專利名稱：復合微生物β－葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種，尤其涉及一種復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法。
背景技術(shù)：
近年來，對于β-葡聚糖的研究方向，主要集中在選育生產(chǎn)β-葡聚糖酶活性高的微生物生產(chǎn)菌，并以β-葡聚糖酶活力作為微生物生產(chǎn)菌活力的反映指標，忽略β-葡萄糖苷酶的活性指標，導致所生產(chǎn)的β-葡聚糖酶活力較高，但在實際應(yīng)用中，水解效果不理想。究其原因，就在于酶組分中β-葡萄糖苷酶很低，甚至檢測不到。然而缺乏β-葡萄糖苷酶，則不能將纖維二糖和纖維三糖完全降解成葡萄糖，嚴重的影響了對β-葡聚糖的水解效率，制約了β-葡聚糖酶的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于解決上述生產(chǎn)β-葡聚糖酶中的問題，提供一種利用綠色木霉和黑曲霉復合微生物混合發(fā)酵，生產(chǎn)β-葡聚糖酶酶系構(gòu)成完整，并具有較高β-葡萄糖苷酶活力的復合酶，實現(xiàn)完全水解β-葡聚糖的復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是將綠色木霉(Trichoderma viride)和黑曲霉(Aspergillus niger)混合發(fā)酵，制作復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶制成固體酶制劑和液體酶制劑，固體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)酶活力β-葡聚糖酶活力16000 mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力3300μg葡萄糖/g·min，(2)粒度制劑能通過3號標準篩，(3)水分含水量低于8％，(4)感官指標黃色粉劑，色澤均一，(5)衛(wèi)生指標固體酶制劑每克細菌總數(shù)小于1萬；液體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)產(chǎn)品酶活力β-葡聚糖酶活力4500mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力860μg葡萄糖/g·min，(2)感官指標深棕色液體，色澤均一，(3)衛(wèi)生指標每毫升細菌總數(shù)小于5萬個。
β-葡聚糖酶屬于水解酶類，其酶系家族主要包括內(nèi)β-1，3葡聚糖酶，(E.C.3.2.1.39)。內(nèi)β-1，3、1，4葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)，外β-1，3葡聚糖酶(E.C.3.2.1.58)，外β-1，4葡聚糖酶(E.C.3.2.1.74)，3-葡聚糖酶包括了一切能分解β-糖苷鍵鏈成的葡萄糖聚合物的酶系。它們對水解大麥、黑麥中的β-葡聚糖有重要的作用。水解產(chǎn)物主要是β葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖。β-葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase E.C 3.2.1.21)簡稱BG，主要作用于β-(1，4)糖苷鍵，它能將內(nèi)切、外切葡聚糖酶水解下來的纖維二糖降解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶對反應(yīng)動力學的作用很大，因為內(nèi)切和外切酶水解的主要產(chǎn)物為纖維二糖，隨著反應(yīng)的進行，纖維二糖的產(chǎn)物積累將使外切酶的活力受到抑制，要使反應(yīng)高效率地進行，必須將纖維二糖轉(zhuǎn)化成為其它形式，而β-葡萄糖苷酶恰恰承擔了這個功能。
本發(fā)明的制作方法是把綠色木霉菌種和黑曲霉菌種分別制成斜面菌種并保存；綠色木霉采用察氏培養(yǎng)基(1L)(Czapek`s agar，CZ)，培養(yǎng)基為蔗糖30g，硝酸鈉2.0g，磷酸氫二鉀1.0g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鉀10.5g，硫酸亞鐵0.01g，瓊脂15g，pH 7.2-7.4；黑曲霉采用土豆培養(yǎng)基(1L)(Potato dextrose agar，PDA)，培養(yǎng)基為土豆200g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀3g，七水硫酸鎂1.5g，瓊脂12g，pH自然；綠色木霉和黑曲霉的斜面菌種培養(yǎng)綠色木霉和黑曲霉分別使用相應(yīng)培養(yǎng)基，接種量5-10％，在28-30℃條件下靜止培養(yǎng)20-48小時，放入4℃冰箱保存。

