專利名稱：異源α淀粉酶在曲霉中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0002本發(fā)明涉及α淀粉酶，其來(lái)源于河內(nèi)曲霉(Aspergillus kawachi)菌株。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及α淀粉酶在絲狀真菌宿主細(xì)胞諸如曲霉細(xì)胞(例如黑曲霉(Aspergillus niger))中的異源表達(dá)，并且涉及包含該α淀粉酶的酶組合物。
背景技術(shù)：
0003葡糖淀粉酶(glucoamylases)，包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的葡糖淀粉酶，是重要的工業(yè)用酶，其被用于生產(chǎn)產(chǎn)品諸如有機(jī)酸(例如乳酸)、氨基酸(例如谷氨酸)、糖類增甜劑產(chǎn)品(例如葡萄糖和高果糖玉米糖漿)、醇類(例如乙醇)和其它來(lái)自于源于谷物(grains)和谷類(cereals)的淀粉底物的化合物。此外，在微生物發(fā)酵過(guò)程中，特別是在同步糖化發(fā)酵(SSF)過(guò)程中，當(dāng)使用顆粒淀粉底物作為碳源時(shí)，減少在發(fā)酵中的殘留淀粉量將是有利的。本發(fā)明通過(guò)提供α淀粉酶例如具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)而滿足了這一需求，所述的α淀粉酶可以與葡糖淀粉酶組合使用以增強(qiáng)淀粉水解作用并提高醇類產(chǎn)量。
0004本發(fā)明優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)組合物和方法的一些優(yōu)點(diǎn)包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)a)減少在淀粉水解和/或終產(chǎn)物生產(chǎn)過(guò)程中的熱能使用；b)減少對(duì)高酶劑量的需求；c)利用從淀粉連續(xù)釋放的葡萄糖來(lái)飼喂酵母；d)保持發(fā)酵罐中相對(duì)低的葡萄糖水平，這可以降低微生物污染的高風(fēng)險(xiǎn)，并可以排除由于高濃度游離葡萄糖而造成的對(duì)酵母的分解代謝產(chǎn)物抑制作用；e)減少褐變反應(yīng)產(chǎn)物的形成；f)降低或排除了鈣的添加，而鈣的添加在現(xiàn)有技術(shù)的噴射蒸煮工藝中可能是必需的；g)減少發(fā)酵過(guò)程中水的使用；h)在發(fā)酵過(guò)程中使用更高含量的固體，這可以導(dǎo)致更高水平的終產(chǎn)物形成并降低能源成本；i)減少了某些副產(chǎn)品諸如甘油的生產(chǎn)水平；和/或j)減少了殘留淀粉含量并增加了蒸餾器干谷物和可溶物的蛋白質(zhì)含量。
發(fā)明概述0005在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含異源多核苷酸的真菌宿主細(xì)胞，所述異源多核苷酸編碼具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，所述α淀粉酶與SEQ ID NO3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，該異源多核苷酸將編碼與SEQ ID NO3的序列具有至少95％序列同一性的、具有GSH活性的asAA。在一些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉(Trichoderma)細(xì)胞，諸如里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是曲霉(Aspergillus)細(xì)胞，諸如黑曲霉(A.niger)。
0006在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有GSH活性的asAA，其包括與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在此方面的一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將是截短的asAA。在一些實(shí)施方式中，該截短的asAA包括序列SEQID NO9或者與該序列具有至少97％序列同一性的序列。
0007在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及酶組合物，其包含具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，其中該asAA具有與序列SEQ ID NO3至少90％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，所述酶組合物包含截短的asAA酶，所述酶與SEQ ID NO9具有至少97％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，所述asAA將從真菌宿主細(xì)胞中異源多核苷酸的表達(dá)中獲得。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該真菌宿主細(xì)胞將是木霉或曲霉宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，組合物將進(jìn)一步包括葡糖淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，所述葡糖淀粉酶將從曲霉或根霉(Rhizopus)菌株中獲得。在其它實(shí)施方式中，所述葡糖淀粉酶將是具有GSH活性的葡糖淀粉酶并將從曲霉、木霉、根霉或腐質(zhì)霉(Humicola)菌株中獲得。在其它實(shí)施方式中，asAA和葡糖淀粉酶兩者將在含有異源多核苷酸的同一真菌宿主中表達(dá)，所述異源多核苷酸表達(dá)具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用此方面所述的酶組合物來(lái)水解淀粉諸如顆粒淀粉的方法。
0008在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組的曲霉菌株，其包含編碼葡糖淀粉酶的DNA和編碼異源α淀粉酶的DNA，所述α淀粉酶具有與SEQ ID NO3或SEQ IDNO4至少90％的序列同一性，其中所述葡糖淀粉酶和異源α淀粉酶由該曲霉菌株表達(dá)并分泌。
