本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種用環(huán)糊精以及卵磷脂為載體制備的番荔素納米粒、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番荔素包括番荔素內(nèi)酯(簡(jiǎn)稱ACGs)及其單體bullatacin、squamostatin、annosquacin等。番荔素是從番荔枝科植物種子中提取的一系列含有35或37個(gè)碳的長(zhǎng)鏈脂肪酸，并含有0到3個(gè)四氫呋喃(THF)環(huán)類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。番荔枝總內(nèi)酯和單體大多數(shù)展示出來(lái)很強(qiáng)的抗腫瘤活性，其中活性最好的單體bullatacin對(duì)肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞、肉瘤S180細(xì)胞等具有顯著療效。同時(shí)，ACGs對(duì)多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞株也有較好活性。

ACGs水溶性差，小于1ug/mL，難于給藥，導(dǎo)致體內(nèi)研究大大受限。已有的體內(nèi)研究多采用懸浮灌胃，或者分散在植物油中口服給藥，由于生物利用度低導(dǎo)致其療效難以最大程度發(fā)揮。并且ACGs毒副作用大，治療窗口窄，對(duì)大鼠的肝和腎有一定毒性。

納米粒是將藥物通過(guò)不同的方法制備成納米大小的顆粒，包括膠束、聚合物納米粒、納米混懸劑等。由于具有較大的表面積，藥物溶出速度和程度均較高，納米粒已成為解決難溶性藥物的給藥問(wèn)題的主要方法之一。同時(shí)，藥物多包封在納米粒內(nèi)部，進(jìn)入體內(nèi)之后可以在一定時(shí)間內(nèi)與外界環(huán)境隔離，從而在一定程度上保護(hù)不穩(wěn)定的藥物，延緩代謝。如果納米粒的粒徑較小(如300nm以內(nèi))，還可由于EPR(enhanced permeation and retention)效應(yīng)而被動(dòng)靶向腫瘤。因此，納米給藥系統(tǒng)是解決難溶性藥物，尤其是難溶性抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用的有效手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種制備方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)番荔素靜脈注射和口服給藥，并增強(qiáng)抗癌療效的納米粒。

一種基于環(huán)糊精及卵磷脂為載體的番荔素納米粒，由番荔素、環(huán)糊精和磷脂組成，其質(zhì)量比為1∶0.02～20∶0.02～20。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述番荔素選自番荔素內(nèi)酯、bullatacin、squamostatin或annosquacin中的一種或者兩種及以上的組合。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，番荔素、環(huán)糊精和磷脂的質(zhì)量比為4∶2∶1。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒的平均粒徑為10-1000nm，優(yōu)選平均粒徑為20-200nm；所述納米粒包括但不限于納米混懸劑、納米晶、納米粒、納米聚集體等。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米?？芍瞥煽诜苿┗蜢o脈給藥制劑。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述環(huán)糊精選自α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精中的一種或者兩種及以上的組合。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述環(huán)糊精選自羥丙基-β-環(huán)糊精。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述環(huán)糊精選自PEG修飾的α-、β-或γ-環(huán)糊精，其中PEG的分子量范圍是200-10000，優(yōu)選分子量范圍是400-5000，更優(yōu)選分子量范圍是600-2000。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述卵磷脂選自大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂中的一種或兩種的組合，其中優(yōu)選大豆卵磷脂。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為進(jìn)一步改善載藥納米粒的性質(zhì)，還可以加入有其他藥劑上可以接受的各種輔料作為非必需的輔助穩(wěn)定劑，這些輔料包括但不限于PCL-PEG、ChoI-PEG、聚乙烯醇等。

另一方面，本發(fā)明提供了一種基于環(huán)糊精及卵磷脂為載體的番荔素納米粒的制備方法，所述方法為溶劑沉淀法或反溶劑法，包括攪拌注入或者超聲注入或者二者結(jié)合來(lái)制備。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法具體步驟包括：