把綠色木霉和黑曲霉的斜面菌種各自分別接種在500毫升三角搖瓶內(nèi)，在搖床上振蕩培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入三角搖瓶中，每瓶100毫升，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，設(shè)定溫度121℃，滅菌30分鐘，自然冷卻后，分別在三角搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)條件溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速180-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量1-3％，培養(yǎng)48-60h。
分別把綠色木霉的斜面菌種和黑曲霉的斜面菌種各自分別接種在搖瓶內(nèi)進行振蕩培養(yǎng)，在搖瓶中分別按比例裝入培養(yǎng)基配比物料，培養(yǎng)基配比物料適宜綠色木霉的斜面菌種和黑曲霉的斜面菌種的振蕩培養(yǎng)制成種子液。
分別把液體搖瓶中綠色木霉和黑曲霉的種子液再各自分別接種到1噸液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入種子罐中，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，高溫高壓滅菌45分鐘，自然冷卻后，分別在液體種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行種子罐培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)條件溫度28-30℃，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量3-7％，時間60-72小時。
分別把綠色木霉種子液和黑曲霉種子液各自分別接種到液體種子罐內(nèi)進行增殖培養(yǎng)，在液體種子罐內(nèi)分別按比例裝入培養(yǎng)基配比物料，培養(yǎng)基配比物料適宜綠色木霉種子液和黑曲霉種子液的增殖培養(yǎng)。
將增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐，進行發(fā)酵，混配固態(tài)發(fā)酵原料，按比例混配固態(tài)發(fā)酵原料，將固態(tài)發(fā)酵原料裝入蒸球中并混合均勻，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，經(jīng)高溫高壓滅菌約60分鐘，使固態(tài)發(fā)酵原料自然冷卻，再將種子罐中綠色木霉與黑曲霉按2.5～3∶1的比例均勻噴灑接種于固態(tài)發(fā)酵原料，并把接種后的固態(tài)發(fā)酵原料無菌傳輸?shù)焦虘B(tài)發(fā)酵罐內(nèi)，進行固態(tài)發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵條件溫度28-30℃，含水量60％，空氣濕度控制80％-90％，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量10-15％，發(fā)酵時間84-96小時。
在固體發(fā)酵罐內(nèi)按比例混合投入增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉進行固態(tài)發(fā)酵，采兩種微生物混合發(fā)酵，這兩種微生物能夠共生無拮抗反應(yīng)，而且所產(chǎn)生的酶系互補，為獲得能夠?qū)⑻烊缓写罅喀?葡聚糖物質(zhì)完全降解成葡萄糖的復合酶，將產(chǎn)β-葡聚糖酶活力高的綠色木霉，與產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力強的黑曲霉混合，生產(chǎn)高效復合酶，實現(xiàn)天然β-葡聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在固體發(fā)酵罐內(nèi)按比例裝入固態(tài)發(fā)酵原料，把綠色木霉與黑曲霉按比例均勻噴灑接種于固態(tài)發(fā)酵原料，進行固態(tài)發(fā)酵。
發(fā)酵后，從固體發(fā)酵罐里取出固體發(fā)酵物料，投入浸提槽內(nèi)，加入水浸提，水的添加量為固體發(fā)酵物料的9倍，浸提約3小時。
將已固態(tài)發(fā)酵三～四天的曲子取出，傾入浸提槽中，加入一定量的水，固體發(fā)酵物料∶水＝1∶9(重量/體積比)，進行約3小時的浸提。
浸提結(jié)束后，先排放浸提槽中上層的清液，再壓榨剩余的固體浸提料；用板框式過濾機過濾上層清液和壓榨液獲得過濾液，再將過濾液用線繞式過濾機進行過濾，最終獲得的濾液放置在儲罐中。
