專利名稱：：短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法，詳細地，涉及用于通過在微生物等細胞中導入短鏈脂肪酸抗性基因使之表達、來育種短鏈脂肪酸抗性提高的細胞的方法、以及作為通過該方法獲得的微生物細胞的應有的、用于生產(chǎn)有用物質(zhì)的高密度菌體培養(yǎng)法和含有短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的有效制備。
背景技術(shù)：
：以往，在微生物工業(yè)培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中添加作為營養(yǎng)源的葡萄糖等碳源、蛋白胨等氮源、硫酸鹽或磷酸鹽、鈉等無機物質(zhì)、鈣或鋅等微量元素、嘌呤、嘧啶等生長因子等營養(yǎng)源。不過，如果這些營養(yǎng)源由于微生物的增殖而被消耗的話，微生物在培養(yǎng)基中生成甲酸和醋酸等對微生物的生長存在毒性的短鏈脂肪酸，其結(jié)果是，當然存在微生物的生長停止這樣的問題。尤其是，在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)中常常使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)在以高密度好氧性發(fā)酵中，可以作為宿主菌廣泛使用。在進行大腸桿菌的好氧高密度培養(yǎng)時，一般在增殖培養(yǎng)基中添加適量的葡萄糖，因此在培養(yǎng)中生成以醋酸作為主要成分的短鏈脂肪酸。這些短鏈脂肪酸是抑制高密度培養(yǎng)的主要原因，還抑制重組蛋白質(zhì)的生成(參照例如，非專利文獻1和非專利文獻2)。為了解決這個問題，可以使用在微生物的培養(yǎng)中，對應于培養(yǎng)時間的推進，向培養(yǎng)基中連續(xù)地或間歇地流加營養(yǎng)源的流加培養(yǎng)法(例如，參照非專利文獻3)和用透析膜等將菌體外的產(chǎn)物除去到培養(yǎng)系外的透析培養(yǎng)法(例如，參照非專利文獻4)等。如果按照流加培養(yǎng)法，可以任意控制培養(yǎng)基中的特定成分的濃度，例如，可以將糖濃度穩(wěn)定地保持在用該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物的最適范圍內(nèi)。因此，可以有效培養(yǎng)目的微生物，并廣泛進行應用。不過，該流加培養(yǎng)法中，無法抑制有機酸的生成，常發(fā)生生成的有機酸導致的增殖率降低以及重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量降低等問題。而且，在透析培養(yǎng)中，通過除去菌體外的產(chǎn)物，可以減少生成的短鏈脂肪酸的影響，不過仍然存在由于裝置特殊，而造成工程復雜化的問題。而且，在大腸桿菌中，好氧條件下的葡萄糖代謝中，添加超過TCA循環(huán)處理能力的量的碳源的情況下，醋酸排出到生成醋酸的細胞外，由此導致生長抑制和重組蛋白質(zhì)的生成抑制(例如，參照非專利文獻5)。由于醋酸是由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)和醋酸激酶(ACK)從乙酰-CoA生物合成的，在非專利文獻5中，制備了大腸桿菌的這些酶(PTA和ACK)基因的缺失變異林。不過，在這些變異林中，即使失活醋酸的生物合成系統(tǒng)(PTA和ACK),由于用于生成醋酸的其它途徑依然存在，因此雖然使醋酸的生成量降低，也不能使其完全不生成。而且，上述缺失變異林過剩地積累了乳酸和丙酮酸等醋酸以外的有機酸(例如，參照非專利文獻6和非專利文獻7)。這樣一來，正在對下述微生物進行開發(fā)，所述微生物能夠完全不生成在微生物培養(yǎng)時所生成的甲酸和醋酸等對生長有害的短鏈脂肪酸，這一開發(fā)還未成功。另一方面，在想要在工業(yè)上生產(chǎn)這些短鏈脂肪酸時，希望開發(fā)通過微生物的發(fā)酵可以有效地大量生產(chǎn)短鏈脂肪酸的方法。這種情況下，需要對短鏈脂肪酸具有充分抗性的微生物，不過至今還未開發(fā)出這種微生物。另一方面，本發(fā)明人等獲得了多個源于醋酸菌的具有提高醋酸抗性功能的基因，不過這些基因中，存在具有ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette)基序的基因群(例如，參照專利文獻l)。這些具有ATP結(jié)合盒基序的基因一般總稱為ABC轉(zhuǎn)運子家族(ABCtransporterfamily),推測其編碼具有將代謝產(chǎn)物和藥劑等從細胞內(nèi)輸送到細胞外或者從細胞外輸送到細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運子功能的蛋白質(zhì)。在多拷貝數(shù)載體中連接構(gòu)成這些ABC轉(zhuǎn)運子家族的基因(ABC轉(zhuǎn)運子基因)的其中之一，導入于醋酸菌中時，所獲得的轉(zhuǎn)化林(醋酸菌)雖然提高了醋酸抗性，不過卻沒有影響對其它有機酸的抗性(例如，專利文獻l參照)。專利文獻l:特開2003-289868號公報非專利文獻1:Appl.Environ.Microbiol.第56巻，p.1004一1011(1990年)非專利文獻2:Biotechnol.Bioeng.第39巻、p.663-671(1992年)非專利文獻3:TrendsBiotechnol.第14巻，p.98-100(1996年)非專利文獻4:Appl.Microbiol.Biotechnol.，第48巻，p.597-601(1997年)非專利文獻5:Biotechnol.Bioeng.，第35巻，p.732-738(1990年)非專利文獻6:Biotechnol.Bioeng.，第38巻，p.1318-1324(1991年)非專利文獻7:Biosci.Biotechnol.Biochem.,第58巻，p.2232-2235(1994年)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明的第一目的為提供不抑制以微生物為代表的細胞的生長，而且保持有用物質(zhì)原有的高生產(chǎn)性，賦予對包括甲酸和醋酸等對生長有害的短鏈脂肪酸的抗性的方法。而且，本發(fā)明的第二目的為提供作為上述微生物的用途的、在短鏈脂肪酸存在下有效培養(yǎng)微生物的方法，用于通過發(fā)酵制備有用的短鏈脂肪酸的方法。用于解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人等在摸索用于解決上述問題的方法的過程中，著眼于短鏈脂肪酸之一的醋酸，聚焦于對該醋酸具有強效抗性的且可以用于在食醋的制備中進行醋酸發(fā)酵時利用的醋酸菌所帶有的基因群，所述基因群為來源于前述醋酸菌的推測為ABC轉(zhuǎn)運子家族的基因群。并且，反復研究了是否可以將構(gòu)成ABC轉(zhuǎn)運子家族的ABC轉(zhuǎn)運子基因?qū)氲皆瓉淼拇姿峋酝獾漠惙N細胞中，使之表達。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)在屬于與醋酸菌完全不同的屬的原本乙醇氧化能力低的大腸桿菌(Escherichiacoli),和屬于醋酸菌的醋酸發(fā)酵能力低的重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)中也可以獲得轉(zhuǎn)化體，并且還發(fā)現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化體與醋酸菌的情況不同，不會因為醋酸以外的短鏈脂肪酸(碳原子數(shù)5以下)而受到生長抑制，也就是說，具有短鏈脂肪酸抗性這一出乎意料的結(jié)果。而且，還發(fā)現(xiàn)通過基因?qū)?，由這些微生物自身產(chǎn)生的有用物質(zhì)和由外部導入的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性沒有降低。而且，在通過醋酸菌的轉(zhuǎn)化林來了解ABC轉(zhuǎn)運子基因如何發(fā)揮對短鏈脂肪酸的抗性增強功能的機理的時候，根據(jù)細胞內(nèi)的醋酸濃度相對原林降低這一點，可以確定是賦予了將醋酸從細胞內(nèi)排出到細胞外的培養(yǎng)基的功能，推測該功能可以解釋為不僅提高了醋酸菌而且還提高了異種細胞的短鏈脂肪酸抗性的機制。并且發(fā)現(xiàn)，將導入了該基因的微生物進行高密度菌體培養(yǎng)時，與沒有導入基因的微生物相比，即使在短鏈脂肪酸存在下也可以充分生長，由此認為在工業(yè)化培養(yǎng)中是有用的。而且還發(fā)現(xiàn)了可以使丙酸等短鏈脂肪酸的蓄積濃度提高。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)完成的。也就是說本發(fā)明由以下的(1)(ll)構(gòu)成。(1)短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法，其特征在于將編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因?qū)氲郊毎?，使之表達。(2)上述(1)中記栽的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列號l中記載的堿基序列中的第301-2073位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)含有與序列表的序列號l中記載的堿基序列中的第301-2073位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)的DNA。(3)上述(1)中記載的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)含有序列表的序列號3中記載的堿基序列中的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)含有與序列表的序列號3中記載的堿基序列中的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性功能的蛋白質(zhì)的DNA。