規(guī)模培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力，也可以提高其分裂率，這樣更大量的細(xì)胞能夠在發(fā)酵罐培養(yǎng)物中存活。至少因為存在更多的產(chǎn)生需要精細(xì)化學(xué)品的活細(xì)胞而提高產(chǎn)率、產(chǎn)量或生產(chǎn)效率。
此外，細(xì)胞本身利用糖代謝產(chǎn)生的許多降解產(chǎn)物作為產(chǎn)生無數(shù)其它有用化合物(其中部分是精細(xì)化學(xué)品)的前體或中間體。例如丙酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸丙氨酸，而核糖-5-磷酸為例如核苷酸分子的一個組成部分。因此，糖代謝的量和效率對這些降解產(chǎn)物在細(xì)胞中的有效性有顯著影響。通過在現(xiàn)有途徑的效率方面增強細(xì)胞代謝糖的能力(例如工程改進(jìn)參與這些途徑的酶，從而優(yōu)化其活性)，或者通過提高參與這些途徑的酶的有效性(例如增加細(xì)胞中存在的這些酶的數(shù)量)，也可以提高這些降解產(chǎn)物在細(xì)胞中的有效性，從而再增強細(xì)胞產(chǎn)生許多不同的其它需要化合物(例如精細(xì)化學(xué)品)。
使谷氨酸棒桿菌精細(xì)化學(xué)品產(chǎn)率提高的上述SMP蛋白誘變策略不是限制性的；對這些策略進(jìn)行改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。采用這些策略并且加入本文公開的機制，可以利用本發(fā)明的核酸分子和蛋白質(zhì)分子來產(chǎn)生表達(dá)突變型SMP核酸分子和蛋白質(zhì)分子的谷氨酸棒桿菌或相關(guān)細(xì)菌菌種，使得需要化合物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率得以改善。這種需要化合物可以是谷氨酸棒桿菌的任何產(chǎn)物，包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和天然存在的代謝途徑的中間體，以及在谷氨酸棒桿菌代謝中不是天然存在的、但由本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌菌株生產(chǎn)的分子。
應(yīng)用以下實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，不應(yīng)將其解釋為限制本發(fā)明。在本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利申請、專利、公布的專利申請、表格和序列表的內(nèi)容均通過引用結(jié)合到本文中。
表1本申請中的基因
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表3可以用于實施本發(fā)明的棒桿菌屬和短桿菌屬菌株
ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA)。
FERM日本發(fā)酵研究所(Fermentation Research Institute，Chiba，Japan)。
NRRL美國農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(ARS Culture Collection，Northern Regional ResearchLaboratory，Peoria，USA)。
CECT西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Coleccion Espanola de Cultivos Tipo，Valencia，Spain)。
NCIMB英國國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collection of Industrial andMarine Bacteria Ltd.，Aberdeen，UK)。
CBS荷蘭真菌菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，NL)。
NCTC英國國立典型培養(yǎng)物保藏中心(National Collection of Type Cultures，London，UK)。
DSMZ德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，Germany)。
參考文獻(xiàn)見Sugawara，H.等(1993)World directory of collections of cultures of microorganismsBacteria，fungi and yeasts(4th edn)，World federation for culture collections world data center onmicroorganisms，Saimata，Japan。
表4序列比對結(jié)果
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
實施例部分實施例1谷氨酸棒桿菌ATCC13032的總基因組DNA的制備讓谷氨酸棒桿菌(ATCC 13032)的培養(yǎng)物于30℃下在BHI培養(yǎng)基(Difco)中振蕩生長過夜。通過離心收集細(xì)胞，棄去上清液，將細(xì)胞重懸于5ml緩沖液I(培養(yǎng)物原始體積的5％--所有指定的體積菌均已經(jīng)根據(jù)100ml培養(yǎng)物體積來計算)。緩沖液I的組成140.34g/l蔗糖、2.46g/l MgSO4×7H2O、10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，用KOH調(diào)至pH 6.7)、50ml/l M12濃縮物(10g/l(NH4)2SO4、1g/l NaCl、2g/l MgSO4×7H2O、0.2g/l CaCl2、0.5g/l酵母膏(Difco)、10ml/l微量元素混合物(200mg/lFeSO4×H2O、10mg/l ZnSO4×7H2O、3mg/l MnCl2×4H2O、30mg/lH3BO3、20mg/l CoCl2×6H2O、1mg/l NiCl2×6H2O、3mg/lNa2MoO4×2H2、500mg/l絡(luò)合劑(EDTA或檸檬酸)、100mg/l維生素混合物(0.2mg/l生物素、0.2mg/l葉酸、20mg/l對氨基苯甲酸、20mg/l核黃素、40mg/l泛酸鈣(ca-panthothenate)、140mg/l煙酸、40mg/l鹽酸吡哆醛、200mg/l肌醇)。將溶菌酶加入上清液中至終濃度2.5mg/ml。于37℃溫育約4小時后，細(xì)胞壁被降解，通過離心收獲所產(chǎn)生的原生質(zhì)體。沉淀用5ml緩沖液I洗滌1次，用5ml TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH 8)洗滌1次。將沉淀重懸于4ml TE緩沖液中，加入0.5mlSDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。在加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml后，將懸浮夜于37℃溫育約18小時。采用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過用苯酚、苯酚-氯仿-異戊醇和氯仿-異戊醇抽提，純化DNA。然后，通過加入1/50體積的3M乙酸鈉和2體積乙醇，然后于-20℃溫育30分鐘，在高速離心機中用SS34轉(zhuǎn)子(Sorvall)以12,000rpm離心30分鐘，沉淀所述DNA。將DNA溶于1ml含有20μg/ml RNA酶A的TE緩沖液中，于4℃對1000ml TE緩沖液透析至少3小時。在此期間，更換緩沖液3次。向0.4ml等份的經(jīng)透析的DNA溶液中，加入0.4ml 2MLiCl和0.8ml乙醇。于-20℃溫育30分鐘后，通過離心(13,000rpm，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，德國)收集DNA。DNA沉淀溶于TE緩沖液中。用該方法制備的DNA可以用于所有目的，包括DNA印跡分析或基因組文庫的構(gòu)建。
