專利名稱：一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物對(duì)鹽分的抗性是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜性狀。鹽分對(duì)植物的影響涉及到植物體內(nèi)的各個(gè)方面和代謝過程，包括離子毒害，滲透脅迫和氧化脅迫以及光合作用。
在胡蘿卜素的合成途徑中，除了八氫番茄紅素合成酶(PSY)以外，還有一個(gè)重要的酶即番茄紅素環(huán)化酶。植物光合系統(tǒng)中的類胡蘿卜素是一個(gè)雙環(huán)復(fù)合物。在類胡蘿卜素的合成過程中有一個(gè)分支點(diǎn)，分別由(番茄紅素ε-環(huán)化酶)LCYE和(番茄紅素β-環(huán)化酶)LCYB催化形成含有ε-環(huán)和β-環(huán)的6-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素。然后再經(jīng)過一次β-環(huán)化反應(yīng)分別形成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素是植物體內(nèi)最重要的單線氧淬滅劑，同時(shí)它是葉黃素循環(huán)色素和ABA的前體物質(zhì)。Rosati等將番茄β-番茄紅素環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)入番茄，結(jié)果果實(shí)中β-胡蘿卜素的含量增加了3.8倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗逆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的植物抗逆相關(guān)蛋白，名稱為SeLCY，來源于鹽角草(Salicornia europaea L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列1由498個(gè)氨基酸殘基組成。
所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆性相關(guān)蛋白編碼基因(SeLCY)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述植物抗逆性相關(guān)蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1937個(gè)脫氧核苷酸組成，自5′端第295-1788位脫氧核苷酸為編碼序列。
含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的SeLCY基因可用現(xiàn)有的方法構(gòu)建到現(xiàn)有的植物表達(dá)載體中，可在其轉(zhuǎn)錄超始核苷酸前加上包括組成型啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子在內(nèi)的任何一種啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)SeLCY基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(Bar基因、GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。攜帶有本發(fā)明的SeLCY基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株，獲得抗逆性提高的植株。
實(shí)驗(yàn)證明，在逆境條件下，轉(zhuǎn)SeLCY擬南芥比野生型擬南芥具有較強(qiáng)的抗逆性，特別是具有較強(qiáng)的抗鹽性和抗氧化性。轉(zhuǎn)基因擬南芥的光合效率和氣孔導(dǎo)度得到了提高，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因株系的生長。
將本發(fā)明的植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入其他植物中，可增強(qiáng)植物的抗逆性，特別是增強(qiáng)對(duì)鹽、氧化的抗性。


圖1為SeLCY中間片段的獲得圖2為SeLCY基因全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3為SeLCY與其他生物八氫番茄紅素合成酶氨基酸序列比較4為SeLCY蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圖5為SeLCY跨膜預(yù)測(cè)圖6為不同生物L(fēng)CY蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較圖7為SeLCY全長的PCR擴(kuò)增圖8為植物表達(dá)載體p35S-1301-SeLCY構(gòu)建過程圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色圖10為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定圖11為轉(zhuǎn)基因擬南芥的Southern和Northern分析圖12為100mM NaCl對(duì)SeLCY轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗生長的影響圖13為百草枯和NaCl處理野生和SeLCY轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片產(chǎn)生的斑點(diǎn)圖14為NaCl脅迫下SeLCY轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生植株中的丙二醛含量圖15為NaCl脅迫下SeLCY轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生植株中的H2O2含量圖16為NaCl處理下野生和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的POD，SOD，CAT活性圖17為SeLCY超表達(dá)擬南芥植株在100mM NaCl脅迫下光合速率的變化圖18為SeLCY超表達(dá)擬南芥植株在100mM NaCl脅迫下氣孔導(dǎo)度的變化圖19為SeLCY超表達(dá)擬南芥植株在100mM NaCl脅迫下Fv/Fm的變化具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、SeLCY蛋白及其編碼基因的獲得擬南芥(Arabidopsis thaliana)，生態(tài)型為Columbia，22℃，16hr光照培養(yǎng)。
菌株大腸桿菌TOP10，購自北京天根公司。
質(zhì)粒pUCm-T載體購自上海生物工程公司，氨卞青霉素(Amp)抗性，用于T/A克隆。
一、SeLCY基因中間片段的獲得鹽角草RNA的提取(Trizol法)將鹽角草幼苗在液氮冷凍條件下充分研磨，保證材料沒有融化，將樣品轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管，并稱重，保證樣品在150-200mg之間，迅速加入1ml Trizol，在渦旋器上迅速混勻(小心防止離心管蓋脹開)，在15-30℃放置5min，裂解蛋白復(fù)合體。然后加入0.2ml氯仿，上下?lián)u動(dòng)15sec，在15-30℃放置2-3min，再在4℃，12000rpm離心15min，將水相轉(zhuǎn)入新管后，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，在15-30℃放置10min。棄去上清，加入75％乙醇1ml，清洗沉淀。在4℃，7500rpm離心5min。室溫干燥5-10min。加入20μl Rnase-free的無菌水溶解沉淀，在55-60℃溶解10min。電泳檢測(cè)結(jié)果表明鹽角草幼苗的總RNA沒有降解。
