專利名稱：快速檢測細小脲原體的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種快速檢測細小脲原體熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))試劑盒，適用于細小脲原體的定性定量檢測。
背景技術(shù)：
解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)是人類泌尿生殖道常見的共生微生物，在性傳播疾病中解脲脲原體與非淋菌性尿道炎(NGU)、附睪炎有關(guān)；與前列腺炎、女性尿道癥狀、腎盂腎炎、盆腔炎有明顯相關(guān)性或提示有病原學(xué)作用。NGU作為我國控制的8種性病之一，其發(fā)病率日益增高。解脲脲原體分為兩個生物群(Biovar)和14個血清型。這兩個生物群可從表型和遺傳上進行鑒定。但越來越多的證據(jù)表明它可分為兩個種，即Ureaplasma parvum(命名為微小脲原體，以前的B iovarl，包括血清型1，3，6，14)和Ureaplasma urealyticum(以前的Biovar 2，包括血清型2，4，5，7～13，保留原來的名稱解脲脲原體)。在人類泌尿生殖道定殖或引起感染的絕大部分為第1群-細小脲原體(Ureaplasmaparvum，UP)。
近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen EffectDetermined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)、病原體的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approachto the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detectionand Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10.)和定量檢測(Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310.；Martell M，Gomez J，Esteban JI，et al.High-ThroughputReal-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detection and Quantification of CMV DNA inUrine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitationof HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法，國內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結(jié)核定量檢測的試劑盒上市。
臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)方法具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費力等缺點；常規(guī)PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優(yōu)勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽性等問題；因此焏待開發(fā)精確、靈敏、快速、無污染的臨床檢驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種快速檢測細小脲原體的熒光定量PCR試劑盒。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一、PCR試劑盒該試劑盒包括a)DNA裂解液，b)熒光定量PCR反應(yīng)液，c)UP標準陽性模板pU-UP，d)陰性質(zhì)控標準品；熒光定量PCR反應(yīng)液含有細小脲原體特異性引物對和熒光探針；細小脲原體(UP)正向引物為5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物為5′-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′，
熒光探針序列為5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′；熒光探針5′端標記報告熒光基團FAM，3′端標記不發(fā)光的淬滅基團標記，并連接小型凹槽結(jié)合物-MGB基團(TaqMan MGB探針)，可以大大提高探針的退火溫度(Tm值)，標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因-脲酶基因的111個堿基對的核苷酸片段構(gòu)成的pUCm-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5α中增殖。
具體地說a)DNA裂解液DNA裂解液包含50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，體積分數(shù)為1％ Triton X-100，體積分數(shù)為1％ NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b)熒光定量PCR反應(yīng)液熒光定量PCR反應(yīng)液包含PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.8μl(10μmol/L)，熒光探針0.8μl(5μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl(2.5U/μl)，無菌雙蒸水10.3μl。熒光探針使用濃度為5μmol/L。
c)UP標準陽性模板pU-UPUP標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因ureE基因111個核苷酸片段構(gòu)成的pUCm-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量并稀釋至109拷貝/μl，-20℃保存。貯存濃度為109拷貝/μl，使用前進行10倍梯度的系列稀釋。
d)陰性質(zhì)控標準品陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水；本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的快速定量檢測細小脲原體熒光定量PCR試劑盒中，有標記了熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5′端報告基團產(chǎn)生的熒光因為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3′端淬滅基團淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，HOTSTART Taq DNA聚合酶利用其5′→3′外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報告基團所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對細小脲原體的定量可通過與標準品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)個數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明提供的檢測細小脲原體熒光定量PCR試劑盒中，針對細小脲原體檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于細小脲原體定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，建立了檢測細小脲原體熒光定量PCR方法，并研制出檢測細小脲原體熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷細小脲原體的要求。
