專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中噬菌粒顆粒(Phagemidparticles)的制備，特別是一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法。
背景技術(shù)：
野生型絲狀噬菌體(filamentous phage)，含一個(gè)約6.4kb的單鏈閉環(huán)DNA分子。其病毒顆粒直徑約6.5nm，長(zhǎng)度約900nm，外殼主要由主要外殼蛋白(pVIII，2700拷貝)組成。次要外殼蛋白(pIII)僅僅有3～5拷貝。病毒顆粒只能感染具有性纖毛的細(xì)菌菌株，當(dāng)病毒穿過(guò)性纖毛時(shí)，其外層主要外殼蛋白(pVIII)脫落，病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA。
迄今為止，pIII，pVIII，pVI，都曾被用來(lái)展示肽配體、蛋白配體、抗原或抗體(如ScFvs，F(xiàn)abs)，并建立相應(yīng)的展示文庫(kù)。
我們知道，動(dòng)物病毒(Animal virus)和非病毒載體(syntheticvector)是最常用的基因?qū)胼d體。但是動(dòng)物病毒載體有天然的嗜性(natural tropism)，靶向性改造非常困難，這也是動(dòng)物病毒載體成為基因治療載體最大的瓶頸；非病毒載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性較差。絲狀噬菌體在人細(xì)胞中沒(méi)有天然嗜性，而且配體(多肽、蛋白、抗體)很容易展示在絲狀噬菌體表面并保持原有生物學(xué)活性(如圖1)。此外，絲狀噬菌體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(low complexity)，病毒顆粒均一，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，絲狀噬菌體近年來(lái)逐漸發(fā)展成為除了動(dòng)物病毒載體和非病毒載體外的又一基因治療載體的選擇。
目前有幾種方法來(lái)把絲狀噬菌體制備成為基因?qū)胼d體。
其中一種方法是直接把絲狀噬菌體作為載體的，也就是說(shuō)把目的基因的表達(dá)盒子(Expression cassette)直接插入噬菌體的雙鏈DNA基因組的基因間隔區(qū)(Intergenic region)，把抗體、多肽、或配體蛋白展示在噬菌體表面，這樣所獲得的噬菌體基因組就含有目的基因的表達(dá)盒了。如圖2所示配體多肽GE11和基因III融合表達(dá)，而增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，簡(jiǎn)稱(chēng)EGFP)表達(dá)盒插入基因間隔區(qū)。這種方法不需要輔助噬菌體的幫助就可以得到帶有目的基因及展示靶向元件的病毒顆粒了。但是這種方法有幾個(gè)不足之處，其一是噬菌體本身包裝容量有限(10kb左右)，自身基因組已經(jīng)占了很大的空間，能夠容納外源基因大小非常有限；其二是在噬菌體雙鏈DNA上進(jìn)行操作很不方便；其三是因?yàn)榛蚪M大，導(dǎo)致病毒顆粒大(基因組和病毒顆粒大小成正比)，而病毒粒徑關(guān)系到其在體內(nèi)的組織穿透力。
另一種方法是把目的基因的表達(dá)盒裝在噬菌粒(phagemid)上。所謂噬菌粒指的就是帶有絲狀噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(f1 origin)的質(zhì)粒。很多商品化的質(zhì)粒包括pEGFP-N1(見(jiàn)圖3)、pGL3等都是噬菌粒。這些噬菌粒在輔助噬菌體的幫助下，可以包裝成噬菌粒顆粒，即含有噬菌粒單鏈DNA基因組，并具有噬菌體外殼的噬菌體。噬菌粒顆粒的外殼就是噬菌體的蛋白(包括pIII，pVIII等)，這些輔助噬菌體的作用就是反式提供包裝噬菌粒的外殼蛋白，識(shí)別噬菌?；蚪M的f1 origin，使噬菌粒進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，包裝形成噬菌粒顆粒。如果把靶向元件和外殼蛋白(如pIII或pVIII)融合表達(dá)，就可以獲得靶向噬菌粒(見(jiàn)圖4A)。和前一種方法相比，噬菌粒顆粒具有外源基因容量大，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
