專利名稱：使用天然型l－半胱氨酸或其衍生物的螢火蟲發(fā)光基質的生物合成系統(tǒng)及包含本系統(tǒng)的 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種更簡便且容易地得到穩(wěn)定的基質的方法以及半胱氨酸、ATP、基因表達的測定法。所述發(fā)光基質如下得到，將應用范圍廣泛的天然型L-半胱氨酸為底物在反應溶液內直接合成，得到作為檢測哺乳動物的基因表達的報告基因有用的發(fā)光甲蟲熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶、鐵道蟲(Phrixothrix hirtus)熒光素酶、金針蟲熒光素酶、大場雌光螢(Rhagophthalmus ohbai)熒光素酶)的發(fā)光基質。
背景技術：
發(fā)光甲蟲的發(fā)光基質是以醌類及D-半胱氨酸為起始物質的化合物熒光素(非專利文獻1)。迄今為止，根據(jù)注入螢火蟲生物體內的標識化合物的取出實驗，證明醌或氫醌是被熒光素取出的且醌類為起始物質(非專利文獻2)，另外，認為其再生路徑為熒光素→氧化熒光素→2-氰基-6-羥基苯并噻唑→熒光素(非專利文獻3)。另一方面，推測熒光素的2’C來自半胱氨酸的α位(非專利文獻4)。根據(jù)這些觀點，總結出圖1所示的迄今為止的見解。在螢火蟲體內，存在于被確認的合成路徑中的物質群為醌(4)、2-氰基-6-羥基苯并噻唑(3)、D-螢火蟲熒光素(1)、氧化熒光素(2)。連接這些點的工作很重要，但并不是直接的研究進展。其中，在推測原料為(4)時，在開始發(fā)生的反應A中，半胱氨酸(5)或半胱氨酸-半胱氨酸(7)發(fā)生反應。然后可以推測反應B或C。推測反應B是在內部作成苯并噻唑環(huán)(11，12)，或者反應C是作成噻唑啉環(huán)(10)，而且，從反應B到反應C、或從反應C到反應B成為代謝路徑，接下來合成螢火蟲熒光素(1)。目前，依照該線路，以比天然型昂貴的D-半胱氨酸(6)為底物合成螢火蟲熒光素。
另外，發(fā)現(xiàn)將作為發(fā)光反應生成物的氧化熒光素(2)交換為2-氰基-6-羥基苯并噻唑(3)的酶(非專利文獻5、非專利文獻6)，通過添加酶，可以使2-氰基-6-羥基苯并噻唑(3)和D-半胱氨酸(6)作用，使熒光素再生，從而可以持續(xù)發(fā)光(專利文獻1)?？傊?，為了測定發(fā)光甲蟲熒光素酶的活性，D-螢火蟲熒光素(1)是必要的，為了制造該D-螢火蟲熒光素，必須使用比天然型昂貴的D-半胱氨酸(6)。
另一方面，有報告稱，由天然型L-半胱氨酸合成L-螢火蟲熒光素，即使使其與發(fā)光甲蟲熒光素酶反應也不發(fā)光，而且，合成的L-螢火蟲熒光素不發(fā)光(非專利文獻7、非專利文獻8)。但是，近年來，也有報告報道由L-螢火蟲熒光素發(fā)光的相反的實驗結果(非專利文獻9)。另外，還有報告稱由L-半胱氨酸合成的L-螢火蟲熒光素成為腺苷化熒光素容易被消旋化(非專利文獻10)，以L-半胱氨酸為底物的螢火蟲發(fā)光系統(tǒng)沒有被充分地研究，沒有定論。
L-半胱氨酸是生物體內的蛋白質構成氨基酸，從營養(yǎng)學來講不是必須的氨基酸。高胱氨酸尿等是高半胱氨酸和絲氨酸反應沒有生成半胱氨酸，或者胱氨酸尿是半胱氨酸輸送存在障礙等，測定體內的L-半胱氨酸、或測定尿中的胱氨酸量是重要的。目前有L-半胱氨酸的測定方法及L-半胱氨酸的測定用試劑，所述L-半胱氨酸的測定方法是用L-半胱氨酸反應催化生成氨、丙酮酸及硫化氫的反應，L-半胱氨酸、高胱氨酸實質上不反應，而是使L-半胱氨酸分解酶在5’-磷酸-吡哆醛的存在下發(fā)生作用，對生成的任一個反應生成物進行定量的L-半胱氨酸的測定方法；所述L-半胱氨酸的測定用試劑是用L-半胱氨酸反應催化生成氨、丙酮酸及硫化氫的反應，D-半胱氨酸、高胱氨酸實質上不反應的包含酶及5’-磷酸-吡哆醛的L-半胱氨酸的測定用試劑(專利文獻2)。另外，作為D-半胱氨酸的特別定量法，有具有如下特征的方法，其包括第1工序，使D-半胱氨酸與D-熒光素前體(2-氰基-6-羥基苯并噻唑、2-氰基-6-O-β-D-半乳糖基苯并噻唑等)反應，使其生成D-熒光素或D-熒光素衍生物；第2工序，通過測定生成的D-熒光素或其衍生物的量，來測定D-半胱氨酸量(專利文獻3)。