通過對(duì)GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中擬南芥，水稻，番茄，煙草，萬壽菊等11種植物的番茄紅素β-環(huán)化酶基因核苷酸序列進(jìn)行多重序列比較，在保守序列處設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。
根據(jù)NCBI上登錄的不同植物L(fēng)CY基因的序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。
LCY-15’-TGTTTGGGT(G/T)GATGA(A/G)TT(T/C)G-3’LCY-25’-AA(C/A)CCATGCCAATAA(T/C)G(T/A)GG-3’將鹽角草幼苗的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此cDNA為模板，以LCY-1和LCY-2為引物，退火溫度為46℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為cDNA 2.0μl(2.0ug)，H2O 13.3μl，dNTP 0.5μl(10mM)，10×PCR buffer 2.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.2μl(5U/μl)，引物(LCY-1)1.0μl(10μM)，引物(LCY-2)1.0μl(10μM)。
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)先94℃5min；然后94℃ 30sec，46℃ 30sec，72℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，得到一條978bp的SeLCY的cDNA中間片段，圖1中泳道M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道7為PCR擴(kuò)增獲得的978bp的cDNA中間片段(箭頭示)。將該cDNA中間片段連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，經(jīng)測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行Blastn比較，結(jié)果與多種植物L(fēng)CY基因有較高的同源性。
二、SeLCY基因全序列的獲得1、3’-RACE擴(kuò)增根據(jù)步驟一得到的978bp的SeLCY的cDNA中間片段核苷酸序列，設(shè)計(jì)3’-RACE引物。
LCY-35’-GTATTTGGGTTCAGGAGGCAG-3’以LCY-3和AUAP為引物，以步驟一獲得的第一鏈cDNA為模板，設(shè)計(jì)退火溫度為50℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系第一鏈cDNA 2.0μl(2.0ug)，水13.3μl，dNTP 0.5μl(10mM)，10×PCR buffer 2.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.2μl(5U/μl)，AUAP引物1.0μl(10μM)，引物(LCY-3)1.0μl(10μM)。
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)先94℃ 5min；然后94℃ 30sec，50℃30sec，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。
2、3’-RACE巢式擴(kuò)增
由于第一次擴(kuò)增效果不好，故設(shè)計(jì)巢式引物L(fēng)CY-4重新擴(kuò)增。
LCY-45’-GAGGCAGGCAGGATGGAAGTG-3’以LCY-4和AUAP為引物，以上述LCY-3和AUAP擴(kuò)增得到的3’-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，退火溫度為55℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增體系PCR產(chǎn)物2.0μl(2.0ug)，H2O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，AUAP 2.0μl(10μM)，Primer(PSY-4)2.0μl(10μM)。
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。電泳檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)兩次PCR擴(kuò)增獲得537bp的基因片段。
3、5’-RACE擴(kuò)增根據(jù)步驟1得到的978bp的SeLCY的cDNA中間片段的核苷酸序列，設(shè)計(jì)5’-RACE引物L(fēng)CY-5進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
1)反轉(zhuǎn)錄LCY-55’-CGAGGCAATCAAGCAAATCC-3’。
按照以下成分調(diào)和第一鏈反應(yīng)液LCY-5 1.0μl(10μM)，按照步驟1的方法提取的總RNA 6.0μl(5μg)，dNTP 1.0μl，DEPC-H2O 5.0μl。
將該第一鏈反應(yīng)液在65℃反應(yīng)5min，然后冰上冷卻，瞬時(shí)離心。然后加入5×buffer 4.0μl，0.1M DTT 1.0μl，Rnaseout 1.0μl，SuperscriptIII 1.0μl，混勻離心，50℃，50min，70℃，15min。迅速冰浴，瞬時(shí)離心，加入RnaseH1.0μl，輕輕混勻，37℃，20min。保存于-20℃。
2)5’-RACE第一鏈cDNA純化(使用Gibco回收試劑盒)向第一鏈反應(yīng)物中加入120μl Binding solution。將該溶液轉(zhuǎn)入Glassmaxspin carridge中，13000rpm離心20min。將離心柱從離心管中取出，將離心管中溶液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新管中保存，直到確定cDNA已經(jīng)成功回收。并將柱子放回到離心管中。在柱子中加入0.4ml 4℃預(yù)冷的1×washing buffer，13000rpm離心20min。倒掉離心管中溶液，并重復(fù)3次。用400μl 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗滌2次。13000rpm離心1min。以去掉70％乙醇。將柱子轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)新管中，加入50μl 65℃預(yù)熱的滅菌蒸餾水，13000g離心20sec，回收cDNA。
3)第一鏈cDNA的加尾反應(yīng)將純化回收的第一鏈cDNA 9.5μl(9.5μg)，5×Tailing buffer5.0μl，0.1％BSA 2.5μl和2mM dCTP 6.0μl混合均勻后在94℃變性2min，冰上冷卻1min。加入TdT 2.0μl，在37℃反應(yīng)30min，65℃失活10min。