實施例2構(gòu)建谷氨酸棒桿菌ATCC13032在大腸桿菌中的基因組文庫采用實施例1所述制備的DNA，按照已知的明確方法(參見例如Sambrook，J.等，(1989)“Molecular CloningA Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F(xiàn).M.等(1994)“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons.)構(gòu)建粘粒文庫和質(zhì)粒文庫。
可以使用任何質(zhì)?；蛘沉！＞唧w使用的質(zhì)粒是質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753737-3741)、pACYC177(Change & Cohen(1978)J.Bacteriol 1341141-1156)、pBS質(zhì)粒系列(pBSSK+、pBSSK-等；Stratagene，LaJolla，USA)或粘粒如SuperCosl(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，RosenthalA.和Waterson，R.H.(1987)Gene 53283-286)。使用質(zhì)粒pSL109可構(gòu)建特別用于谷氨酸棒桿菌的基因文庫(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)。
實施例3DNA測序和計算功能分析應(yīng)用實施例2描述的基因組文庫按照標(biāo)準(zhǔn)方法、尤其是利用ABI377測序儀的鏈終止法(參見例如Fleischman，R.D.等(1995)“流感嗜血桿菌Rd.的隨機全基因組測序和裝配”，Science，269496-512)進(jìn)行DNA測序。使用具有以下核苷酸序列的測序引物5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。
實施例4體內(nèi)誘變將質(zhì)粒(或其它載體)DNA通過保持遺傳信息完整性的能力受損的大腸桿菌或其它生物(例如桿菌屬桿菌或酵母如釀酒酵母)進(jìn)行傳代，從而可在體內(nèi)誘變谷氨酸棒桿菌。典型增變株的DNA修復(fù)系統(tǒng)基因存在突變(例如muHLS、mutD、mutT等；參考文獻(xiàn)見Rupp，W.D.(1996)DNA修復(fù)機制，載于Escherichia coli and Salmonella，第2277-2294頁，ASMWashington.)。這類菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies 732-34中介紹了所述菌株的使用。
實施例5大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌之間的DNA轉(zhuǎn)移若干棒桿菌屬和短桿菌屬物種含有自主復(fù)制(綜述參見例如Martin，J.F.等(1987)Biotechnology，5137-146)的內(nèi)源性質(zhì)粒(例如pHM1519或pBL1)。采用其中加入谷氨酸棒桿菌復(fù)制起點和谷氨酸棒桿菌合適標(biāo)記的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)載體(Sambrook，J.等(1989)，“MolecularCloningA Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Ausubel，F(xiàn).M.等(1994)“Current Protocols in Molecular Biology”，JohnWiley & Sons)，能夠容易地構(gòu)建大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體。所述復(fù)制起點優(yōu)選取自分離自棒桿菌屬和短桿菌屬物種的內(nèi)源性質(zhì)粒。具體使用的這些物種的轉(zhuǎn)化標(biāo)記為卡那霉素抗性基因(例如Tn5或Tn903轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的卡那霉素抗性基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)，F(xiàn)rom Genes to Clones-Introduction to GeneTechnology，VCH，Weinheim)。所述文獻(xiàn)中列舉了大量關(guān)于構(gòu)建各種穿梭載體的實例，所述穿梭載體可在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制而且可用于若干目的，包括基因過量表達(dá)(參考文獻(xiàn)參見例如Yoshihama，M.等(1985)J.Bacteriol.162591-597，Martin J.F.等(1987)Biotechnology，5137-146和Eikmanns，B.J.等(1991)Gene，10293-98)。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法可將目的基因克隆入一種上述穿梭載體并將這種雜合載體導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌菌株中?？刹捎靡韵路椒ㄞD(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Kastsumata，R.等(1984)J.Bacteriol.159306-311)、電穿孔(Liebl，E.等(1989)FEMS Microbiol.Letters，53399-303)，如果使用特殊載體，也可以采用接合方法(見例如Schfer，A等(1990)J.Bacteriol.1721663-1666)。通過制備谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒DNA(利用本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法)并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，也可以使穿梭載體從谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)移到大腸桿菌。采用標(biāo)準(zhǔn)方法可進(jìn)行這種步驟，但是最好使用Mcr缺陷大腸桿菌菌株如NM522(Gough & Murray(1983)J.Mol.Biol.1661-19)。