目前有兩種策略用于制備靶向性噬菌粒顆粒。一種策略(見(jiàn)圖4A)是克隆配體與pIII融合的表達(dá)盒(expression cassette)于噬菌粒然后用輔助噬菌體如R408、VCSM13(Stratagene，La Jolla，CA，USA)來(lái)拯救。這種方法制備出來(lái)的噬菌粒由于有野生型蛋白III的參與，所以配體展示水平比較低。另一種策略(見(jiàn)圖4B)相對(duì)復(fù)雜。把輔助噬菌體R408的基因III缺失，產(chǎn)生基因III缺失的輔助噬菌體R408d3。這種輔助噬菌體只有在能提供蛋白III的細(xì)胞才能擴(kuò)增。由于以上兩種策略所用的phagemid都必須表達(dá)有配體-蛋白III(ligand-pIII fusion protein)表達(dá)盒，所以必然增加phagemid的大小。因?yàn)槭删ｎw粒的大小和噬菌?；蚪M大小成正比，所以這兩種方法所形成的噬菌粒顆粒會(huì)比較大。這樣就會(huì)影響噬菌粒顆粒在體內(nèi)組織的穿透能力。
為了尋找一種既簡(jiǎn)便，又能使噬菌粒顆粒高水平展示靶向配體，而且還可以不用噬菌粒來(lái)表達(dá)配體-蛋白III的方法，我們?cè)?jīng)采用直接改造輔助噬菌體的方法(Zonghai Li，et al.BioTechniques，2005，39(4)，493-496)來(lái)達(dá)到這兩個(gè)目的。該方法直接在輔助噬菌體表達(dá)融合有外源多肽的蛋白III。然后制備輔助噬菌體，用所制備的輔助噬菌體來(lái)感染(Infection)轉(zhuǎn)化了噬菌粒的F因子陽(yáng)性細(xì)菌，從而拯救了噬菌粒，形成噬菌粒顆粒。并成功地用該噬菌粒顆粒轉(zhuǎn)染了COS-1細(xì)胞。但是我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，如果想直接用制備在蛋白III融合表達(dá)一些比較大的蛋白如EGF的輔助噬菌體時(shí)，輔助噬菌體的產(chǎn)量很低，制備成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，主要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，所制備的噬菌粒顆粒的外源多肽的展示水平高，且不用制備輔助噬菌體，減少了復(fù)雜的制備輔助噬菌體的過(guò)程。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于采用編碼外源多肽與pIII外殼蛋白融合蛋白的輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒共轉(zhuǎn)化或先后轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，從而獲得展示外源多肽的噬菌粒顆粒。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該絲狀噬菌體M13的輔助噬菌體M13KO7的pIII外殼蛋白的編碼序列替換成外源多肽與pIII的融合蛋白的編碼序列，其中外源多肽位于融合蛋白的氨基端，pIII位于融合蛋白的羧基端，外源多肽前面保留了pIII的分泌信號(hào)肽序列。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該絲狀噬菌體M13的輔助噬菌體M13KO7的pIII外殼蛋白的編碼序列替換成外源多肽與pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼序列，其中外源多肽位于融合蛋白的氨基端，pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域位于融合蛋白的羧基端，外源多肽前面保留了pIII的分泌信號(hào)肽序列，外源多肽與pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域之間存在一個(gè)富含甘氨酸的接頭。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該輔助噬菌體的蛋白III或蛋白III羧基端結(jié)構(gòu)域的氨基端融合了外源多肽。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該噬菌粒攜帶可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的各種遺傳物質(zhì)。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于各種遺傳物質(zhì)包括綠色熒光蛋白的表達(dá)盒。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該外源蛋白或肽可以是抗原、抗體，也可以是配體或其它多肽。