(4)上述(1)中記載的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)、(b)、(c)或(d)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列、和第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第17242500位堿基構(gòu)成的堿基序列并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA;(c)包括序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第10021724位堿基構(gòu)成的堿基序列，和與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA;(d)包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和、與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA。(5)上述(1)中記栽的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DM:(a)序列表的序列號8中記載的堿基序列中的第2491025位堿基構(gòu)成的DNA。(b)包括與序列表的序列號8中記栽的堿基序列中的第249~1025位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DM在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)的DNA。(6)上述(1)~(5)任一項中記載的細胞育種方法，其特征在于短鏈脂肪酸為曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸或戊酸。(7)用上述(1)~(5)任一項中記載的方法育種的細胞，其特征在于細胞為微生物細胞。(8)上述(7)中記載的細胞，其特征在于微生物細胞為屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞。(9)高密度菌體培養(yǎng)法，其特征在于使用上述(8)中記載的細胞。(10)上述(8)中記載的高密度菌體培養(yǎng)法，其特征在于在短鏈脂肪酸存在下培養(yǎng)細胞。(11)含有短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制造方法，其特征在于在細胞生成短鏈脂肪酸的條件下培養(yǎng)上述(8)中記載的細胞。發(fā)明的效果如果根據(jù)本發(fā)明，賦予對短鏈脂肪酸的抗性，可以育種短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞。而且，在微生物細胞中使用本發(fā)明的育種方法時，可以有效育種不受培養(yǎng)中生成的對生長有害的短鏈脂肪酸產(chǎn)生的影響的細胞。由本發(fā)明獲得的短鏈脂肪酸抗性的微生物細胞也可以應用于生成短鏈脂肪酸的高密度菌體培養(yǎng)中。而且，還可以應用于含有高濃度短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制備中。尤其是，在是賦予了短鏈脂肪酸抗性的大腸桿菌等的情況下，其在培養(yǎng)中的增殖能力顯著提高，可以有效積累高濃度的短鏈脂肪酸，因此在產(chǎn)業(yè)上有用。圖1是表示大腸桿菌-醋酸菌穿梭載體pGIlS的構(gòu)建的簡圖。圖2表示實施例l中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體在(a)未添加培養(yǎng)基、(b)含有甲酸的培養(yǎng)基、(c)添加醋酸的培養(yǎng)基和(d)添加丙酸的培養(yǎng)基中的生長量的經(jīng)時變化。圖3表示實施例1中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體在(a)含有丁酸的培養(yǎng)基、(b)含有異丁酸的培養(yǎng)基、和(c)添加了正戊酸的培養(yǎng)基中的生長量的經(jīng)時變化。圖4表示實施例2中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體在(a)含有甲酸的培養(yǎng)基、和(b)添加了醋酸的培養(yǎng)基中的生長量的經(jīng)時變化。圖5葡糖酸醋桿菌.工》夕-4來源的基因片段的限制性酶切圖鐠和短鏈脂肪酸抗性基因的位置和向質(zhì)粒pABC31中的插入片段的簡圖。圖6表示實施例3中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體在(a)含有甲酸的培養(yǎng)基、和(b)添加了醋酸的培養(yǎng)基中的生長量的經(jīng)時變化。圖7表示實施例4中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體在(a)含有曱酸的培養(yǎng)基、和(b)添加了醋酸的培養(yǎng)基中的生長量的經(jīng)時變化。圖8來源于克隆的葡糖酸醋桿菌工^夕-4的基因片段的限制性酶切圖鐠和短鏈脂肪酸抗性基因的位置、和向質(zhì)粒pABC41中插入的片段的簡圖。圖9表示實施例6(1)中的各細胞的生長量、以及培養(yǎng)液中的總有機酸量和醋酸量的推移。圖10表示實施例6(2)中的葡萄糖的流加培養(yǎng)中的生長量的推移。圖11表示實施例7中的轉(zhuǎn)化體和未轉(zhuǎn)化體的在含有醋酸的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)經(jīng)過。圖12表示序列表的序列號1記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的限制性酶切圖i脊和短鏈脂肪酸抗性基因的位置、和向質(zhì)粒pABCl中的插入片段的簡圖。具體實施例方式以下，對本發(fā)明詳細地il明。本發(fā)明的目的在于將具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的基因(短鏈脂肪酸抗性基因)導入細胞的育種方法、由該育種方法育種的細胞、以及使用該細胞的高密度菌體培養(yǎng)法以及含有有用短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制造方法?！?〕本發(fā)明的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法的特征在于，如權(quán)利要求l中記載的，將編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因(短鏈脂肪酸抗性基因)導入細胞中使之表達。這里，所謂具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)是指，本發(fā)明的育種方法的對象細胞中，可以發(fā)揮將整合到該細胞中的或由代謝等細胞內(nèi)的功能生產(chǎn)的短鏈脂肪酸排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)，例如，在添加了對生長有影響的醋酸濃度的培養(yǎng)基中，相對于原菌林，使細胞內(nèi)的醋酸濃度降低15~20°/以上的蛋白質(zhì)。作為這種蛋白質(zhì)，具體可以例舉有，具有序列表的序列號2、4、或9中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、和具有序列號6和7中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)復合體。而且，只要是具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)，在序列表的序列號2、4和9所示的各氨基酸序列中，包含在l個或多個，優(yōu)選l個或幾個氨基酸中的取代、缺失、插入、添加、逆位等變異的蛋白質(zhì)也包含在上述蛋白質(zhì)中。而且，同樣地，只要是具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)，在序列號6和/或7所示的氨基酸序列的任一個中含有在l個或多個，優(yōu)選l個或幾個氨基酸中的取代、缺失、插入、添加、逆位等變異的蛋白質(zhì)復合體也包含在上述蛋白質(zhì)中。而且，所謂編碼上述蛋白質(zhì)的基因(短鏈脂肪酸抗性基因)是指含有上述蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域，且可以導入到細胞內(nèi)使之表達的基因。作為這種基因的代表，可以例舉有推測為ABC轉(zhuǎn)運子家族的、構(gòu)成醋酸菌來源的基因群的ABC轉(zhuǎn)運子基因。ABC轉(zhuǎn)運子基因是指具有ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette)的基序的基因或者編碼與具有該基序的基因形成操縱子的蛋白質(zhì)復合體的基因。具有ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette)的基序的基因一般4皮稱為ABC轉(zhuǎn)運子家族(ABCtransporterfamily)，據(jù)推測其編碼具有將代謝產(chǎn)物或藥劑等從細胞內(nèi)輸送到細胞外，或者從細胞外輸送到細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運子的功能的蛋白質(zhì)。作為這種ABC轉(zhuǎn)運子基因，可以例舉有，例如，包含編碼具有序列表的序列號2、4、6、7或9中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域的基因，具體可以例舉有，如權(quán)利要求25的(a)中記載的，包括序列號1、3、5或8中記載的堿基序列中、序列號1的第301~2073位堿基構(gòu)成的堿基序列、序列號3的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列、序列號5的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列和第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或序列號8的第249~1025位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA。這些DM可以是含有上述特定的堿基序列的DNA,也可以采用例如，序列表的序列號l、3、5或8各個序列中記載的堿基序列的全長構(gòu)成的,?