(1)將卵磷脂溶于能與水互溶的有機(jī)溶劑中，攪拌條件下將所述含有卵磷脂的溶液加入到含有環(huán)糊精的水溶液中，減壓旋蒸法除去有機(jī)溶劑；

(2)將番荔素溶于能與水互溶的有機(jī)溶劑中，攪拌條件下，將所述含有番荔素的溶液加入到上一步的溶液中，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得所述的納米粒。

在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述能與水互溶的有機(jī)溶劑選自DMSO、DMF、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、異丙醇、PEG400、PEG600中的一種或兩種及以上的混合體系；或者以上溶劑與乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等與水不相混溶的有機(jī)溶劑的混合體系，只要混合體系能和水混溶同時(shí)能很好地溶解藥物和輔料即可。

在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法中番荔素在有機(jī)溶劑中的濃度為0.001％～20％(w/v)，載體的濃度為0.001％～50％(w/v)。

在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)中有機(jī)溶劑與水相的體積比為1∶2～100(v/v)。

在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(1)和(2)中的攪拌條件為攪拌溫度20-60℃；攪拌速度100～1000rpm；攪拌時(shí)間1～60min，優(yōu)選的攪拌條件為25℃，500rpm，攪拌20min。

在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，還包括步驟(3)還可以通過(guò)冷凍干燥進(jìn)一步固化。所用凍干保護(hù)劑可以是海藻糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精中的一種或兩種及兩種以上的組合中的一種或兩種及以上的組合，優(yōu)選乳糖為凍干保護(hù)劑；凍干保護(hù)劑的用量為0.1％-5％(g/100mL)，凍干保護(hù)劑的用量?jī)?yōu)選為0.5-2.5％。

另一方面，本發(fā)明提供了提供一種番荔素納米粒在制備用于治療肝癌的注射劑中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的注射劑選自注射液或無(wú)菌凍干粉針。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒注射劑的水相分散介質(zhì)可用高濃度的氯化鈉或葡萄糖水溶液調(diào)成0.9％氯化鈉或者5％葡萄糖生理等滲體系，適應(yīng)臨床應(yīng)用。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米粒無(wú)菌凍干粉針可加入適量的無(wú)菌藥用0.9％氯化鈉或者5％葡萄糖水溶液稀釋?zhuān)亟ǔ晒╈o脈給藥用的分散體系，適應(yīng)臨床使用。

本發(fā)明的納米粒的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)處方簡(jiǎn)單，所用的載體對(duì)人體無(wú)毒副作用，并且經(jīng)濟(jì)易得；

(2)載藥量可高達(dá)50％以上，平均粒徑小，具有較高的藥物傳輸效率，同時(shí)易實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的被動(dòng)靶向；

(3)體外釋放沒(méi)有突釋?zhuān)?/p>

(4)在人工胃腸液和血漿當(dāng)中均穩(wěn)定，既可以口服給藥，也可以靜脈注射。

本發(fā)明的納米粒經(jīng)體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，與番荔素DMSO溶液相比，表現(xiàn)出更顯著的腫瘤細(xì)胞抑制率。

本發(fā)明的納米粒經(jīng)荷瘤小鼠藥效實(shí)驗(yàn)證明，與市售喜樹(shù)堿注射液(陽(yáng)性藥)相比，具體更顯著的抗腫瘤藥效，在腫瘤治療方面，是一種非常有前景的藥物遞送系統(tǒng)。

本發(fā)明的納米粒工藝簡(jiǎn)單，輔料經(jīng)濟(jì)安全易得，有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中ACGs納米粒的平均粒徑分布圖。

圖2為實(shí)施例1中透射電鏡照片(×19000)。

圖3為實(shí)施例1中ACGs納米粒在人工胃腸液中的穩(wěn)定性考察(n＝3)。

圖4為實(shí)施例1中ACGs納米粒在血漿中的穩(wěn)定性考察(n＝3)。

圖5為實(shí)施例1中ACGs納米粒的溶血考察(n＝3)。

圖6為實(shí)施例1中ACGs納米粒在PBS中的體外釋放曲線(n＝3)。

圖7為實(shí)施例1中ACGs納米粒對(duì)HepG2、Hela細(xì)胞毒考察(n＝6)。

圖8為實(shí)施例1中荷瘤小鼠體重隨時(shí)間變化曲線(n＝10)。

圖9為實(shí)施例1中荷瘤小鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化曲線(n＝10)。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施方式進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書(shū)記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。