所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該方法可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒顆粒同時(shí)轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株；也可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把噬菌粒轉(zhuǎn)化至含有該輔助噬菌體的質(zhì)粒的菌株；還可以把噬菌粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有該噬菌粒的菌株。


圖1是基因工程改造的絲狀噬菌體用于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Larocca，D.and A.Baird.Receptor-mediated gene transfer by phage-display vectorsapplications in functional genomics and gene therapy.Drug Discovery Today，2001，6(15)793-801)。
其中(a)天然的噬菌體，沒(méi)有配體展示，所以無(wú)法轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(b)展示了配體，因而可以感染表達(dá)相應(yīng)受體的腫瘤細(xì)胞，并將噬菌體基因組攜帶的外源基因GFP表達(dá)。
圖2是M13KE-GE11-egfp(-)Amp基因組(質(zhì)粒)圖譜。
其中EGFP基因插在M13基因組的基因間隔區(qū)，GE11多肽編碼序列融合在基因III的5’端。
圖3是pEGFP-N1(clontech)質(zhì)粒圖譜。
其中F1 Ori指的是絲狀噬菌體的復(fù)制起始點(diǎn)。
圖4是現(xiàn)有制備多肽(或配體)展示的噬菌粒顆粒的方法的示意圖。
圖5是本發(fā)明方法的實(shí)施例中M13EGFKO7(或稱(chēng)M13KO7-EGF)的基因組質(zhì)粒圖譜。
圖6是本發(fā)明方法的實(shí)施例中M13EGFKO7的質(zhì)粒酶切圖譜。
圖7是本發(fā)明方法的實(shí)施例中M13EGFKO7CT(或稱(chēng)M13KO7EGF-CT)的基因組質(zhì)粒圖譜。
圖8是本發(fā)明方法的實(shí)施例中M13EGFKO7CT的質(zhì)粒酶切圖譜。
圖9是本發(fā)明方法的實(shí)施例中噬菌粒pEGFP-Amp圖譜。
圖10是本發(fā)明方法的實(shí)施例中噬菌粒顆粒單鏈DNA圖譜。
圖11是本發(fā)明方法的實(shí)施例中噬菌粒顆粒的EGF展示水平圖。
圖12是本發(fā)明方法的實(shí)施例中噬菌粒顆粒在前列腺癌細(xì)胞系中的內(nèi)吞圖。
圖13是本發(fā)明方法的實(shí)施例中噬菌粒顆粒的體外基因?qū)搿?br> 具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，該方法采用編碼外源多肽與pIII外殼蛋白融合蛋白的輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒共轉(zhuǎn)化或先后轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，從而獲得展示外源多肽的噬菌粒顆粒。利用該方法所獲得的噬菌粒顆粒具有展示外源多肽水平高，容納外源目的基因的能力大，病毒顆粒小等特點(diǎn)。利用該種方法可以制備噬菌體基因?qū)胼d體，制備展示抗原的載體作為抗原。
該方法可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒顆粒同時(shí)轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株；也可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把噬菌粒轉(zhuǎn)化至含有該輔助噬菌體的質(zhì)粒的菌株；還可以把噬菌粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有該噬菌粒的菌株。
本發(fā)明方法中的噬菌粒顆粒指的是來(lái)源于絲狀噬菌體的噬菌粒顆粒，該絲狀噬菌體可以是M13噬菌體，也可以是其它絲狀噬菌體。
本發(fā)明方法中所用的輔助噬菌體，可以是M13來(lái)源的輔助噬菌體，也可以是其它絲狀噬菌體來(lái)源的輔助噬菌體，其特征在于它的蛋白III或蛋白III羧基端結(jié)構(gòu)域的氨基端融合了外源多肽。