0009在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及在絲狀真菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)α淀粉酶和葡糖淀粉酶的方法，包括用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡糖淀粉酶的曲霉宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包括在該曲霉宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子被可操縱地連接于編碼α淀粉酶的多核苷酸，該α淀粉酶具有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少85％的序列同一性；將該轉(zhuǎn)化的曲霉宿主細(xì)胞培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中以使其能夠表達(dá)所述α淀粉酶和葡糖淀粉酶；并生產(chǎn)α淀粉酶和葡糖淀粉酶。在一種實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括回收所生產(chǎn)的α淀粉酶和葡糖淀粉酶。
0010在第六個(gè)方面，本發(fā)明涉及在曲霉細(xì)胞中生產(chǎn)α淀粉酶的方法，其包括在適于表達(dá)和生產(chǎn)異源α淀粉酶的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)異源α淀粉酶多肽的曲霉細(xì)胞，該異源α淀粉酶多肽具有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少90％的序列同一性，并生產(chǎn)該異源α淀粉酶。
0011在第七個(gè)方面，本發(fā)明涉及在絲狀真菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)異源酸穩(wěn)定性α淀粉酶和葡糖淀粉酶的方法，包括在絲狀宿主中共表達(dá)葡糖淀粉酶和α淀粉酶，這是通過(guò)下面的步驟完成的用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包括在該宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子被可操縱地連接于編碼α淀粉酶的多核苷酸，該α淀粉酶具有與SEQ ID NO3至少90％的序列同一性，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)并生產(chǎn)葡糖淀粉酶，將該轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中以使其能夠表達(dá)所述α淀粉酶和葡糖淀粉酶，并生產(chǎn)α淀粉酶和葡糖淀粉酶。
0012在第八個(gè)方面，本發(fā)明涉及水解淀粉諸如顆粒淀粉的方法，其包括將含有淀粉的底物與包含α淀粉酶和葡糖淀粉酶的酶組合物相接觸，所述酶組合物按照本發(fā)明所包括的方法生產(chǎn)。在一種實(shí)施方式中，接觸包括將底物與包含曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)基相接觸，該曲霉細(xì)胞產(chǎn)生葡糖淀粉酶和α淀粉酶。在另一實(shí)施方式中，接觸包括將底物與葡糖淀粉酶和α淀粉酶相接觸，所述葡糖淀粉酶和α淀粉酶已從產(chǎn)生葡糖淀粉酶和α淀粉酶的曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)物中回收。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述α淀粉酶具有與序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少85％的序列同一性。


0013圖1提供了編碼天然河內(nèi)曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶的基因組DNA序列(SEQID NO1)。八個(gè)推定的內(nèi)含子用下劃線標(biāo)示。
0014圖2說(shuō)明了由圖1的多核苷酸編碼的蛋白(SEQ ID NO4)。推定的信號(hào)序列(氨基酸1-21)用下劃線和黑體表示(SEQ ID NO2)。推定的接頭(linker)是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSS SCTATSTT(SEQ ID NO8)。該接頭上游的氨基酸，未加下劃線，包括催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO9)，該接頭下游的氨基酸包括淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)(SEQ ID NO10)。所述SBD包括圖2中所述多肽的最后102個(gè)氨基酸。成熟蛋白缺少信號(hào)序列，用催化結(jié)構(gòu)域、接頭和SBD的氨基酸序列(SEQ ID NO3)來(lái)表示。
0015圖3A-D提供了質(zhì)粒pTrex3g_Akalpha(圖4)完整的核苷酸序列(SEQ IDNO5)，10990bp。
0016圖4提供了pTrex3g_Akalpha質(zhì)粒圖，該質(zhì)粒被用來(lái)表達(dá)編碼AsaA(河內(nèi)曲霉asAA)的核酸，且其含有位于真菌表達(dá)載體側(cè)翼的EcoRI位點(diǎn)，在所述的真菌表達(dá)載體中，a)cbhl啟動(dòng)子是里氏木霉的纖維二糖水解酶啟動(dòng)子；b)asaA是編碼SEQ ID NO.4的酸穩(wěn)定性α淀粉酶的河內(nèi)曲霉多核苷酸；c)cbhl終止子是里氏木霉的纖維二糖水解酶終止子；d)amdS是構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因；和e)attB是用于重組的Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)λ噬菌體位點(diǎn)。
0017圖5提供了pSL898_Muni質(zhì)粒圖(8951bp)(參見(jiàn)A)和pSL902質(zhì)粒(10782bp)(參見(jiàn)B)，它們被用來(lái)在黑曲霉宿主中表達(dá)編碼AsaA的核酸。
0018圖6的A和B提供了SDS-PAGE凝膠圖，其顯示了在如實(shí)施例5所述的里氏木霉克隆的代表性發(fā)酵過(guò)程中里氏木霉的asaA表達(dá)情況。在圖6A中，泳道1表示標(biāo)準(zhǔn)See Blue+2標(biāo)記物；泳道2表示80小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的AsaA；泳道3表示162小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的AsaA，泳道4表示162小時(shí)的里氏木霉宿主細(xì)胞對(duì)照，其中所述宿主細(xì)胞并未用asaA轉(zhuǎn)化。在大約90kDa清楚地觀察到AsaA蛋白帶，此條帶在宿主菌株對(duì)照中不存在。在圖6B中，泳道1表示210小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的完整AsaA，泳道2表示200小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的完整形式和截短形式的AsaA的三個(gè)條帶，泳道3表示分子量標(biāo)記對(duì)照。