專利文獻1日本特開2001-103972專利文獻2日本特開2004-105057專利文獻3日本特開2000-275247非專利文獻1White E.H.，McCapra F.，F(xiàn)ireld G.and McElroy W.D.(1961)J.Amer.Chem.Soc.，83，2402-2403非專利文獻2Okada，K.，Ito H.& Goto T.(1976)J.C.S.Chem.Comm.，32非專利文獻3Okada，K.，Ito H.，Kubota I.& Goto T.(1974)Tetrahedron Letters，15，2771-2774非專利文獻4McCapra，F(xiàn).& Razavi，Z.(1976)J.C.S.Chem.Comm.，153-154非專利文獻5Gomi，K.& Kajiyama，N.(2001)，J.Biol.Chem.，276，36508-36513非專利文獻6Gomi，K.，Hirokawa，K.，Kajiyama，N.(2002)，Gene294，157-66非專利文獻7White E.H.；McCapra F.；Fireld G.；McElroy W.D.(1961)J.Amer.Chem.Soc.，83，2402-2403非專利文獻8E.H.White，F(xiàn).McCapra，F(xiàn)ireld G.and G.F.Field.(1963)J.Amer.Chem.Soc.，85，337-343非專利文獻9Lembert，N.(1996).Biochem.J.，317，273-7非專利文獻10Imai，K.；Goto，T.(1988)Agric.Biol.Chem.，52，2803-2809發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于，開發(fā)一種更簡便且容易地得到穩(wěn)定的發(fā)光基質的方法以及半胱氨酸、包含胱氨酸的由半胱氨酸衍生的物質(半胱氨酸衍生物)、ATP、基因表達的測定法。所述發(fā)光基質如下得到，不是直接使用螢火蟲發(fā)光進展，而是以應用范圍廣泛的天然型L-半胱氨酸或由其衍生的物質為底物在反應溶液內直接合成，得到作為檢測哺乳動物的基因表達的報告基因有用的螢火蟲熒光素酶的發(fā)光。根據(jù)本發(fā)明，可以廉價地測定螢火蟲熒光素酶的活性，可以長期控制穩(wěn)定地發(fā)光，以及可以對半胱氨酸、包含胱氨酸的由半胱氨酸衍生的物質(半胱氨酸衍生物)或ATP進行定量。
為了解決上述問題，本發(fā)明人再次確認螢火蟲發(fā)光基質的生物合成路徑，發(fā)現(xiàn)與以往不同的發(fā)光基質合成路徑的可能性，即使沒有發(fā)光基質D-螢火蟲熒光素，以天然型L-半胱氨酸為起始物質也可以生物合成發(fā)光基質，通過加入與該路徑相關的物質群和螢火蟲熒光素酶進行發(fā)光，根據(jù)這種發(fā)現(xiàn)，研究穩(wěn)定且短時間精制發(fā)光基質的方法，同時研究其保存法，于是完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供以下螢火蟲發(fā)光基質的合成法、報告基因用發(fā)光基質溶液及ATP、半胱氨酸的測定法。
1.一種D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造方法，其特征在于，所述方法是使L-螢火蟲熒光素原料與酯酶發(fā)生反應，從而制造D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物，所述L-螢火蟲熒光素原料包含選自(1)L-螢火蟲熒光素或其衍生物的酯、及(2)L-螢火蟲熒光素或其衍生物的硫酯構成的族中的至少一種。
2.如1所述的方法，其中，所述L-螢火蟲熒光素原料是L-螢火蟲熒光素CoA或其外消旋體。
3.如1所述的方法，其中，所述酯酶是來自哺乳動物的酯酶或來自昆蟲的酯酶。
4.如3所述的方法，其中，所述來自昆蟲的酯酶是螢火蟲酯酶。
5.一種D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造方法，其特征在于，所述方法是使L-螢火蟲熒光素CoA與酯酶發(fā)生反應，從而制造D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物，所述L-螢火蟲熒光素CoA由如下方法得到，即，在輔酶A、ATP及Mg2+的存在下，使L-螢火蟲熒光素或L-螢火蟲熒光素衍生物或者其供給源與熒光素酶發(fā)生反應，從而得到L-螢火蟲熒光素CoA。