可使用包含pCG1(美國專利號4,617,267)或其片段和任選包含TN903卡那霉素抗性基因(Grindley，N.D.和Joyce，C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12)7176-7180)的質(zhì)粒在谷氨酸棒桿菌菌株中過量表達(dá)各種基因。此外，也可以使用質(zhì)粒pSL109在谷氨酸棒桿菌菌株中過量表達(dá)各種基因(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4256-263)。
除了使用復(fù)制型質(zhì)粒之外，也可以通過整合入基因組實現(xiàn)基因過量表達(dá)。利用周知的方法可實現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌或其它棒桿菌屬或短桿菌屬物種中的基因組整合，例如與基因組區(qū)的同源重組、限制性內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的融合(REMI)(參見例如DE專利19823834)或應(yīng)用轉(zhuǎn)座子。也可以采取以下措施修飾調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子、阻抑物和/或增強子)而調(diào)節(jié)目的基因的活性利用定點方法(例如同源重組)或基于隨機事件的方法(例如轉(zhuǎn)座子誘變或REMI)進(jìn)行序列修飾、插入或缺失。也可以在本發(fā)明一個或多個基因編碼區(qū)的3’插入轉(zhuǎn)錄終止子作用的核酸序列；所述終止子是本領(lǐng)域周知的，例如在Winnacker，E.L.(1987)FromGenes to Clones-Introduction to Gene Technology.VCHWeinheim)中有其介紹。
實施例6評價突變蛋白的表達(dá)觀測轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的突變蛋白活性依賴于這樣的事實突變蛋白以與野生型蛋白相似的方式和相似的量表達(dá)。一種確定突變基因轉(zhuǎn)錄水平(可翻譯成基因產(chǎn)物的mRNA量的指標(biāo))的有用方法是進(jìn)行RNA印跡(參考文獻(xiàn)見例如Ausubel等(1988)Current Protocols in MolecularBiology，Wiley紐約)，其中用可檢測標(biāo)記(通常為放射性或化學(xué)發(fā)光)標(biāo)記結(jié)合目的基因的設(shè)計引物，使得當(dāng)提取所述生物體培養(yǎng)物的總RNA、在凝膠上電泳、轉(zhuǎn)移至穩(wěn)定基體上以及與所述探針溫育時，所述探針的結(jié)合以及結(jié)合量可說明存在所述基因以及指示該基因的mRNA量。這樣的信息是突變基因轉(zhuǎn)錄程度的證據(jù)。應(yīng)用若干本領(lǐng)域周知的方法可從谷氨酸棒桿菌制備總細(xì)胞RNA，例如Bormann，E.R.等(1992)Mol.Microbiol.6317-326介紹的方法。
為了評價所述mRNA翻譯蛋白存在與否或相對量，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如蛋白質(zhì)印跡(參見例如Ausubel等(1988)Current Protocols inMolecular Biology，Wiley紐約)。在此過程中，提取總細(xì)胞蛋白，經(jīng)凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至如硝酸纖維素的基體上以及與特異性結(jié)合需要蛋白的探針如抗體溫育。這種探針一般用容易檢測的化學(xué)發(fā)光或比色標(biāo)記物標(biāo)記。觀測到標(biāo)記物存在和標(biāo)記物量說明所述細(xì)胞中存在需要的突變蛋白及其量。
實施例7遺傳改良的谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)-培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件用合成或天然生長培養(yǎng)基培養(yǎng)遺傳改良棒桿菌。用于棒桿菌的許多不同生長培養(yǎng)基是眾所周知的而且容易獲得(Lieb等(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32205-210；von der Osten等(1998)Biotechnology Letters，1111-16；專利DE 4,120,867；Liebl(1992)“棒桿菌屬”，載于The Procaryotes，第II卷，Balows，A.等編著，Springer-Verlag)。這些培養(yǎng)基的組成是一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和微量元素。優(yōu)選碳源為糖如單糖、二糖或多糖。例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素是非常好的碳源。也可以通過復(fù)合化合物如糖蜜或精制糖的其它副產(chǎn)品為培養(yǎng)基提供糖。提供不同碳源的混合物也可能是有益的。其它可能的碳源為醇類和有機酸，例如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常為有機或無機氮化合物，或者含有這些化合物的物質(zhì)。典型氮源包括氨氣或銨鹽，例如氯化銨或硫酸銨、氫氧化銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸或復(fù)合氮源如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏等。
培養(yǎng)基可含有的無機鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的鹽酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。所述培養(yǎng)基中可加入螯合化合物，以保持溶液中的金屬離子。特別有效的螯合化合物包括二羥基酚(例如兒茶酚或兒茶酚酸鹽)或有機酸(例如檸檬酸)。所述培養(yǎng)基還常規(guī)含有其它生長因子，例如維生素或生長促進(jìn)劑，其實例包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長因子和鹽通常源自復(fù)合培養(yǎng)基組分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。培養(yǎng)基復(fù)合物的確切成分與直接實驗密切相關(guān)而且具體取決于各特定情況。關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的信息可在教科書“Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編著，IRL Press(1997)，第53-73頁，ISBN 0 19 9635773)中獲得。也可以從商業(yè)供應(yīng)商選擇生長培養(yǎng)基，例如標(biāo)準(zhǔn)1號(Merck)或BHI(grain heart infusion，DIFCO)等。
