專利名稱：玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)植物品種真實(shí)性的試劑盒，更具體地說，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)玉米真實(shí)性的試劑盒。
背景技術(shù)：
玉米真實(shí)性鑒定是玉米種子質(zhì)量控制和品種權(quán)保護(hù)的依據(jù)。隨著目前社會(huì)上玉米品種的逐年增多，魚龍混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，使用常規(guī)的形態(tài)鑒別難以進(jìn)行準(zhǔn)確的判定，造成管理的困難。
目前國(guó)內(nèi)外玉米真實(shí)性鑒定仍以形態(tài)鑒定為主，參考同工酶和種子貯藏蛋白電泳圖譜。形態(tài)性狀的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大，鑒定工作量大、周期長(zhǎng)、受季節(jié)限制；同工酶和種子貯藏蛋白多態(tài)性不夠豐富，此外同工酶存在組織和器官特異性，取材有嚴(yán)格的一致性要求，所以鑒定結(jié)果不夠穩(wěn)定。本發(fā)明人研究了利用SSR(simple sequence repeat)引物對(duì)檢測(cè)玉米真實(shí)性的鑒定方法，在2003年提出了中國(guó)專利申請(qǐng)第200310117180.3號(hào)，在該試劑盒(此后有時(shí)也將它稱為現(xiàn)有的試劑盒)中包含了20個(gè)引物，這20個(gè)引物是從網(wǎng)上直接下載的引物序列，沒有進(jìn)行特殊的設(shè)計(jì)，因此它們存在的最大問題是所選引物在染色體上不是均勻分布的，造成某些引物位點(diǎn)間存在不同程度的連鎖；其次是引物不適合組合多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，多重聚合酶連鎖反應(yīng))的要求，這些引物需要單個(gè)地進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，造成工作量大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒存在的引物在染色體上分布不均勻和不適合組合多重PCR的要求的問題，經(jīng)過大量的引物篩選，提供了一種包含20個(gè)引物的試劑盒及其檢測(cè)方法。
具體技術(shù)方案如下。
本發(fā)明提供的玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒包含下列20個(gè)引物

本發(fā)明所使用的引物的制備方法沒有特別的要求，可以采用已知的常規(guī)方法合成。根據(jù)本發(fā)明提供的上述引物序列，可以利用DNA合成儀合成。如果自己有設(shè)備，可以自己合成，如果沒有，可直接讓引物合成公司，由引物合成公司合成，也就是說，只要知道引物序列，就可以得到該引物。如果采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳，則根據(jù)引物序列直接合成即可。如果采用毛細(xì)管電泳五色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，則需為每套引物序列標(biāo)記上四種不同的熒光。
本發(fā)明的玉米品種真實(shí)性檢測(cè)用SSR引物組合試劑盒是通過對(duì)大量的引物篩選確定的，為了保證引物在玉米染色體上分布均勻，在玉米10條染色體的長(zhǎng)臂、短臂各選取一個(gè)多態(tài)性高、帶型容易統(tǒng)計(jì)的引物位點(diǎn)，累計(jì)20個(gè)引物位點(diǎn)。為了使其能夠進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，在原引物位點(diǎn)的基礎(chǔ)上利用引物設(shè)計(jì)軟件按照統(tǒng)一的擴(kuò)增條件重新設(shè)計(jì)，P01-P10(每條染色體上選取1個(gè)引物)作為第一套組合，P11-20(每條染色體上選取1個(gè)引物)作為第二套組合。
使用本發(fā)明的玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)玉米品種有下列三種方法。
第一種玉米真實(shí)性檢測(cè)方法是采用毛細(xì)管電泳結(jié)合五色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其中，首先將上述20個(gè)引物分成2套組合，P01-P10作為第一套組合，P11-20作為第二套組合，每套組合按照如下三重或兩重組合標(biāo)記4種不同的熒光。
第一套10重組合