浸提后，把上層清液先排放出來，再將剩余固體浸提料進行壓榨，然后將收集起來的浸提上層清液及壓榨液經(jīng)過板框式過濾機進行過濾。經(jīng)過板框過濾的過濾液再度經(jīng)過線繞式過濾機進行過濾，所得濾液放置在儲罐中。
從儲罐中取出濾液，用超濾膜濃縮濾液，超濾的壓力小于0.1Mpa，濃縮時間3小時/6噸濾液，每批濾液被濃縮成300～400升的濃縮酶液。
將儲罐中濾液進行超濾膜濃縮，超濾的壓力應(yīng)小于0.1Mpa，濃縮時間3小時/批，每批濃縮酶液被濃縮約20倍。
在濃縮酶液中摻入95％的工業(yè)乙醇和甘油，使95％的工業(yè)乙醇和甘油，在濃縮酶液中的終濃度分別達到10％和20％，充分攪拌均勻后獲得液體酶制劑，包裝入庫。
向濃縮酶液中加入保護劑，保護劑為95％的工業(yè)乙醇和甘油，使二者在濃縮酶液中的終濃度分別達到10％和20％，并于勻漿中充分攪拌混勻，此時的產(chǎn)品為液體酶制劑。
在濃縮酶液中加入糊精作為載體，使糊精在濃縮酶液中的終濃度達到10％，經(jīng)充分攪拌后的濃縮酶液送入噴霧旋轉(zhuǎn)流化干燥造粒設(shè)備，濃縮酶液經(jīng)霧化器噴入干燥造粒器，溫度45-55℃，直接干燥成固體顆粒獲得固體酶制劑，包裝入庫。
向濃縮酶液中加入糊精作為載體，使其在濃縮酶液中的終濃度達到10％，并于勻漿中充分攪拌混勻。將已加入糊精載體的濃縮酶液經(jīng)過噴霧旋轉(zhuǎn)流化干燥造粒設(shè)備制成固體顆粒，設(shè)備預熱，高溫干燥空氣(140℃)在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)，實現(xiàn)系統(tǒng)內(nèi)的滅菌15分鐘，滅菌達到工作要求啟動原料輸送系統(tǒng)，原料經(jīng)霧化器噴入干燥造粒器(溫度45-55℃)，直接干燥成顆粒，獲得的產(chǎn)品為固體酶制劑。
在制作工藝過程中綠色木霉和黑曲霉分別需進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，綠色木霉和黑曲霉進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配比物料為每升含稻草粉10-15份，麩皮10-15份，葡萄糖5-8份，酵母粉1-3份，磷酸氫二鉀3.6-4.6份，七水硫酸鎂1.5-2.5份，pH 5.0。
增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐進行發(fā)酵，固體發(fā)酵罐內(nèi)使用的固態(tài)發(fā)酵原料為每千克含稻草粉270-300份，麩皮80-100份，啤酒糟40-80份，玉米漿2.9-4份，硫酸銨1.5-3份，磷酸氫二鉀3.6-4.6份，七水硫酸鎂1.5-2.5份，水600-800份，pH 5.0。
本發(fā)明是復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法。工藝設(shè)計科學、合理，通過對多株真菌混合培養(yǎng)篩選得到綠色木霉和黑曲霉這兩株菌種可以共生混合培養(yǎng)，相互無拮抗反應(yīng)。培養(yǎng)基配比物料和固態(tài)發(fā)酵原料組方配伍科學、合理，制作成本低，能耗低，無污染，節(jié)能環(huán)保，通過篩選、純化，采用綠色木霉和黑曲霉兩種微生物混合發(fā)酵，這兩種微生物必須能夠共生無拮抗反應(yīng)，而且所產(chǎn)生的酶系互補，生長產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件先進。利用綠色木霉和黑曲霉混合培養(yǎng)生產(chǎn)這一復合酶，其中綠色木霉具有產(chǎn)生較高的β-葡聚糖酶活性的特點，黑曲霉具有產(chǎn)生較高的β-葡萄糖苷酶活性的特點，混合可解除纖維二糖對綠色木霉分泌β-葡聚糖酶的反饋抑制，使得綠色木霉生產(chǎn)β-葡聚糖酶效率提高。通過對多種碳源和氮源及無機鹽的條件試驗得到，適宜綠色木霉和黑曲霉混合培養(yǎng)，且有利于β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分泌的培養(yǎng)基配比物料和固態(tài)發(fā)酵原料的組份，尤其是固態(tài)發(fā)酵原料成本低，能耗少，無廢液和廢渣排放，是可持續(xù)發(fā)展性節(jié)能環(huán)保的一種生產(chǎn)方式。
本發(fā)明針對固態(tài)發(fā)酵3-葡聚糖酶酶系組成不合理，不能完全水解β-葡聚糖的缺點，利用綠色木霉和黑曲霉復合微生物混合發(fā)酵，生產(chǎn)β-葡聚糖酶酶系構(gòu)成完整，并具有較高β-葡萄糖苷酶活力的復合酶，從而實現(xiàn)完全水解β-葡聚糖的目的。傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝由于生產(chǎn)條件粗放，不能實現(xiàn)無菌培養(yǎng)，所以只能生產(chǎn)粗酶制劑，本發(fā)明通過工藝路線和設(shè)備的創(chuàng)新，實現(xiàn)生產(chǎn)食品級和試劑級純酶制劑，極大的提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，增加了產(chǎn)品的附加值，使之更具有市場競爭力。