4)5’-RACE第一輪PCRAbridged anchor promer5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’第一輪PCR反應(yīng)體系第一鏈cDNA 2.0μl(2.0ug)，H2O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，Abridged anchor promer 2.0μl(10μM)，引物(LCY-5)2.0μl(10μM)。
擴(kuò)增程序先94℃ 5min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。
5)第二輪巢式PCR根據(jù)引物L(fēng)CY-5，設(shè)計(jì)巢式引物L(fēng)CY-65’-TGGCTTCAAACTCATCAACCC-3’以LCY-6和AUAP為引物，退火溫度為55℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系5′RACE第一輪PCR產(chǎn)物2.0μl(2.0ug)，H2O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，AUAP 2.0μl(10μM)，引物(LCY-6)2.0μl(10μM)。
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)先94℃ 2min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。4℃保存。電泳檢測(cè)。結(jié)果表明最終得到697bp的SeLCY基因5’序列。
4、SeLCY全長cDNA片段的擴(kuò)增根據(jù)測(cè)定的SeLCY基因5’-RACE，3’-RACE以及中間片段的序列，采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，獲得全長為1937bp的核苷酸序列。然后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長的cDNA片段。
LCY-75’-CACTCAGCCACAACAACCATT-3’LCY-85’-ACGTATCAACAGAGTGTATTG-3’以LCY-7和LCY-8為引物，以鹽角草幼苗的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為鹽角草幼苗的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA 2.0μl(2.0ug)，H2O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，LCY-7 2.0μl(10μM)，LCY-8 2.0μl(10μM)。
按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)先94℃ 3min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min。4℃保存。電泳檢測(cè)結(jié)果表明獲得1906bp的片段(圖2)。圖2中，泳道M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為PCR擴(kuò)增獲得的1906bp SeLCY基因片段(箭頭示)。測(cè)序結(jié)果表明該1906bp的片段具有由自序列1的5′端的第1至1906位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
SeLCY具有序列表中序列1的核苷酸序列。NCBI檢索結(jié)果表明SeLCY和許多物種的LCY基因有很高的同源性。該序列包括1494bp的開放讀碼框(openreading frame，ORF)(自序列1的5′端第295-1788位核苷酸序列)，294個(gè)堿基的5′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)(自序列1的5′端第1-294位核苷酸序列)，120個(gè)堿基的3′非翻譯區(qū)(自序列1的5′端第1789-1908位核苷酸序列)和29個(gè)堿基的多聚腺苷酸(自序列1的5′端第1909-1937位核苷酸序列)。此cDNA編碼一個(gè)498個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)SeLCY，SeLCY具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列，推測(cè)分子量為56.1kDa，等電點(diǎn)為8.41。
5、SeLCY蛋白的同源性分析為了將鹽角草的SeLCY的氨基酸序列和其它細(xì)菌、藍(lán)藻和高等植物的LCY基因編碼的蛋白進(jìn)行同源性分析，從NCBI網(wǎng)站上檢索到歐文氏菌(Pantoeaagglomerans)，藍(lán)藻(Synechococcus sp.CC9605)，擬南芥(A.thaliana)，番茄(Lycopersicon esculentum)，煙草(Nicotiana tabacum)，甜椒(Capsicumannuum)，柑桔(Citrus sinensis)等生物的LCY同源基因的蛋白序列。通過DNAMAN軟件分析結(jié)果表明SeLCY蛋白編碼的氨基酸序列與它們的同源性分別為15％，27％，75％，76％，76％，76％，79％。說明鹽角草LCY蛋白與細(xì)菌的同源性最低，在高等植物中它們的同源性都比較高。相比之下，在N端的同源性要明顯低于C端(圖3)。
6、SeLCY基因二級(jí)結(jié)構(gòu)分析植物的LCY在細(xì)胞質(zhì)中合成后，被運(yùn)輸?shù)饺~綠體，線粒體以及其它質(zhì)體中發(fā)揮功能，參與類胡蘿卜素的合成。Chlorop1.1分析軟件網(wǎng)上預(yù)測(cè)(http//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)結(jié)果表明自序列2的氨基端第1-37位氨基酸殘基存在信號(hào)肽(圖4)。
疏水性分析表明SeLCY在自序列2的氨基端79-96，367-385和454-474位氨基酸區(qū)域有3個(gè)跨膜區(qū)(圖5)。
通過HNN軟件包對(duì)鹽角草，擬南芥，藍(lán)藻和歐文氏菌的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(http//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明鹽角草(圖6-A)SeLCY有498個(gè)氨基酸，其中有171個(gè)氨基酸形成了α-螺旋，形成多個(gè)連續(xù)的α-螺旋片段，占氨基酸數(shù)目的34.34％，擬南芥(圖6-B)中形成α-螺旋的氨基酸占35.53％，而歐文氏菌(圖6-D)和藍(lán)藻(圖6-C)中形成α-螺旋的氨基酸比例相對(duì)較高。鹽角草和擬南芥的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，但與細(xì)菌和藍(lán)藻差異較大，不過它們?cè)贑端都有一段α-螺旋相對(duì)集中的結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例2、SeLCY及其編碼基因的功能驗(yàn)證一、SeLCY基因表達(dá)載體的構(gòu)建為了鑒定SeLCY的功能，在SeLCY基因序列的3’和5’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物L(fēng)CY-95’-TTGGATCCATGTCTACTTTGCTTAAAATT-3’；LCY-105’-TTG AGCTCTCAATCAGTATCTTTTACTAG-3’。以鹽角草cDNA為模板，通過RT-PCR得到一條1513bp的DNA序列，并將它克隆到pUCm-T載體中，測(cè)序結(jié)果表明該片段序列含有SeLCY編碼序列，該片段具有自序列1的5′端第295-1789位核苷酸序列。RT-PCR的產(chǎn)物的凝膠電泳圖如圖7所示，其中，泳道DL2000為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為RT-PCR的產(chǎn)物。
