專利名稱：一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測樣品中細菌的試劑盒，特別涉及一種快速檢測樣 品中單增李斯特菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
單核細胞增生李斯特氏菌(簡稱單增李斯特菌Z歷朋OC/fOg朋M)是 一種人畜共患致病菌，可使人和動物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流
產(chǎn)、死胎等疾病，死亡率高達30 70%。該病廣泛存在于土壤、人和動物的糞
便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆發(fā)。近年來己有不少國家
報道了由于污染單增李斯特菌發(fā)生的食物中毒事件。早在1929年，就有報道該 菌對人有致病性，最嚴重的一次是1985年在美國加里福尼亞地區(qū)，應食用乳酪 引起的單增李斯特菌食物中毒。目前該菌每年在美國已成為由食物污染引起死亡 的四大病原菌之一。此外由于該菌在4'C冰箱保存的食品中也可生長繁殖，故其 危害性進一步增大。因此世界各國政府部門對其菌越來越重視，紛紛制定一些新 的食品安全法規(guī)，并把單增李斯特菌納入法定強檢項目。我國每年大量進口水產(chǎn) 品，加入WT0以來，進出口貿(mào)易呈直線上升態(tài)勢，傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢驗方法， 檢驗周期冗長，至少需要5 14d才能得出結(jié)果，歩驟繁瑣且檢驗精度低。為了 適應對外貿(mào)易發(fā)展的新需要，實現(xiàn)與國際檢測技術(shù)接軌，有必要建立一種簡便、 快速、準確的檢出方法，以更好的為檢驗檢疫事業(yè)服務。
近年來，國內(nèi)外的研究人員建立了多種快速檢測食品中單增李斯特菌的方 法，包括商海濤等的"李斯特氏菌因子血清的制備及食品檢測的免疫磁性分離一 PCR (MIPA)方法的建立"(中國獸醫(yī)學報，1999， 19(4) :339-343)、寇運同等. 的"用免疫磁珠捕集法快速檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌"(檢驗檢疫科 學，2001, 11(6) :12-13)、 0 Connor等的PCR/DNA探針方法、孫煥冬等"半套式 聚合酶鏈反應檢測牛奶中部分腸道致病菌"(職業(yè)與健康，2002, 18(3) :43-44) 等方法。上述方法樣品均需前增菌，延長了檢出的時間且檢測的靈敏度低。還沒 有解決快速檢出單增李斯特菌的問題。
隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)在國際上得到了越 來越廣泛的應用，不少用PCR檢測致病菌的方法己十分成熟，并在某些國家成為
官方認可的方法。
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載 體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學 活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相 載體表面的抗原或抗體起反應。用洗漆的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合 物與液體中的其它物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在 固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反 應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接 相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接 地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。
PCR-ELISA技術(shù)的原理是PCR 5'端標記上地高辛或生物素等非放射性標記 物，擴增產(chǎn)物滴加到固定有特異性探針的微孔板上，再加入抗地高辛或生物素酶 標抗體一辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終加底物顯色。在酶標板上測定OD值判定 結(jié)果。根據(jù)內(nèi)標的讀數(shù)作出標準曲線，并利用標準曲線讀出樣品單增李斯特菌的 含量。本發(fā)明采用PCR—ELISA方法，利用單增李斯特菌毒力簇金屬蛋白酶基因 (/職力作為PCR的靶基因，應用地高辛標記的DIG-PCR-ELISA技術(shù)進行檢測單增 李斯特菌的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，以 便可以快速、靈敏、準確地檢出樣品中單增李斯特菌，適合于各種樣品的大批量 檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明的試劑盒主要由以下幾種試劑配方組成