本發(fā)明生產(chǎn)的β-葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶復合酶穩(wěn)定的pH范圍在3-8，并可以作用于不同性質(zhì)的纖維素原料，因此適用范圍寬泛，可用于飼料、紡織、造紙等工業(yè)生產(chǎn)。β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶復合酶是棉織物生物酶的重要組成部分，與淀粉酶混合，在一定條件下用它可以去除棉纖維上的纖維素共生物和棉織物經(jīng)紗上的淀粉漿料，提高棉織物的潤濕性能，利于后續(xù)加工。該復合酶還能應(yīng)用于棉紡織品的后整理加工，對棉纖維進行表面改性，以改善織物的外觀、手感和服用性能，提高產(chǎn)品的檔次和附加值。β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶復合酶還可用于廢紙脫墨，用該復合酶和半纖維素酶結(jié)合處理，比化學法脫墨效果更好，還能改善漿料的強度及其濾水性。β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的復合酶，填補了我國酶制劑品種的空白，并具有較大的市場前景。
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明詳細說明。


圖1復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作工藝流程圖具體實施方式
實施例1將綠色木霉(Trichoderma viride)和黑曲霉(4spergillus niger)混合發(fā)酵，制作復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶制成固體酶制劑和液體酶制劑，固體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)酶活力β-葡聚糖酶活力16000mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力3300μg葡萄糖/g·min，(2)粒度制劑能通過3號標準篩，(3)水分含水量低于8％，(4)感官指標黃色粉劑，色澤均一，(5)衛(wèi)生指標固體酶制劑每克細菌總數(shù)小于1萬；液體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)產(chǎn)品酶活力β-葡聚糖酶活力4500mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力860μg葡萄糖/g·min，(2)感官指標深棕色液體，色澤均一，(3)衛(wèi)生指標每毫升細菌總數(shù)小于5萬個，如圖1所示。
實施例2把綠色木霉菌種和黑曲霉菌種分別制成斜面菌種并保存；綠色木霉采用察氏培養(yǎng)基(1L)(Czapek`s agar，CZ)，培養(yǎng)基為蔗糖30g，硝酸鈉2.0g，磷酸氫二鉀1.0g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鉀10.5g，硫酸亞鐵0.01g，瓊脂15g，pH 7.2-7.4；
黑曲霉采用土豆培養(yǎng)基(1L)(Potato dextrose agar，PDA)，培養(yǎng)基為土豆200g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀3g，七水硫酸鎂1.5g，瓊脂12g，pH自然；綠色木霉和黑曲霉的斜面菌種培養(yǎng)綠色木霉和黑曲霉分別使用相應(yīng)培養(yǎng)基，接種量5-10％，在28-30℃條件下靜止培養(yǎng)20-48小時，放入4℃冰箱保存，如圖1所示。
實施例3把綠色木霉和黑曲霉的斜面菌種各自分別接種在500毫升三角搖瓶內(nèi)，在搖床上振蕩培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入三角搖瓶中，每瓶100毫升，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，設(shè)定溫度121℃，滅菌30分鐘，自然冷卻后，分別在三角搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)條件溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速180-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量1-3％，培養(yǎng)48-60h，如圖1所示。