將RT-PCR得到的片段連入pUCm-T載體構(gòu)建成的重組載體與載體SN1301(SN1301由pCAMBIA1301載體的GUS基因上游插入單獨(dú)的35S啟動(dòng)子序列構(gòu)建而成，具有卡那霉素(Kanamycin)抗性和潮霉素(Hygromycin)抗性)分別用BamHI，SacI雙酶切，并將SeLCY片段正向連接到植物表達(dá)載體SN1301的35S啟動(dòng)子下，將經(jīng)過酶切，測(cè)序驗(yàn)證正確的重組載體命名為p35S-1301-SeLCY(重組載體p35S-1301-SeLCY的構(gòu)建流程示意圖如圖8所示)。
二、轉(zhuǎn)SeLCY基因擬南芥的鑒定及其功能分析1、轉(zhuǎn)SeLCY基因擬南芥的獲得及篩選1)潮霉素抗性篩選將構(gòu)建的質(zhì)粒p35S-1301-SeLCY轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，用蘸花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)化后得到的T1代種子用10％次氯酸鈉消毒后平鋪在含潮霉素25mg/L的MS0培養(yǎng)基(未添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基)上，4℃冰箱中春化3d，在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4d后檢查種子的發(fā)芽和生長情況。生長良好且植株高者可初步確定為轉(zhuǎn)基因植株，即T1代轉(zhuǎn)基因植株。將其在光下培養(yǎng)3d后移入花盆中繼續(xù)培養(yǎng)。T1代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子和由該種子長成的植株為T2代，依此類推。通過篩選得到8株T1代陽性苗。
2)GUS組織化學(xué)分析將8株T1代轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8)的葉片經(jīng)GUS組化反應(yīng)液染色后出現(xiàn)不同程度的顯色反應(yīng)，其中有5株(L1、L2、L3、L4、L5)藍(lán)色非常明顯，而野生型(WT)葉片則無藍(lán)色，暗示無GUS活性存在，部分T1代轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株(L1、L2、L3、L4)葉片的GUS染色結(jié)果如圖9所示。
3)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR鑒定以LCY-9，LCY-10為引物，對(duì)經(jīng)GUS染色鑒定為陽性的轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY T1代擬南芥基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，以野生型擬南芥(圖10中WT)和p35S-1301-SeLCY(圖10中質(zhì)粒)的PCR檢測(cè)為對(duì)照，結(jié)果表明除L2外，L1、L3、L4、L5中均可擴(kuò)增到1513bp的條帶，而野生型植株中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY單株的PCR產(chǎn)物電泳圖片如圖10所示。圖10中，質(zhì)粒表示p35S-1301-SeLCY。
4)轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株的Southern和Northern雜交驗(yàn)證將GUS染色和PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥單株提取DNA，以GUS基因的特異引物GUS-1和GUS-2，以轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥基因組DNA為模板擴(kuò)增得到720bp GUS基因片段為探針進(jìn)行Southern雜交，具體方法如下所述A、雜交膜的制備取20-30μg轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥基因組DNA用EcoRI進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系如下基因組DNA 20μl，10×buffer 20μl，EcoRI 10μl，滅菌水150μl。
雜交膜制備方法，按常規(guī)方法進(jìn)行，具體如下所述將酶切產(chǎn)物加入2倍預(yù)冷的無水乙醇，-20℃保存2hr。12000rpm離心10min。加入70％乙醇，12000rpm離心10min。棄上清，將DNA充分干燥，否則DNA會(huì)在點(diǎn)樣時(shí)隨乙醇順著點(diǎn)樣孔爬出。將酶切的總DNA在0.7％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml EB)上電泳，電壓條件為1V/cm，當(dāng)溴酚蘭標(biāo)準(zhǔn)移到離凝膠末端2cm處時(shí)，停止電泳。在紫外燈下，將瓊脂糖凝膠上沒有DNA的、不平整的邊緣和點(diǎn)樣孔切除，并在凝膠左上角(加樣孔一端為上)切去一角，作為記號(hào)。將切好的瓊脂糖凝膠放在數(shù)倍體積的變性液中(1.5M NaCl+0.5M NaOH)浸泡45min，并不斷溫和搖動(dòng)，使凝膠中的DNA變性。將凝膠塊用無離子水漂洗，然后浸泡于數(shù)倍體積的中和液(1.0M Tris·Cl pH7.4+1.5M NaCl)中，溫和搖動(dòng)15min，更換中和液，將凝膠繼續(xù)浸泡15min。用Whatman 3MM濾紙包裹一有機(jī)玻璃平臺(tái)，放進(jìn)一白瓷盤中，倒入轉(zhuǎn)移緩沖液(10×SSC)，使液面略低于平臺(tái)表面。當(dāng)平臺(tái)上面的濾紙滲透后，趕出濾紙下所有的氣泡。裁取一張比凝膠長、寬各大1mm的Hybond-N+尼龍膜(Amersham Pharmacia Biotech)，并切除一角，使之與瓊脂糖凝膠上的缺角一致。將尼龍膜浮在無離子水表面，直至濾膜從下向上濕透為止，隨后用20×SSC浸泡尼龍膜5min。從中和液中取出凝膠，將其翻轉(zhuǎn)以使其背面朝上。把凝膠放在平臺(tái)上濕潤的Whatman 3MM濾紙中央，放膠時(shí)要確保濾紙和凝膠之間不能有氣泡。用保鮮膜鋪在凝膠四周邊上，形成隔液裙以阻止轉(zhuǎn)移緩沖液不通過凝膠直接向凝膠上方的吸水紙上流。在凝膠上放好用20×SSC浸泡過的尼龍膜，并使二者的缺角重疊，用玻璃棒擠出濾膜與凝膠之間的氣泡。用2×SSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的Whatman 3MM濾紙，鋪在尼龍膜上，擠出氣泡。切一疊(10cm厚)與凝膠大小相當(dāng)?shù)奈?，放在Whatman 3MM濾紙的上方，濾紙頂端壓上重量為500g左右的重物，轉(zhuǎn)移過夜。期間要不斷更換吸水紙。移去重物，吸水紙、取出尼龍膜，在6×SSC溶液中浸泡5min。從6×SSC溶液中取出尼龍膜，等濾膜上的溶液滴盡后，放在吸水紙上晾干30min。80℃烘干2hr，將DNA交聯(lián)在尼龍膜上。
