專利名稱：：葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：葛根素(Puerarin)化學(xué)名為4’，7-二羥基-8-β-D-葡萄糖異黃酮。其毒副作用小，有較廣泛的生理功能如具有抗心律失常及降血壓；擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)，減少心肌梗死范圍；擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，改善大腦供氧；改善耳、視網(wǎng)膜等器官微循環(huán)；抑制血小板聚集，改善血液流變，降低血液黏滯度的作用和低密度脂蛋白被氧化損傷的程度；能清除自由基和抗氧化作用；保護(hù)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻止動(dòng)脈粥樣硬化，防止血栓形成；有較緩和的降低血糖的作用；對(duì)糖尿病大鼠腎功能具有保護(hù)作用。Sato(1992年)報(bào)道3′-羥基葛根素有良好的抗氧化活性；而Cao(1999年)報(bào)道3′-羥基葛根素在植物體內(nèi)的含量?jī)H為葛根素的幾十分之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法篩選獲得可催化Puerarin為3′羥基-葛根素(3′-hydroxypuerarin)微生物菌株，以便采用微生物轉(zhuǎn)化的方法，獲得3′-hydroxypuerarin產(chǎn)品。Puerarin和3′-hydroxypuerarin的分子結(jié)構(gòu)式見式1。<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="644">R1R2R3R4Puerarin3’-hydroxylpueraringlcglcHHHHHOH</table></tables>式1.Puerarin和3′-hydroxypuerarin的分子結(jié)構(gòu)式本發(fā)明采用分離及保藏的具有葛根素羥基化酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌絲體分離；所獲菌絲體作為靜息細(xì)胞，加入到含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為羥基葛根素；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得3′-羥基葛根素固體；或?qū)⑥D(zhuǎn)化液的上清液用有機(jī)溶劑萃取，再用水從有機(jī)相中反萃取，獲得的水相萃取液經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，可得到含3′-羥基葛根素的溶液，再將含3′-羥基葛根素的溶液經(jīng)濃縮、或低溫處理后，可得到3′-羥基葛根素粉末或晶體。上述具有葛根素羥基化酶活力的微生物菌種，可以是哈茨木霉，也可以是任何可羥基化葛根素的微生物或混合微生物。所說的哈茨木霉可以是TrichodermaharzianumATCC20671，TrichodermaharzianumATCC64060，TrichodermaharzianumATCC60850，TrichodermaharzianumATCC52443，TrichodermaharzianumATCC52444，HypocrealixiiATCCMYA-2453等中的一種或幾種。發(fā)明人篩選的擬命名TrichodermaharzianumNJ01的菌株，用于本發(fā)明有更好的效果，該菌株已于2005年11月1日保存于北京的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存號(hào)CGMCCNO.1523，分類命名為哈茨木霉Trichodermaharzianum。上述用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沒有特別的限制，可以是任何一種適合于微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，如PDA培養(yǎng)液，察氏培養(yǎng)基，或任何以淀粉、玉米粉、糖蜜、葡萄糖、蔗糖等為碳源，以玉米漿、黃豆餅粉、花生餅粉，棉籽粉等為氮源的培養(yǎng)基。上述葛根素羥基化微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是20～40℃，10～400rrpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時(shí)間12～96小時(shí)。上述的發(fā)酵液與菌絲體分離，可采用過濾或離心分離方法獲得菌絲體。上述的葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在水相、有機(jī)相或水相-有機(jī)雙相中進(jìn)行。水相轉(zhuǎn)化條件為底物質(zhì)量比濃度為大于0.01％至飽和，在任意一種pH3～7的偏酸性的緩沖溶液中；有機(jī)相為乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺，或其他對(duì)細(xì)胞毒性較小的有機(jī)溶劑；水相-有機(jī)相為上述水相與有機(jī)相的任意比例混合物。轉(zhuǎn)化溫度范圍在20～40℃，10～400rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時(shí)間12～96小時(shí)，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌體通過離心或過濾分開，可獲得含有3′-hydroxypuerarin的轉(zhuǎn)化液。上述含有3′-hydroxypuerarin溶液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得3′-羥基葛根素固體(純度≥50％)；或向上述含有3′-hydroxypuerarin溶液中加入正丁醇或任何其他可萃取產(chǎn)物的有機(jī)溶劑，振蕩、萃取，靜置或離心分層后，有機(jī)相部分再用水萃取，萃取液經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，可得到含3′-hydroxypuerarin的溶液，再經(jīng)濃縮、或低溫處理后，可得到3′-hydroxypuerarin粉末(純度≥90％)。