第二套組合

然后采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，每套組合進(jìn)行10重PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物使用毛細(xì)管電泳結(jié)合五色熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，其中引物共占用4種不同顏色熒光，分子量?jī)?nèi)標(biāo)占用1種顏色熒光。
第二種玉米真實(shí)性檢測(cè)方法是采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)，其中，首先將上述20個(gè)引物分成下述8套組合第1套組合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2擴(kuò)增范圍399-419、263-319、144-201第2套組合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8擴(kuò)增范圍421-465、288-376、141-203第3套組合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8擴(kuò)增范圍319-385、192-250第4套組合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1擴(kuò)增范圍413-433、219-327第5套組合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6擴(kuò)增范圍394-440、286-330、154-215第6套組合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3擴(kuò)增范圍370-410、279-325、168-215第7套組合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1
擴(kuò)增范圍265-310、137-200第8套組合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5擴(kuò)增范圍290-365、130-213然后采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，每套組合根據(jù)上述分別擴(kuò)增三重或二重，再使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)，完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)。
從上述檢測(cè)方法看到，第一種檢測(cè)方法僅需2次PCR反應(yīng)就可完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)，第二種檢測(cè)方法僅需8次PCR反應(yīng)就可完成檢測(cè)。
第三種方法是使用權(quán)利要求1所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒中的2～20個(gè)引物，采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，使用所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒中單個(gè)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，能夠得到結(jié)論就停止檢測(cè)。從后面描述的判定方法可以看到，如果使用兩種或兩種以上的引物就可以判斷兩個(gè)品種是不同的，那么就可以停止檢測(cè)過程，直接得到結(jié)論。這種方法特別適合于已經(jīng)初步判定兩種品種是不同品種的情況，這樣可以節(jié)省物力。
本發(fā)明的檢測(cè)方法中的DNA提取可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中提供的各種方法獲得質(zhì)量符合PCR擴(kuò)增要求的DNA。試驗(yàn)材料可以為種子、幼苗、葉片等。
本發(fā)明的檢測(cè)方法中的PCR擴(kuò)增方法具體如下反應(yīng)體系反應(yīng)液體積為20μl，組分配制應(yīng)符合下表的規(guī)定。
表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

備注引物量為每個(gè)引物0.25μl，如果采用10重PCR，即加入的引物總量為2.5μl；同理，如果采用3重PCR，即加入的引物總量為0.75μl，采用2重PCR，即加入的引物總量為0.5μl。
反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，68℃退火35s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
本發(fā)明的檢測(cè)方法中的電泳檢測(cè)推薦下列兩種電泳檢測(cè)方法(1)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)；(2)毛細(xì)管電泳結(jié)合熒光檢測(cè)。
兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果均有效，具體方法如下。
(1)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)1清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95％乙醇擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂上0.5ml親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5ml剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。
2組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。
3灌膠在100ml 4.5％PAGE膠中加入TEMED和25％過硫酸銨各100μl，迅速混勻后灌膠。待膠流動(dòng)到下部，在上部輕輕的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。
4預(yù)電泳在正極槽(下槽)中加入1×TBE緩沖液600ml，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的1×TBE緩沖液600ml，拔出梳子。90W恒功率預(yù)電泳10-20min。
5變性在20μl PCR樣品中加入4μl 6×加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序95℃變性5min，4℃冷卻10min以上。
6電泳用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳子。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μl樣品。80W恒功率電泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部(約40min)。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會(huì)緊貼在長(zhǎng)板上。
7銀染7.1固定固定液中輕輕晃動(dòng)3min；7.2漂洗雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s；7.3染色染色液中染色5min；7.4漂洗雙蒸水快速漂洗，時(shí)間不超過10s；7.5顯影顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；7.6定影固定液中定影5min；7.7漂洗雙蒸水漂洗1min。
(2)毛細(xì)管電泳結(jié)合五色熒光檢測(cè)1變性將PCR產(chǎn)物稀釋30倍，在96孔板的每個(gè)孔中分別加入9μL甲酰胺、0.1μL內(nèi)標(biāo)和1μL稀釋后的PCR產(chǎn)物，在PCR儀上運(yùn)行變性程序95℃變性5min，4℃冷卻10min以上。
2電泳將樣品板取出后，3000rpm短甩離心，于遺傳分析儀(如ABI3730XL遺傳分析儀)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。預(yù)電泳15KV，2min；電泳15KV，20min。
3數(shù)據(jù)搜集分析用數(shù)據(jù)收集軟件收集原始數(shù)據(jù)，用片段分析軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
使用本發(fā)明的玉米品種真實(shí)性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)和判定玉米品種真實(shí)性的標(biāo)準(zhǔn)如下
用本發(fā)明的引物進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)品種在20個(gè)引物位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用20個(gè)位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較a)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；b)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為相近品種；c)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為疑同品種。
從上述判定標(biāo)準(zhǔn)可以看到，當(dāng)出現(xiàn)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2時(shí)，就可以停止檢測(cè)，給出檢測(cè)玉米是不同品種的結(jié)論。
本發(fā)明的玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒與現(xiàn)有的玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒相比具有顯著的有益效果。
首先從整套引物組合來看，它具有以下特點(diǎn)(1)從引物在染色體上的分布看，現(xiàn)有的引物組合在第3、4、6、8染色體選取了3～4個(gè)引物位點(diǎn)，且某些位點(diǎn)落在相近區(qū)域，如在第6染色體的6.00區(qū)域選取了3個(gè)引物位點(diǎn)；在第2染色體上選取了2個(gè)引物位點(diǎn)，但相距較近；在第1、7、9、10染色體上只分別選取了一個(gè)引物位點(diǎn)；在第5染色體上沒有選取引物位點(diǎn)，因此沒有遵循在玉米染色體上均勻分布的原則，造成某些引物間連鎖比較緊密。而本發(fā)明的引物組合在玉米10條染色體的每條染色體上選取2個(gè)引物(長(zhǎng)臂和短臂各選取1個(gè)引物)，保證了引物在玉米染色體上分布均勻。
(2)從引物組合多重PCR的能力看，現(xiàn)有引物組合中，擴(kuò)增產(chǎn)物大小除了bnlg125在300bp以上，bnlg439和bnlg162在200bp以上外，其它17個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在100-200bp左右，不同引物的產(chǎn)物大小范圍有交叉，無法組合多重PCR；而且不同引物的TM值相差較大，最低的僅66.6，最高的達(dá)到82.1，而引物TM值的大小不同，則引物擴(kuò)增程序選用的最適退火溫度不同，因此，這套引物不適合按照統(tǒng)一的程序進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，只能進(jìn)行單引物擴(kuò)增，所以，完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)需要進(jìn)行20次PCR反應(yīng)。而本發(fā)明的引物組合的所有引物均是按照統(tǒng)一的條件設(shè)計(jì)的，引物的TM值均在73-76度之間，擴(kuò)增產(chǎn)物大小是按照組合多重PCR的要求特殊設(shè)計(jì)的，同一套組合內(nèi)的引物之間沒有明顯的相互作用影響擴(kuò)增，如果采用毛細(xì)管電泳四色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，每組(三重或兩重)標(biāo)記不同的熒光，則每套組合均可以組成10重PCR，僅需2次PCR反應(yīng)就可完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)，如果采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)系統(tǒng)，則可按提供的組合方式分別擴(kuò)增三重和二重，僅需8次PCR反應(yīng)就可完成檢測(cè)。因此，比現(xiàn)有引物組合擴(kuò)增效率大大提高。
表2本發(fā)明的引物

