專利名稱：擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及來源于擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與其在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的開花發(fā)育和脅迫環(huán)境應(yīng)答等生理過程受多基因的調(diào)控。國內(nèi)外眾多植物學(xué)家經(jīng)研究初步揭示了植物開花發(fā)育和環(huán)境脅迫應(yīng)答的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，擬南芥的開花發(fā)育時(shí)間主要受到自主、春化、赤霉素和光周期四條主要途徑的調(diào)控(He Y，Michaels SD，Amasino RM Regulation of flowering time by histone acetylationin Arabidopsis.Science，2003 3021751-1754)。擬南芥脅迫環(huán)境應(yīng)答的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究目前主要發(fā)現(xiàn)了兩條調(diào)控途徑，根據(jù)與ABA的依賴關(guān)系，分為ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑，如圖2所示，這兩條途徑主要都通過調(diào)控一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，如CBF1，2，3，4、DREB1，2和RD29A，B等的表達(dá)，對環(huán)境脅迫應(yīng)答起作用(Zhu JKSalt and drought stress signal transduction in plants.Annu.Rev.Plant Biol.，2002，53247-273)。
植物的開花發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程都與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控相關(guān)。研究表明，基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控既受遺傳因素影響又受表觀遺傳調(diào)控。表觀遺傳是一門新學(xué)科，主要研究DNA的甲基化、小RNA(siRNA和miRNA)干擾和染色質(zhì)重塑等對基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控機(jī)制(Strahl BD，Allis CD The language of covalent histone modification.Nature，2000，40341-45)。其中組蛋白N端氨基酸修飾作用以及這些修飾作用之間的不同組合形成的組蛋白密碼子(Histone code)對生命活動(dòng)的所有重大過程的調(diào)控機(jī)制將是表觀遺傳學(xué)研究的長期任務(wù)之一。
組蛋白末端氨基酸共價(jià)修飾對植物開花發(fā)育的調(diào)控作用的研究最近兩年才剛剛開始。研究表明FLC的抑制因子和促進(jìn)因子通過改變組蛋白氨基酸的共價(jià)修飾，影響FLC基因所在區(qū)域的染色質(zhì)重塑，調(diào)控FLC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，從而調(diào)控開花時(shí)間(He Y，Amasino RM Role of chromatin modification in flowering-time control.Trendsin plant science，2005，1030-35)。已有的文獻(xiàn)(Bastow R，Mylne JS，ListerC，Lippman Z，Martienssen RA，Dean C Vernalization requires epigeneticsilencing of FLC by histone methylation.Nature，2004，427164-167.Zhao Z，Yu Y，Meyer D，Wu C，Shen W-H Prevention of early flowering by expression ofFLOWERING LOCUS C requires methylation of histone H3K36 Nat.Cell Biol.2005，71256-1260)表明通過染色質(zhì)的組蛋白不同修飾研究FLC調(diào)控功能是研究開花發(fā)育分子開關(guān)的一個(gè)新的途徑。而關(guān)于組蛋白末端共價(jià)修飾在環(huán)境脅迫信號(hào)調(diào)控過程中的作用研究則更少。
近年來，通過對動(dòng)物和酵母細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)組蛋白精氨酸甲基化與賴氨酸甲基化一樣，參與了組蛋白密碼和染色質(zhì)重塑，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和脅迫應(yīng)答(Bao S，QyangY，Yang P，Kim H，Du H，Bartholomeusz G，Henkel J，Pimental R，Verde F，MarcusS.The highly conserved protein methyltransferase，Skb1，is a mediator ofhyperosmotic stress response in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.J Biol Chem.，2001，276(18)14549-52.)。組蛋白精氨酸甲基化由蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)催化。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目前已經(jīng)鑒定了8個(gè)PRMTs，它們在調(diào)控染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA剪接等過程中起到重要作用(Bedford MT，Richard S.Arginine methylationan emerging regulator of protein function.Mol Cell.2005，18(3)263-72.)，但是PRMT及其催化的組蛋白精氨酸甲基化在植物發(fā)育和脅迫應(yīng)答等過程中的作用還沒有任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來源于擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT5)。