；谝孕蛄刑?、3、5或8所示的堿基序列設(shè)計的引物，以醋酸菌(醋酸桿菌屬和葡糖酸醋桿菌屬的醋酸菌)的基因作為模板通過PCR法可以容易地獲得這些DNA。尤其是，序列表的序列號1和3記載的各堿基序列構(gòu)成的DNA可以分別以醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)No.102琳(于1983年6月27日(由原保藏于1989年2月13日移交)以保藏號FERMBP-2287保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號)(舊稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所，舊址日本茨城筑波市東1-1-3)。)作為模板分別獲得。而且，序列表的序列號5和8記載的各堿基序列構(gòu)成的DNA，可以以Gluconacetobacterentanii之一的AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(于1984年2月23日以保藏號FERMBP-491保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)(舊稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所，舊址日本茨城筑波市東1-1-3)。)作為模板分別獲得。而且，在本發(fā)明中，作為短鏈脂肪酸抗性基因，可以同樣使用如權(quán)利要求2、3和5的(b)中記載的那樣，含有序列號l、3或8中記載的堿基序列中、序列號l的第301-2073位堿基構(gòu)成的堿基序列、序列號3的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列、或與由該堿基序列的至少一部分且編碼具有增強醋酸抗性功能的蛋白質(zhì)的DM。于是，同樣可以使用如權(quán)利要求4的(b)、(c)或(d)中記載的那樣，(b)包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA、或(c)包括序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列，和與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DM在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA，或(d包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第17242500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA。并且，這里所稱的嚴格條件是指所謂形成特異的雜交體而不形成非特異的雜交體的條件。該條件是難以明確地數(shù)值化，不過如果要舉出一例，可以例舉有同源性高的DNA同類，例如具有70。/。以上的同源性的DNA同類之間雜交，比其同源性更低的DNA之間不雜交的條件，或者通常的雜交的洗滌條件，例如在60X:以與1xSSC，0.1。/。SDS相當?shù)柠}濃度進行洗滌的條件等。上述的短鏈脂肪酸抗性基因編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因的確認，可以通過判別例如，如后述的實施例中說明的那樣，通過實際上將基因?qū)爰毎怪磉_，在含有短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細胞(轉(zhuǎn)化體)時生長的有無，和該培養(yǎng)基中生長量的增加(增殖程度)來確認。這里，所謂短鏈脂肪酸是指碳原子數(shù)l~5的直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)的脂肪酸，可以有也可以沒有不飽和鍵。由本發(fā)明的育種方法獲得的細胞是對尤其是碳原子數(shù)l~5的直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)的飽和脂肪酸，也就是如權(quán)利要求6中記載的對曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸或戊酸具有強抗性的細胞。本發(fā)明的育種方法的對象如果是可以導入上述短鏈脂肪酸抗性基因進行表達的細胞，就沒有特別的限定。作為細胞，可以例舉有屬于大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌等細菌細胞、酵母細胞、曲霉屬的微生物等真菌細胞等微生物細胞。其中，通過以如權(quán)利要求7中記載的微生物細胞作為對象，通過增強短鏈脂肪酸抗性功能，可以使通過工業(yè)化培養(yǎng)、尤其是使高密度菌體培養(yǎng)法進行的培養(yǎng)中的培養(yǎng)效率和短鏈脂肪酸的發(fā)酵生產(chǎn)中的生產(chǎn)效率有所提高，因此優(yōu)選。作為微生物細胞，可以例舉有尤其是如權(quán)利要求8中記載的屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞。細菌細胞中，如果以大腸桿菌，葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter)屬的醋酸菌等自身乙醇氧化能力低的細菌細胞作為對象，由于可以使該短鏈脂肪酸的生產(chǎn)量和生產(chǎn)效率、菌體的生長量顯著增加，因此優(yōu)選。作為醋酸菌，可以例舉有屬于醋酸桿菌(Acetobacter)屬和葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter)屬的醋酸菌。作為醋酸桿菌屬的細菌，具體可例舉有醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)，具體可以4吏用醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)No.1023抹(于1983年6月27日(由原保藏于1989年2月13日移交)以保藏號FERMBP-2287保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)(舊稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所，舊址日本茨城筑波市東1-1-3)、醋化醋桿菌木糖亞種3288(Acetobacteracetisubsp.xyli麵IF03288)林、醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)IF03283抹等。作為葡糖酸醋桿菌屬的細菌，可例舉有，例如，歐洲葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobactereuropaeus)、重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、葡糖酸醋桿菌工》夕-(Gluconacetobacterentanii)，具體可以使用歐洲葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobactereuropaeus)讓6160株、重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)ATCC49037林、葡糖酸醋桿菌工y夕-4(Gluconacetobacterentanii)之一的AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(于1984年2月23日以保藏號FERMBP-491保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利微生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)(舊稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所，舊址日本茨城筑波市東1-1-3)。作為大腸桿菌，優(yōu)選屬于埃希氏菌(Escherichia)屬的細菌。作為屬于埃希氏菌屬的細菌，可例舉有，例如，大腸桿菌(Escherichiacoli)，具體可以使用大腸桿菌K12林、大腸桿菌JM109林、大腸桿菌DH5ot抹、大腸桿菌C600林、大腸桿菌BL21株、大腸桿菌W3110林等。而且，作為屬于桿菌屬(Bacillus)的細菌，可例舉有，例如，枯草桿菌(Bacillussubtilis)和納豆桿菌(Bacillussubtilis)，具體可以使用枯草桿菌Marburgl68林等。作為酵母細胞，可以使用例如，p卑酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomycespombe)等。尤其是，使用本發(fā)明的權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所涉及的DNA作為短鏈脂肪酸抗性基因時，這些細胞中，優(yōu)選以大腸桿菌和重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)作為對象。大腸桿菌自身的乙醇氧化能力極低，而且，重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌是醋酸菌，但由于醋酸發(fā)酵能力低，因此通過賦予這些微生物短鏈脂肪酸抗性，可以充分提高其有用性。在本發(fā)明的育種方法中向細胞導入表達短鏈脂肪酸抗性基因的可以利用重組載體進行。也就是說，可以通過使用在適當?shù)妮d體中連接了短鏈脂肪酸抗性基因的重組載體轉(zhuǎn)化細胞，擴增該基因的細胞內(nèi)的拷貝數(shù)的方法，或者，通過使用在適當?shù)妮d體中連接了短鏈脂肪酸抗性基因的結(jié)構(gòu)基因和在該細胞中有效行使功能的啟動子序列的重組載體轉(zhuǎn)化細胞，通過擴增該基因在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)來實現(xiàn)。作為用于重組載體的制備中使用的載體，可以使用可以在宿主中自我增殖的噬菌體載體或質(zhì)粒載體等。