所有培養(yǎng)基組分通過加熱(于1.5帕和121℃ 20分鐘)或無菌過濾消毒。所述組分可一起消毒，如果需要可分別消毒。所有培養(yǎng)基組分可培養(yǎng)開始時就存在，或者可以任選連續(xù)或分批加入。
每個實驗分別規(guī)定培養(yǎng)條件。溫度應(yīng)為15℃-45℃。培養(yǎng)溫度可保持恒定或?qū)嶒炛懈淖?。培養(yǎng)基的pH應(yīng)為5-8.5、優(yōu)選約7.0，可在培養(yǎng)基中加入緩沖劑維持pH。用于該目的的典型緩沖劑為磷酸鉀緩沖劑。可選擇使用或同時使用合成緩沖劑如MOPS、HEPES、ACES等。也可以在培養(yǎng)期間加入氫氧化鈉或氫氧化銨維持恒定培養(yǎng)pH。如果使用復(fù)合培養(yǎng)基組分如酵母提取物，對額外緩沖劑的需要可能降低，因為實際上許多復(fù)合化合物具有高緩沖能力。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)所述微生物，也可以使用氨氣控制pH。
培養(yǎng)時間通常為數(shù)小時至數(shù)天。選擇培養(yǎng)時間以使液體培養(yǎng)基累積的產(chǎn)物量最多。可用各種容器進(jìn)行所公開的使用，例如微量滴定板、玻璃管、玻璃瓶或不同大小的玻璃或金屬發(fā)酵罐。為了篩選大量克隆，應(yīng)用微量滴定板、玻璃管或搖瓶(帶有或沒有擋板)。優(yōu)選使用100ml搖瓶，其中裝以10％(體積)需要的生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶應(yīng)在搖床(振幅25mm)上以100-300rpm速度范圍振搖。維持濕潤氣氛使蒸發(fā)喪失最少；或者應(yīng)進(jìn)行精確校正蒸發(fā)損失。
如果測試遺傳改進(jìn)克隆，也應(yīng)該測試未改良的對照克隆或含沒有任何插入片段的基礎(chǔ)質(zhì)粒的對照克隆。利用已經(jīng)于30℃溫育的瓊脂平板如CM平板(10g/l葡萄糖、2.5g/l氯化鈉、2g/l尿素、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l肉膏、22g/l氯化鈉、2g/l尿素、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l肉膏、22g/l瓊脂，用2M氫氧化鈉調(diào)至pH6.8)上的細(xì)胞接種培養(yǎng)基至OD600為0.5-1.5。加入得自CM平板的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的鹽水懸浮液或加入該菌的液體預(yù)培養(yǎng)物，從而完成培養(yǎng)基接種。
實施例8體外分析突變蛋白的功能本領(lǐng)域已有明確的酶活性和動力學(xué)參數(shù)測定法。必須使測定任何給定改變酶活性的實驗適合野生型酶的比活，這完全在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。關(guān)于酶的一般介紹以及涉及結(jié)構(gòu)、動力學(xué)、原理、方法、應(yīng)用的具體細(xì)節(jié)和許多酶活性測定實例可見于例如以下文獻(xiàn)Dixon，M.和Webb，E.C.，(1979)Enzymes，LongmansLondon；Fersht，(1985)Enzyme Structure and Mechanism，F(xiàn)reeman紐約；Walsh，(1979)Enzymatic Reaction Mechanisms.FreemanSan Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)Fundamentals of Enzymology.Oxford Univ.PressOxford；Boyer，P.D.編著(1983)The Enzymes，第三版，Academic Press紐約；Bisswanger，H.，(1994)Enzymkinetik，第二版，VCHWeinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.編著(1983-1986)Methods of Enzymatic Analysis，第三版，第I-XII卷，VerlagChemieWeinheim；以及Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1987)，第A9卷，“Enzymes”，VCHWeinheim，第352-363頁。
可應(yīng)用數(shù)種明確的方法如DNA條帶移位測定(也稱為凝膠阻滯測定)測定結(jié)合DNA的蛋白活性?？捎脠蟮阑驕y定(例如Kolmar，H.等(1995)EMBO J.143895-3904以及其中的引用文獻(xiàn)介紹的測定)測量所述蛋白對其它分子表達(dá)的影響。報道基因測試系統(tǒng)是眾所周知的而且明確用于原核生物細(xì)胞和真核生物細(xì)胞，利用酶如β半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白等。
按照例如Gennis，R.B.(1989)“孔穴、通道與轉(zhuǎn)運蛋白”，載于Biomembranes，Molecular Structure and Function，SpringerHeidelberg，第85-137、199-234和270-322頁介紹的方法，可測定膜轉(zhuǎn)運蛋白的活性。
實施例9分析突變蛋白對需要產(chǎn)物產(chǎn)生的影響可如下檢測谷氨酸棒桿菌的遺傳改進(jìn)對需要化合物(例如氨基酸)產(chǎn)生的影響使改良微生物在合適條件(例如上述條件)下生長，然后分析所述培養(yǎng)基和/或細(xì)胞組分中的需要產(chǎn)物(即氨基酸)的產(chǎn)量增加情況。所述分析技術(shù)是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員周知的，包括光譜檢測法、薄層層析、各種染色法、酶以及微生物學(xué)方法、以及分析型層析法如高效液相層析(參見例如Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第89-90和443-613頁，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.等，(1987)“HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用”，載于Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等(1993)Biotechnology，第3卷，第III章“產(chǎn)物的回收與純化”，第469-714頁，VCHWeinheim；Belter，P.A.等(1988)Bioseparationsdownstreamprocessing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological materials，John Wiley和Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學(xué)分離，載于Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第B3卷，第11章，第1-27頁，VCHWeinheim；以及Dechow，F(xiàn).J.(1989)Separation andpurification techniques in biotechnology，Noyes Publications)。