本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，名稱為AtPRMT5(或SKB1)，來源于擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至三十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加對植物的生長發(fā)育和抗逆性具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由642個(gè)氨基酸殘基組成。
編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的基因(AtPRMT5或SKB1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №2限定的核苷酸序列具有80％以上同源性且在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性中起重要作用的核苷酸序列；
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1929個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1-1929位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有上述蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌以及擴(kuò)增蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的方法，是將本發(fā)明的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，植物的生長發(fā)育和抗逆性得到調(diào)控。
所述蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因可通過含有蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI121、pBI221、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達(dá)載體。
使用蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)和水稻肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(Actin)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。
上述調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的方法對所有植物都適用，既適用于單子葉植物，也適用于雙子葉植物。
本發(fā)明提供了一個(gè)來源于擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因AtPRMT5。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，本發(fā)明的基因可顯著提高植物的生長發(fā)育速度及對高鹽脅迫的耐受能力，從而為植物品種的改良提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，同時(shí)也對深入理解蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能和生物學(xué)過程，進(jìn)一步破譯組蛋白密碼子和理解組蛋白密碼子在高等植物發(fā)育分化、遺傳變異發(fā)生中的作用具有非常重要的意義。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2及野生型擬南芥在相同條件下培育14、35天時(shí)的生長情況圖2為AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株中組蛋白H4第三位精氨酸對稱性雙甲基化修飾的Western blot檢測結(jié)果圖3A為AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株在含高鹽的MS固體培養(yǎng)基中的生長情況圖3B為AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株在含高鹽的土壤中的生長情況圖4為經(jīng)鹽脅迫處理不同時(shí)間AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株中RD29A和RD28B基因表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測結(jié)果圖5為超表達(dá)AtPRMT5對植物生長發(fā)育及高鹽脅迫耐受性影響的檢測結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物合成由上海生工完成，測序工作由北京三博遠(yuǎn)志公司完成。