作為質(zhì)粒載體，可例舉有大腸桿菌來源的質(zhì)粒(例如pBR322、pBR325、pUC118、pET16b等)、枯草桿菌來源的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5等)、酵母來源的質(zhì)粒(例如Yep13、Ycp50等)等，作為噬菌體載體，可以例舉有入噬菌體(AgtlO、人ZAP等)等。進而，也可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒等動物病毒載體、桿狀病毒等昆蟲病毒載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等制備轉(zhuǎn)化體。而且，還可以使用多拷貝載體或轉(zhuǎn)座子等將目的DNA導入到宿主中，在本發(fā)明中，這種多拷貝載體或轉(zhuǎn)座子包含于本發(fā)明的重組載體中。作為多拷貝載體，可以例舉有pUF106(例如，參照Cellulose、p.153-158(1989年))、pMV24(例如，參照Appl.Environ.Microbiol.)、第55巻、p.171-176(1989年))、pGI18(參照例如，后述的制造例l)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例如，參照特開昭60-9488號公報)等。而且，還可以例舉有染色體整合型載體pMVLl(例如，參照Agric.Biol.Chem.第52巻，p.3125-3129(1988年))。進而，作為轉(zhuǎn)座子，可以例舉有Mu和IS1452等。通過在栽體中連接短鏈脂肪酸抗性基因制備重組載體時，可釆用用適當?shù)南拗菩悦盖懈罴兓腄NA，通過在適當?shù)脑泽wDNA的限制性酶切部位或多克隆位點插入連接于載體中的方法等。這里，需要在將獲得的重組載體導入于細胞時，通過表達短鏈脂肪酸抗性基因所編碼的具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)，發(fā)揮前述功能。因此，在重組載體中，除短鏈脂肪酸抗性基因和啟動子序列之外，還可以根據(jù)希望通過連接插入增強子等順式因子、剪接信號、polyA添加信號、選擇標記、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等。這里，作為選擇標記，可以例舉有例如二氫葉酸還原酶基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。而且，也可以將染色體DNA上的短鏈脂肪酸抗性基因的啟動子序列置換為在醋酸桿菌屬或葡糖酸醋桿菌屬的醋酸菌或者在大腸桿菌中有效行使功能的其它啟動子序列，此時，可以設(shè)法構(gòu)建同源重組用的載體，用該栽體在微生物的染色體中發(fā)生同源重組。作為這種啟動子序列，可以例舉有，例如，大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322(寶生物公司制)的氨千青霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG298(寶生物公司制)的卡那霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG396(寶生物公司制)的氯霉素抗性基因、p-半乳糖苷酶基因等各基因的啟動子等醋酸菌以外的微生物來源的啟動子序列。用于同源重組的載體構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。這樣一來，在微生物中通過將內(nèi)源性的短鏈脂肪酸抗性基因配置于強力的啟動子的控制下，可以擴增該短鏈脂肪酸抗性基因的拷貝數(shù)，增強其表達。作為這種重組載體，具體可以例舉有，通過在醋酸菌-大腸桿菌穿梭栽體(多拷貝載體)pGI18分別連接序列表的序列號l、3、5和8記載的各堿基序列構(gòu)成的DNA獲得的pABClll、pABC112、pABC31和pABC41。本發(fā)明的育種方法中向細胞導入表達短鏈脂肪酸抗性基因可以使用上述重組載體按照常規(guī)方法進行。例如，細菌細胞的情況是，可以通過采用鈣離子的方法(例如，參照Agric.Biol.Chem.，第49巻，p.2091-2097(1985年))、電穿孔法(例如，參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第87巻、p.8130-8134(1990年)、Biosci.Biotech.Biochem.，第58巻，第974頁，1994年等)等。而且，在酵母細胞中(作為宿主)使用的情況，可以例舉有，例如，電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法等。而且，轉(zhuǎn)化體的選擇可以利用導入的基因內(nèi)構(gòu)成的標記基因的性質(zhì)來實施。例如，釆用氨節(jié)青霉素抗性基因的情況下，可以選擇對氨千青霉素藥劑顯示抵抗性的細胞，具體的是，使用添加適當量(例如，100jag/m1程度)氨爺青霉素形成的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，涂布轉(zhuǎn)化林，進行培養(yǎng)，以在選擇培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化林。而且，在使用新霉素抗性基因時，可以選擇對G418藥劑顯示出抵抗性的細胞。在本發(fā)明的育種方法中，這樣一來，通過在細胞中導入短鏈脂肪酸抗性基因使之表達，可以獲得短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞。經(jīng)育種的細胞的短鏈脂肪酸抗性是否獲得提高的確認，通過以下方式進行在細菌細胞的情況是，在添加了O.01~3%左右的短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時以上，測定生長度，吸光度及干燥菌體重量，與未轉(zhuǎn)化的原始細胞完全或基本不生長相比，其顯示出生產(chǎn)量大幅提高。作為這種短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞，本發(fā)明人實際上可以獲得如后述的實施例中所示，通過在醋酸菌醋化醋桿菌No.1023林中導入上述重組載體pABClll獲得的No.1023/pABClll林、通過在大腸桿菌JM109林中導入重組載體pABClll獲得的JM109/pABClll林、同樣，通過在重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌ATCC49037林中導入重組載體pABClll獲得的ATCC49037/pABClll林、通過在大腸桿菌JM109林中導入重組載體pABC112獲得的JM109/pABC112林、同樣，通過在大腸桿菌JM109林中導入重組栽體pABC31獲得的JM109/pABC31林、通過在大腸桿菌JM109林中導入重組載體pABC41獲得的JM109/pABC41抹。這些轉(zhuǎn)化林中的5林保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，JM109/pABClll林的保藏號為FERMBP-10184、ATCC49037/pABC111林的保藏號為FERMBP-10186、JM109/pABC112林的保藏號為FERMBP-10185、JM109/pABC31抹的保藏號為FERMBP-10182、JM109/pABC41林的保藏號為FERMBP-10194?！?〕本發(fā)明的高密度培養(yǎng)法本發(fā)明的高密度菌體培養(yǎng)法，如權(quán)利要求9中記載的，特征在于使用權(quán)利要求8中記載的細胞，也就是說、其特征在于，使用的是通過前述〔1〕中說明的本發(fā)明的育種方法，在屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞中導入短鏈脂肪酸抗性基因使之表達而由此育種得到的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞。這里，所謂高密度菌體培養(yǎng)法是指在高密度，一般是在培養(yǎng)基中密度為50~200g(干燥菌體)/L的條件下培養(yǎng)細菌細胞(菌體)的方法。對于培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件，可以根據(jù)細胞的種類等進行適當設(shè)定，例如在大腸桿菌的情況下，可以在天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基的任一種培養(yǎng)基中，也可以在例如，添加葡萄糖的LB培養(yǎng)基中于28"C~37X:進行通氣培養(yǎng)。一旦細菌細胞消耗了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源，通常、培養(yǎng)基中就會生成短鏈脂肪酸，這成為抑制生長的原因，不過本發(fā)明的高密度菌體培養(yǎng)法由于使用短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細菌細胞，因此可以阻止生長抑制。也就是說、如權(quán)利要求10中記栽的，即使在甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸、或戊酸等對生長存在毒性的短鏈脂肪酸存在下培養(yǎng)細胞，也不會抑制生長，可以維持微生物自身生產(chǎn)的有用物質(zhì)以及由外部導入的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性。這里，作為有用物質(zhì)，如果是可以通過利用微生物制備的物質(zhì)，可以是任意一種形態(tài)，沒有特別的限定。作為其中1例，可以例舉有微生物菌體本身。而且，如果使用本發(fā)明的細胞，由于可以使細胞的終密度提高，因此即使是由常規(guī)代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，也可以以極高效率制備。作為這種物質(zhì)的例子，可以例舉有脂肪酸、氨基酸、抗生物質(zhì)、酶、維生素和乙醇等。如實施例6中所示，可以提高培養(yǎng)基中有機酸的生成量。而且，作為重組蛋白質(zhì)，可以例舉有，例如，人的成長激素和肽、白介素1P、干擾素等。尤其是、在大腸桿菌的情況下，除上述碳原子數(shù)5以下的短鏈脂肪酸以外還可以有效生產(chǎn)檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、焦谷氨酸等有機酸。