0019圖7說(shuō)明了在里氏木霉宿主中天然的河內(nèi)曲霉(nAk-AsaA)和表達(dá)的河內(nèi)曲霉(rAk-AsaA)(SEQ ID NO3)的pH穩(wěn)定性，表示為％殘留活性，如實(shí)施例6所述。
發(fā)明詳述0020在一些方面，本發(fā)明依賴于在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法。下列資源包括了對(duì)本發(fā)明有用的一般方法學(xué)的描述Sambrook et al.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(2nd Ed.，1989)；Kreigler.GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)andAusubel etal.，Eds.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br> 0021除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。Singleton，et al.，DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale & Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般性釋義。
0022盡管任何與本文中所述的方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料都可以被應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)，但優(yōu)選的方法和材料被描述。
0023現(xiàn)在將使用以下定義和實(shí)例僅以作為參考的方式詳細(xì)描述本發(fā)明。本文中所引用的全部專利和出版物，包括在這些專利和出版物中所公開(kāi)的所有序列，被明確地并入本文作為參考。
0024數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字。
0025除非另作說(shuō)明，核酸是按5′至3′方向從左至右書(shū)寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書(shū)寫。
0026本文中提供的標(biāo)題并非是對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞降南薅ǎ景l(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方式可以通過(guò)參考整個(gè)說(shuō)明書(shū)來(lái)理解。
定義0027如本文所用，術(shù)語(yǔ)“淀粉”指植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何物質(zhì)，包括具有式(C6H10O5)X的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)字。具體而言，該術(shù)語(yǔ)指任何基于植物的物質(zhì)，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體而言，小麥、燕麥、玉米、黑麥、稻、高粱、糠、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯和木薯。
0028如本文所用，術(shù)語(yǔ)“顆粒淀粉”指生(未煮熟的)淀粉，例如尚未經(jīng)過(guò)糊化處理的淀粉。
0029如本文所用，術(shù)語(yǔ)“顆粒淀粉水解(GSH)酶”和“具有顆粒淀粉水解(GSH)活性”指具有水解顆粒形式的淀粉的能力的酶。
0030如本文所用，術(shù)語(yǔ)“α淀粉酶(例如E.C.類3.2.1.1)”指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述為在含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單位的多糖中完成1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的酶。另一個(gè)用于描述這些酶的術(shù)語(yǔ)是“糖原酶(glycogenase)”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
0031如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酸穩(wěn)定性α淀粉酶(″asAA″)”指在pH 3.0至7.0的pH范圍內(nèi)以及在pH 3.5至6.5的pH范圍內(nèi)具有活性的α淀粉酶。
0032如本文所用，術(shù)語(yǔ)“截短的”，諸如“截短的α淀粉酶”，指酶，其中至少一部分的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被去除，但功能性部分保留了生物學(xué)功能，諸如催化功能。
0033如本文所用，術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)”指優(yōu)先地結(jié)合于淀粉(多糖)底物的氨基酸序列。
0034如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接頭”指短的氨基酸序列，一般具有3至40個(gè)氨基酸殘基，其共價(jià)地將包含淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列連接于包含催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
0035如本文所用，術(shù)語(yǔ)“催化結(jié)構(gòu)域”指多肽的結(jié)構(gòu)區(qū)，其不同于SBD并含有用于底物水解的活性位點(diǎn)。
0036如本文所用，術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶”指淀粉葡萄糖苷酶類的酶(例如EC.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原性末端釋放出葡糖基殘基。該酶也水解α-1，6和α-1，3鍵，盡管水解速度大大慢于α-1，4鍵。