6.如5所述的方法，其中，所述L-螢火蟲熒光素或其衍生物的供給源由L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物和下述式(1)所示的化合物構成。
式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團。
其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基。
R表示CN或如下基團。
其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基。Z1及Z2相同或不同，為氧原子(O)或硫原子(S)。
7.一種螢火蟲熒光素酶或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光活性測定系統(tǒng)，所述測定系統(tǒng)包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、ATP，Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶。
8.一種L-半胱氨酸或其衍生物的定量方法，其特征在于，在包含下述式(1)所示的化合物、輔酶A、ATP、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團。
其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基。
R表示CN或如下基團。
其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基。Z1及Z2相同或不同，為氧原子(O)或硫原子(S)。
9.一種ATP的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
10.一種微生物的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
11.一種酯酶的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、ATP、Mg2+及發(fā)光甲蟲熒光素酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
12.一種L-半胱氨酸或其衍生物的定量試劑盒，其中，包含下述式(1)所示的化合物、發(fā)光甲蟲熒光素酶、輔酶A、ATP、Mg2+及酯酶。
式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團。
其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基。
R表示CN或如下基團。
其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基。Z1及Z2相同或不同，為氧原子(O)或硫原子(S)。
13.一種ATP的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、酯酶、輔酶A及Mg2+。
14.一種微生物的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、酯酶、輔酶A及Mg2+。
15.一種酯酶的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、輔酶A、ATP及Mg2+。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了以L-半胱氨酸為起始物質可以合成可以發(fā)光的D-螢火蟲熒光素的路徑，利用它可以構筑發(fā)光基質試劑、半胱氨酸定量試劑、酯酶活性測定試劑等。由此可以廉價地測定螢火蟲熒光素酶的活性，可以長期控制穩(wěn)定地發(fā)光，以及可以對半胱氨酸、胱氨酸或ATP進行定量。