作為高密度菌體培養(yǎng)法，作為從實驗室水平到工業(yè)化生產(chǎn)水平都可以廣泛應用的方法，可以例舉有流加培養(yǎng)、透析培養(yǎng)。流加培養(yǎng)是一種對應于培養(yǎng)時間的退役，連續(xù)或間接地向培養(yǎng)基中流加特定營養(yǎng)源進行培養(yǎng)的方法。作為流加對象的營養(yǎng)源，優(yōu)選抑制細胞的增殖和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的作為短鏈脂肪酸的直接原料的葡萄糖、甘油等碳源。為了將培養(yǎng)基中的碳源濃度和/或菌體的生長濃度保持在一定水平，流加的程序表可以為按照指數(shù)函數(shù)來不斷增加流加速度的方式、一邊將培養(yǎng)基中的碳源濃度保持在規(guī)定濃度以下一邊梯度性地(一般，每隔2~5小時)增加流加速度(流加量)的一些方式。對于培養(yǎng)基的種類、溫度、濕度、pH、時間、攪拌的有無等培養(yǎng)條件，也可以根據(jù)細菌細胞的種類和狀態(tài)來適當確定。在以往的流加培養(yǎng)中，為了避免微生物培養(yǎng)中生成的以醋酸為代表的短鏈脂肪酸所導致的細胞的增殖抑制，蛋白質(zhì)生產(chǎn)抑制等，不僅需要調(diào)整葡萄糖等流加速度，還需要細致地調(diào)整培養(yǎng)基中的溶解氧量以抑制生成的短鏈脂肪酸，本發(fā)明的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞由于可以不受短鏈脂肪酸的影響地維持生產(chǎn)性，因此可以省去以往這樣的調(diào)整的麻煩。而且，透析培養(yǎng)是一邊向培養(yǎng)系統(tǒng)外使用透析膜等除去醋酸等菌體外產(chǎn)物，一邊進行培養(yǎng)的方法。在以往的透析培養(yǎng)中，需要特殊的裝置，不過本發(fā)明的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞由于可以不受短鏈脂肪酸的影響地維持生產(chǎn)性，因此即使用簡單的裝置(例如，發(fā)酵罐)也可以實施?！?〕含有短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的發(fā)酵液的制造方法的特征在于，在細胞生成短鏈脂肪酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8中記載的細胞。所謂權(quán)利要求8中記載的細胞，是指通過前述〔1〕中說明的本發(fā)明的育種方法，將短鏈脂肪酸抗性基因?qū)雽儆诖姿峋?、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞使之表達由此育種得到的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的、屬于醋酸菌、大腸桿菌或桿菌屬的細菌細胞，可以從其中選擇具有所希望的短鏈脂肪酸生產(chǎn)能力的細菌細胞。例如，大腸桿菌可以生產(chǎn)所有短鏈脂肪酸，醋酸菌可以選擇性地生產(chǎn)醋酸。而且，所謂短鏈脂肪酸除了甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸之外還指乳酸和丙酸。本發(fā)明的發(fā)酵液的制造方法需要在生成短鏈脂肪酸的條件下培養(yǎng)對象細菌細胞，這種條件，可以根據(jù)細菌細胞的種類的生成對象-短鏈脂肪酸的種類適當確定，不過，通常根據(jù)短鏈脂肪酸適量添加短鏈乙醇。實施例以下，通過實施例更具體地說明本發(fā)明。(制造例l)大腸桿菌-醋酸菌穿梭載體pGI18的開發(fā)醋酸菌_大腸桿菌穿梭載體pGI18由來源于AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的約3.lkb的質(zhì)粒pGIl和pUC18制備而成。圖l中顯示了質(zhì)粒pGI18制備的概況。首先，由Acetobacteraltoacetigenes制備質(zhì)粒pGIl。也就是說，從AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的培養(yǎng)液中收集菌體，使用氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉溶菌后，進行苯酚處理，再用乙醇純化質(zhì)粒DNA。獲得的質(zhì)粒是具有3個HincII的位點以及l(fā)個Sfil識別部位的環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒，質(zhì)粒整體長度為約3100個堿基對(3.lkbp)。而且，沒有EcoRI、Sacl、Kpnl、Smal、BamHI、Xbal、Sall、Pstl、Sphl、HindIII的識別部位。將該質(zhì)粒命名為pGIl，用于載體pGI18的制備。通過PCR法擴增如上述方式獲得的質(zhì)粒pGIl，用AatII切割。將該片段插入pUC18(2.7kbp、寶生物(林)制)的經(jīng)過限制性酶AatII切割的部位，制成質(zhì)粒pGI18。PCR法，具體按下述方式實施。使用質(zhì)粒pGIl作為模板，而且，使載的堿基序列)和引物B(參照序列表的序列號ll記載的堿基序列)作為引物。用上述模板和引物，釆用KOD-Plus-(東洋紡織(林)制)，以94'C30秒、60'C30秒、68X:3分作為l個循環(huán)進行30個循環(huán)的條件下實施PCR。其結(jié)果獲得的質(zhì)粒pGI18，如圖1中所示，還包括pUC18和pGIl中的任一種，整體長度為約5800個堿基對(5.8kbp)。該質(zhì)粒pGI18的堿基序列如序列表的序列號12中所示。(實施例1)在用序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的醋化醋桿菌中的醋酸的排出(1)轉(zhuǎn)化株的獲得用限制性酶PsU切割克隆了序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的pABCl(圖12)，將獲得的約2.5Kb的片段連接到制造例l中制備的醋酸菌—大腸桿菌穿梭載體pGI18的限制性酶Pstl切割部位中，制備質(zhì)粒pABClll。通過電穿孔法(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第87巻、p.8130-8134(1990年))將由此制備的pABClll轉(zhuǎn)化醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)No.1023林(FERMBP-2287)。在添力口了100jug/ml的氨節(jié)青霉素和2y。的醋酸的YPG培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化林。對于在上述選擇培養(yǎng)基上生長的氨千青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林，通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行分析，確認帶有具有序列表的序列號l中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的質(zhì)粒。(2)轉(zhuǎn)化林的醋酸排出對于帶有如上所述獲得的質(zhì)粒pABClll的氨節(jié)青霉素抗性的轉(zhuǎn)化抹(No.1023/pABClll林)，使之在添加了醋酸的YPG培養(yǎng)基上的生長、將其細胞內(nèi)的醋酸濃度，與只導入了穿梭栽體pGI18的醋化醋桿菌No.1023林(No.1023/pGI18抹)進行比較。也就是說，按照久^4大一等人的方法(例如，參照Biotechnol.Bioeng.，第84巻，p.40-44，2003年)，在含有l(wèi)、2、3和4重量/體積。/。的各濃度的醋酸鉀的100ml的YPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)No.1023/pABClll林和No.1023/pGI18林。從50ml的培養(yǎng)液中收集菌體，進行堿性溶菌后，用F-試劑盒(口少夕工)測定從各培養(yǎng)液獲得的細胞內(nèi)的醋酸濃度(M)，進行比較。各培養(yǎng)液中細胞內(nèi)醋酸鉀濃度的結(jié)果示于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表l中所示，轉(zhuǎn)化株No.1023/pABClll林和非轉(zhuǎn)化林No.1023/pGI18林中的任何一林隨著培養(yǎng)液中的醋酸鉀濃度的增高，細胞內(nèi)的醋酸鉀濃度也上升，不過其上升度，轉(zhuǎn)化林(No.1023/pABClll林)比較慢，尤其是，在培養(yǎng)時的醋酸鉀濃度為4重量/容量％時，No.1023/pABClll林只能積累No.1023/pGI18林的84%。這表明轉(zhuǎn)化林No.1023/pABCl1l林將細胞內(nèi)的醋酸排出到細胞外。由此表明序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA是編碼具有將醋酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因。(實施例2)被序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的短鏈脂肪酸抗性(l)轉(zhuǎn)化林的獲得桿菌JM109林，以添加了100ng/ml的氨千青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化林。通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行解析，確認在選擇培養(yǎng)基上生長的氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林帶有具有醋酸抗性基因的質(zhì)粒。這樣獲得的轉(zhuǎn)化株JM109/pABClll林于2004年12月14日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)，其保藏號為FERMBP-10184。