除了檢測發(fā)酵終產(chǎn)物之外，也可以分析用以產(chǎn)生需要產(chǎn)物的代謝途徑的其它組分，例如中間體和副產(chǎn)物，以確定產(chǎn)生所述化合物的總體效率。分析方法包括測量培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素水平(例如糖、烴類、氮源、磷酸鹽和其它離子)、檢測生物量組成和生長、分析生物合成途徑共同代謝物的產(chǎn)量以及測量發(fā)酵期間產(chǎn)生的氣體。這些檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法概述于Applied Microbial Physiology，A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編著，IRL Press，第103-129、131-163和165-192頁(ISBN0199635773)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。
實施例10從谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物純化需要產(chǎn)物可用本領(lǐng)域周知的各種方法從上述培養(yǎng)物的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞或上清液中回收需要產(chǎn)物。如果需要產(chǎn)物不從細(xì)胞中分泌出來，可以通過低速離心從培養(yǎng)物收獲細(xì)胞，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法裂解細(xì)胞，例如機械力或超聲。離心去除細(xì)胞碎片，保留含有所述可溶性蛋白的上清液部分供進(jìn)一步純化所需要的化合物。如果產(chǎn)物從谷氨酸棒桿菌細(xì)胞分泌出來，則通過低速離心從所述培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，保留上清液部分供進(jìn)一步純化。
使得自任一純化方法的上清液部分在合適樹脂上進(jìn)行層析，或者需要分子保留在層析樹脂上而樣品中的大多數(shù)雜質(zhì)被洗出，或者雜質(zhì)保留在樹脂上而需要分子樣品被洗出。根據(jù)需要可重復(fù)所述層析步驟，使用相同或不同層析樹脂。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員在選擇合適層析樹脂和將所述樹脂最有效地應(yīng)用于待純化的特定分子方面是非常精通的。純化產(chǎn)物可通過過濾或超濾濃縮，貯藏在產(chǎn)物最穩(wěn)定的溫度狀態(tài)下。
有許多本領(lǐng)域已知的純化方法，上述純化方法并不是限制性的。這樣的純化方法描述于例如Bailey，J.E.& Ollis，D.F.，BiochemicalEngineering Fundamentals，McGraw-Hill紐約(1986)。
應(yīng)用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可檢測分離化合物的身份和純度。所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括高效液相色譜(HPLC)、光譜法、染色法、薄層層析、NIRS、酶測定法或微生物測定法。所述分析方法的綜述見Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；以及Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer，1967-70；Ulmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90、521-540、540-547、559-566、575-581和581-587頁；Michal，G.(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of biochemistry and MolecularBiology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用，載于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷。
實施例11分析本發(fā)明的基因序列比較序列并確定兩種序列的同源性百分率是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，可以采用數(shù)學(xué)算法完成，例如Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68)及其改良算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77。這種算法加入了Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)?？蓱?yīng)用NBLAST程序，打分＝100，字串長度＝12進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，以便獲得與本發(fā)明SMP核酸分子同源的核苷酸序列?？蓱?yīng)用XBLAT程序，打分＝50，字串長度＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，以便獲得與本發(fā)明SMP蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得比較目的的帶空位序列對比，可按照Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res 25(17)3389-3402所述，使用Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何優(yōu)化用于分析特定序列的程序(例如XBLAST和NBLAST)參數(shù)。
用于序列比較的另一個數(shù)學(xué)算法實例是Meyers和Miller算法((1988)Comput.Appl.Biosci.411-17)。這種算法加入了ALIGN程序(2.0版)，ALIGN程序是GCG序列對比軟件包的組成部分。當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可使用PAM120權(quán)重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。其它序列分析算法是本領(lǐng)域已知的，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5介紹的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)P.N.A.S.852444-8介紹的FASTA。