注*bin代表所在染色體區(qū)域；**U、L、P分別代表上游引物序列、下游引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物序列的TM值。
表3現(xiàn)有的引物

然后從單個(gè)引物看，它具有以下特點(diǎn)(1)在本發(fā)明的引物組合和現(xiàn)有的引物組合中有7個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)是相同的，即bnlg439、bnlg125、phi072、bnlg161、phi116、phi080、phi065，但現(xiàn)有的引物是直接下載的網(wǎng)上公開的引物序列，這些引物不是按照相同的擴(kuò)增條件設(shè)計(jì)的，不同引物之間TM值相差較大，如bnlg125上下游序列TM值為66.6和67.9，而bnlg589上下游序列TM值為82.1和80.3，除了phi080外，其它6個(gè)引物TM值均沒有設(shè)計(jì)在73-76度范圍內(nèi)，而本發(fā)明的引物均按照相同的擴(kuò)增條件設(shè)計(jì)，TM值均設(shè)計(jì)在73-76度范圍內(nèi)，此外，對(duì)phi080，盡管現(xiàn)有引物的TM值符合設(shè)計(jì)要求，但為了組合多重PCR的需要，現(xiàn)有引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小不符合設(shè)計(jì)要求，因此，對(duì)該引物也進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，使其擴(kuò)增產(chǎn)物大小在規(guī)定的范圍內(nèi)。
(2)在本發(fā)明的引物組合和現(xiàn)有的引物組合中有13個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)是不同的，之所以沒有選用與原引物組合相同的位點(diǎn)，主要原因是現(xiàn)有引物在染色體上的分布不符合要求，即在每條染色體的長(zhǎng)臂和短臂上各選取一個(gè)引物，其次，即使現(xiàn)有的那套引物組合中某些引物在染色體上的分布符合要求，也從引物設(shè)計(jì)難易、多態(tài)性高低、是否符合多重PCR組合的要求等方面進(jìn)行比較后重新選用了新的引物位點(diǎn)，如umc1196在玉米第10染色體長(zhǎng)臂10.07位置上，但在該引物位點(diǎn)上，bnlg1450k2比umc1196多態(tài)性高，且更容易設(shè)計(jì)出規(guī)定產(chǎn)物大小的引物來，因此，用bnlg1450代替了umc1196。
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例的方式進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明不局限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例1鑒定送檢未知樣品(代號(hào)A)是不是已知品種農(nóng)大108(代號(hào)B)，操作流程如下(1)DNA提取將未知樣品A及已知品種B的標(biāo)準(zhǔn)樣品各提取5份個(gè)體DNA，提取方法如下剝?nèi)瘟８煞N子的胚，放入1.5ml離心管中，加入100μl氯仿后研磨，加入300μl DNA提取液(1mol/l Tris-HCl 50ml，0.5mol/lEDTA 50ml，5mol/l NaCl 50ml，SDS 7.5g，定容至500ml)，混勻后于10000rpm離心2min，吸上清液，將其加到預(yù)先裝有300μl異丙醇和300μl NaCl溶液的1.5ml離心管中，待DNA成團(tuán)后挑出，經(jīng)70％乙醇洗滌后加入200μl TE緩沖液(1mol/l Tris-HCl 5ml，0.5mol/l EDTA 1ml，加HCl調(diào)pH至8.0，定容至500ml)，待充分溶解后備用。
(2)SSR引物合成采用熒光標(biāo)記的引物。在上游引物的5’端分別標(biāo)記四種不同的熒光FAM、VIC、NED、PET，熒光引物序列由美國(guó)ABI公司合成。
表4熒光引物序列