二、本發(fā)明的使用方法包括下列步驟a)對貯存濃度為109拷貝/μl標準陽性模板pU-UP進行10倍的系列稀釋，制備陽性標準品，用紫外分光光度計測定A260對標準品定量；b)用DNA裂解液從待測標本中提取UP DNA；c)分別取b)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的a)步中的兩種陽性標準品加入到含Taq DNA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；d)通過比較待測樣品和相應(yīng)標準品的循環(huán)域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數(shù)進行定量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果1、定量準確；2、檢測速度快，僅1小時，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時；3、特異性好，靈敏度高；4、可鑒定區(qū)別檢測細小脲原體和解脲脲原體；5、使用步驟簡單，可重復(fù)性高。
本試劑盒可對細小脲原體進行快速定性定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，這些實施實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實施例1試劑盒組成與配制a、DNA提取試劑(裂解液)為自己配制，裂解液50mmol/L NaOH，10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，體積分數(shù)為1％ Triton X-100，體積分數(shù)為1％ NP-40，0.5mmol/L EDTA pH 8.0。
b、熒光PCR 10×Buffer組成500mM KCl、100mM Tris-HCl(PH9.0 25℃)、1.0％ Triton X-100；c、熒光定量PCR反應(yīng)液PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.8μl(10μmol/L)，熒光探針0.8μl(5μmol/L)，MgCl22.5μl(25mmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，HOTSTART Taq DNA聚合酶0.4μl(2.5U/μl)，無菌雙蒸水10.3μl。熒光探針使用濃度為5μmol/L。
d、標準陽性模板貯存液濃度為109拷貝/μl標準陽性模板pU-UP。
e、陰性質(zhì)控標準品為無菌雙蒸水實施實例2使用試劑盒快速檢測細小脲原體a、在標本試管中加入1ml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，10000g離心5min，再重復(fù)洗滌1次。沉淀直接加50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，10000g離心5min，取上清液2μl做PCR反應(yīng)。
b、將陽性標準模板(試劑d)系列稀釋為108拷貝/μl、107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl。
c、分別取熒光定量PCR反應(yīng)液(試劑c)各18μl，取第a)步所得UPDNA和第b)步稀釋的UP陽性標準模板各2μl，并設(shè)陰性對照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為95℃預(yù)變性400s；95℃ 10s，58℃ 40s，擴增40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的第二步結(jié)束時進行，同步檢測波長為510nm(FAM)。
循環(huán)結(jié)束后，運用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為UP標準陽性模板108拷貝/μl、107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl的Ct值分別為12.02，15.14，17.93，22.38，26.19，29.78；陰性對照為0；反復(fù)重復(fù)試驗3次，得到Ct值進行統(tǒng)計學(xué)分析P＞0.05，數(shù)據(jù)差異無顯著意義，說明其不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。
從上述實例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準確，而且，熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2個小時就能完成，而傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)法約需1周左右才能完成，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間，并且傳統(tǒng)方法不能鑒定區(qū)別檢測細小脲原體和解脲脲原體。
該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程，一次可檢測32-384個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測細小脲原體的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由DNA裂解液、熒光定量PCR反應(yīng)液、標準陽性模板pU-UP、陰性質(zhì)控標準品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有細小脲原體特異性引物對和熒光探針；正向引物為5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，反向引物為5＇- TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；熒光探針序列為5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′，熒光探針5′端標記報告熒光基團FAM，3′端標記不發(fā)光的淬滅基團標記，并連接小型凹槽結(jié)合物-MGB基團，標準陽性模板pU-UP是含有細小脲原體高度保守基因-脲酶基因的111個堿基對的核苷酸片段構(gòu)成的pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖；所述的PCR即聚合酶鏈式反應(yīng)，所述的UP即細小脲原體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應(yīng)液是由PCR10×buffer，10μmol/L的UP正向引物和反向引物，5μmol/L UP熒光探針，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和無菌雙蒸水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是UP標準陽性模板pU-UP包含的ureE基因的核苷酸序列為CATTGATGTTGCACAAGGAGAAAAAATTCCTCGTAAGGGTGGTCAAGGNATGATTAAATCAGAMTTATTTATTATTAATAAAGTTGATTTAGCTCCTTATGTTGGTGCTAA；NG或者A；MT或者C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測細小脲原體的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種性傳播疾病病原體基因檢測技術(shù)，適用于細小脲原體定性定量檢測。本發(fā)明由DNA裂解液、熒光定量PCR反應(yīng)液、標準陽性模板pU－UP、陰性質(zhì)控標準品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有細小脲原體特異性引物對和熒光探針。本發(fā)明特異性好，靈敏度高，定量精確，快速簡便，可重復(fù)性高，可以對細小脲原體的全部4個血清型進行定性定量檢測，可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，同時該試劑盒可以用于鑒別區(qū)分細小脲原體和解脲脲原體。
文檔編號C12Q1/68GK1873024SQ20061001876
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者曹軒, 王業(yè)富 申請人:武漢大學(xué)