本發(fā)明方法中所指的噬菌粒顆粒展示的外源多肽沒(méi)有特別的限制，可以是一些小肽如GE11(Zonghai Li，et al.FASEB J，2005；19，1978-1985)，P1(Zonghai Li，et al.BioTechnqiues，2005，39(4)493-6)等，也可以是一些比較大的蛋白質(zhì)如表皮生長(zhǎng)因子等，還可以是單鏈抗體等。
本發(fā)明方法中所用的噬菌粒沒(méi)有特別的限制，它不須含有基因III，也不須含有蛋白III與外源多肽的融合蛋白的編碼序列；它可以攜帶各種基因，也可以攜帶siRNA、microRNA、反義cDNA、核酶等的編碼序列。
該噬菌粒攜帶可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的各種遺傳物質(zhì)，各種遺傳物質(zhì)包括綠色熒光蛋白的表達(dá)盒。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于①通過(guò)本發(fā)明方法制備的噬菌粒顆粒的外源多肽的展示水平高。
②本發(fā)明方法中所包裝的噬菌粒不須含有基因III，也不須含有蛋白III與外源多肽的融合蛋白的編碼序列，從而為攜帶其它目的基因節(jié)省至少580bp的空間。
③本發(fā)明過(guò)程中不用制備輔助噬菌體，減少了復(fù)雜的制備輔助噬菌體的過(guò)程。
下面結(jié)合一具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其實(shí)驗(yàn)方法通常按照常規(guī)條件例如Sambrook等人的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
該實(shí)施例的具體過(guò)程如下一、輔助噬菌體質(zhì)粒的制備把表皮生長(zhǎng)因子的編碼序列亞克隆進(jìn)入用Acc65I及EagI雙酶切的M13KO7P1(Zonghaili，et al.BioTechniques，2005，39(4)493-6)質(zhì)粒骨架上。EGF編碼序列是用M13EGF-15’-cggggtacctttctattctcactctaattccgactctgaatgccc-3’和M13EGF-25’-gtttCggccgaacctccaccacgcagttcccaccatttc-3’引物，以pAE-8(Gan，B.-R.；Huang，P.；Yuan，Y.；Yao，J.；Wen，H.；Wen，Z.，Secretion of OverproducedHuman Epidermal Growth Factor in Escherichia Coli.Acta Biochimica etBiophysica Sinica 1992，24.)為模板擴(kuò)增獲得的。PCR擴(kuò)增條件為45 s at95℃，45 s at 60℃，30 s at 72℃，20 cycles；72℃，5min，1cycle?；厥誅NA，用Aee65I和EagI酶切，瓊脂糖回收，連接到Acc65I和EagI雙酶切的M13KO7P1質(zhì)粒載體，由此產(chǎn)生載體M13EGFKO7(或稱(chēng)為M13KO7-EGF)。圖譜見(jiàn)圖5，質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6；圖6A指的是用XhoI與MluI雙酶切結(jié)果；圖6B指的是KpnI與HindIII雙酶切結(jié)果。
M13EGFKO7CT(或稱(chēng)M13KO7CT-EGF)用引物M13EGF-15’-cggggtacctttctattctcactctaattccgactctgaatgccc-3’和M13EGF-25’-gtttCggccgaacctccaccacgcagttcccaccatttc-3’，以M13EGFKO7為模板擴(kuò)增產(chǎn)生DNA片段1；用引物CT-15’-ctgcgtggtggaggttcggctagcggtggtggctctggttccggt-3’CT-25’-Cgcgcagaggcgaattattc-3’從M13EGFKO7擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA片段2。把片段1和2進(jìn)行搭橋PCR(assembly PCR)就可以產(chǎn)生DNA片段3，它含有EGF-pIIICT(也就是EGF與蛋白III的羧基端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)的編碼序列。用KpnI和PacI酶切片段3，然后與用KpnI和PacI雙酶切的M13KO7載體連接。克隆經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序確定，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖7，酶切圖譜見(jiàn)圖8。