表4(續(xù))熒光引物序列

(3)PCR擴(kuò)增利用上面提供的SSR引物對(duì)組成兩個(gè)10重PCR反應(yīng)體系對(duì)DNA樣品進(jìn)行10重PCR擴(kuò)增，10重PCR組合方式第一套10重組合

第二套10重組合

表510重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增在PTC-100PCR儀(MJ Research，Watertown，MA)上進(jìn)行。
(4)毛細(xì)管電泳檢測(cè)變性將PCR產(chǎn)物稀釋30倍，在96孔板的每個(gè)孔中分別加入9μL甲酰胺、0.1μL內(nèi)標(biāo)和1μL稀釋后的PCR產(chǎn)物，在PCR儀上運(yùn)行變性程序95℃變性5min，4℃冷卻10min以上。
毛細(xì)管電泳將樣品板取出后，3000rpm短甩離心，于ABI3730XL遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。預(yù)電泳15KV，2min；電泳15KV，20min。數(shù)據(jù)搜集分析用數(shù)據(jù)收集軟件收集原始數(shù)據(jù)，用片段分析軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
(5)檢測(cè)結(jié)果用這套引物進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)品種在20個(gè)引物位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用20個(gè)位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種在bnlg439w1、phi065k9、bnlg125k1共3個(gè)引物位點(diǎn)指紋不同，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定送檢樣品A不是農(nóng)大108。
實(shí)施例2鑒定送檢未知樣品(代號(hào)A)是不是已知品種黃早四(代號(hào)B)，操作流程如下(1)DNA提取將未知樣品A及已知品種B的標(biāo)準(zhǔn)樣品各提取5份個(gè)體DNA，提取方法如下剝?nèi)瘟８煞N子的胚，放入1.5ml離心管中，加入100μl氯仿后研磨，加入300μl DNA提取液(1mol/l Tris-HCl 50ml，0.5mol/lEDTA 50ml，5mol/l NaCl 50ml，SDS 7.5g，定容至500ml)，混勻后于10000rpm離心2min，吸上清液，將其加到預(yù)先裝有300μl異丙醇和300μl NaCl溶液的1.5ml離心管中，待DNA成團(tuán)后挑出，經(jīng)70％乙醇洗滌后加入200μl TE緩沖液(1mol/l Tris-HCl 5ml，0.5mol/l EDTA 1ml，加HCl調(diào)pH至8.0，定容至500ml)，待充分溶解后備用。
(2)SSR引物合成采用本發(fā)明的引物。引物序列由上海英駿公司合成。
表6本發(fā)明的引物序列