(2)轉(zhuǎn)化林的短鏈脂肪酸抗性對于如上述方式獲得的帶有質(zhì)粒pABClll的氨爺青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林(JM109/pABClll林)，將其在添加了甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸等各短鏈脂肪酸的LB培養(yǎng)基上的生長與只導入了穿梭載體pGI18的大腸桿菌(JM109/pGI18林)進行比較。也就是說，作為短鏈脂肪酸，用含有O.10%甲酸、0.15%醋酸、0.10%丙酸、0.10°/。丁酸、0.15%異丁酸和0.25%正戊酸任一種、100ug/ml氨芐青霉素、lmMIPTG(異丙基-l-巰基-p-D-硫代半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基(pH5.0:短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基)，于37"C進行JM109/pABC111林和JM109/pGI18林的振蕩培養(yǎng)(150rpm)。而且，為了比較，除了不添加短鏈脂肪酸之外，用與上述短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基相同的組成構(gòu)成的未添加培養(yǎng)基進行相同的培養(yǎng)。在各培養(yǎng)基中，根據(jù)時間變化測定660nm處的吸光度，在各培養(yǎng)基間進行比較，以此作為各細胞的增殖程度(生長量)的指標。各培養(yǎng)基中生長量(吸光度(660nm))隨時間的變化示于圖2和圖3中。如圖2和圖3中所示，在未添加培養(yǎng)基中，任一種細胞均可以生長，與之相對，在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基中，非轉(zhuǎn)化抹-JM109/pGI18林無法生長或生長非常弱，與之相對，轉(zhuǎn)化林-JM109/pABClll林可以增殖。也就是說，非轉(zhuǎn)化抹(JM109/pGI18林)受短鏈脂肪酸存在的影響，與之相對，轉(zhuǎn)化抹(JM109/pABClll林)對任意一種短鏈脂肪酸均具備抗性。由此表明，通過在大腸桿菌細胞中導入序列表的序列號l中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以育種對各種短鏈脂肪酸的抗性獲得提高的大腸桿菌。(實施例3)用序列表的序列號3中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的短鏈脂肪酸抗性(l)轉(zhuǎn)化林的獲得通過PCR法擴增序列表的序列號3中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，將獲得的片段連接于制備例1中制備的醋酸菌一大腸桿菌穿梭載體pGI18的限制性酶SmaI切割部位中，制備質(zhì)粒pABC112。PCR法具體按以下方式實施。用AcetobacteraUoacetigenesMH-M林(FERMBP-W1)的基因組DNA作為模板，并且，使用引物l(參照序列表的序列號13記載的堿基序列)和引物U參照序列表的序列號14記栽的堿基序列)作為引物。通過上述模板和引物，采用KOD-Plus-(東洋紡織(林)制)，在94C15秒、60匸30秒、68匸2分作為1個循環(huán)，進行30個循環(huán)的條件下實施PCR。用電穿孔法(參照Biosci,Biotech.Biochem.，第58巻，笫974頁，1994年)用這樣制備的pABC112轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100iug/ml的氨千青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化株。對于在選擇培養(yǎng)基上生長的氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林，通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行分析，確認帶有具有序列表的序列號3中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的質(zhì)粒。這樣獲得的轉(zhuǎn)化林JM109/pABC112株于2004年12月14日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)，其保藏號為FERMBP-10185。(2)轉(zhuǎn)化抹的短鏈脂肪酸抗性對于按上述方式獲得的帶有質(zhì)粒pABC112的氨千青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林(JM109/pABCl12抹)，將其在添加了甲酸和醋酸等各短鏈脂肪酸的LB培養(yǎng)基上的生長與只導入了穿梭載體pGI18的大腸桿菌(JM109/pGI18林)進行比較。具體而言，用含有O.10%甲酸或0.15%醋酸作為短鏈脂肪酸、100"g/ml氨芐青霉素、lmMIPTG(異丙基-l-巰基-p-D-疏代半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基(pH5.0),于37。C,進行JM109/pABC112林和JM109/pGI18林的靜置培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)(150rpm)。在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基中，根據(jù)時間變化測定66Onm處的吸光度，在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基間進行比較，以此作為各細胞的增殖程度(生長量)的指標。各培養(yǎng)基中生長量(吸光度(660nm))的經(jīng)時變化示于圖4。如圖4中所示，轉(zhuǎn)化林JM109/pABCl12林在任意添加各短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中均可以增殖，與之相對，非轉(zhuǎn)化林JM109/pGI18林無法生長。也就是說、非轉(zhuǎn)化林(JM109/pGI18林)受短鏈脂肪酸存在的影響，與之相對，轉(zhuǎn)化株(JM109/pABCl12株)對甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通過在大腸桿菌細胞中導入序列表的序列號3中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以育種對各種短鏈脂肪酸的抗性獲得提高的大腸桿菌。(實施例4)用序列表的序列號5中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的短鏈脂肪酸抗性(l)大腸桿菌轉(zhuǎn)化林的獲得通過PCR法擴增序列表的序列號5中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，將獲得的片段連接于制造例l中制備的醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18的限制性酶Smal切割部位中，制備出質(zhì)粒pABC31。PCR法具體按以下方式實施。用ActobacteraltoacetigenesMH-2A林(FERMBP-W1)的基因組DM作為模板，并且，使用引物3(參照序列表的序列號15記栽的堿基序列)和引物4(參照序列表的序列號16記栽的堿基序列)作為引物。通過上述模板和引物，采用KOD-Plus-(東洋紡織(抹)制)，在94T15秒、60"C30秒、68°Cl分作為l個循環(huán)，進行30個循環(huán)的條件下實施PCR。AcetobacteraltoacetigenesMH-24林的基因組DNA中序歹'J號5記載的堿基序列的限制性酶切圖譜和序列號5記載的堿基序列的位置、和質(zhì)粒pABC31中的插入片段的簡圖示于圖5。用電穿孔法用這樣制備的pABC31轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100jag/ml的氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化林。對于在選擇培養(yǎng)基上生長的氨爺青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林、通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行分析，確認帶有具有序列表的序列號5中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的質(zhì)粒。這樣獲得的轉(zhuǎn)化抹JM109/pABC31林于2004年12月14日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東l-l-l中央第6號)，其保藏號為FERMBP-10182。(2)轉(zhuǎn)化體的短鏈脂肪酸抗性按上述方式獲得的帶有質(zhì)粒pABC31的氨千青霉素抗性的轉(zhuǎn)化抹(JM109/pABC31林)，將其在添加了甲酸和醋酸等各短鏈脂肪酸的LB培養(yǎng)基上的生長與只導入了穿梭載體pGI18的大腸桿菌(JM109/pGI18林)進行比較。具體而言，用含有O.10%曱酸或0.15%醋酸作為短鏈脂肪酸、100pg/ml氨千青霉素、lmMIPTG(異丙基-l-巰基-P硫代半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基(pH5.0),于37。C,進行JM109/pABC31林和JM109/pGI18林的靜置培養(yǎng)、或振蕩培養(yǎng)(150rpm)。在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基中，根據(jù)時間變化測定66Onm處的吸光度，在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基間進行比較，以此作為各細胞的增殖程度(生長量)的指標。各培養(yǎng)基中生長量(吸光度(660nm))示于圖6。如圖6中所示，轉(zhuǎn)化林JM109/pABC31抹在任意添加各短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中均可以增殖，與之相對，非轉(zhuǎn)化抹JM109/pGI18林無法生長。