圖1表示螢火蟲熒光素酶的生物合成路徑的線路。
圖2表示L-半胱氨酸底物發(fā)光測定試劑中的熒光素酶濃度-發(fā)光量的關系。
圖3表示D-螢火蟲熒光素和L-螢火蟲熒光素的HPLC分離曲線、及由D-半胱氨酸及L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑合成D-螢火蟲熒光素和L-螢火蟲熒光素的反應線路。
圖4表示由L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑、在熒光素酶的存在下、經(jīng)由熒光素-SCoA、利用酯酶合成D-螢火蟲熒光素的線路。
圖5表示L-半胱氨酸底物發(fā)光測定試劑中的豬酯酶濃度-發(fā)光量的關系。
圖6表示L-半胱氨酸底物發(fā)光測定試劑中的半胱氨酸濃度-發(fā)光量的關系。
圖7表示L-半胱氨酸底物發(fā)光測定試劑中的ATP濃度-發(fā)光量的關系。
具體實施例方式
螢火蟲發(fā)光體系被用于進行基因表達解析的報告酶(螢火蟲熒光素酶等發(fā)光甲蟲熒光素酶的定量)、作為反應的輔助因子的ATP量的測定、或將ATP量作為指標的細菌等的菌檢測等工業(yè)用途，生成有許多制品。推測該螢火蟲發(fā)光體系的反應機理是，發(fā)光基質D-螢火蟲熒光素和ATP反應，成為腺苷熒光素，接下來與氧反應成為氧化熒光素時發(fā)光。此時，作為推進反應平穩(wěn)進行的催化劑是螢火蟲熒光素酶等發(fā)光甲蟲熒光素酶，而且，鎂離子作為輔助因子也是必須的。由此，在使發(fā)光反應開始發(fā)生方面，必要的物質群為D-螢火蟲熒光素、ATP、鎂離子和發(fā)光甲蟲熒光素酶(特別是螢火蟲熒光素酶)。另外，此時，發(fā)光甲蟲熒光素酶認識熒光素的手征對稱性，非天然體L-螢火蟲熒光素不發(fā)光，只有D-螢火蟲熒光素發(fā)光。因此，考慮D-螢火蟲熒光素的生物合成時，該基質通常由D-半胱氨酸合成(圖1)。
但是，只要將L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑混合，就可以合成沒有發(fā)光活性的L-螢火蟲熒光素，而且發(fā)現(xiàn)，當加入輔酶A、ATP、Mg離子及硫酯水解酶(酯酶)時，經(jīng)由L-熒光素CoA可以合成可以發(fā)光的D-螢火蟲熒光素。由此查明如下體系，不以D-半胱氨酸(100％)為起始物質，即由反應試劑內含有的天然型L-半胱氨酸或其一部分是作為D-半胱氨酸的D-及L-半胱氨酸的混合物(特別是外消旋體)可以有效地合成可以發(fā)光的D-螢火蟲熒光素。
在本發(fā)明的一個實施方式中，作為D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造原料，可以例舉選自由L-螢火蟲熒光素或其衍生物的酯及硫酯構成的族中的至少一種。對這些原料而言，由于(硫)酯酶的作用而導致(硫)酯水解，這時立體構型翻轉，成為D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物。
作為L-螢火蟲熒光素衍生物，可以例舉在苯并噻唑基的6位上具有烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基或二烷氨基取代基的物質。
作為L-螢火蟲熒光素或其衍生物的酯，可以例舉烷基酯(甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯、叔丁酯、戊酯、己酯等具有C1～C6的直鏈或支鏈的烷基酯、芐酯等芳烷基酯、苯酯等芳基酯等。
另外，作為L-螢火蟲熒光素或其衍生物的硫酯，可以例舉(甲硫酯、乙硫酯、正丙硫酯、異丙硫酯、叔丁硫酯、戊硫酯、己硫酯等具有C1～C6的直鏈或支鏈的烷基硫酯、輔酶A(有時略記為CoA或CoA-SH)或半胱胺、泛酸和半胱胺的酰胺體等具有SH基的輔酶A的部分結構物的酯等。
作為D-螢火蟲熒光素的發(fā)光性衍生物，可以例舉在苯并噻唑基的6位上具有酰氧基、烷氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或下述基團的衍生物。
其中，R1與上述的定義相同。
在本發(fā)明的一個實施方式中，對L-螢火蟲熒光素CoA等L-螢火蟲熒光素(硫)酯而言，通過使用酯酶被分解時，變換成D-螢火蟲熒光素。