制得的3′-hydroxypuerarin在DMSO中的1H-NMR和13C-NMR的化學(xué)位移的解析結(jié)果如下1H-NMR(400MHz，DMSO-d6+D2O)δ(ppm)＝4.81(1H，d，J＝9.6Hz，glcH-1)，6.76(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，6.80(1H，dd，J＝8.1，1.9Hz，H-6′)，7.03(1H，d，J＝1.8Hz，H-2′)，6.99(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.93(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，8.30(1H，s，H-2)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ(ppm)＝153.0(C-2)，123.7(C-3)，175.3(C-4)，126.7(C-5)，115.8(C-6)，161.5(C-7)，113.1(C-8)，153.0(C-9)，117.4(C-10)；123.4(C-1′)，115.8(C-2′)，145.2(C-3′)，145.7(C-4′)，117.1(C-5′)，120.2(C-6′)；73.9(C-1″)，71.3(C-2″)，79.2(C-3″)，70.9(C-4″)，82.3(C-5″)，61.9(C-6″)。MS分析制得的3′-hydroxypuerarin的分子量為432。本發(fā)明用微生物轉(zhuǎn)化方法獲得的3′-羥基化葛根素其抗氧化活性比葛根素高20倍，且水溶性是底物的1.3以上，其他的藥理活性都有不同程度的改善，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，具有很好的應(yīng)用前景。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1.將100mlPDA培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入TrichodermaharzianumNJ01(CGMCC1523)菌種，30℃，200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)后，停止發(fā)酵，紗布過濾分離菌絲體和發(fā)酵液，取62.5ml菌液的菌絲體加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸鹽緩沖液(pH5.3)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振蕩通氣進(jìn)行葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，48小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌絲體，上清液中含有38％的3′-hydroxypuerarin。上清液用5ml正丁醇萃取兩次后，3′-hydroxypuerarin含量可達(dá)到80％。濃縮液經(jīng)硅膠柱層析分離濃縮后，得到純度達(dá)95％的3′-hydroxypuerarin粉末。實(shí)施例2.將50mlPDA培養(yǎng)基放入250ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入TrichodermaharzianumATCC20671菌種，20℃，150rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，96小時(shí)后，停止發(fā)酵，過濾使菌絲體和發(fā)酵液分離，取62.5ml菌液的菌絲體加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸鹽緩沖液(pH5.3)的250ml三角瓶中，20℃，150rpm振蕩通氣進(jìn)行葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，12小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌絲體，上清液中含有(純度32％)3′-hydroxypuerarin。上清液用10ml正丁醇萃取兩次后，3′-hydroxypuerarin純度可達(dá)到80％。濃縮色譜分離后，可得到(純度90％)3′-hydroxypuerarin粉末。實(shí)施例3.將3.5LPDA培養(yǎng)基放入5L全自動(dòng)發(fā)酵罐，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入TrichodermaharzianumATCC64060菌種，28℃，400rpm通氣發(fā)酵，36小時(shí)后，停止發(fā)酵，過濾使菌絲體和發(fā)酵液分離，取62.5ml菌液的菌絲體加入到含有0.5％葛根素，25ml磷酸鹽緩沖液(pH5.3)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振蕩通氣進(jìn)行葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，48小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌絲體，上清液中含有45％的3′hydroxypuerarin。上清液用15ml正丁醇萃取兩次后，3′-hydroxypuerarin含量可達(dá)到80％。濃縮色譜分離后，可得到(純度90％)3′-hydroxypuerarin粉末。實(shí)施例4.將100ml含(2％)淀粉，(2％)玉米漿培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入TrichodermaharzianumNJ01(CGMCC1523)菌種，28℃，250rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，36小時(shí)后，停止發(fā)酵，過濾使菌絲體和發(fā)酵液分離，取62.5ml菌液的菌絲體加入到含有0.5％葛根素，25m1磷酸鹽緩沖液(pH5.5)的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振蕩通氣進(jìn)行葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。48小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌絲體，上清液直接濃縮、干燥后，可得到3′-hydroxypuerarin粉末(純度為50％)。實(shí)施例5.