實(shí)施例1、擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的基因AtPRMT5的克隆擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的基因全長cDNA序列的獲得，包括以下步驟對GenBank中公布的人的PRMT5基因序列(GenBank號(hào)NM_006109)，通過同源序列比較，從擬南芥基因組中獲得同源序列(GenBank號(hào)NM_119262)，并根據(jù)該同源序列的5’和3’末端序列設(shè)計(jì)一對引物，引物序列如下P1(上游引物)；5’-aagagctccatgccgctcggagagagaggagg-3’P2(下游引物)5’-aactcgagaaggccaacccagtacgaacgg-3’提取擬南芥葉片總RNA(Promega，SV total RNA isolation system)，以擬南芥葉片的總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA(依據(jù)Plant RT-PCR Kit2.01(TaKaRa，Japan)的用戶手冊進(jìn)行)。在引物P1和P2的引導(dǎo)下，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的全長cDNA序列，50ul PCR反應(yīng)體系為模板2ul，LA taq 0.5ul，2*GC緩沖液I 25ul，2.5uM dNTPs 8ul，P1 1.5ul，P2 1.5ul，水11.5ul。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性30秒，58℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸3分鐘，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化長度約2000bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pET28b(Novagen公司)中，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，用T7+/-引物對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因全長cDNA具有序列表中SEQID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1929個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1-1929位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該基因命名為AtPRMT5，其編碼蛋白命名為AtPRMT5。擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶成熟蛋白的分子量為72kDa。
實(shí)施例2、檢測AtPRMT5對擬南芥開花發(fā)育的調(diào)控作用一、AtPRMT5失活純合突變體的篩選用下述方法篩選擬南芥AtPRMT5活純合突變體從ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)獲得AtPRMT5位點(diǎn)兩種不同T-DNA插入的突變體株系的種子(Salk 065814和Salk 095085)(Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Leisse，T.J.，Kim，C.J.，Chen，H.，Shinn，P.，Stevenson，D.K.，Zimmerman，J.，Barajas，P.，Cheuk，R.，et al.2003.Genome-wide insertional mutagenesisof Arabidopsisthaliana.Science 301653-657.)，通過PCR鑒定獲得了2種不同T-DNA插入位點(diǎn)的AtPRMT5失活純合突變體，分別命名為AtPRMT5-1和AtPRMT5-2。
二、AtPRMT5失活純合突變體與野生型植株生長情況的比較收獲步驟一篩選的AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2及野生型擬南芥(Wt)的種子，在相同條件下對AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2及野生型擬南芥的種子進(jìn)行播種、培養(yǎng)，觀察植株生長情況。結(jié)果AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2的開花時(shí)間比野生型明顯延遲，在正常長日照光周期下，生長發(fā)育明顯滯后，植株矮小，各植株14、35天時(shí)的生長情況如圖1所示，開花時(shí)間比野生型大約晚60天，而植物的根、莖、葉和花器官等沒有發(fā)現(xiàn)變異。同時(shí)用RT-PCR和Western blot方法檢測突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2及野生型植株中PRMT5的表達(dá)情況，其中RT-PCR檢測中所用的引物為P1和P2，Western blot檢測所用的一抗為抗AtPRMT5抗血清(制備方法為跑12％SDS-PAGE電泳后，用0.25M KCl+1mM DTT對膠進(jìn)行染色，切膠回收AtPRMT5蛋白條帶，用研缽研磨成粉末，用PBS緩沖液溶解，測濃度后(約0.5mg/mL)免疫兔子，免疫后得到抗At PRMT5抗血清)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔的IgG(購自華美生物工程公司)，結(jié)果均未檢測到AtPRMT5的表達(dá)，而野生型植株中AtPRMT5正常表達(dá)，初步證明突變體表型缺陷是由于AtPRMT5沉默引起的，AtPRMT5對擬南芥的開花發(fā)育具有調(diào)控作用。
三、AtPRMT5在AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2中的表達(dá)1、構(gòu)建擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AtPRMT5的植物表達(dá)載體將實(shí)施例1克隆的擬南芥蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AtPRMT5連接入載體pBI121(Clontech公司)多克隆位點(diǎn)的XbaI和SacI酶切位點(diǎn)之間，得到含有擬南芥AtPRMT5的全長cDNA與花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子融合基因的重組載體，命名pBI121-35S∷PRMT5。
2、AtPRMT5在AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2中的表達(dá)將步驟1構(gòu)建的載體pBI121-35S∷PRMT5轉(zhuǎn)化步驟二篩選的AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2，然后在相同條件下對AtPRMT5轉(zhuǎn)基因植株及野生型擬南芥植株進(jìn)行培育，結(jié)果AtPRMT5轉(zhuǎn)基因植株的開花時(shí)間與野生型植株沒有區(qū)別，同時(shí)用與步驟二相同的方法檢測轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株中AtPRMT5的表達(dá)情況，結(jié)果均可檢測到AtPRMT5的表達(dá)，進(jìn)一步證明突變體表型缺陷是由于AtPRMT5沉默引起的，AtPRMT5對擬南芥的開花發(fā)育具有調(diào)控作用。