為了將L-螢火蟲熒光素變換成D-螢火蟲熒光素，優(yōu)選使用L-螢火蟲熒光素的硫酯，特別是更優(yōu)選使用輔酶A或半胱胺等與硫酯形成相關的輔酶A的部分結構物的酯。
作為將L-螢火蟲熒光素的酯水解的酶，酯酶和硫酯酶都可以使用。在L-螢火蟲熒光素的酯的水解中，酯酶和硫酯酶都可以使用。同樣，在L-螢火蟲熒光素的硫酯的水解中，也可以使用酯酶。
作為可以水解硫酯的酯酶，例如，可以例舉來自豬、人、牛、羊、狗、猴、小鼠、大白鼠、倉鼠、豚鼠等哺乳動物的酯酶、來自螢火蟲、金針蟲、蠶等昆蟲的酯酶。將L-螢火蟲熒光素的CoA酯用酯酶水解，可以提高熒光素的立體構型的變換效率，故優(yōu)選。
對L-螢火蟲熒光素的酯及硫酯而言，可以是100％的L體，也可以是其一部分為D體(D-螢火蟲熒光素)的D體和L體的混合物。原料的酯/硫酯中的D體的混合比例，通常為50％以下，但也可以超過50％。
L-螢火蟲熒光素或其衍生物的供給源，由L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物與下述式(1)所示的化合物構成。
式中，Y及R與上述的定義相同。
作為L-半胱氨酸衍生物，可以例舉L-半胱氨酸酯體(例如，烷基酯、芳烷基酯、芳基酯等)。對L-半胱氨酸的烷基酯、芳烷基酯、芳基酯的烷基、芳烷基、芳基而言，可以例示與上述同樣的基團。
在本發(fā)明中，作為烷氧基，可以例舉甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等具有C1～C6的直鏈或支鏈的烷氧基。
作為酰氧基，可以例舉甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、正丁酰氧基、異丁酰氧基、仲丁酰氧基、叔丁酰氧基、戊酰氧基、異戊酰氧基、特戊酰氧基、羥乙酰氧基、乳酰氧基、苯乙酰氧基、苯酰氧基等。
作為一烷氨基，可以例舉甲氨基、乙氨基、正丙氨基、異丙氨基、正丁氨基、異丁氨基、仲丁氨基、叔丁氨基、戊氨基、己氨基等用具有C1～C6、優(yōu)選C1～C4的直鏈或支鏈的烷基進行單取代的氨基。
作為二烷氨基，可以例舉二甲氨基、二乙氨基、二正丙氨基、二異丙氨基、二正丁氨基、二異丁氨基、二仲丁氨基、二叔丁氨基、二戊氨基、二己氨基等用具有C1～C6、優(yōu)選C1～C4的直鏈或支鏈的烷基進行雙取代的氨基。
作為烷基，可以例舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等具有C1～C6、優(yōu)選C1～C4的直鏈或支鏈的烷基。
作為芳烷基，可以例舉芐基、1-苯乙基、2-苯乙基。
作為芳基，可以例舉苯基、萘基、甲苯基、二甲苯基等。
本發(fā)明的一個實施方式是，編入L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源及輔酶A、ATP、Mg離子、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶而形成的螢火蟲發(fā)光體系。
本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方式是，編入L-半胱氨酸和2-氰基-6-羥基苯并噻唑及輔酶A、ATP、Mg離子、螢火蟲熒光素酶及酯酶而形成的螢火蟲發(fā)光體系。
本發(fā)明的一個特征在于，通過使L-螢火蟲熒光素CoA等的L-螢火蟲熒光素酯(優(yōu)選硫酯)在可以水解該酯的酯酶的存在下進行酯水解反應，L-熒光素的羧基的立體構型發(fā)生翻轉，得到D-熒光素。
對作為D-熒光素制造原料特別優(yōu)選的L-熒光素CoA而言，如圖4所示，通過使L-熒光素和輔酶A(CoA-SH；有時也記為CoA)、ATP、Mg2+、螢火蟲熒光素酶(LUC)發(fā)生反應，可以得到L-熒光素CoA。需要說明的是，對L-螢火蟲熒光素的制造反應而言，通過使L-半胱氨酸和2-氰基-6-羥基苯并噻唑在水、或者乙醇、甲醇、丙醇等醇或含水醇、乙腈、丙酮、THF，DMF，DMSO等適當?shù)娜軇┲谢蛘咚?有機溶劑的2相體系中，在從室溫到溶劑沸騰的溫度下反應1～24小時左右，有利地進行該制造反應。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光體系，由使用有昂貴的非天然型D-半胱氨酸、D-螢火蟲熒光素的發(fā)光體系，可以構筑以廉價的天然型L-半胱氨酸為底物的試劑群。