實施例4分別把液體搖瓶中綠色木霉和黑曲霉的種子液再各自分別接種到1噸液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入種子罐中，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，高溫高壓滅菌45分鐘，自然冷卻后，分別在液體種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行種子罐培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)條件溫度28-30℃，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量3-7％，時間60-72小時，如圖1所示。
實施例5將增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐，進行發(fā)酵，混配固態(tài)發(fā)酵原料，按比例混配固態(tài)發(fā)酵原料，將固態(tài)發(fā)酵原料裝入蒸球中并混合均勻，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，經(jīng)高溫高壓滅菌約60分鐘，使固態(tài)發(fā)酵原料自然冷卻，再將種子罐中綠色木霉與黑曲霉按2.5～3∶1的比例均勻噴灑接種于固態(tài)發(fā)酵原料，并把接種后的固態(tài)發(fā)酵原料無菌傳輸?shù)焦虘B(tài)發(fā)酵罐內(nèi)，進行固態(tài)發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵條件溫度28-30℃，含水量60％，空氣濕度控制80％-90％，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量10-15％，發(fā)酵時間84-96小時，如圖1所示。
實施例6發(fā)酵后，從固體發(fā)酵罐里取出固體發(fā)酵物料，投入浸提槽內(nèi)，加入水浸提，水的添加量為固體發(fā)酵物料的9倍，浸提約3小時。
浸提結(jié)束后，先排放浸提槽中上層的清液，再壓榨剩余的固體浸提料；用板框式過濾機過濾上層清液和壓榨液獲得過濾液，再將過濾液用線繞式過濾機進行過濾，最終獲得的濾液放置在儲罐中。
從儲罐中取出濾液，用超濾膜濃縮濾液，超濾的壓力小于0.1Mpa，濃縮時間3小時/6噸濾液，每批濾液被濃縮成300～400升的濃縮酶液。
在濃縮酶液中摻入95％的工業(yè)乙醇和甘油，使95％的工業(yè)乙醇和甘油，在濃縮酶液中的終濃度分別達到10％和20％，充分攪拌均勻后獲得液體酶制劑，包裝入庫，如圖1所示。
實施例7在濃縮酶液中加入糊精作為載體，使糊精在濃縮酶液中的終濃度達到10％，經(jīng)充分攪拌后的濃縮酶液送入噴霧旋轉(zhuǎn)流化干燥造粒設(shè)備，濃縮酶液經(jīng)霧化器噴入干燥造粒器，溫度45-55℃，直接干燥成固體顆粒獲得固體酶制劑，包裝入庫，如圖1所示。
實施例8(高劑量)在制作工藝過程中綠色木霉和黑曲霉分別需進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，綠色木霉和黑曲霉進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配比物料為每升含(重量比，每份為1g)稻草粉15g，麩皮15g，葡萄糖8g，酵母粉3g，磷酸氫二鉀4.6g，七水硫酸鎂2.5g，pH 5.0，如圖1所示。
實施例9(低劑量)在制作工藝過程中綠色木霉和黑曲霉分別需進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，綠色木霉和黑曲霉進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配比物料為每升含(重量比，每份為1g)稻草粉10g，麩皮10g，葡萄糖5g，酵母粉1g，磷酸氫二鉀3.6g，七水硫酸鎂1.5g，pH 5.0，如圖1所示。
實施例10(中等劑量)在制作工藝過程中綠色木霉和黑曲霉分別需進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，綠色木霉和黑曲霉進行搖瓶振蕩培養(yǎng)和液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基配比物料為每升含(重量比，每份為1g)稻草粉12.5g，麩皮12.5g，葡萄糖6.5g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀4.1g，七水硫酸鎂2g，pH 5.0，如圖1所示。