B、α-32P-dCTP標(biāo)記探針的制備設(shè)計(jì)GUS基因的特異引物為GUS-15’-GCATGTTACGTCCTGTAGAAACCC-3’GUS-25’-CAAAGCCAGTAAAGTAGAACGGT-3’以轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA為模板，按照如下體系盒程序標(biāo)記探針10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(2.5mmol/L each)3.0μl，30μCiα-32P dCTP 3.0μl，Gus-1(10μmol/L)1.0μl，Gus-2(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taq polymerase(2.5U/μl)1.0μl，無菌水33μl。
使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化(天為時(shí)代)加5倍體積的結(jié)合液PB，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CB中，室溫放1min，12000rpm離心1min，倒掉廢液。加入700μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉廢液。加入.500μl漂洗液PW，12000rpm離心30sec，倒掉廢液。將CB放回收集管中，12000rpm離心2min。取出吸附柱，放入一干凈的離心管中，加20～100ul洗脫緩沖液EB，室溫放1min，12000rpm離心1min。
C、預(yù)雜交將含有目的DNA的尼龍膜漂浮于6×SSC液面上，待其由下至上完全浸透后，將尼龍膜在6×SSC中浸泡2min。將雜交的尼龍膜卷入雜交管中，倒入20ml預(yù)交液，雜交爐中65℃預(yù)雜交3hr以上。
D、雜交將制備好的探針于沸水浴加熱5min，迅速置于冰中冷卻。迅速倒干凈預(yù)雜交液。將已預(yù)熱到65℃雜交液(約10ml)迅速倒入雜交管，并迅速加入已變性探針。雜交爐中65℃雜交過夜(16hr以上)。
E、洗膜及顯影含有探針的雜交液倒入回收廢液桶中。用2×SSC+0.5％SDS在65℃洗膜兩遍，每次15min。廢液倒入廢液桶中。用0.2×SSC+0.1％SDS在65℃洗膜兩遍，每次15min。測(cè)定放射性強(qiáng)弱，一般非條帶區(qū)應(yīng)小于500，條帶區(qū)應(yīng)高于800。信號(hào)合適后，壓片。-70℃曝光15d。顯影、定影，并記錄結(jié)果。
結(jié)果表明L1，L4單株表現(xiàn)為SeLCY單拷貝插入(圖11中A)。
將GUS染色和PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株(L1、L3、L4、L5提取RNA，以步驟1中LCY-9，LCY-10為引物，以p35S-1301-SeLCY質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增得到1513bp GUS基因片段為探針進(jìn)行Northern雜交，具體方法如下所述提取轉(zhuǎn)SeLCY基因T1代株系的RNA，進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳。
探針標(biāo)記體系為10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(均2.5mmol/L)3.0μl，30μCiα-32P dCTP 3.0μl，Primer LCY-9(10μmol/L)1.0μl，Primer LCY-10(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taq polymerase(2.5U/μl)1.0μl，無菌水33μl。
結(jié)果表明L1，L3，L4出現(xiàn)雜交信號(hào)，表明SeLCY已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中轉(zhuǎn)錄。而對(duì)照野生型(WT)擬南芥沒有任何雜交信號(hào)，部分結(jié)果如圖11中B所示。
2、功能鑒定1)鹽分對(duì)轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥幼苗生長的影響將野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代種子在不加潮霉素的1/2MS0培養(yǎng)基(未添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基)上發(fā)芽后，選長勢(shì)一致的幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)3周后分別用1/4Hoagland溶液和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)處理幼苗根系。結(jié)果如圖12所示，在1/4Hoagland處理下，轉(zhuǎn)基因株系L4的長勢(shì)優(yōu)于野生型。L1的T3代和野生型沒有太大的區(qū)別。但在100mM NaCl下，轉(zhuǎn)基因株系均表型出比野生型強(qiáng)的耐鹽性。處理4天后，野生型則開始出現(xiàn)壞死的斑點(diǎn)，且葉片呈萎焉狀，變白；轉(zhuǎn)基因株系卻沒有出現(xiàn)任何脅迫癥狀。
2)對(duì)氧化脅迫的影響A、不同濃度鹽分和百草枯處理對(duì)擬南芥離體葉片的影響將野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株L1，L3，L4的T3代植株同一部位的葉片分別浸泡在蒸餾水，5μM，10μM百草枯和200mM，400mMNaCl溶液中，1-2d后拍照。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)。
結(jié)果表明處理24hr后，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株葉片在百草枯處理下葉片出現(xiàn)壞死的斑點(diǎn)比野生型要少。相比之下在NaCl處理下，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY株系并沒有表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的抗性。(圖13)。
B、鹽分對(duì)轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥幼苗丙二醛含量的影響將野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代種子在不加潮霉素的1/2MS0培養(yǎng)基上發(fā)芽后，選長勢(shì)一致的幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)3周后分別用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)處理幼苗根系。5天后，稱取0.7g植株葉片，加入7ml 5％三氯乙酸(TCA)溶液在研缽中研磨，勻漿在3000rpm離心10min，取上清2ml加入2ml 0.5％的硫代巴比妥酸溶液，搖勻，沸水浴30min。立即將試管放入冷水中。冷卻后，3000rpm離心15min，取上清液并量其體積，以0.5％硫代巴比妥酸溶液為空白測(cè)吸光度A450，A532和A600。提取液中MDA的含量(μM)＝6.45(A532-A600)-0.56A450，并進(jìn)一步算出其在植物組織中的含量。結(jié)果如圖14所示，表明在不加鹽的條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量沒有顯著的變化，經(jīng)100mMNaCl處理后野生型丙二醛的含量是轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代植株的1.16，1.17倍。說明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株的膜質(zhì)過氧化程度明顯小于野生型。