對本發(fā)明的發(fā)光體系而言，由于其發(fā)光量與螢火蟲熒光素酶量、半胱氨酸量、ATP量及硫酯水解酶量直線相關，因此可以構筑基因表達檢測試劑、半胱氨酸定量試劑、ATP定量試劑及酯酶活性測定試劑等。另外，通過對ATP進行定量，也可以對細菌進行定量。
對本發(fā)明的測定體系而言，由L-熒光素或其供給源(L-半胱氨酸或其衍生物和2-氰基-6-羥基苯并噻唑)得到的D-熒光素，通過對由于ATP和熒光素酶的作用而發(fā)光的發(fā)光量進行定量，可以對與該測定體系相關的ATP、L-半胱氨酸或其衍生物、熒光素酶、酯酶等進行定量。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，該測定體系使用的各成分的濃度如下所述。
ATP0.1～10mM；優(yōu)選1～5mM；螢火蟲熒光素酶0.0001～10unit/ml；優(yōu)選0.1～1unit/ml；酯酶10-6～10-2unit/ml；優(yōu)選10-4～10-3unit/ml；
L-半胱氨酸或其衍生物0.01～20mM；優(yōu)選0.1～10mM。
需要說明的是，測定時的溫度優(yōu)選為室溫～37℃左右的溫度，測定時間優(yōu)選為1～50秒左右。
對本發(fā)明的發(fā)光體系而言，利用硫酯水解酶等酯酶從L-螢火蟲熒光素向D-螢火蟲熒光素變換。通過同時使用抗氧化劑，可以提高其保存穩(wěn)定性。作為抗氧化劑，可以例舉抗壞血酸、脫氧劑等。
實施例下面，基于實施例對本發(fā)明進行更詳細地說明。
實施例1將10mM的2-氰基-6-羥基苯并噻唑、1mM的L-半胱氨酸、10mM的CoA-SH、0.1mg/ml的螢火蟲熒光素酶、100unit/ml的豬肝臟酯酶溶解于緩沖溶液(0.1M Tris-HCl(pH8))中，每10ml分別加入到發(fā)光測定用管中，而且利用同一緩沖液作成100ml。在其中噴射ATP-Mg溶液(6mMATP-Na，16mM MgSO4)100ml，使其引發(fā)發(fā)光反應，用ATTO(株)社制亮度計AB2200測定發(fā)光量。其結果，可以確認發(fā)光。如圖2所示，測定使熒光素酶濃度從1×10-4mg/ml變化至1mg/ml的發(fā)光量，結果發(fā)現(xiàn)，開始后1-50秒、及551-600秒的累計發(fā)光強度與發(fā)光秒濃度的關系呈直線變化。由此可知，在L-半胱氨酸、2-氰基-6-羥基苯并噻唑、CoA-SH、酯酶存在下，只要有發(fā)光酶熒光素酶，就可以發(fā)生發(fā)光反應。由此判明，即使不直接加入作為發(fā)光基質的D-螢火蟲熒光素，在本條件下由L-半胱氨酸可以合成發(fā)光基質。同時判明，發(fā)光活性依存于發(fā)光酶量、通過測定發(fā)光活性量，可以對發(fā)光酶量進行定量。
實施例2圖3是將D-半胱氨酸或L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑在室溫混合后，用HPLC分離，用激發(fā)波長330nm激發(fā)的熒光波長530nm的信號的分布圖。分離柱為ダイセル工業(yè)，將Chiralcel OD-RHz在分離溶劑中以27％乙腈、0.1％TFA(三氟醋酸)水系、流速為1.0ml/min的條件進行分離。將預先合成的D-螢火蟲熒光素和L-螢火蟲熒光素分別進行分離，其結果是，在保持時間為7分鐘時L-螢火蟲熒光素溶出，在保持時間為9分鐘時D-螢火蟲熒光素溶出，可以確認，在各自的混合物中，在相同的保持時間溶出，可以確認，2-氰基-6-羥基苯并噻唑和D-半胱氨酸反應，生成D-螢火蟲熒光素，和L-半胱氨酸反應，生成L-螢火蟲熒光素。另外，在加入10mM乙腈、1mML-半胱氨酸、10mMCoA-SH、0.1mg/ml熒光素酶的條件下，利用質譜確認熒光素-ScoA的存在。根據(jù)這些結果，確認如圖4所示的由L-半胱氨酸合成D-螢火蟲熒光素的路徑。即，由L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑合成的L-螢火蟲熒光素在熒光素酶的存在下成為熒光素-ScoA。本生成物沒有發(fā)光，但通過作為酯酶的豬肝臟酯酶成為D-螢火蟲熒光素，可以發(fā)光。