也可以使用GCG軟件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com獲得)，選用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣以及空位權(quán)重為12、10、8、6或4而長度權(quán)重為2、3或4，獲得兩種氨基酸序列的同源性百分率計算。應(yīng)用GCG軟件包中的GAP程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，例如空位權(quán)重50而長度權(quán)重3，可獲得兩種核酸序列的同源性百分率。采用本領(lǐng)域已知的方法(參見例如Bexevanis和Ouellette編著(1998)BioinformaticsA Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，John Wiley和Sons紐約)，可進(jìn)行本發(fā)明基因序列與Genbank序列的比較分析。以3步驟方法比較本發(fā)明基因序列與Genbank序列。第一步，對本發(fā)明各序列與Genbank核苷酸序列進(jìn)行BLASTN分析(例如局部對比分析)，保留前500個命中序列供進(jìn)一步分析。第二步，對這500個命中序列進(jìn)行FASTA檢索(例如聯(lián)合局部和全局序列的綜合對比分析，其中排列對比序列限定區(qū)域)。最后，采用GCG軟件包中的GAP程序(使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù))，對本發(fā)明各基因序列與前3個FASTA命中序列中的每一個進(jìn)行全局性序列對比。為了獲得正確的結(jié)果，應(yīng)用本領(lǐng)域周知的方法使從Genbank取出的序列長度調(diào)整為查詢序列長度。分析結(jié)果見表4。獲得的數(shù)據(jù)與單獨對本發(fā)明各基因與Genbank各參考序列進(jìn)行GAP(全局)分析獲得的數(shù)據(jù)相同，但是與這樣的數(shù)據(jù)庫-寬GAP(全局)分析相比，需要的計算時間顯著減少。沒有獲得高于閾值的序列對比的本發(fā)明序列在表4中標(biāo)示為沒有序列對比信息。進(jìn)而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道的是，表4表頭“同源性(％)(GAP)”下的GAP序列對比同源性百分率是以歐洲數(shù)字格式列出的，其中“，”代表小數(shù)點。例如該欄中的數(shù)值“40,345”是指“40.345％”。
實施例12構(gòu)建和操作DNA微陣列此外，本發(fā)明序列可以用于構(gòu)建和操作DNA微陣列(DNA陣列的設(shè)計、方法學(xué)以及使用是本領(lǐng)域眾所周知的，例如在以下文獻(xiàn)中有其介紹Schena，M.等(1995)Science 270467-470；Wodicka，L.等(1997)Nature Biotechnology 151359-1367；DeSaizieu，A.等(1998)NatureBiotechnology 1645-48；以及DeRisi，J.L.等(1997)Science 278680-686)。
DNA微陣列是固體或柔性支持物，由硝酸纖維素、尼龍、玻璃、硅酮或其它材料組成。核酸分子與支持物表面有序結(jié)合。適當(dāng)標(biāo)記后，其它核酸或核酸混合物可與固定核酸分子雜交，標(biāo)記物可用來監(jiān)測和測量確定區(qū)域中的雜交分子的各信號強度。該方法可同時定量所加核酸樣品或混合物中全部或選定核酸的相對量或絕對量。因此，DNA微陣列可平行分析多個(多達(dá)6800個或更多)核酸的表達(dá)(參見例如Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)427-431)。
本發(fā)明序列可用來設(shè)計寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物能夠通過諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴增反應(yīng)擴增一種或多種谷氨酸棒桿菌基因的規(guī)定區(qū)域。選擇和設(shè)計5’或3’寡核苷酸引物或合適接頭可使產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與上述支持物介質(zhì)表面共價連接(此外，參見例如Schena，M.等(1995)Science 270467-470介紹)。
按照Wodicka，L.等(1997)Nature Biotechnology 151359-1367介紹，也可以通過原位寡核苷酸合成構(gòu)建核酸微陣列。應(yīng)用照相制板法使基體精確定義區(qū)曝光。由此激活光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)，并加入核苷酸，而避光區(qū)則不會發(fā)生任何改變。隨后的保護(hù)和光激活循環(huán)使得在定義區(qū)合成不同寡核苷酸。通過固相寡核苷酸合成可在微陣列上合成本發(fā)明基因限定區(qū)。
樣品或核苷酸混合物中存在的本發(fā)明核酸分子可與所述微陣列雜交。按照標(biāo)準(zhǔn)方法可標(biāo)記這些核酸分子。簡而言之，例如逆轉(zhuǎn)錄或DNA合成時通過摻入同位素或熒光標(biāo)記核苷酸，從而標(biāo)記核酸分子(例如mRNA分子或DNA分子)。已有關(guān)于標(biāo)記核酸與微陣列雜交的介紹(例如載于Schena，M等(1995)同上；Wokicka，L等(1997)，同上；以及DeSaizieu A.等(1998)，同上)。雜交分子的檢測和定量須適合特定摻入標(biāo)記物。例如按照Schena，M等(1995)(同上)介紹可檢測放射性標(biāo)記物，而例如按照Shalon等((1996)Genome Research 6639-645)的方法可檢測熒光標(biāo)記物。
如上所述，將本發(fā)明序列用于DNA微陣列技術(shù)可比較分析谷氨酸棒桿菌或其它棒桿菌屬的不同菌株。例如，核酸陣列方法學(xué)有助于根據(jù)各個轉(zhuǎn)錄物分布研究菌株內(nèi)變異和鑒定對于特定和/或所需菌株特性如致病性、生產(chǎn)能力和脅迫耐受性重要的基因。此外，利用核酸陣列方法可以比較發(fā)酵期間本發(fā)明基因的表達(dá)分布。
實施例13分析細(xì)胞蛋白群動力學(xué)(蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics))本發(fā)明基因、組合物和方法可用于研究蛋白群相互作用和動力學(xué)，稱為“蛋白質(zhì)組學(xué)”。目的蛋白群包括但不限于谷氨酸棒桿菌總蛋白群(例如與其它生物體的蛋白群比較)、在特定環(huán)境或代謝條件下(例如發(fā)酵期間的高溫或低溫，或者高pH或低pH)具有活性的蛋白、在培養(yǎng)和發(fā)展特定期具有活性的蛋白。
