專利名稱：枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB及包括該基因的質粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB及含有該基因的質粒。
背景技術：
植物類胡蘿卜素通過類異戊二烯途徑合成。GGPP(牦牛兒基牦牛兒焦磷酸)是該途徑的直接前體，2個GGPP在PSY(八氫番茄紅素合成酶)作用下形成八氫番茄紅素，八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫反應，形成鏈孢紅素，番茄紅素。番茄紅素是類胡蘿卜素進一步合成代謝的分枝點，在LycB(番茄紅β-環(huán)化酶)作用下番茄紅素環(huán)化形成β-胡蘿卜素，在LycB(番茄紅β-環(huán)化酶)和LycE(番茄紅ε-環(huán)化酶)的共同作用下形成α-胡蘿卜素，并進一步形成葉黃素等。隨著分子生物學研究手段的發(fā)展，編碼這些酶的基因已經(jīng)從番茄、煙草、辣椒和擬南芥等植物中陸續(xù)分離鑒定。枸杞的總胡蘿卜素含量為295.27mg/100g，其含量之高為植物所罕見。黃胡蘿卜中總胡蘿卜素含量也只有3.62mg/100g。枸杞類胡蘿卜素合成酶基因的克隆還未見報道。主要技術文獻有Cunningham FX，Gantt E.Genes andenzymes of carotenoid biosynthesis in plants.Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol，1998，6(49)557～583；Ji J，Yamamura S，Nixihala H.Study the role each crt.geneon biosynthesis of provitamin A(β-carotene)and lutein 2000，IBRC Report，20～21；陶俊，張上隆，徐昌杰，安新民，張良誠.類胡蘿卜素合成的相關基因及基因工程.生物工程學報，2002，18(3)276～281；李忠，彭光華，張聲華.枸杞子中的類胡蘿卜素的組成及含量.植物資源與環(huán)境，1999，8(4)57～58等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB編碼的多肽。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB的重組質粒pGEM-lblycB。
本發(fā)明的技術方案概述如下一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB，它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一種構杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB編碼的多肽，它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
一種包含權利要求1基因的重組質粒pGEM-lblycB，是以序列表SEQ ID No.3、SEQID No.4為引物PCR擴增出的DNA序列，回收得到1541bpDNA，將其克隆到pGEM-T載體上，構建了重組質粒pGEM-lblycB。
本發(fā)明參照其它植物的lycB基因序列設計引物，采用PCR技術從枸杞cDNA文庫中分離到lycB基因，將其克隆到T載體，并采用生物信息軟件對所獲得的lycBcDNA及其推導的氨基酸序列進行分析。
本發(fā)明成功的獲得枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB，為通過基因工程手段調控植物體內類胡蘿卜素的代謝和積累，創(chuàng)造類胡蘿卜素含量更高的品系，改良果蔬的營養(yǎng)品質，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)天然類胡蘿卜素奠定基礎。


圖1為以從枸杞cDNA文庫中提取到的λ噬菌體DNA為模板，SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4為引物的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜，圖中，1.PCR產(chǎn)物；2.Marker2000；圖2為重組質粒pGEM-lblycB的PCR擴增鑒定，圖中1.2 pGEM-lbLycB的PCR結果；3.Marker2000；圖3為重組質粒pGEM-lblycB的酶切鑒定，圖中1.Marker2000；2.3 pGEM-lbLycB的雙酶切結果；圖4為枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB序列的開放讀碼框分析。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1PCR模板的制備枸杞cDNA文庫由本實驗室提供，采用液體培養(yǎng)法提取λ噬菌體DNA。
本領域的技術人員都可以在實驗室構建枸杞cDNA文庫。該文庫的構建步驟(1)總RNA提取及mRNA純化；(2)cDNA雙鏈的合成；(3)用連接酶將cDNA與接頭連接；(4)去除小片段及多余接頭；(5)將cDNA克隆到載體上；(6)噬菌體的包裝；(7)cDNA文庫質量檢測。
在cDNA文庫構建過程中，使用了mRNA分離試劑盒、cDNA合成試劑盒、LambdaDNA包裝試劑盒、載體λExCell等，這些試劑盒均已經(jīng)商品化。