實施例3將10mM的2-氰基-6-羥基苯并噻唑、1mM的L-半胱氨酸、10mM的CoA-SH、0.1mg/ml的螢火蟲熒光素酶、100或10unit/ml的豬肝臟酯酶溶解于緩沖溶液(0.1M Tris-HCl(pH8))中，每10m1分別加入發(fā)光測定用管中，而且利用同一緩沖液作成100ml。在其中噴射ATP-Mg溶液(6mM ATP-Na，16mM MgSO4)100ml，使其引發(fā)發(fā)光反應，用ATTO(株)社制亮度計AB2200測定發(fā)光量。圖5表示酯酶量和發(fā)光活性的關系，當酯酶濃度成倍變化時，發(fā)光量也成倍變化，由此判明，L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑→L-螢火蟲熒光素→D-螢火蟲熒光素的變換效率依存于作為酯酶的豬肝臟酯酶量。
實施例4將10mM的2-氰基-6-羥基苯并噻唑、100-0.1mM的L-半胱氨酸、10mM的CoA-SH、0.1mg/ml的螢火蟲熒光素酶、100unit/ml的豬肝臟酯酶溶解于緩沖溶液(0.1M Tris-HCl(pH8))中，每10ml分別加入到發(fā)光測定用管中，而且利用同一緩沖液作成100ml。在其中噴射ATP-Mg溶液(6mM ATP-Na，16mM MgSO4)100ml，使其引發(fā)發(fā)光反應，用ATTO(株)社制亮度計AB2200測定發(fā)光量。圖6表示L-半胱氨酸和發(fā)光活性的關系，使L-半胱氨酸濃度變化至10-10000mM時，發(fā)光活性大致呈直線增加。由此判明，L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑→L-螢火蟲熒光素→D-螢火蟲熒光素的變換效率依存于L-半胱氨酸，通過測定發(fā)光活性可以對L-半胱氨酸進行定量。
實施例5將10mM的2-氰基-6-羥基苯并噻唑、1mM的L-半胱氨酸、10mM的CoA-SH、0.1mg/ml的螢火蟲熒光素酶、100unit/ml的豬肝臟酯酶溶解于緩沖溶液(0.1M Tris-HCl(pH8))中，每10ml分別加入到發(fā)光測定用管中，而且利用同一緩沖液作成100ml。在其中噴射ATP-Mg溶液(6mMATP-Na，16mM MgSO4)100ml，使其引發(fā)發(fā)光反應，用ATTO(株)社制亮度計AB2200測定發(fā)光量。圖7表示ATP量和發(fā)光活性的關系，使ATP濃度變化至0.25-3mM時，發(fā)光活性大致呈直線增加。由此判明，L-半胱氨酸與2-氰基-6-羥基苯并噻唑→L-螢火蟲熒光素→D-螢火蟲熒光素的變換效率依存于ATP量，通過測定發(fā)光活性可以對ATP進行定量。
權利要求
1.一種D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造方法，其特征在于，使L-螢火蟲熒光素原料與酯酶發(fā)生反應，所述L-螢火蟲熒光素原料包含選自(1)L-螢火蟲熒光素或其衍生物的酯及(2)L-螢火蟲熒光素或其衍生物的硫酯中的至少一種。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述L-螢火蟲熒光素原料是L-螢火蟲熒光素CoA或其外消旋體。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述酯酶是來自哺乳動物的酯酶或來自昆蟲的酯酶。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述來自昆蟲的酯酶是螢火蟲酯酶。
5.一種D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造方法，其特征在于，使L-螢火蟲熒光素CoA與酯酶發(fā)生反應，所述L-螢火蟲熒光素CoA是在輔酶A、ATP及Mg2+的存在下，使L-螢火蟲熒光素或L-螢火蟲熒光素衍生物或者其供給源與熒光素酶發(fā)生反應而得到。