也就是說，非轉(zhuǎn)化抹(JM109/pGI18抹)受短鏈脂肪酸存在的影響，與之相對，轉(zhuǎn)化林(JM109/pABC31林)對甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通過在大腸桿菌細胞中導入序列表的序列號5中記栽的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以育種對各種短鏈脂肪酸的抗性獲得提高的大腸桿菌。(實施例5)被序列表的序列號8中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的短鏈脂肪酸抗性(l)大腸桿菌轉(zhuǎn)化林的荻得通過PCR法擴增序列表的序列號8中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA,將獲得的片段連接于制造例l中制備的醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18的限制性酶SmaI切割部位中，制備出質(zhì)粒pABC41。PCR法具體按以下方式實施。用AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的基因組DNA作為模板，并且，引物5(參照序列表的序列號17記載的堿基序列)和引物6(參照序列表的序列號18記載的堿基序列)作為引物。通過上述模板和引物，采用KOD-Plus-(東洋紡織(林)制)，在94'C15秒、60X:30秒、l分作為l個循環(huán)，進行30個循環(huán)的條件下實施PCR。用電穿孔法用這樣制備的pABC41轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100pg/ml的氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化抹。對于在選擇培養(yǎng)基上生長的氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林、通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行分析，確認帶有具有序列表的序列號8中記載的堿基序列構(gòu)成的DM的質(zhì)粒。確認序列表的序列號8中記載的堿基序列中，在第249~1025位堿基方面，存在編碼序列號9記載的259個氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列的開放閱讀框(ORF)。而且，清楚了序列表的序列號9中記載的氨基酸序列與已知序列的同源性低至30%,序列表的序列號8中記栽的堿基序列構(gòu)成的基因由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，是新基因。AcetobacteraltoacetigenesMH-24林的基因組DNA中序歹'J號8記載的堿基序列的限制性酶切圖語和序列號8記載的堿基序列的位置以及在質(zhì)粒pABC41中的插入片段的簡圖示于圖8。這樣獲得的轉(zhuǎn)化林JM109/pABC41林于2004年12月27日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號)，其保藏號為FERMBP-10194。(2)轉(zhuǎn)化體的短鏈脂肪酸抗性對于按上述方式獲得的帶有質(zhì)粒pABC41的氨節(jié)青霉素抗性的轉(zhuǎn)化抹(JM109/pABC41林)，將其在添加了甲酸和醋酸等各短鏈脂肪酸的LB培養(yǎng)基上的生長與只導入了穿梭載體pGI18的大腸桿菌(JM109/pGI18林)進行比較。具體而言，用含有o.15%的甲酸或醋酸作為短鏈脂肪酸、100jjg/ml氛芐青霉素、lmMIPTG(異丙基-1-巰基-p-D-硫代半乳糖苷)的LB培養(yǎng)基(pH5.0),于37C，進行JM109/pABC41林和JM109/pGI18林的靜置培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)(150rpm)。在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基中，根據(jù)時間變化測定66Onm處的吸光度，在各短鏈脂肪酸添加培養(yǎng)基間進行比較，以此作為各細胞的增殖程度(生長量)的指標。各培養(yǎng)基中生長量(吸光度(660nm))示于圖7。如圖7中所示，轉(zhuǎn)化抹JM109/pABC41林在任意添加各短鏈脂肪酸的培養(yǎng)基中均可以增殖，與之相對，大腸桿菌JM109/pGI18林無法生長。也就是說、非轉(zhuǎn)化抹(JM109/pGI18林)受短鏈脂肪酸存在的影響，與之相對，轉(zhuǎn)化抹JM109/pABC41林對甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通過在大腸桿菌細胞中導入序列表的序列號8中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以育種對各種短鏈脂肪酸的抗性獲得提高的大腸桿菌。(實施例6)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的高密度培養(yǎng)(1)添加葡萄糖的LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)對于實施例2中獲得的帶有質(zhì)粒pABClll的大腸桿菌JM109抹的轉(zhuǎn)化抹(JM109/pABClll林)，將在LB培養(yǎng)基中添加了葡萄糖的培養(yǎng)基中的生長與只導入穿梭栽體pGI18的大腸桿菌林(JM109/pGI18抹)進行比較。具體而言，用5升小型罐(三少7理化學工業(yè)公司制；KMJ-2A),對含有20%葡萄糖、100lag/ffll氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(pH7.0)進行過濾滅菌，進行"C、500rpm、0.3vvm的通氣培養(yǎng)。比較轉(zhuǎn)化林與非轉(zhuǎn)化林的培養(yǎng)中和培養(yǎng)結(jié)束時的生長量、以及培養(yǎng)液中的醋酸量和總有機酸量。生長量是作為660nm處的吸光度(OD660nm)進行測定的。另一方面，培養(yǎng)液中的總有機酸量和醋酸量是通過從培養(yǎng)液中離心分離菌體，適當稀釋上清液，用島津高效液相層析有機酸分析系統(tǒng)(柱ShodexRSpakKC-811、移動相4mM對甲苯磺酸、反應液4mM對曱苯磺酸、80]uMEDTA、16mMBis-Tris),作為上清液中的總短鏈脂肪酸(有機酸)濃度(檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、焦谷氨酸的各濃度的總值)和醋酸濃度進行測定的。圖9中表示各細胞的生長量、以及培養(yǎng)液中的總有機酸量和醋酸量的推移。而且，培養(yǎng)開始后第22小時的生長量、以及培養(yǎng)液中的總短鏈脂肪酸量和醋酸量匯集在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>根據(jù)圖9的結(jié)果，確認了轉(zhuǎn)化林JM109/pABClll株比非轉(zhuǎn)化林JM109/pGI18林的生長量、總短鏈脂肪酸(有機酸)量和醋酸量都要高。而且，根據(jù)表2的結(jié)果，可以確認，對于培養(yǎng)開始后第22小時的生長量，總有機酸量和醋酸量，轉(zhuǎn)化林(JMlG9/pABClll林)比非轉(zhuǎn)化林(JM109/pGI18林)都要高。由此表明，通過在大腸桿菌細胞中導入序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA獲得的大腸桿菌在高密度菌體培養(yǎng)中，不受短鏈脂肪酸所導致的生長抑制，而且不僅可以生產(chǎn)醋酸等短鏈脂肪酸，還可以產(chǎn)生許多有機酸。(2)葡萄糖流加培養(yǎng)使用實施例2中獲得的帶有質(zhì)粒pABClll的大腸桿菌JM109林的轉(zhuǎn)化抹(JM109/pABClll林)，將其培養(yǎng)中在培養(yǎng)基中添加葡萄糖的流加培養(yǎng)中的生長與只導入穿梭載體pGI18的大腸桿菌(JM109/pGI18林)進行比較。培養(yǎng)中，使用2升的小型罐(三少7理化學工業(yè)公司制；KMJ-2A)、pH控制器(三少"7理化學工業(yè)公司制；數(shù)字pH控制器MPH-2C)。而且，使用對應于l升礦物培養(yǎng)基(Mineralmedium:2.OgNa2S04，2.468g(NH4)2S04，0.5gNH4C1，14.6gK2HP04，3.6gNaH2P04H20，l.Og(匪4)廣H-檸檬酸鹽，Q.05g)，添加3ml1M的MgS04、3ml的微量元素溶液(Traceelementsolution:0.5gCaCl2，0.18gZnS047H20,0.lgMnS04H20，20.lgEDTA—Na2，16.7gFeCl36H20，0.16gCuS045H20，0.18gCoCl26H20(每l升培養(yǎng)用培養(yǎng)基))構(gòu)成的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)培養(yǎng)基。一邊將溫度、pH、攪拌速度和通氣量分別控制為35X:、6.8、700rpm、0.51/min，一邊進行培養(yǎng)。pH的調(diào)整通過添加29yD氨溶液來進^亍。收集用5ml添加了100jig/ml的氨千青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)了6小時的培養(yǎng)液中的菌體，將l升用5ml前述的培養(yǎng)培養(yǎng)基再次懸浮的懸浮液接種于培養(yǎng)基，通氣攪拌培養(yǎng)16.5小時。然后，到第26.5小時，連續(xù)地按表3中所示程序表隨時間依次一邊提高流加速度和流加量，一邊流加50%葡萄糖溶液，一邊進行通氣攪拌培養(yǎng)(通氣量；0.5vvm、攪拌速度；70Qrpm)—邊培養(yǎng)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>通過測定660nm的吸光度(OD660nm)處的生長量和菌體干燥重量確認菌體的增殖。葡萄糖的流加培養(yǎng)中的生長量(OD660nm)的推移示于圖10。