C、鹽分對(duì)轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥幼苗H2O2含量的影響按照上述方法，用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)處理野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代幼苗根系，然后，測(cè)定H2O2含量。擬南芥幼苗中H2O2含量測(cè)定是參照Patterson等(1984)(Anal Biochem，139(2)487-492)的方法。稱取3g新鮮的擬南芥葉片加入10ml冷丙酮，3000×g離心15min，取上清液3ml，加入0.2ml 0.2M TiSO4，0.4ml濃氨水，3000×g離心10min，棄上清液，沉淀用冷丙酮懸浮洗滌3次。最后在沉淀中加入10.0ml 2.0M H2SO4溶解。于415nm處測(cè)定光吸收值。
結(jié)果如圖15所示，表明轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥在1/4Hoagland和100mM NaCl處理下的過氧化氫的含量都比野生型擬南芥降低。在1/4Hoagland下轉(zhuǎn)基因植株的過氧化氫含量比野生型分別降低了33％和14％，而在100mM NaCl下轉(zhuǎn)基因植株的過氧化氫含量比野生型分別降低了16％和9％。
D、鹽分對(duì)轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥幼苗POD，CAT，SOD酶活的影響按照上述方法，將野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代用100mM的NaCl處理，然后，按照如下方法檢測(cè)POD，CAT，SOD活性SOD活性的測(cè)定將2.0g樣品加提取介質(zhì)10ml(50mM，pH＝7.8磷酸緩沖液，內(nèi)含1％PVP)，在冰上研磨成勻漿，4℃，13000rpm離心30min，上清液為酶提取液。取20μM核黃素溶液(以含0.1mM EDTA的50mM pH＝7.8磷酸緩沖液配制)0.3ml、750μM的硝基四唑藍(lán)0.3ml，130mM蛋氨酸0.3ml和酶提取液0.1ml于試管中，在3000Lux燈下放置15min，然后立即遮光停止反應(yīng)，在560nm波長處測(cè)OD值，以0.01ml 50mM Ph＝7.8的磷酸緩沖液作空白。酶活力，即SOD活力(U/g FW)＝((D1-D2)×V)/(D1×Vt×W×50％)，式中D1為空白對(duì)照吸光值，D2為測(cè)定樣品的吸光值，ΔA為A0與加入酶反應(yīng)液的吸光值差，W為樣品鮮重，V為酶提取液的總體積，Vt為加入酶液的體積。
POD活性的測(cè)定準(zhǔn)確稱取2.0g樣品，加入10ml 200mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝6.4)，將樣品于冰上研磨成勻漿，13000rpm，4℃離心30min，上清液即為酶提取液，保存在冷處備用。取酶提取液0.1ml，0.1％愈創(chuàng)木酚2ml于比色杯中30℃5min，加0.08％過氧化氫1ml。在470nm波長下測(cè)OD值，每隔10sec讀數(shù)1次，以反應(yīng)混合液中加0.1ml 200mM的磷酸緩沖液(pH＝6.4)為空白對(duì)照。酶活性以每分鐘吸光度變化值表示。
CAT活性的測(cè)定準(zhǔn)確稱取2.0g樣品，加入10ml 50mM磷酸緩沖液(pH＝7.0)，將樣品于冰上研磨成勻漿，13000rpm，4℃離心30min，輕輕吸取上清即為酶提取液。取0.2ml酶提取液，加入2.8ml 40mmol/L H2O2，10sec后在240nm掃描1min內(nèi)吸光值的變化，間隔10sec。計(jì)算CAT的活性。
結(jié)果如圖16所示，結(jié)果表明，經(jīng)1/4Hoagland處理后，POD在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的活性沒有變化，但是在鹽脅迫下轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代比野生型分別升高了1.22和1.21倍。
轉(zhuǎn)基因植株的CAT活性在1/4Hoagland和100mM NaCl下顯著升高。在1/4Hoagland下轉(zhuǎn)基因植株CAT活性比野生型植株分別增加了32.4％和21.3％。在100mM NaCl下轉(zhuǎn)基因植株CAT活性比轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代分別升高了33.2％和21.4％。
在1/4Hoagland下轉(zhuǎn)基因植株SOD活性比野生型植株顯著升高，但是在100mM NaCl下野生型植株SOD活性和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代之間差異并不顯著。
3)鹽分脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥光合作用的影響A、鹽分對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗光合速率和氣孔導(dǎo)度的影響將野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代種子在不加潮霉素的1/2MS0培養(yǎng)基上發(fā)芽后，選長勢(shì)一致的幼苗移栽到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)3周后分別用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)處理幼苗根系。5天后，用Li-6400光合測(cè)定系統(tǒng)及其配備的擬南芥葉室(Li-COR公司，美國)測(cè)定不同處理的野生型(WT)和轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代幼苗葉片的光合速率和氣孔導(dǎo)度。早上9:00-11:00進(jìn)行，溫室中幼苗的葉片在強(qiáng)光下照射30min后測(cè)定。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)5個(gè)數(shù)據(jù)。
結(jié)果如圖17、18所示，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代擬南芥植株的光合速率得到顯著的提高，在1/4Hoagland處理下轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代植株的光合速率比對(duì)照增分別增加了0.77，1.12倍。在100mM NaCl下轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株的光合速率也比對(duì)照分別增加了0.8，2.0倍(圖17)。在1/4Hoagland處理下，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株和野生型植株的氣孔導(dǎo)度并沒有顯著的變化，但是在100mM NaCl下轉(zhuǎn)基因植株的氣孔導(dǎo)度顯著增加(圖18)。