6.如權利要求5所述的方法，其中，所述L-螢火蟲熒光素或其衍生物的供給源由L-半胱氨酸或L-半胱氨酸衍生物和下述式(1)所示的化合物構成， 式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團， 其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基，R表示CN或如下基團， 其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基，Z1及Z2相同或不同，為氧原子或硫原子。
7.一種螢火蟲熒光素酶或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光活性測定系統(tǒng)，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、ATP，Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶。
8.一種L-半胱氨酸或其衍生物的定量方法，其特征在于，在包含下述式(1)所示的化合物、輔酶A、ATP、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光， 式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團， 其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基，R表示CN或如下基團， 其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基，Z1及Z2相同或不同，為氧原子或硫原子。
9.一種ATP的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
10.一種微生物的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、Mg2+、發(fā)光甲蟲熒光素酶及酯酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
11.一種酯酶的定量方法，其特征在于，在包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、輔酶A、ATP、Mg2+及發(fā)光甲蟲熒光素酶的反應體系中，測定來自D-螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的發(fā)光。
12.一種L-半胱氨酸或其衍生物的定量試劑盒，其中，包含下述式(1)所示的化合物、發(fā)光甲蟲熒光素酶、輔酶A、ATP、Mg2+及酯酶， 式中，Y表示羥基、烷氧基、酰氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基或如下基團， 其中，R1表示烷基、芳烷基或芳基，R表示CN或如下基團， 其中，R2表示烷基、芳烷基或芳基，Z1及Z2相同或不同，為氧原子或硫原子。
13.一種ATP的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、酯酶、輔酶A及Mg2+。
14.一種微生物的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、酯酶、輔酶A及Mg2+。
15.一種酯酶的定量試劑盒，其中，包含L-螢火蟲熒光素或其衍生物或者其供給源、發(fā)光甲蟲熒光素酶、輔酶A、ATP及Mg2+。
全文摘要
本發(fā)明提供一種D－螢火蟲熒光素或其發(fā)光性衍生物的制造方法，其特征在于，使L－螢火蟲熒光素原料與酯酶發(fā)生反應，所述L－螢火蟲熒光素原料包含選自(1)L－螢火蟲熒光素或其衍生物的酯及(2)L－螢火蟲熒光素或其衍生物的硫酯中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明，可以廉價地測定螢火蟲熒光素酶的活性，可以長期控制穩(wěn)定地發(fā)光，以及可以對半胱氨酸、胱氨酸或ATP進行定量。
文檔編號C12Q1/06GK101090976SQ200580045139
公開日2007年12月19日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權日2004年12月28日
發(fā)明者近江谷克裕, 丹羽一樹, 丹羽治樹, 中村光裕, 龍福正行 申請人:國立大學法人電氣通信大學