將100ml含(1％)淀粉，(3％)玉米漿培養(yǎng)基放入500ml三角瓶共15瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入TrichodermaharzianumNJ01(CGMCC1523)菌株的孢子，25℃，220rpm通氣發(fā)酵，36小時(shí)后，停止發(fā)酵，過濾使菌絲體和發(fā)酵液分離，取1500ml菌液的菌絲體加入到475ml磷酸鹽緩沖液(pH5.3)，再加入25ml含40g/L葛根素的二甲基亞砜溶液(混合相中含葛根素2g/L)分裝入5個(gè)500ml三角瓶中。上述混合相于25℃，200rpm振蕩通氣進(jìn)行葛根素羥基化靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，72小時(shí)后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過濾去除菌絲體，上清液用250ml正丁醇萃取兩次后，經(jīng)HPLC制備色譜分離，濃縮結(jié)晶后，可得到0.6g純度為98％的3′-hydroxypuerarin粉末。實(shí)施例6與實(shí)施例1基本相同，但菌種采用TrichodermaharzianumATCC60850。實(shí)施例7與實(shí)施例1基本相同，但菌種采用TrichodermaharzianumATCC52443。實(shí)施例8與實(shí)施例1基本相同，但菌種采用HypocrealixiiATCCMYA-2453。本發(fā)明不限于這些公開的實(shí)施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。權(quán)利要求1.一種葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，所述的方法是將具有葛根素羥基化酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌絲體分離；所獲菌絲體作為靜息細(xì)胞，加入到含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為羥基葛根素；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得3′-羥基葛根素固體；或者將轉(zhuǎn)化液的上清液用有機(jī)溶劑萃取處理，有機(jī)溶劑萃取液再用水反萃取后，經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，得到含3′-羥基葛根素的溶液，再將含3′-羥基葛根素的溶液經(jīng)濃縮、或低溫處理后，得到3′-羥基葛根素粉末或晶體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的具有葛根素羥基化活力的微生物菌種是哈茨木霉，或者是任何可羥基化葛根素的微生物或混合微生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的哈茨木霉是TrichodermaharzianumNJ01(CGMCC1523)，TrichodermaharzianumATCC20671，TrichodermaharzianumATCC64060，TrichodermaharzianumATCC60850，TrichodermaharzianumATCC52443，HypocrealixiiATCCMYA-2453中的一種或幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液，是PDA培養(yǎng)液或其它任何適合于哈茨木霉或其它能羥基化葛根素的微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是20～40℃，10～400rpm搖瓶振蕩或通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，發(fā)酵12～96小時(shí)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)液與菌絲體分離，采用過濾分離方法或離心分離方法。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的菌絲體，可作為靜息細(xì)胞用于葛根素羥基化，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在水相、有機(jī)相或水相-有機(jī)雙相中進(jìn)行水相轉(zhuǎn)化條件為底物質(zhì)量比濃度為大于0.01％至飽和，在任意一種pH3～7的偏酸性的緩沖溶液中；有機(jī)相為乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺，或其他對(duì)細(xì)胞毒性較小的有機(jī)溶劑；水相-有機(jī)相為上述水相與有機(jī)相的混合物；轉(zhuǎn)化溫度范圍在20～40℃，10～400rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時(shí)間12～96小時(shí)，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌絲體過濾或離心分開，可獲得含有羥基葛根素的轉(zhuǎn)化液。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所說的萃取轉(zhuǎn)化液的有機(jī)溶劑為正丁醇，或任何其他可萃取產(chǎn)物的有機(jī)溶劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種葛根素羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明采用分離及保藏的具有葛根素羥基化酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌絲體分離；所獲菌絲體作為靜息細(xì)胞，加入到含有葛根素的轉(zhuǎn)化液中，使葛根素轉(zhuǎn)化為羥基葛根素；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌絲體，上清液經(jīng)濃縮、低溫干燥處理后，可得3′－羥基葛根素固體；或?qū)⑥D(zhuǎn)化液的上清液用有機(jī)溶劑萃取，再用水從有機(jī)相中反萃取，獲得的水相萃取液經(jīng)濃縮、硅膠層析分離，可得到含3′－羥基葛根素的溶液，再將含3′－羥基葛根素的溶液經(jīng)濃縮、或低溫處理后，可得到3′－羥基葛根素粉末或晶體。文檔編號(hào)C12R1/645GK1850982SQ20061003854公開日2006年10月25日申請(qǐng)日期2006年3月1日優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日發(fā)明者袁生,葉輝,叢曉東申請(qǐng)人:南京師范大學(xué),江蘇聯(lián)創(chuàng)醫(yī)藥技術(shù)有限公司