實(shí)施例1

稱取大豆卵磷脂2mg溶于0.2mL甲醇中，25℃，500rpm攪拌條件下緩慢注入到含有4mg羥丙基-β-環(huán)糊精的4mL水溶液中，繼續(xù)攪拌10分鐘后，旋蒸除去甲醇。隨后將8mgACGs溶于0.4mL甲醇中，常溫，500rpm攪拌條件下注入到上述獲得的溶液中，隨后旋蒸除去甲醇，即得ACGs納米粒。平均粒徑為144.4nm(圖1)，多分散性指數(shù)(PDI)為0.08，電位值-22.9mV。

實(shí)施例2

制備2mg/mL濃度的ACGs混懸劑，吸取6μL滴到300目的銅網(wǎng)上，空氣中自然晾干，后用0.1％醋酸鈾染色10min，透射電鏡下觀察粒子的形態(tài)(圖2)。

實(shí)施例3 ACGs納米粒在人工胃腸液中的穩(wěn)定性考察

人工胃液的配置：取濃度為1mol/L的稀鹽酸16.4mL，加800mL蒸餾水，10g胃蛋白酶，混勻，加水稀釋至1000mL。

人工腸液的配置：6.8g磷酸二氫鉀，加水500mL，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH6.8，另取胰蛋白酶10g，加水溶解，兩液混合后加水稀釋至1000mL。

取0.5mL過(guò)膜后的配置好的人工胃腸液，與ACGs納米粒等體積混合，一定時(shí)間點(diǎn)測(cè)其粒徑的變化。

結(jié)果：在人工胃腸液中，ACGs納米粒在12h之內(nèi)粒徑變化幾乎不大(圖3)，說(shuō)明ACGs納米粒在人工胃腸液中基本穩(wěn)定，能夠口服給藥。

實(shí)施例4 ACGs納米粒在血漿中的穩(wěn)定性考察

ACGs納米粒與大鼠血漿混合后(1∶4，v/v)，在特定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)其粒徑的變化。

結(jié)果：ACGs納米粒與血漿孵育后，6h之內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)沉淀或者粒徑變化(圖4)，說(shuō)明ACGs納米粒在血漿中基本穩(wěn)定。

實(shí)施例5 ACGs納米粒的溶血考察

大鼠眼眶取血后，于5000rpm離心10min，收集沉淀。隨后用0.9％的NaCl溶于洗滌幾遍，直至上清無(wú)明顯紅色。隨后血細(xì)胞沉淀用0.9％的NaCl的溶液稀釋至4％紅細(xì)胞懸浮液(v/v)。取此懸浮液0.5mL與0.5mL的已調(diào)等滲的納米?；旌?，37℃孵育4h后，5000rpm離心10min，取上清于酶標(biāo)儀540nm處測(cè)吸光值。同時(shí)將4％的紅細(xì)胞懸浮液與0.9％的NaCl混合作為陰性對(duì)照，4％的紅細(xì)胞懸浮液與去離子水混合作為陽(yáng)性對(duì)照。

溶血率(％)＝(OD樣品-A陰性對(duì)照)/(A陽(yáng)性對(duì)照-A陰性對(duì)照)×100

結(jié)果：ACGs溶液劑溶血明顯(圖5)，0.25mg/mL時(shí)溶血率20％，2mg/mL時(shí)溶血率將近95％。而相比之下，ACGs納米粒的溶血率大大降低，2mg/mL的ACGs納米粒溶血率不足10％，體內(nèi)靜脈給藥時(shí)所需的濃度完全不溶血，滿足靜脈注射的條件。

實(shí)施例6 ACGs納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)