實(shí)施例3、檢測AtPRMT5對組蛋白氨基酸修飾的影響用可特異識(shí)別組蛋白H4第三位精氨酸位點(diǎn)對稱性雙甲基化修飾的抗體Anti-H4-R3-sdiMe購自晶美生物工程公司，ABCAM公司產(chǎn)品)對AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株(對照，WT)進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果如圖2所示，組蛋白的甲基化水平在AtPRMT5失活純合突變體和野生型植株中的表達(dá)水平明顯不同，表明AtPRMT5的失活導(dǎo)致組蛋白H4第三位精氨酸對稱性甲基化修飾水平降低，影響了組蛋白氨基酸其它位點(diǎn)的共價(jià)修飾，改變了組蛋白的密碼子，從而影響了植物開花信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因(如FLC)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，初步證明了AtPRMT5參與了組蛋白密碼子的調(diào)控和染色質(zhì)重塑。
實(shí)施例4、檢測在脅迫條件下AtPRMT5對脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中關(guān)鍵基因的作用一、檢測AtPRMT5/SKB1失活純合突變體對高鹽脅迫的耐受能力以高鹽脅迫為例，檢測實(shí)施例2篩選的AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株(對照，WT)對脅迫條件的耐受能力，實(shí)驗(yàn)方法為將AtPRMT5失活純合突變體AtPRMT5-1和AtPRMT5-2及野生型植株培養(yǎng)于添加有0mM(對照)、120mM、160mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基，及澆300mM NaCl的土壤中，觀察植株生長情況。
在MS固體培養(yǎng)基中的生長情況如圖3A所示，在土壤中的生長情況如圖3B所示，與野生型擬南芥相比，AtPRMT5失活純合突變體對高鹽的耐受能力明顯下降，初步證明AtPRMT5與植物的抗脅迫能力相關(guān)。
二、熒光定量PCR檢測在高鹽脅迫下AtPRMT5對脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中關(guān)鍵基因表達(dá)情況的影響對AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株(對照，WT)在200mM NaCl的高鹽下處理0h、6h、12h、24h，然后用熒光定量PCR方法檢測經(jīng)高鹽脅迫處理不同時(shí)間的AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株中脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中的關(guān)鍵基因RD29A(GenBank號(hào)NM_124610)和RD29B(GenBank號(hào)NM_001036984)的表達(dá)情況，檢測RD29A所用的引物為P15’-cggtgggagatcaaactcaa-3’和P25’-aacttcgtcgtcacggcaga-3’，檢測RD28B所用的引物為P15’-gaaacatcggactgggaagc-3’和P25’-cacaggagtgttcaatggctct-3’，結(jié)果如圖4所示，RD29A和RD29B在AtPRMT5失活純合突變體和野生型擬南芥中的表達(dá)量明顯不同，表明AtPRMT5的失活不僅影響了組蛋白精氨酸的甲基化修飾，還參與了調(diào)控植物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因(如RD29A和RD29B)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步證明AtPRMT5與植物的抗脅迫能力相關(guān)。
實(shí)施例5、檢測超表達(dá)AtPRMT5對植物生長發(fā)育及高鹽脅迫耐受性的影響將實(shí)施例2構(gòu)建的AtPRMT5的植物表達(dá)載體pBI121-35S∷PRMT5通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因植株，觀察轉(zhuǎn)基因植株、AtPRMT5失活純合突變體及野生型植株在正常和高鹽脅迫條件下(200mM NaCl)的生長發(fā)育情況。在高鹽脅迫條件下植株的生長發(fā)育情況如圖5所示，AtPRMT5轉(zhuǎn)基因植株在正常和高鹽脅迫條件下的生長發(fā)育速度都比野生型和AtPRMT5失活純合突變體植株明顯加快，證明AtPRMT5對植物生長發(fā)育和抗逆性具有調(diào)控作用。
序列表<160>2<210>1<211>642<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Pro Leu Gly Glu Arg Gly Gly Trp Glu Arg Thr Glu Ser Arg Tyr1 5 10 15Cys Gly Val Glu Thr Asp Phe Ser Asn Asp Val Thr His Leu Leu Asn20 25 30Phe Asn Ile Ser Thr Gly Gly Phe Asp Tyr Val Leu Ala Pro Leu Val35 40 45Asp Pro Ser Tyr Arg Pro Ser Leu Val Glu Gly Asn Gly Val Asp Thr50 55 60Gln Val Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Leu Val Leu Ser Pro Ser Gln65 70 75 80Trp Ser Ser His Val Val Gly Lys Ile Ser Ser Trp Ile Asp Leu Asp85 90 95Ser Glu Asp Glu Val Leu Arg Met Asp Ser Glu Thr Thr Leu Lys Gln100 105 110Glu Ile Ala Trp Ala Thr His Leu Ser Leu Gln Ala Cys Leu Leu Pro115 120 125Thr Pro Lys Gly Lys Ser Cys Ala Asn Tyr Ala Arg Cys Val Asn Gln130 135 140Ile Leu Gln Gly Leu Thr Thr Leu Gln Leu Trp Leu Arg Val Pro Leu145 150 155 160Val Lys Ser Glu Gly Asp Ser Met Asp Asp Thr Ser Glu Gly Leu Asn165 170 175