試劑A: DNA提取液；
試劑B: PCR引物和探針；
試劑C: PCR反應液，其中含有特定一對引物(LM1;5'端被地高辛標記的 LM2 )， 其序列分別為5，-GAAAAAGCATTTGCCAT-3'和 5'-GCAACTTCCGGCTCAGC-3';
試劑D: ELISA反應液(l.結(jié)合buffer; 2.生物素標記的捕獲探針LM4和IS5; 3.變性液;4.雜交液;5.洗液I; 6.anti-DIG-POD; 7.洗液II; 8.顯色底物A; 9.顯色底 物B; IO.終止液)，其中5'端被生物素標記的探針LM4和IS5序列分別為 5，-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3'和5'-TACGTACTCTCGATCACGTC-3，。
鏈(霉)親和素包被的96孔板。
試劑C、 D中所含的特定引物每種含量應不少于O.,M。 本發(fā)明所提供的快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒的使用方法如下
一、 前處理樣品及DNA的提取
1. 離心機選取參數(shù)10000g，將lmL的待測細菌培養(yǎng)液離心10分鐘，棄上清 液。
2. 沉淀重懸在50(VL50mMNaOH中，且重懸液在加熱器中95'C溫育10分 鐘，用80pL 1M Tris-HCl中和；
3. —20。C保存DNA留用。
二、 PCR反應
取lpL待檢樣品DNA加入反應管C中，混勻后在PCR儀中進行以下反應
95 °C10分鐘95 °C30秒
59 °C30秒-95。C至72'C這三組循環(huán)35次
72 °C30秒
72 °C5分鐘4°C停止三、ELISA反應
L200nL結(jié)合buffer加入lnL2.5^M生物素標記的捕獲探針LM4(終濃 度為2.5pM),加入鏈(霉)親和素包被的96孔板中，20。C 25。C 孵育2小時，去掉buffer。
2. PCR產(chǎn)物通過加入等體積的變性液孵育10min變性，lOpL已變性的 PCR產(chǎn)物與lOOpL雜交液混合后加入反應板中，50。C雜交30min， 然后用預熱的wash buffer I 50°C洗4次。
3. 每孔加入稀釋的anti-DIG-POD (原濃度150U/mL,l:2000稀釋) lOOpL， 37。C孵育30min。
4. 室溫用wash buffer II洗4次。
5. 加入顯色底物A和B后反應15 min。最后加終止液100pL終止反應，
用酶標儀450nm檢測吸光度。
反應結(jié)束后，根據(jù)內(nèi)標的讀數(shù)作出標準曲線，并利用標準曲線中單增李斯特 菌的拷貝數(shù)。使用本發(fā)明的試劑盒，經(jīng)實際試驗，證明可以快速、準確、半定量 地檢出樣品中的單增李斯特菌。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明檢測單增李斯特菌PCR-ELISA試劑盒，可對 單增李斯特菌能進行半定量檢測，其方法比常規(guī)電泳檢測方法靈敏度高，可達 104CFU/mL，在5 6小時即可完成檢驗。可以快速、準確、半定量地檢出樣品中 的單增李斯特菌，適合于各種樣品的大批量檢測。
具體實施例方式豬肉糜和青菜用快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒檢測。試 劑盒組成為
試劑A: DNA提取液,其組成為50mM NaOH, 1M Tris-HQ; 試劑B: PCR引物LM1、 LM2和探針LM4和IS5;
試劑C: PCR反應液，每管25pL擴增反應體系組成中含2pL 0. 025mol r'MgCl2; 0. 4pM 1對弓I物LM1禾口LM2為1^L; 10xPCR buffre 2. 5pL; 200|iM dNTP lpL; Taq酶0. 75U; 15U尿嘧啶-DNA糖基化酶；DNA lpL (終濃 度為10 100ng/mL); ddH20 15. 85pL;
試劑D: ELISA反應液，組成為1.結(jié)合buffer(10mMTris-HC1, lOOmMNaCl, lmM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，O. 15%(V/V)TritonX-100, pH 7. 5 ); 2.生物素標記探 針LM4、 IS5(終濃度為2.5pM); 3.變性液(125函aOH; 20mMEDTA); 4.雜交液
(2. 5xSSC, 2x Denhardt， s solution, 10mM Tris—HC1， 1 mM EDTA'pH7. 5); 5.洗液I (lxSSC, 2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HCl, 1 mMEDTA, pH7. 5); 6.抗-DIG (地高辛)-POD (150U/mL，用時1:2000稀釋)7.洗液II
(lOOmMTris-HQ, 150 mM NaCl, 0.05%(V/V)Tween (吐溫) 20, 0. 5%(W/V) blocking reagent (反應終止劑),100|ig/mL DNA from herring sperm