二、噬菌粒載體的制備pEGFP-Amp的構(gòu)建是用氨芐青霉素抗性基因取代pEGFP-N1(BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)的卡那霉素抗性基因。氨芐青霉素抗性基因是用Amp-pvuII5’-CCCCAGCTGCGTCAGGTGGCACTTTTC-3’和Amp-Eco05’-CTGAGGGCCTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAG-3’引物，以pUC119質(zhì)粒(大連寶生物，中國(guó))為模板擴(kuò)增獲得的。PCR條件為45sat 95℃，45 s at 60℃，90 s at 72℃ for 20cycles，72℃，7-min.回收純化DNA，用pvuII和Eco0109 I酶切，瓊脂糖回收純化，連接到pvuII和Eco0109I雙酶切的pEGFP-N1載體片段，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖9。
三、噬菌粒顆粒的制備噬菌粒，pEGFP-amp可以和M13KO7-EGF共轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，并于含氨芐青霉素(60μg/ml)/卡那霉素(50μg/ml)的細(xì)菌培養(yǎng)平板(LB+15G/L細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂)。第二天，挑一菌落于含有2ml氨芐青霉素(60μg/ml)/卡那霉素(50μg/ml)的LB的5ml試管，于搖床37℃，300rpm/min，搖至細(xì)菌OD值達(dá)到約0.6；然后把這些菌液全部轉(zhuǎn)到含有200ml LB(含氨芐青霉素(60μg/ml)/卡那霉素(50μg/ml)的1L三角燒瓶中，于搖床37℃，300rpm/min，搖16小時(shí)左右。然后于4℃，以10000rpm/min，離心15min，收集上清，把上清重復(fù)離心一次，收集80％的上清，加入上清的1/6體積的混勻，4℃過(guò)夜。4℃，以10000rpm/min，離心15min，去上清，再次瞬時(shí)離心一次，把殘液盡量去掉。用1ml TBS重懸沉淀，然后加入200μ1 6M PEG/NaCl。以商品化的M13KO7作為標(biāo)準(zhǔn)品，以O(shè)D260測(cè)定噬菌粒顆粒的滴度，大約為1.8×1011cfu/ml。
四、噬菌體單鏈DNA的制備流程是1)噬菌體和噬菌粒顆粒用PEG/NaCl沉淀；2)把沉淀重懸于100μl的碘化鈉(4M)緩沖液；3)加入250μl乙醇，孵育10分鐘；4)為了使單鏈DNA沉淀，13000rpm/min，離心10分鐘；5)用70％乙醇洗滌，風(fēng)干10分鐘；6)用30μl TE buffer(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)溶解沉淀；7)電泳分析。單鏈DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖10，Lane1M13EGFKO7CT包裝的pEGFP-amp；Lane2M13EGFKO7包裝的pEGFP-amp；Lane3M13KO7helper phage.
五、EGF展示水平的免疫印跡分析過(guò)程
1)純化的噬菌體和噬菌粒用含5％巰基乙醇的Tris-glycine-SDS樣品緩沖液煮沸5分鐘；2)10％的SDS-PAGE電泳分離；3)轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(0.2-mm pore；Bio-Rad)；4)用5％脫脂牛奶的PBST封閉2小時(shí)；5)把膜和mouse anti-M13pIII monoclonal antibody(1μg/ml；NEB，用5％脫脂牛奶的PBST以1∶1000稀釋)室溫下孵育1小時(shí)；6)PBST洗滌3次；7)加HRP標(biāo)記的抗鼠二抗，用5％脫脂牛奶的PBST以1∶5000稀釋)室溫1小時(shí)；8)PBST洗滌3次；9)用supersignal west-pico kit(Pierce Chemical，Rockford，IL)處理5min；10)壓片，顯影及定影。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。LanelM13EGFKO7CT包裝的pEGFP-amp；Lane2M13EGFKO7包裝的pEGFP-amp；Lane3M13KO7 helper phage.