Asp Ser Trp Glu Leu Trp Asn Ser Phe Arg Leu Leu Cys Glu His Asp180 185 190Ser Lys Leu Ser Val Ala Leu Asp Val Leu Ser Thr Leu Pro Ser Glu195 200 205Thr Ser Leu Gly Arg Trp Met Gly Glu Ser Val Arg Ala Ala Ile Leu210 215 220Ser Thr Asp Ala Phe Leu Thr Asn Ala Arg Gly Tyr Pro Cys Leu Ser225 230 235 240Lys Arg His Gln Lys Leu Ile Ala Gly Phe Phe Asp His Ala Ala Gln245 250 255Val Val Ile Cys Gly Lys Pro Val His Asn Leu Gln Lys Pro Leu Asp260 265 270Ser Ser Ser Glu Gly Thr Glu Lys Asn Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Asp275 280 285Tyr Val Ala Tyr Leu Phe Gln Lys Met Glu Ser Leu Ser Glu Gln Glu290 295 300Arg Ile Glu Leu Gly Tyr Arg Asp Phe Leu Gln Ala Pro Leu Gln Pro305 310 315 320Leu Met Asp Asn Leu Glu Ala Gln Thr Tyr Glu Thr Phe Glu Arg Asp325 330 335Ser Val Lys Tyr Ile Gln Tyr Gln Arg Ala Val Glu Lys Ala Leu Val340 345 350Asp Arg Val Pro Asp Glu Lys Ala Ser Glu Leu Thr Thr Val Leu Met355 360 365Val Val Gly Ala Gly Arg Gly Pro Leu Val Arg Ala Ser Leu Gln Ala370 375 380Ala Glu Glu Thr Asp Arg Lys Leu Lys Val Tyr Ala Val Glu Lys Asn385 390 395 400Pro Asn Ala Val Val Thr Leu His Asn Leu Val Lys Met Glu Gly Trp405 410 415Glu Asp Val Val Thr Ile Ile Ser Cys Asp Met Arg Phe Trp Asn Ala420 425 430
Pro Glu Gln Ala Asp Ile Leu Val Ser Glu Leu Leu Gly Ser Phe Gly435 440 445Asp Asn Glu Leu Ser Pro Glu Cys Leu Asp Gly Ala Gln Arg Phe Leu450 455 460Lys Pro Asp Gly Ile Ser Ile Pro Ser Ser Tyr Thr Ser Phe Ile Gln465 470 475 480Pro Ile Thr Ala Ser Lys Leu Tyr Asn Asp Val Lys Ala His Lys Asp485 490 495Leu Ala His Phe Glu Thr Ala Tyr Val Val Lys Leu His Ser Val Ala500 505 510Lys Leu Ala Pro Ser Gln Ser Val Phe Thr Phe Thr His Pro Asn Phe515 520 525Ser Thr Lys Val Asn Asn Gln Arg Tyr Lys Lys Leu Gln Phe Ser Leu530 535 540Pro Ser Asp Ala Gly Ser Ala Leu Val His Gly Phe Ala Gly Tyr Phe545 550 555 560Asp Ser Val Leu Tyr Lys Asp Val His Leu Gly Ile Glu Pro Thr Thr565 570 575Ala Thr Pro Asn Met Phe Ser Trp Phe Pro Ile Phe Phe Pro Leu Arg580 585 590Lys Pro Val Glu Val His Pro Asp Thr Pro Leu Glu Val His Phe Trp595 600 605Arg Cys Cys Gly Ser Ser Lys Val Trp Tyr Glu Trp Ser Val Ser Ser610 615 620Pro Thr Pro Ser Pro Met His Asn Thr Asn Gly Arg Ser Tyr Trp Val625 630 635 640Gly Leu<210>2<211>1929<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2atgccgctcg gagagagagg aggatgggag aggaccgagt ccagatactg cggcgttgag 60actgatttct ccaacgatgt tactcatctt ctcaacttca acatttccac cggcggtttt120gactatgttc tcgctcctct ggtggatcct tcgtataggc cgagcttggt ggaaggaaat180ggtgtagata ctcaggttct tccagtctgt ggctctgact tagtcttgtc accttctcaa240tggagcagtc atgttgttgg aaaaattagt tcgtggattg acttggattc tgaagatgag300gtcttacgga tggattcaga aaccacattg