0037如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糖基化作用”指通過(guò)加入碳水化合物部分對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后修飾，其中所述碳水化合物是N-連接或O-連接的，由此形成糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分通過(guò)糖苷鍵被連接于天冬酰胺殘基的β-酰胺氮上。O-連接碳水化合物通過(guò)糖苷鍵經(jīng)絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基被連接于蛋白質(zhì)上。
0038如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過(guò)導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過(guò)改變天然核酸或蛋白而被修飾，或者所述細(xì)胞來(lái)自于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因，但這些基因異常表達(dá)、表達(dá)不足(under expressed)或者完全不表達(dá)。
0039如本文所用，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
0040如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”表示結(jié)合于蛋白質(zhì)N-末端部分的氨基酸序列，其促進(jìn)成熟形式的蛋白質(zhì)分泌至細(xì)胞外。信號(hào)序列的定義是一種功能性定義。成熟形式的胞外蛋白缺少信號(hào)序列，其在分泌過(guò)程中被切除。
0041如本文所用，術(shù)語(yǔ)“天然的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(n-asAA)”指由asAA的內(nèi)源性表達(dá)而產(chǎn)生的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。例如，術(shù)語(yǔ)“n-asaA”表示來(lái)自河內(nèi)曲霉的內(nèi)源性表達(dá)的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(例如SEQ ID NO3)。
0042如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(r-asAA)”、“重組表達(dá)的asAA”和“重組生產(chǎn)的asAA”指由宿主細(xì)胞表達(dá)異源多核苷酸而產(chǎn)生的成熟asAA蛋白序列。例如，術(shù)語(yǔ)“r-asaA”表示在宿主中表達(dá)并產(chǎn)生的河內(nèi)曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(例如SEQ ID NO3)，在所述宿主中已導(dǎo)入編碼asaA的多核苷酸。
0043如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
0044如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。
0045術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。
0046如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指被設(shè)計(jì)用來(lái)將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
0047如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱地連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上的合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。
0048如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者組成型啟動(dòng)子。
0049如本文所用，短語(yǔ)“在轉(zhuǎn)錄控制下”是指多核苷酸序列——通常是DNA序列——的轉(zhuǎn)錄決定于其被可操縱地連接于一種元件，該元件有助于啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。
0050如本文所用，短語(yǔ)“在翻譯控制下”是本領(lǐng)域所熟知的術(shù)語(yǔ)，其是指在mRNA形成之后發(fā)生的調(diào)控過(guò)程。
0051如本文所用，當(dāng)描述蛋白或編碼它們的基因時(shí)，用于該基因的術(shù)語(yǔ)一般用斜體表示(例如，編碼asaA(河內(nèi)曲霉asAA)的基因可以被表示為asaA)。用于蛋白的術(shù)語(yǔ)一般不用斜體表示，且首字母一般大寫(例如，由asaA基因編碼的蛋白可以表示為AsaA或者asaA)。
0052如本文所用，術(shù)語(yǔ)“來(lái)源(derived)”涵蓋了術(shù)語(yǔ)“源自(originated from)”、“獲得(obtained)”或“可獲得自(obtainable from)”以及“分離自(isolated from)”，且如本文所用，其表示由核苷酸序列編碼的多肽由天然存在該核苷酸的細(xì)胞或者已被插入該核苷酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生。
0053如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接(operably linked)”指并列關(guān)系，其中元件以允許它們?cè)诠δ苌舷嗷リP(guān)聯(lián)的方式排布。例如，如果啟動(dòng)子控制某序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子被可操縱地連接于該編碼序列。
0054如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記(selective marker)”指能夠在宿主中表達(dá)的基因，其使得能夠方便地選擇那些含導(dǎo)入的核酸或載體的宿主。