方案：取制備好的ACGs納米粒4mL(1mg/mL，平行三份)，于即用型透析袋(MWCO＝20000，Spectra/Por，USA)中，分別置于1L釋放介質(zhì)PBS中，37℃下100rpm攪拌，定時(shí)從透析袋內(nèi)吸取50μL釋放內(nèi)液，加950μL甲醇溶解納米粒和未釋放的藥物，HPLC測(cè)定ACGs的含量，計(jì)算累積釋放率。

結(jié)果：ACGs納米粒能夠緩慢釋放72h(圖6)，整個(gè)過(guò)程無(wú)明顯突釋?zhuān)尫判袨榻咏患?jí)釋放。

實(shí)施例7 ACGs納米粒對(duì)HepG2、Hela的體外細(xì)胞毒考察

方案：用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液將HepG2、Hela細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞左右接種到96孔板。5％CO₂、37℃細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋ACGs納米粒至不同濃度梯度，加入200uL繼續(xù)培養(yǎng)(同時(shí)以不含胎牛血清的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照)，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。孵育48h后，吸去樣品溶液，每孔加MTT溶液(5mg·mL^-1，PBS配制)20μL；繼續(xù)孵育4h后，終止孵育，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加200μL DMSO，振蕩20min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫熒光儀檢測(cè)OD值。

細(xì)胞抑制率(％)＝(空白對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/空白對(duì)照組OD×100％。

結(jié)果：與番荔素DMSO溶液相比，納米粒混懸劑對(duì)HepG2、Hela均具有更強(qiáng)的抑制作用(圖7)，尤其是對(duì)于Hela細(xì)胞(IC₅₀值0.018μg/mL vs.0.241μg/mL，p＜0.01)。孵育48h后，ACGs溶液和納米粒的IC₅₀值如下表：

(mean±SD，n＝10，^**p＜0.01vs.ACGs溶液劑)

實(shí)施例8 ACGs納米粒在H22荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效研究

給藥方案：將篩選出來(lái)的荷瘤小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，除正常飲食外，尾靜脈注射ACGs納米粒(100，200，400ug/kg)，灌胃給予ACGs納米粒(400ug/kg)和ACGs油溶液(4mg/kg)，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性藥對(duì)照組(尾靜脈注射給予市售HCPT注射液5mg/kg)，生理鹽水陰性對(duì)照組。隔天給藥，實(shí)驗(yàn)7天。

考察指標(biāo)：每日上午9點(diǎn)至10點(diǎn)，用電子秤稱量小鼠體重；用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腋下腫瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率(％)＝(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)×100％。

結(jié)果：納米粒組的小鼠體重變化并未明顯降低，中劑量和低劑量甚至還有升高趨勢(shì)(圖8)，表明該治療組對(duì)小鼠沒(méi)有顯著毒性。ACGs納米粒靜脈注射時(shí)表現(xiàn)出卓越的抗腫瘤治療，400ug/kg尾靜脈給藥的腫瘤抑制率較HCPT市售注射劑5mg/kg(70.31％vs.35.28％，p＜0.01)有顯著性增強(qiáng)。ACGs納米粒呈現(xiàn)出劑量依賴性，中劑量(200ug/kg，iv)和低劑量(100ug/kg，iv)抑瘤率相比于高劑量抑瘤率低(分別為56.39％和47.52％)，但都比陽(yáng)性藥的抑瘤率高?？诜o藥時(shí)，ACGs納米粒僅用ACGs油溶液十分之一的劑量就能達(dá)到近乎相同的腫瘤抑制率(47.94％vs.49.74％，p＞0.05)。

表明采用羥丙基-β-環(huán)糊精與大豆卵磷脂為載體制備的ACGs納米粒是一種非常有前景的藥物遞送系統(tǒng)。ACGs納米粒，ACGs油溶液及陽(yáng)性藥對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤率如下表：

(mean±SD，n＝10，^#p＜0.05vs.空白對(duì)照，^##p＜0.01vs.空白對(duì)照，^*p＜0.05vs.HCPT注射液，^&p＜0.05vs.ACGs油溶液).

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原料的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。