aagcaagaaa tagcttgggc tactcatctc360tccttacagg catgccttct tcccactcct aaagggaaat cgtgcgccaa ttatgccaga420tgtgtgaacc agatcttaca aggcctcact accttgcagt tatggctaag ggttccactg480gtgaagtctg aaggtgattc aatggatgat acctcagagg gactgaatga ttcctgggag540ctgtggaatt cgtttcgtct tctttgtgag catgacagta agctgtctgt tgctcttgat600gttctgagta cactaccctc tgaaacttca ctagggcgct ggatgggaga gtctgtgaga660gcagccatat taagcactga tgctttctta acaaatgctc ggggttatcc ttgcttgtcc720aaacgccacc aaaagttaat agcaggattt tttgatcatg ctgcccaggt tgtaatttgt780ggaaagcctg ttcataatct tcaaaagcct cttgattcta gctcggaggg tacagagaag840aatcctctgc gcatatattt ggactatgtt gcttatctgt tccaaaagat ggaatcactt900tctgaacagg aacgcatcga gctgggttac agggattttt tgcaggcacc cctgcagcct960cttatggaca acctcgaagc ccaaacctat gagacgtttg agagagactc tgttaaatac 1020atccaatatc aaagagcagt tgagaaagcc ttggtggaca gggtacctga tgaaaaagca 1080tccgagttga ctactgtcct gatggttgtg ggggcaggaa ggggacccct tgtgagggca 1140tcgttacagg cagctgaaga aactgatcgg aagttgaaag tttatgccgt ggaaaagaat 1200cctaatgccg ttgtaacact ccataatttg gttaagatgg aaggatggga agacgttgtt 1260acgataatat cctgtgacat gcgtttttgg aatgctcccg agcaagctga tatattggtt 1320agcgaactgc tgggttcttt tggagacaat gaactttctc ctgagtgtct tgatggagcc 1380caaaggtttc tgaagccaga cggaatttca ataccatcct cgtatacaag tttcatacag 1440cctataacag cttcgaagct ttacaatgac gttaaggctc ataaagatct tgcgcacttt 1500gaaactgctt atgttgtcaa gctgcatagt gtagcaaagc ttgctccttc ccagtctgtt 1560ttcacattta ctcatccaaa cttctcaacg aaagtcaaca accaacgcta taagaagctt 1620cagttcagtc taccaagcga tgctggctca gctttggtgc atggattcgc tggctatttt 1680gattccgtcc tttataaaga tgttcatctt gggatcgagc ctacaacagc aacaccaaac 1740atgttcagct ggttcccaat ctttttccca ttgaggaagc ctgtggaggt tcaccctgat 1800
actccattag aagtacactt ttggaggtgt tgtggttcct caaaggtttg gtatgaatgg1860tcggtgtctt cacctactcc atctccgatg cataacacca atggccgttc gtactgggtt1920ggcctttag1929
權(quán)利要求
1.擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至三十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加對植物的生長發(fā)育和抗逆性具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的DNA；3)與序列表中SEQ ID №2限定的核苷酸序列具有80％以上同源性且在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性中起重要作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求3所述基因的宿主菌。
9.一種調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的方法，是將權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，植物的生長發(fā)育和抗逆性得到調(diào)控。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)擬南芥的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與其在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性中的應(yīng)用。該酶是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至三十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加對植物的生長發(fā)育和抗逆性具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的基因可顯著提高植物的生長發(fā)育速度及對高鹽脅迫的耐受能力，從而為植物品種的改良提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1888058SQ20061008882
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者鮑時(shí)來, 種康, 王昕 , 張婭, 徐云遠(yuǎn), 馬其斌 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所