可用本領(lǐng)域周知的方法如凝膠電泳分析蛋白質(zhì)群。例如通過裂解或提取可獲得細(xì)胞蛋白，應(yīng)用各種電泳技術(shù)可使蛋白群彼此分開。十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)主要根據(jù)蛋白分子量分離蛋白。等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF-PAGE)通過蛋白等電點(它不僅反映氨基酸序列，而且反映所述蛋白翻譯后修飾)分離蛋白。另一個更優(yōu)選的蛋白分析方法是IEF-PAGE和SDS-PAGE的順序組合，稱為2-D-gel電泳(例如見以下文獻(xiàn)介紹Hermann等(1998)Electrophoresis 193217-3221；Fountoulakis等(1998)Electrophoresis 191193-1202；Langen等(1997)Electrophoresis 181184-1192；Antelmann等(1997)Electrophoresis 181451-1463)。也可以使用其它蛋白分析方法進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，例如毛細(xì)管電泳；所述技術(shù)是本領(lǐng)域周知的技術(shù)。
可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如染色或標(biāo)記，顯現(xiàn)所述方法分開的蛋白。合適染料是本領(lǐng)域已知的，包括考馬斯亮藍(lán)、銀染料或熒光染料如SyproRuby(Molecular Probes)。在谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)基中含有放射性標(biāo)記氨基酸或其它蛋白前體(例如35S-甲硫氨酸、35S-半胱氨酸、14C-標(biāo)記氨基酸、15N-標(biāo)記氨基酸、15NO3或15NH4+或13C-標(biāo)記氨基酸)可在其分離前標(biāo)記這些細(xì)胞的蛋白。同樣可使用熒光標(biāo)記物?？砂凑涨笆龇椒ㄌ崛　⒎珠_和分離所述標(biāo)記蛋白。
通過測量所用染料或標(biāo)記物量，可進(jìn)一步分析所述技術(shù)顯現(xiàn)的蛋白。采用例如光學(xué)方法可定量測定給定蛋白量，而且可以與相同凝膠或其它凝膠上的其它蛋白量比較。例如采用光學(xué)比較、光譜法、圖象掃描和凝膠分析、或者通過應(yīng)用照相膠片和屏幕，可在凝膠上進(jìn)行蛋白比較。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域周知的。
為了確定任何給定蛋白的身份，可采用直接測序或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？墒褂美鏝-和/或C-末端氨基酸測序(例如Edman降解)，也可以使用質(zhì)譜法(尤其是MALDI或ESI技術(shù)(參見例如Langen等(1997)Electrophoresis 181184-1192))。本發(fā)明提供的蛋白序列可用于通過所述技術(shù)鑒定谷氨酸棒桿菌蛋白。
所述方法獲得的信息可用于比較各種生物條件(例如不同生物、不同發(fā)酵時間點、不同培養(yǎng)基條件或不同群落生境等)的不同樣品之間的蛋白存在模式、蛋白活性或蛋白修飾。這些實驗單獨或與其它技術(shù)聯(lián)合獲得的資料可用于各種用途，例如比較給定(例如代謝)情況下各種生物的行為、提高生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的菌株的生產(chǎn)能力或提高生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率。
等同實施方案本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或者僅采用常規(guī)實驗就能夠確定本發(fā)明介紹的具體實施方案的許多等同實施方案。以下的權(quán)利要求書包括這樣的等同實施方案。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含選自SEQID NO1至781的各奇數(shù)核酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因組成。
2.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子編碼包含選自SEQ ID NO2至782的各偶數(shù)氨基酸序列的多肽，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因組成。
3.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子編碼一種多肽的天然存在的等位基因變異體，所述多肽包含選自SEQ ID NO2至782的各偶數(shù)氨基酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因組成。
4.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含與SEQ IDNO1至781的任意奇數(shù)完整核苷酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因組成。
5.一種分離的核酸分子或其互補序列，所述核酸分子包含選自SEQID NO1至781的任意奇數(shù)核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因組成。
6.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含權(quán)利要求1-5中任一項的核酸分子和一種編碼異源多肽的核苷酸序列。
7.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求1-6中任一項的核酸分子。
8.權(quán)利要求7的載體，所述載體為表達(dá)載體。
9.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求8的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是微生物。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)。
12.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致對由所述細(xì)胞產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品進(jìn)行調(diào)節(jié)。
13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述精細(xì)化學(xué)品選自有機酸、生成蛋白質(zhì)的氨基酸和非生成蛋白質(zhì)的氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷、核苷酸、脂質(zhì)、飽和和不飽和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素、輔因子、聚酮化合物和酶。
14.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)所述多肽。
15.一種分離的多肽，所述多肽包含選自SEQ ID NO2至782的各偶數(shù)氨基酸序列，前提是所述氨基酸序列不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因編碼。