B、鹽分對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗熒光特性的影響用FMS2型脈沖調(diào)制熒光儀(英國Hansatech公司)于晴天測(cè)定葉綠素?zé)晒狻?br> 將不同濃度NaCl處理的擬南芥幼苗葉片暗適應(yīng)20min后，分別測(cè)定葉片的Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)v和Fv/Fm。Fo初始熒光強(qiáng)度，它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSII中心都開放時(shí)的熒光強(qiáng)度。Fm黑暗中最大熒光強(qiáng)度，它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSII中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度。Fv黑暗中最大可變熒光強(qiáng)度，F(xiàn)v＝Fm-Fo，表明潛在的PSII的光化學(xué)效率。Fv/Fm沒有遭受環(huán)境脅迫并經(jīng)過充分暗適應(yīng)的植物葉片PSII最大的量子效率指標(biāo)。
結(jié)果如圖19所示，在1/4Hoagland處理下，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代植株和野生型Fv/Fm比值稍微沒有顯著變化。但在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY擬南芥植株L1，L4的T3代株系比野生型植株Fv/Fm比值顯著提高。說明轉(zhuǎn)p35S-1301-SeLCY植株的光系統(tǒng)II的損傷程度明顯低于野生型。
SeLCY對(duì)氧化脅迫的抗性的可能機(jī)理如下LCY是類胡蘿卜素合成途徑中的分支點(diǎn)上的關(guān)鍵酶。能夠促進(jìn)類胡蘿卜素的合成向β-胡蘿卜素合成。在植物中最重要的單線氧的淬滅劑就是類胡蘿卜素，而在類胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素淬滅單線氧的效果最好。同時(shí)在植物葉綠體中，葉黃素循環(huán)是保護(hù)植物光系統(tǒng)II的主要途徑。SeLCY基因?qū)霐M南芥在一定程度上可能提高了葉黃素循環(huán)中玉米黃素，環(huán)氧玉米黃素和堇菜黃素的含量。使得轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠通過葉黃素循環(huán)消除植物光合作用中產(chǎn)生的ROS，提高其抗氧化能力。
序列表<160>2<210>1<211>1937<212>DNA<213>鹽角草(Salicornia europaea L.)<400>1cactcagcca caacaaccat tgccactcga aatcaagata tccgggttgg atttttcaat 60cgattcatct tcctccacca ccaccgactc cacagcccat ctcctcaccg ccgtcccccg120actgccatct cttttttacg gcttcgaagt tcgttctgca gcactccatc tctacactcg180aagttccttc gtggctgcct tccccattga agtagaagcg gagcttctga ggttcacttc240ctagatctga tactgatttg gaggataccc acttgggaat tttttggggg aaaaatgtct300actttgctta aaattcatca caagtttgag ttttggagcc atgttcggtt ttctgagaga360tgttctcatt tgagtgttcc aaagggacac caacattata ttagaaaacc ccatgaaaaa420gggttcaaaa aggggtctgt tagagtaagc agtactcttt tggagcttgt tcctgagacc480aagaaggaga accttgaatt cgagctgcct ttctatgact cgtctaaggg cctgttggta540gaccttgccg ttgtgggagg tggccctgct ggactcgctg ttgcacaaca agtttctaat600gcaggtctct cagtttgtgc gattgatcct aacccgaaat tgatatggcc taataactat660ggtgtttggg tagatgaatt tgaagccatg gatttgcttg attgcctcga tactacatgg720tcaggtgctg ttgtttacat tgatgagaat ttaaagaaga atcttgatag gccttacgga780agggttaata gaaagttatt aaagtccaaa atgatgcaaa aatgtatatc aactggagtg840aaatttcatc aagcaaaagt catgaaagtc gtccatggag agtctaaatc gcaacttatg900tgcaatgacg gagtcacaat tcaagcttct gtggttttgg atgcaacggg gtttgctcgc960tgccttgtac agtatgataa accatacaac cctggttacc aagttgctta tgggattttg1020gccgaagttg aagggcatcc ttttgatgtg gataagatgt tattcatgga ttggagagat1080tcgcacttgg ttgataataa ggaattaaga gggagaaata gcaaaattcc gaccttccta1140tatgctatgc ctttctcgtc taataggata ttcttggagg aaacttcact cgttgctcgg1200cctggagtgc ctatggagga cattcagcaa agaatggacg ctcgattgag gcaccttggc1260ataaacatca agcgcattga ggaggatgaa cgctgcgtga tccctatggg tgggcccctt1320ccggtaatcc ctcaaagagt tgtgggaatt ggtggcactg ctggtttggt gcatccttct1380acggggtata tggttgcaag gactttggca gcagctccaa ttgttgccag tacaattgtt1440cagtatttgg gttcaggagg caggcaggat ggaagtgaat tgtttgaagg agtgtggaaa1500aacttatggc ccatagagag gaggcgtcaa agagagttct tctgctttgg tatggatatc1560ctgctcaaac ttgatttgcc gggtacaaga aagtttttcg atgcattttt tgatctagaa1620