實施例11(高劑量)增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐進行發(fā)酵，固體發(fā)酵罐內(nèi)使用的固態(tài)發(fā)酵原料為每千克含(重量比，每份為1g)稻草粉300g，麩皮100g，啤酒糟80g，玉米漿4g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀4.6g，七水硫酸鎂2.5g，水800g，pH 5.0，如圖1所示。
實施例12(低劑量)增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐進行發(fā)酵，固體發(fā)酵罐內(nèi)使用的固態(tài)發(fā)酵原料為每千克含(重量比，每份為1g)稻草粉270g，麩皮80g，啤酒糟40g，玉米漿2.9g，硫酸銨1.5g，磷酸氫二鉀3.6g，七水硫酸鎂1.5g，水600g，pH 5.0，如圖1所示。
實施例13(中等劑量)增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐進行發(fā)酵，固體發(fā)酵罐內(nèi)使用的固態(tài)發(fā)酵原料為每千克含(重量比，每份為1g)稻草粉285g，麩皮90g，啤酒糟60g，玉米漿3.45g，硫酸銨2.25g，磷酸氫二鉀4.1g，七水硫酸鎂4g，水700g，pH 5.0，如圖1所示。
權(quán)利要求
1.一種復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法，其特征是將綠色木霉(Trichoderma viride)和黑曲霉(Aspergillus niger)混合發(fā)酵，制作復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶制成固體酶制劑和液體酶制劑，固體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)酶活力β-葡聚糖酶活力16000mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力3300μg葡萄糖/g·min，(2)粒度制劑能通過3號標準篩，(3)水分含水量低于8％，(4)感官指標黃色粉劑，色澤均一，(5)衛(wèi)生指標固體酶制劑每克細菌總數(shù)小于1萬個；液體酶制劑的理化性質(zhì)為(1)產(chǎn)品酶活力β-葡聚糖酶活力4500mg葡萄糖/g·h，β-葡萄糖苷酶活力860μg葡萄糖/g·min，(2)感官指標深棕色液體，色澤均一，略有酸味，pH值4～5，(3)衛(wèi)生指標每毫升細菌總數(shù)小于5萬個；該制作方法是把綠色木霉菌種和黑曲霉菌種分別制成斜面菌種并保存；綠色木霉采用察氏培養(yǎng)基(1L)(Czapek`s agar，CZ)，培養(yǎng)基為蔗糖30g，硝酸鈉2.0g，磷酸氫二鉀1.0g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鉀10.5g，硫酸亞鐵0.01g，瓊脂15g，pH 7.2-7.4；黑曲霉采用土豆培養(yǎng)基(1L)(Potato dextrose agar，PDA)，培養(yǎng)基為土豆200g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀3g，七水硫酸鎂1.5g，瓊脂12g，pH自然；綠色木霉和黑曲霉分別使用相應(yīng)培養(yǎng)基，接種量5-10％，在28-30℃條件下靜止培養(yǎng)20-48小時，放入4℃冰箱保存；把綠色木霉和黑曲霉的斜面菌種各自分別接種在500毫升三角搖瓶內(nèi)，在搖床上振蕩培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入三角搖瓶中，每瓶100毫升，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，設(shè)定溫度121℃，滅菌30分鐘，自然冷卻后，分別在三角搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)條件溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速180-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量1-3％，培養(yǎng)48-60h；分別把液體搖瓶中綠色木霉和黑曲霉的種子液再各自分別接種到1噸液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，混配綠色木霉和黑曲霉的培養(yǎng)基配比物料，按比例把培養(yǎng)基配比物料分裝入種子罐中，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，