0055與另一序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，當(dāng)被聯(lián)配時(shí)，在比較這兩個(gè)序列時(shí)所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。所述聯(lián)配以及同源性或同一性百分比可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的軟件程序確定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY (F.M.Ausubel et al.(eds)1987，增刊30，7.7.18節(jié))中描述的那些軟件程序。優(yōu)選的程序包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson et al.(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 852444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul et al.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，MD，and Altschul et al.，(1997)NAR 253389-3402)。另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)配程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，PA)，優(yōu)選地使用默認(rèn)參數(shù)。另一個(gè)有用的序列軟件程序是TFASTA數(shù)據(jù)檢索程序，其可在序列軟件套裝版6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，W1)中獲得。由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以可以使用一種以上的密碼子來(lái)編碼特定的氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
0056本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明所包含的序列也通過(guò)在嚴(yán)緊雜交條件下與示例性asaA序列(例如SEQ ID NO1)進(jìn)行雜交的能力來(lái)定義。當(dāng)單鏈形式的核酸可以與另一核酸在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下進(jìn)行退火時(shí)，該核酸可與該另一核酸序列雜交。雜交和洗滌條件是本領(lǐng)域所熟知的(參見(jiàn)例如Sambrook(1989)見(jiàn)上，具體地第9章和第11章)。在一些實(shí)施方式中，嚴(yán)緊條件對(duì)應(yīng)于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。
0057如本文所用，“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼α淀粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)宿主細(xì)胞或宿主菌株指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體。
0058術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌”指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見(jiàn)Alexopoulos，C.J.(1962).INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York and AINSWORTH ANDBISBY DICTIONARY OF THE FUNGI，9thEd.(2001)Kirk et al.，Eds.，CABInternational University Press，Cambridge UK)。這些真菌的特征是帶有由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲的延伸來(lái)完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以是，但不限于，木霉(例如里氏木霉(以前被分類為長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)，目前也被稱為Hypocrea jecorina)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum))、青霉屬某種(Penicillium sp.)、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea))；Chrysosporiumsp.(例如C.lucknowense)、粘帚霉屬某種(Gliocladium sp.)、曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、河內(nèi)曲霉(A.kawachi)、泡盛曲霉(A.awamori))、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurosporasp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細(xì)胞(也參見(jiàn)Innis等，(1985)Sci.22821-26)。
0059如本文所用，術(shù)語(yǔ)“木霉”或“木霉屬某種”指以前或目前被分類為木霉屬的任何真菌屬。
0060如本文所用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”指使一群微生物細(xì)胞在適當(dāng)條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)指將淀粉底物諸如包含顆粒淀粉的底物發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物(一般在容器和反應(yīng)器中)。發(fā)酵是通過(guò)微生物將有機(jī)物質(zhì)酶促厭氧降解以產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。當(dāng)發(fā)酵在厭氧條件下進(jìn)行時(shí)，并不意味著將該術(shù)語(yǔ)唯一地限定在嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵也在存在氧的條件下進(jìn)行。
0061如本文所用，短語(yǔ)“同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification andfermentation)(SSF)”指在生產(chǎn)終產(chǎn)物中的一種工藝，其中微生物諸如產(chǎn)乙醇的微生物和至少一種酶諸如α淀粉酶存在于同一加工步驟中。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，SSF指在同一反應(yīng)容器中同時(shí)將顆粒淀粉底物水解為包括葡萄糖在內(nèi)的糖并將糖發(fā)酵成為醇。