實施例2PCR體外擴增根據(jù)柑桔、擬南芥、辣椒、番茄、煙草、黃水仙等LycB基因保守序列設計合成一對引物引物1(5′端引物SEQ ID No.3)5′-GGA TCC ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACTCCA-3′；引物2(3′端引物SEQ ID No.4)5′-GC GGC CGC TTA TTC TTT GTC CCG CAATAA GTT-3′。在25μl反應體系中，加入10×PCR Buffer(Mg2+1SmM)2.5μl，dNTP(各2.5mmol/L)2μl，引物1(20μM)和引物2(20μM)各1μl，Ex TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，模板DNA 1.5ng。反應條件94℃ 3min→(94℃ 1min→59℃ 1min→72℃ 2min)35→72℃ 10min。擴增反應在德國UNOII Biometra DNA擴張儀上進行。反應結束后在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢查。
實施例3擴增產(chǎn)物的克隆與DNA序列測定采用寶生物DNA片段回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。回收產(chǎn)物在T 4DNA連接酶作用下與p GEM-T載體進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM109。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選。隨機挑取白色菌落，用堿裂解法小量提取質粒DNA，并做PCR和雙酶切(SacI，NcoI)鑒定。由華大基因上海鼎安生物科技有限公司用DNA熒光自動序列分析儀進行序列測定。
實施例4LycB基因序列分析對重組質粒pGEM-lbLycB進行的DNA序列分析結果表明，分離克隆的LycB基因cDNA全長1541bp(包含引物)，編碼區(qū)1524bp，共編碼508個氨基酸，其中A占28％，C占17％，G占23％，T占31％。將1541bp的核苷酸序列結果在NCBI服務器上用BLAST搜索軟件進行同源性基因檢索，結果發(fā)現(xiàn)該基因與柑桔(AF240787)、擬南芥(L40176)、辣椒(X86221)、番茄(X86452)、煙草(X81787)、黃水仙(X98796)LycB的同源性分別為87％，83％，81％，79％，78％，87％。該基因所推導的氨基酸序列與其它植物LycB的同源性高達70％-78％，肽鏈長度相仿，由498-508個氨基酸組成。
實施例5LycB基因所編碼的蛋白質特性分析用Antheprot軟件對lycB基因編碼的蛋白質的基本特性和氨基酸組成進行分析。結果為，分子量(Molecular Weight)是57 230，等電點(Isoelectric Point)為8.205。在pH 7.0時，電荷為5.797。
表1 LycB基因編碼的蛋白質氨基酸組成Table.1 The amino acid components by lycB

SEQ ID No.1ggatccatgg atactttagt gaaaactcca aataagcttg aatttctgca ccctttatgtgggtttgttg ataaagtctg ctcctttagc tgtctgaggt ctcataatca agaatacaataagtatttct tgaagaagtc tcatctgaaa acgggtagta aaaagggctt ttgtgttaaggctggaagta gcagtgctat tttggagctt gttcctgaaa ctaaaatgga gaatcttgaatttgagctcc cattatttga tcactcaaaa gggatagtcg ttgatttggc tattgttggtggtggtcctg ccggacttgc tgttgtacaa caggtttccg aggcggggct ttcggtttgttctattgatc catctccaaa actgatttgg ccaaacaatt atggtgtttg ggttgatgaatttgaggcca tggatttatt agattgcctt gatgctacat ggtctggagc agttgtatttatagacgacc ataaaagtaa agatctcgga aggccgtatg gaagggttaa taggaagcagttgaaatcta aaatgatgca aaaatgcata tcgaatggtg tgaagtttca taaagctaaagttgtgaaag ttactcacga ggaatcaaaa tcattagtaa tttgtaacga tggcgttact
attcaagctg ctgtggttct tgatgcaacc ggtttttcta gatgtttggt tcaatataataagccatata atcctggtta tcaggtggct tatgggattt tagctgaagt agaagaacacccttttgata taaacaagat ggttttcatg gattggcgcg attcacatct taacaataacacaaacctaa aggaaagaaa cagaaaggtg cccacctttc tttatgccat gccattttctaaagacaaaa tttttctaga agaaacgtcc cttgtagctc gtcccgggtt ggcaatagaagatatccaag agaggatggt tgctcgatta aggcacctcg gtataaaagt gaaatccatcgaagaagatg agcgttgtgt gattccaatg gggggtccac ttcctgtaat acctcagagagtagttggaa taggtggtac tgcaggaatg gttcatccat caactggtta tatggtagcaagaactcttg cagcagcacc cattgttgct aatgcgatag tgcgatatct tggttccgaaaagaggcatt taggtgctga gttatctggt gaagtttgga aagatttgtg gccaattgagaggagacgcc aaagggaatt cttctgtttt ggcatggata tattgcttaa gcttgatttagatgctttaa