六、噬菌粒顆粒的內(nèi)吞檢測(cè)過(guò)程是1)將前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)過(guò)夜；2)把噬菌體或噬菌粒顆粒(1×1010pfu/ml)加到24孔板中，37℃孵育48個(gè)小時(shí)；3)用PBST洗細(xì)胞3×10min；4)4％多聚甲醛固定培養(yǎng)細(xì)胞30min；5)用PBST洗細(xì)胞3×10min；6)10％正常羊血清封閉1hr；7)加入mouse anti-M13 antibody(1∶200)；8)PBST洗6×10min；
9)加1∶50稀釋的Fluorescein-labeled affinity purifiedantibody to mouse IgG(H+L)(KPL，Guildford，United Kingdom)及1∶100稀釋的DAPI，室溫避光30min；10)PBST洗6×10min；11)熒光顯微鏡下觀察；12)在競(jìng)爭(zhēng)組中，0.5mM GE11多肽和噬菌粒顆?；蚴删w共孵育。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12，可見(jiàn)有很多細(xì)胞存在噬菌粒顆粒內(nèi)吞。
七、噬菌粒顆粒的體外基因?qū)脒^(guò)程是1)把COS-1 cells或MCF-7(2,000cells/well)接種于24孔板；2)24h后，加入噬菌粒顆粒(1011pfu/ml)，繼續(xù)孵育48小時(shí)；3)熒光顯微鏡下觀察；4)在羥基喜樹(shù)堿處理組中，噬菌粒顆粒和細(xì)胞孵育后30小時(shí)，把培基換成含10μM的羥基喜樹(shù)堿的新鮮培養(yǎng)；7小時(shí)后換成完全培基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13，由圖13A可見(jiàn)有約8％的細(xì)胞有EGFP表達(dá)，由圖13B可見(jiàn)當(dāng)添加羥基喜樹(shù)堿時(shí)有約20％的細(xì)胞有EGFP表達(dá)。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
權(quán)利要求
1.一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于采用編碼外源多肽與pIII外殼蛋白融合蛋白的輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒共轉(zhuǎn)化或先后轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，從而獲得展示外源多肽的噬菌粒顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該絲狀噬菌體M13的輔助噬菌體M13KO7的pIII外殼蛋白的編碼序列替換成外源多肽與pIII的融合蛋白的編碼序列，其中外源多肽位于融合蛋白的氨基端，pIII位于融合蛋白的羧基端，外源多肽前面保留了pIII的分泌信號(hào)肽序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該絲狀噬菌體M13的輔助噬菌體M13KO7的pIII外殼蛋白的編碼序列替換成外源多肽與pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的編碼序列，其中外源多肽位于融合蛋白的氨基端，pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域位于融合蛋白的羧基端，外源多肽前面保留了pIII的分泌信號(hào)肽序列，外源多肽與pIII的羧基端結(jié)構(gòu)域之間存在一個(gè)富含甘氨酸的接頭。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該輔助噬菌體的蛋白III或蛋白III羧基端結(jié)構(gòu)域的氨基端融合了外源多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該噬菌粒攜帶可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的各種遺傳物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于各種遺傳物質(zhì)包括綠色熒光蛋白的表達(dá)盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該外源蛋白或肽可以是抗原、抗體，也可以是配體或其它多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法，其特征在于該方法可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒顆粒同時(shí)轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株；也可以是把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把噬菌粒轉(zhuǎn)化至含有該輔助噬菌體的質(zhì)粒的菌株；還可以把噬菌粒轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，然后再把輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有該噬菌粒的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的噬菌粒顆粒，特別是一種制備展示多肽的噬菌粒顆粒的方法。該方法采用編碼外源多肽與pIII外殼蛋白的融合蛋白的輔助噬菌體的基因組質(zhì)粒與噬菌粒共轉(zhuǎn)化或先后轉(zhuǎn)化F因子陽(yáng)性的菌株，從而獲得展示外源多肽的噬菌粒顆粒。使用該方法所制備的噬菌粒顆粒的外源多肽的展示水平高，且不用制備輔助噬菌體，減少了復(fù)雜的制備輔助噬菌體的過(guò)程。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1884555SQ20061002794
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日
發(fā)明者李宗海, 顧健人, 楊勝利, 張捷, 石必枝 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所