16.一種分離的多肽，所述多肽包含一種含有選自SEQ ID NO2至782的各偶數(shù)氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變異體，前提是所述氨基酸序列不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因編碼。
17.一種分離的多肽，所述多肽由一種核酸分子編碼，所述核酸分子包含與SEQ ID NO1至781的任意奇數(shù)完整核酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的核酸分子組成。
18.一種分離的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO2至782的任意偶數(shù)完整氨基酸序列至少有50％同一性的氨基酸序列，前提是所述氨基酸序列不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因編碼。
19.一種分離的多肽，所述多肽包含一種含有SEQ ID NO2至782的任意偶數(shù)氨基酸序列的多肽的片段，前提是所述氨基酸序列不由表1給出的任何F標(biāo)志的基因編碼，其中所述多肽片段保持包含氨基酸序列的多肽的生物活性。
20.一種分離的多肽，所述多肽由包含SEQ ID NO1至781的任意奇數(shù)核苷酸序列的核酸分子編碼，前提是所述核酸分子不由表1給出的任何F標(biāo)志的核酸分子組成。
21.權(quán)利要求15-20中任一項的分離多肽，所述多肽還包含異源氨基酸序列。
22.一種生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求9的細(xì)胞，由此生產(chǎn)所述精細(xì)化學(xué)品。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述方法還包括從所述培養(yǎng)物回收所述精細(xì)化學(xué)品的步驟。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞屬于棒桿菌屬或短桿菌屬。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)、百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒桿菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酰棒桿菌(Corynebacterium acetophilum)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium fujiokense、Corynebacterium nitrilophilus、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium butanicum、谷氨酸棒桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、希氏短桿菌(Brevibacterium healii)、酮戊二酸短桿菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、Brevibacterium ketosoreductum、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、擴展短桿菌(Brevlbacterium linens)、Brevibacterium paraffinolyticum和表3中給出的菌株。
26.權(quán)利要求22的方法，其中來自所述載體的所述核酸分子的表達(dá)導(dǎo)致對所述精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)產(chǎn)生調(diào)節(jié)。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述精細(xì)化學(xué)品選自有機酸、生成蛋白質(zhì)的氨基酸和非生成蛋白質(zhì)的氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷、核苷酸、脂質(zhì)、飽和和不飽和脂肪酸、二元醇、糖類、芳族化合物、維生素、輔因子、聚酮化合物和酶。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所述精細(xì)化學(xué)品為氨基酸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述氨基酸選自賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
30.一種生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的方法，所述方法包括培養(yǎng)其基因組DNA因為含有權(quán)利要求1-6中任一項的核酸分子而改變的細(xì)胞。
31.一種診斷受治療者體內(nèi)白喉棒桿菌的存在或其活性的方法，所述方法包括檢測所述受治療者體內(nèi)是否存在權(quán)利要求1-5的核酸分子或權(quán)利要求15-20的多肽分子中的至少一種，由此診斷所述受治療者體內(nèi)白喉棒桿菌的存在或活性。
32.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含選自SEQ ID NO1至781的各奇數(shù)核酸分子，其中所述核酸分子被破壞。
33.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含選自SEQ ID NO1至781的各奇數(shù)核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ ID NO1至781的任意奇數(shù)序列相比包含一個或多個核酸修飾。
34.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含選自SEQ ID NO1至781的各奇數(shù)核酸分子，其中相對于所述核酸分子的野生型調(diào)節(jié)區(qū)而言，所述核酸分子的調(diào)節(jié)區(qū)被修飾。
全文摘要
本發(fā)明介紹了編碼谷氨酸棒桿菌新型SMP蛋白的分離核酸分子(稱為SMP核酸分子)。本發(fā)明還提供反義核酸分子、含有SMP核酸分子的重組表達(dá)載體以及導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供分離的SMP蛋白、突變SMP蛋白、融合蛋白、抗原性肽以及改進(jìn)用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)需要化合物的方法，該方法的基礎(chǔ)是遺傳工程改進(jìn)的谷氨酸棒桿菌SMP基因。
文檔編號C12Q1/68GK1920040SQ20061010740
公開日2007年2月28日 申請日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者M·波姆佩朱斯, B·克雷格爾, H·施雷德爾, O·策爾德, G·哈貝豪爾 申請人:Basf公司