gaagattttt cgatgcattt tttgatttag agcctcgata ttggcatggattcttgtctt ctcggctatt tcttccagag ctggctttat ttgggctttc tcttttctctcatgctacca acacctcaag gcttgaaata atgtcaaaag gaacgcttcc tcttataaatatgataaaca acttattgcg ggacaaagaa taagcggccg cSEQ ID No.2MetAspThrLeu ValLysThrPro AsrLysLeuGlu PheLeuHisProLeuCysGlyPhe ValAspLysVal CysSerPheSer CysLeuArgSerHisAsnGlnGlu TyrAsnLysTyr PheLeuLysLys SerHisLeuLysThrGlySerLys LysGlyPheCys ValLysAlaGly SerSerSerAlaIleLeuGluLeu ValProGluThr LVsMetGluAsn LeuGluPheGluLeuProLeuPhe AspHisSerLys GlyIleValVal AspLeuAlaIleValGlyGlyGly ProAlaGlyLeu AlaValValGln GlnValSerGluAlaGlyLeuSer ValCysSerIle AspProSerPro LysLeuIleTrpProAsnAsnTyr GlyValTrpVal AspGluPheGlu AlaMetAspLeuLeuAspCysLeu AspAlaThrTrp SerGlyAlaVal ValPheIleAspAspHisLysSer LysAspLeuGly ArgProTyrGly ArgValAsnArgLysGlnLeuLys SerLysMetMet GlnLysCysIle SerAsnGlyValLysPheHisLys AlaLysValVal LysValThrHis GluGluSerLysSerLeuValIle CysAsnAspGly ValThrIleGln AlaAlaValValLeuAspAlaThr GlyPheSerArg CysLauValGln TyrAsnLysProTyrAsnProGly TyrGlnValAla TyrGlyIleLeu AlaGluValGluGluHisProPhe AspIleAsnLys MetValPheMet AspTrpArgAspSerHisLeuAsn AsnAsnThrAsn LeuLysGluArg AsnArgLysValProThrPheLeu TyrAlaMetPro PheSerLysAsp LysIlePheLeu
GluGluThrSer LeuValAlaArg ProGlyLeuAla IleGluAspIleGlnGluArgMet ValAlaArgLeu ArgHisLeuGly IleLysValLysSerIleGluGlu AspGluArgCys ValIleProMet GlyGlyProLeuProValIlePro GlnArgValVal GlyIleGlyGly ThrAlaGlyMetValHisProSer ThrGlyTyrMet ValAlaArgThr LeuAlaAlaAlaProIleValAla AsnAlaIleVal ArgTyrLeuGly SerGluLysArgHisLeuGlyAla GluLeuSerGly GluValTrpLys AspLeuTrpProIleGluArgArg ArgGlnArgGlu PhePheCysPhe GlyMetAspIleLeuLeuLysLeu AspLeuAspAla LeuArgArgPhe PheAspAlaPhePheAspLeuGlu ProArgTyrTrp HisGlyPheLeu SerSerArgLeuPheLeuProGlu LeuAlaLeuPhe GlyLeuSerLeu PheSerHisAlaThrAsnThrSer ArgLeuGluIle MetSerLysGly ThrLeuProLeuIleAsnMetIle AsnAsnLeuLeu ArgAspLysGluSEQ ID No.3Ggatccatgg atactttagt gaaaactcca 30SEQ IDNo.4Gcggccgctt attctttgtc ccgcaataag tt 3權利要求
1.一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB，其特征是它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB編碼的多肽，其特征是它具有序列表SEQ IDNo.2所述的氨基酸序列。
3.一種包含權利要求1基因的重組質粒pGEM-lblycB，其特征是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4為引物PCR擴增出的DNA序列，回收得到1541bpDNA，將其克隆到pGEM-T載體上，構建了重組質粒pGEM-lblycB。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB及包括該基因的質粒，枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，本發(fā)明的枸杞類胡蘿卜素合成酶基因lycB為通過基因工程手段調控植物體內類胡蘿卜素的代謝和積累，創(chuàng)造類胡蘿卜素含量更高的品系，改良果蔬的營養(yǎng)品質，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)天然類胡蘿卜素奠定基礎。
文檔編號C12N15/63GK1884546SQ20061001448
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權日2006年6月29日
發(fā)明者季靜, 王罡, 鄭陽霞 申請人:天津大學