高溫高壓滅菌45分鐘，自然冷卻后，分別在液體種子罐內(nèi)的培養(yǎng)基配比物料各自接種綠色木霉菌種、黑曲霉菌種，進行種子罐培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)條件溫度28-30℃，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量3-7％，時間60-72小時；將增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐，進行發(fā)酵，混配固態(tài)發(fā)酵原料，按比例混配固態(tài)發(fā)酵原料，將固態(tài)發(fā)酵原料裝入蒸球中并混合均勻，設(shè)定溫度120℃、3個大氣壓，經(jīng)高溫高壓滅菌約60分鐘，使固態(tài)發(fā)酵原料自然冷卻，再將種子罐中綠色木霉與黑曲霉按2.5～3∶1的比例均勻噴灑接種于固態(tài)發(fā)酵原料，并把接種后的固態(tài)發(fā)酵原料無菌傳輸?shù)焦虘B(tài)發(fā)酵罐內(nèi)，進行固態(tài)發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵條件溫度28-30℃，含水量60％，空氣濕度控制80％-90％，通風量9-13m3/h，罐壓0.02-0.09Mpa，接種量10-15％，發(fā)酵時間84-96小時；發(fā)酵后，從固體發(fā)酵罐里取出固體發(fā)酵物料，投入浸提槽內(nèi)，加入水浸提，水的添加量為固體發(fā)酵物料的9倍，浸提約3小時；浸提結(jié)束后，先排放浸提槽中上層的清液，再壓榨剩余的固體浸提料；用板框式過濾機過濾上層清液和壓榨液獲得過濾液，再將過濾液用線繞式過濾機進行過濾，最終獲得的濾液放置在儲罐中；從儲罐中取出濾液，用超濾膜濃縮濾液，超濾的壓力小于0.1Mpa，濃縮時間3小時/6噸濾液，每批濾液被濃縮成300～400升的濃縮酶液；在濃縮酶液中摻入95％的工業(yè)乙醇和甘油，使95％的工業(yè)乙醇和甘油，在濃縮酶液中的終濃度分別達到10％和20％，充分攪拌均勻后獲得液體酶制劑，包裝入庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法，其特征在于所述的濃縮酶液中加入糊精作為載體，使糊精在濃縮酶液中的終濃度達到10％，經(jīng)充分攪拌后的濃縮酶液送入噴霧旋轉(zhuǎn)流化干燥造粒設(shè)備，濃縮酶液經(jīng)霧化器噴入干燥造粒器，溫度45-55℃，直接干燥成固體顆粒獲得固體酶制劑，包裝入庫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基配比物料為每升含稻草粉10-15份，麩皮10-15份，葡萄糖5-8份，酵母粉1-3份，磷酸氫二鉀3.6-4.6份，七水硫酸鎂1.5-2.5份，pH 5.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合微生物β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的制作方法，其特征在于所述的固態(tài)發(fā)酵原料為每千克含稻草粉270-300份，麩皮80-100份，啤酒糟40-80份，玉米漿2.9-4份，硫酸銨1.5-3份，磷酸氫二鉀3.6-4.6份，七水硫酸鎂1.5-2.5份，水600-800份，pH 5.0。
全文摘要
本發(fā)明是復合微生物β－葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶的制作方法。將綠色木霉和黑曲霉混合發(fā)酵，制作復合微生物β－葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶，制成固體酶制劑和液體酶制劑，把綠色木霉菌種和黑曲霉菌種分別經(jīng)過斜面菌種、搖瓶振蕩培養(yǎng)、液體種子罐內(nèi)增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)后的綠色木霉和黑曲霉混合投入固體發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵后，浸提、過濾、超濾膜濃縮、添加保護劑后獲得液體酶制劑；濃縮酶液中加入糊精經(jīng)干燥造粒獲得固體酶制劑。本發(fā)明工藝設(shè)計科學、合理，通過對多株真菌混合培養(yǎng)篩選得到綠色木霉和黑曲霉可以共生混合培養(yǎng)，相互無拮抗反應(yīng)，成本低，能耗少，無廢液和廢渣排放，適用范圍寬泛，填補了我國酶制劑品種的空白，并具有較大的市場前景。
文檔編號C12R1/685GK1884506SQ200610014479
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者王德培, 丁友昉 申請人:天津科建科技發(fā)展有限公司