ccacgttatt ggcatggatt cttgtcttct cgactatatc ttcctgaact tattgttttc 1680gggttctctc tttttgctca tgcctctaac tcttctaggc tagaaataat gtcaaaaggc 1740actcttccat tgttaaatat ggtcaacaac ctagtaaaag atactgattg atatgtctta 1800gcttgtttta tgtctttttc atttgtgatc atgcatacag atcatttgct tcaacttgta 1860gattaaaata taaaaatgtc aattacaata cactctgttg atacgtataa aaaaaaaaaa 1920aaaaaaaaaa aaaaaaa 1937<210>2<211>498<212>PRT<213>鹽角草(Salicornia europaea L.)<400>2Met Ser Thr Leu Leu Lys Ile His His Lys Phe Glu Phe Trp Ser His1 5 10 15Val Arg Phe Ser Glu Arg Cys Ser His Leu Ser Val Pro Lys Gly His20 25 30Gln His Tyr Ile Arg Lys Pro His Glu Lys Gly Phe Lys Lys Gly Ser35 40 45Val Arg Val Ser Ser Thr Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr Lys Lys50 55 60Glu Asn Leu Glu Phe Glu Leu Pro Phe Tyr Asp Ser Ser Lys Gly Leu65 70 75 80Leu Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Ala Val85 90 95Ala Gln Gln Val Ser Asn Ala Gly Leu Ser Val Cys Ala Ile Asp Pro100 105 110Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu115 120 125Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Thr Thr Trp Ser Gly130 135 140
Ala Val Val Tyr Ile Asp Glu Asn Leu Lys Lys Asn Leu Asp Arg Pro145 150 155 160Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Leu Leu Lys Ser Lys Met Met Gln Lys165 170 175Cys Ile Ser Thr Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Met Lys Val180 185 190Val His Gly Glu Ser Lys Ser Gln Leu Met Cys Asn Asp Gly Val Thr195 200 205Ile Gln Ala Ser Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ala Arg Cys Leu210 215 220Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala Tyr Gly225 230 235 240Ile Leu Ala Glu Val Glu Gly His Pro Phe Asp Val Asp Lys Met Leu245 250 255Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Val Asp Asn Lys Glu Leu Arg260 265 270Gly Arg Asn Ser Lys Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Ser275 280 285Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg Pro Gly290 295 300Val Pro Met Glu Asp Ile Gln Gln Arg Met Asp Ala Arg Leu Arg His305 310 315 320Leu Gly Ile Asn Ile Lys Arg Ile Glu Glu Asp Glu Arg Cys Val Ile325 330 335Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Ile Pro Gln Arg Val Val Gly Ile340 345 350Gly Gly Thr Ala Gly Leu Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala355 360 365Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Ile Val Ala Ser Thr Ile Val Gln Tyr370 375 380
Leu Gly Ser Gly Gly Arg Gln Asp Gly Ser Glu Leu Phe Glu Gly Val385 390 395 400Trp Lys Asn Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu Phe Phe405 410 415Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Gly Thr Arg420 425 430Lys Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp His Gly435 440 445Phe Leu Ser Ser Arg Leu Tyr Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe Gly Phe450 455 460Ser Leu Phe Ala His Ala Ser Asn Ser Ser Arg Leu Glu Ile Met Ser465 470 475 480Lys Gly Thr Leu Pro Leu Leu Asn Met Val Asn Asn Leu Val Lys Asp485 490 495Thr Asp
權(quán)利要求
1.一種植物抗逆性相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因的編碼序列為自序列1的5′端第295-1788位脫氧核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的編碼基因，其特征在于所述植物抗逆性相關(guān)蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №1的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求2-4任一所述的基因的重組表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求2-4任一所述的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求2-4任一所述的基因的工程菌。
8.權(quán)利要求2-4任一所述的基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗逆性是抗鹽性和/或抗氧化性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該植物抗逆性相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明的植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，可增強(qiáng)植物的抗逆性，特別是增強(qiáng)對(duì)鹽、氧化的抗性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1900112SQ200610088889
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月24日
發(fā)明者李銀心, 韓和平 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所