根據(jù)圖10,可以清楚地確認轉(zhuǎn)化林(JM109/pABCl1l林)的生長量比JM109/pGI18林有所提高。而且，在培養(yǎng)結(jié)束時測定最終菌體量(干燥菌體重量(g:DCW(DriedCellWeight))和消耗葡萄糖量，計算菌體濃度(每1L培養(yǎng)基的千燥菌體重量g/1)和菌體產(chǎn)率(w/wM)。再計算平均增殖速度(g/h)作為每個單位時間的菌體的增殖速度。各菌中的這些結(jié)果匯集于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>根據(jù)表4的結(jié)果，轉(zhuǎn)化林(JM109/pABClll林)的菌體量、菌體濃度、菌體產(chǎn)率、每單位時間的增殖速度都比JM109/pGI18林的值要高。由此可以確認葡萄糖的流加培養(yǎng)所產(chǎn)生的高密度培養(yǎng)的有用性。(實施例7)被序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA轉(zhuǎn)化的重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌的短鏈脂肪酸抗性(l)轉(zhuǎn)化林的獲得的醋酸菌的l種重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)ATCC49037林。在添加了IOOpg/ml的氨節(jié)青霉素YPG培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化株。對于在選擇培養(yǎng)基上生長的氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林、通過常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進行分析，確認帶有具有序列表的序列號l中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA的質(zhì)粒。這樣獲得的轉(zhuǎn)化株ATCC49037/pABClll株于2004年12月14日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城筑波市東1-1-1中央笫6號)，其保藏號為FERMBP-10186。(2)轉(zhuǎn)化體的醋酸抗性對于如上述方式獲得的帶有質(zhì)粒pABClll的氨千青霉素抗性的轉(zhuǎn)化林(ATCC49037/pABClll抹)，將其在添加了醋酸的YPG培養(yǎng)基中的生長與只導入穿梭載體pGI18的重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌ATCC49037林(ATCC49037/pGI18林)進行比較。具體而言，用含有O.05X醋酸、100jag/ml氨千青霉素的YPG培養(yǎng)基，于30'C進行振蕩培養(yǎng)(150rpm),根據(jù)時間變化測定660nm處的吸光度，作為各細胞的增殖的程度(生長量)的指標進行比較。各培養(yǎng)基中生長量(吸光度(660nm)的經(jīng)時變化)示于圖11。其結(jié)果，如圖ll中所示，可以確認轉(zhuǎn)化林(ATCC49037/pABClll林)可以在添加了0.05。/。醋酸的YPG培養(yǎng)基中增殖，與之相對，ATCC49037/pGI18林無法生長。由此表明，通過在不生產(chǎn)醋酸的醋酸菌-重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌中導入序列表的序列號1中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以增強其醋酸抗性。工業(yè)實用性如果根據(jù)本發(fā)明，可以賦予對短鏈脂肪酸的抗性，育種短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞。而且對于微生物細胞，在適用本發(fā)明的育種方法的情況下，可以有效育種不受培養(yǎng)中生成的對生長有害的短鏈脂肪酸所產(chǎn)生的影響的細胞。由本發(fā)明獲得的短鏈脂肪酸抗性的微生物細胞也可以應用于生成短鏈脂肪酸的高密度菌體培養(yǎng)中。而且，還可以應用于含有高濃度短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制造中。尤其是被賦予了短鏈脂肪酸抗性的大腸桿菌等情況下，由于培養(yǎng)中增殖能力顯著提高，可以有效積蓄高濃度的短鏈脂肪酸，因此在產(chǎn)業(yè)上有用。權(quán)利要求1、短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法，其特征在于將編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因?qū)氲郊毎惺怪磉_。2、根據(jù)權(quán)利要求l中記栽的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列號l中記栽的堿基序列中的第301-2073位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)含有與序列表的序列號1中記栽的堿基序列中的第301-2073位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DM在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)的DNA。3、根據(jù)權(quán)利要求l中記載的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)含有序列表的序列號3中記栽的堿基序列中的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)含有與序列表的序列號3中記載的堿基序列中的第331~2154位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)的DNA。4、根據(jù)權(quán)利要求l中記載的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)、(b)、(c)或(d)中所示的DM:(a)包括序列表的序列號5中記栽的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列、和第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列的DNA;(b)包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA;(c)包括序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列，和與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DNA;(d)包括與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1002~1724位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列、和、與序列表的序列號5中記載的堿基序列中的第1724~2500位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)復合體的DM。5、根據(jù)權(quán)利要求l中記載的細胞育種方法，其特征在于編碼具有將短鏈脂肪酸從細胞內(nèi)排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因為下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)序列表的序列號8中記載的堿基序列中的第2491025位堿基構(gòu)成的DNA。(b)包括與序列表的序列號8中記載的堿基序列中的第249~1025位堿基構(gòu)成的堿基序列或由該堿基序列的至少一部分制備的可以成為探針的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的堿基序列，并且編碼具有增強醋酸抗性的功能的蛋白質(zhì)的DNA。6、權(quán)利要求1~5任一項中記栽的細胞育種方法，其特征在于短鏈脂肪酸為曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸或戊酸。7、用權(quán)利要求1~5任一項中記載的方法育種的細胞，其特征在于細胞為微生物細胞。8、權(quán)利要求7中記栽的細胞，其特征在于微生物細胞為屬于醋酸菌、大腸桿菌、或桿菌屬的細菌細胞。9、高密度菌體培養(yǎng)法，其特征在于使用權(quán)利要求8中記載的細胞。10、根據(jù)權(quán)利要求9中記載的高密度菌體培養(yǎng)法，其特征在于在短鏈脂肪酸存在下培養(yǎng)細胞。11、含有短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制造方法，其特征在于在細胞生成短鏈脂肪酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8中記載的細胞。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供不抑制以微生物為代表的細胞的生長，而且保持有用物質(zhì)原有的高生產(chǎn)性，賦予對甲酸和醋酸等對生長有害的短鏈脂肪酸的抗性的方法、以及在短鏈脂肪酸存在下有效培養(yǎng)微生物的方法，用于通過發(fā)酵制備有用的短鏈脂肪酸的方法。本發(fā)明提供了特征在于編碼具有從細胞內(nèi)將排出到細胞外功能的蛋白質(zhì)的基因?qū)爰毎?，使之表達的短鏈脂肪酸抗性獲得提高的細胞的育種方法，特征在于使用該細胞的高密度菌體培養(yǎng)法，以及特征在于在該細胞生成短鏈脂肪酸的條件下培養(yǎng)該細胞的含有短鏈脂肪酸的發(fā)酵液的制備方法。文檔編號C12P21/02GK101103106SQ20058004576公開日2008年1月9日申請日期2005年12月12日優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日發(fā)明者中野繁,深谷正裕申請人:株式會社味滋集團公司