(3)PCR擴(kuò)增利用上面提供的SSR引物對(duì)組成8個(gè)兩重或三重PCR反應(yīng)體系對(duì)DNA樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，多重PCR組合方式第1套組合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2擴(kuò)增范圍399-419、263-319、144-201第2套組合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8擴(kuò)增范圍421-465、288-376、141-203第3套組合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8擴(kuò)增范圍319-385、192-250第4套組合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1擴(kuò)增范圍413-433、219-327第5套組合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6擴(kuò)增范圍394-440、286-330、154-215第6套組合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3擴(kuò)增范圍370-410、279-325、168-215第7套組合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1擴(kuò)增范圍265-310、137-200第8套組合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5擴(kuò)增范圍290-365、130-213
表5多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增在PTC-100PCR儀(MJ Research，Watertown，MA)上進(jìn)行。
(4)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)1清洗玻璃板用自來水沾洗滌靈將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，95％乙醇擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂上0.5ml親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5ml剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板互相污染。
2組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。
3灌膠在100ml 4.5％PAGE膠中加入TEMED和25％過硫酸銨各100μl，迅速混勻后灌膠。待膠流動(dòng)到下部，在上部輕輕的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌膠過程中防止出現(xiàn)氣泡。
4預(yù)電泳在正極槽(下槽)中加入1×TBE緩沖液600ml，在負(fù)極槽(上槽)加入預(yù)熱至65℃的1×TBE緩沖液600ml，拔出梳子。90W恒功率預(yù)電泳10-20min。
5變性在20μl PCR樣品中加入4μl 6×加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序95℃變性5min，4℃冷卻10min以上。
6電泳用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳子。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μl樣品。80W恒功率電泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部(約40min)。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會(huì)緊貼在長(zhǎng)板上。
7銀染7.1固定固定液中輕輕晃動(dòng)3min；7.2漂洗雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s；7.3染色染色液中染色5min；7.4漂洗雙蒸水快速漂洗，時(shí)間不超過10s；7.5顯影顯影液中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；7.6定影固定液中定影5min；7.7漂洗雙蒸水漂洗1min。
(5)檢測(cè)結(jié)果用這套引物進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)品種在20個(gè)引物位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)，利用20個(gè)位點(diǎn)的DNA指紋譜帶數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種在所有20個(gè)位點(diǎn)指紋譜帶完全相同，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定送檢樣品A與已知品種黃早四為疑同品種。
權(quán)利要求
1.一種玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它包含下列20個(gè)引物
2.一種檢測(cè)玉米真實(shí)性的方法，其特征在于，它使用權(quán)利要求1所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒，采用毛細(xì)管電泳結(jié)合五色熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，其中，首先將上述20個(gè)引物分成2套組合，P01-P10作為第一套組合，P11-20作為第二套組合，將每套按照三重或兩重分別標(biāo)記不同的熒光，然后采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，每套組合組成10重PCR，其中引物共占用4種不同顏色熒光，分子量?jī)?nèi)標(biāo)占用1種顏色熒光，每套組合分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，再使用毛細(xì)管電泳結(jié)合五色熒光檢測(cè)完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)。
3.一種檢測(cè)玉米真實(shí)性的方法，其特征在于，它使用權(quán)利要求1所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染進(jìn)行檢測(cè)，其中，首先將上述20個(gè)引物分成下述8套組合第1套組合，3重PCR引物Phi065k9、Bnlg161k6、Umc1705k2擴(kuò)增范圍399-419、263-319、144-201第2套組合，3重PCR引物Bnlg1754k5、Bnlg1450k2、Umc1741k8擴(kuò)增范圍421-465、288-376、141-203第3套組合，2重PCR引物Bnlg439w1、Bnlg1792k8擴(kuò)增范圍319-385、192-250第4套組合，2重PCR引物Phi072k4、Bnlg125k1擴(kuò)增范圍413-433、219-327第5套組合，3重PCR引物bnlg2331k6、umc2105k3、bnlg1191k6擴(kuò)增范圍394-440、286-330、154-215第6套組合，3重PCR引物bnlg2291k4、phi080k7、phi116k3擴(kuò)增范圍370-410、279-325、168-215第7套組合，2重PCR引物umc1225k5、phi299852k1擴(kuò)增范圍265-310、137-200第8套組合，2重PCR引物umc2163w3、mmc0191k5擴(kuò)增范圍290-365、130-213然后采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，每套組合根據(jù)上述分別進(jìn)行三重或二重PCR擴(kuò)增，再使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測(cè)，完成所有20個(gè)引物的檢測(cè)。
4.一種檢測(cè)玉米真實(shí)性的方法，其特征在于，它使用權(quán)利要求1所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒中的2～20個(gè)引物，采用常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取，使用所述玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒中單個(gè)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，能夠得到結(jié)論就停止檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明的玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法屬于植物品種真實(shí)性鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，為了解決現(xiàn)有玉米真實(shí)性檢測(cè)試劑盒存在的引物在染色體上分布不均勻和不適合組合多重PCR的要求的問題，經(jīng)過特定的設(shè)計(jì)，提出一種包含20個(gè)引物的試劑盒，本發(fā)明的這20個(gè)引物在染色體上分布均勻、合理，符合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)的要求，從而它們組成的引物組合的擴(kuò)增效率高，大大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)水平。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101037709SQ20061006573
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者王鳳格, 趙久然, 郭景倫 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院