(鯡魚精DNA) ， pH7.5 ; 8.顯色底物A:O. 4 mM TMB(四甲基聯(lián)苯胺)、顯色底物 B (0.02% H202); 9.終止液(50mM H2S04)
按本發(fā)明所提供的快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒的使用方法，先用 試劑A提取樣品中的DNA,進行PCR反應，反應結(jié)束后取20nLPCR反應液加至 ELISA反應液中根據(jù)OD值換算樣品中單增李斯特菌的拷貝數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其特征是，該試劑盒由以下試劑組成試劑ADNA提取液；試劑BPCR引物和探針；試劑CPCR反應液，其中含有特定的1對引物LM1，5’端被地高辛標記的LM2，其序列分別為5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；試劑DELISA反應液，其中含有特定的1對引物5’端被生物素標記的探針LM4和IS5，序列分別為5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其 特征是所述的DNA提取液其組成為50mM NaOH， 1M Tris-HC1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其 特征是所述的PCR引物為LM1、 LM2，探針為LM4和IS5。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其 特征是所述的PCR反應液為每管25pL擴增反應體系組成中含2pL 0. 025mol r'MgCl2; 0.4pMl對引物LMl和LM2為lpL; 10xPCR buffre 2. 5pL; 200nM dNTP lpL; Taq酶O. 75U; 15U尿噴啶-DNA糖基化酶；DNA lpL; ddH20 15. 85pL。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒， 其特征是DNA的終濃度為10 100ng/mL。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其 特征是ELISA反應液由以下組成結(jié)合buffer : lOmMTris-HC1 ， lOOmMNaCl ， lMmedta ， 體積比為 0.15%TritonX-100， pH7. 5 ;生物素標記探針LM4、 IS5，終濃度為2.5pM; 變性液125 mMNaOH， 20mMEDTA ; 雜交液2. 5xSSC，2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HCl， 1 mMEDTA，pH7. 5 ;洗液I: lxSSC，2x Denhardt' s solution, 10mM Tris-HC1, 1 mMEDTA, pH7.5;抗-DIG-POD:原濃度為150U/mL，用時1:2000稀釋；洗液II: lOOmM Tris-HC1, 150 mM NaCl,體積比為0. 05%Tween 20，重量體 積比為0. 5%blocking reagent, lOOpg/mL腿from herring sperm, pH7. 5 ; 顯色底物A: 0. 4 mM TMB ; 顯色底物B: 0. 02% HA; 終止液50mM H2S04。
7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其 特征是試劑C、 D中所含的特定引物每種含量應不少于0.4pM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測樣品中細菌的試劑盒，特別涉及一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒。主要解決常規(guī)電泳檢測方法速度慢、靈敏度低的技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種快速檢測樣品中單增李斯特菌的試劑盒，其特征是該試劑盒由以下試劑組成試劑ADNA提取液；試劑BPCR引物和探針；試劑CPCR反應液，其中含有特定的1對引物LM1，5’端被地高辛標記的LM2，其序列分別為5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；試劑DELISA反應液，其中含有特定的1對引物5’端被生物素標記的探針LM4和IS5，序列分別為5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。本發(fā)明主要用于對樣品中單增李斯特菌的快速檢測。
文檔編號C12Q1/04GK101113465SQ200610029348
公開日2008年1月30日 申請日期2006年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日
發(fā)明者李曉虹, 閻東麗, 偉 韓 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局