0062如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接觸”指將各酶(一種或多種)放置于足夠地接近各底物以使所述酶(一種或多種)能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)變成為終產(chǎn)物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，酶與各底物的混合溶液可以實(shí)現(xiàn)接觸。
0063如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酶促轉(zhuǎn)化”一般指通過(guò)酶作用對(duì)底物進(jìn)行修飾。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)也指通過(guò)酶的作用對(duì)顆粒淀粉底物進(jìn)行的修飾。
0064如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糖化”指將淀粉酶促轉(zhuǎn)化成為葡萄糖。
0065如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糊化”表示通過(guò)蒸煮將淀粉分子溶解以形成粘性懸浮液。
0066如本文所用，術(shù)語(yǔ)“糊化溫度”指淀粉開(kāi)始糊化時(shí)的溫度。精確的糊化溫度決定于具體的淀粉并且可能根據(jù)多種因素諸如植物種類以及環(huán)境和生長(zhǎng)條件而有所變化。
0067如本文所用，短語(yǔ)“低于糊化溫度”指低于糊化開(kāi)始發(fā)生時(shí)的溫度的溫度。
0068如本文所用，術(shù)語(yǔ)“液化”指淀粉轉(zhuǎn)化中的某階段，其間糊化的淀粉被水解，從而得到低分子量的可溶性糊精。
0069如本文所用，術(shù)語(yǔ)“聚合度(DP)”指在給定的糖中無(wú)水吡喃型葡萄糖單元的數(shù)目(n)。DP1的實(shí)例為單糖，諸如葡萄糖和果糖。DP2的實(shí)例為二糖，諸如麥芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。
0070如本文所用，術(shù)語(yǔ)“終產(chǎn)物”或“所需的終產(chǎn)物”指任何碳源來(lái)源的分子產(chǎn)物，其是由淀粉底物諸如包含顆粒淀粉的淀粉底物的酶促轉(zhuǎn)化而來(lái)的。
0071如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干固體含量(dry solids content(ds))”指基于干重計(jì)算的以％表示的漿液總固體。
0072如本文所用，術(shù)語(yǔ)“漿液”指含不溶性固體的含水混合物。
0073如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可溶性淀粉水解產(chǎn)物”指由淀粉水解產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物，其可以包含單糖、二糖和寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和更高級(jí)的糖)。
0074如本文所用，術(shù)語(yǔ)“殘留淀粉”指在含淀粉的底物發(fā)酵后組合物中所剩下的殘留淀粉(可溶的或不可溶的)。
0075如本文所用，術(shù)語(yǔ)“蒸餾器干谷物(distillers dried grain，DDG)”和“含可溶物的蒸餾器干谷物(distillers dried grain with solubles，DDGS)”指谷物發(fā)酵中有用的副產(chǎn)物(co-products)。
0076如本文所用，術(shù)語(yǔ)“醪(mash)”指用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物例如酒精的可發(fā)酵碳源(碳水化合物)的水混合物。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“啤酒”、“醪”和“發(fā)酵肉湯”可以被互換使用。
0077如本文所用，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenic microorganism)”指具有將糖或寡糖轉(zhuǎn)變成乙醇的能力的微生物。產(chǎn)乙醇微生物依靠其表達(dá)一種或多種單獨(dú)或一起將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的酶的能力來(lái)產(chǎn)乙醇。
0078如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乙醇生產(chǎn)者”或“產(chǎn)乙醇微生物”指能夠由己糖或戊糖生產(chǎn)乙醇的任何生物或細(xì)胞。一般而言，產(chǎn)乙醇細(xì)胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產(chǎn)乙醇微生物的實(shí)例包括真菌微生物諸如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母(S.cerevisiae)。
0079如本文所用，有關(guān)多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“異源”指在宿主細(xì)胞中并非天然存在的多核苷酸或蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包含由天然發(fā)生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。
0080如本文所用，有關(guān)多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源”指在宿主細(xì)胞中天然存在的多核苷酸或蛋白質(zhì)。
0081如本文所用，術(shù)語(yǔ)“回收的(recovered)”、“分離的(isolated)”和“分離的(separated)”如本文所用，指化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸，它們是從與之天然相關(guān)的至少一種組分中移出的。
0082如本文所用，有關(guān)細(xì)胞所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”表示該細(xì)胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因組或者作為被保持多代的附加體質(zhì)粒。
0083如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指根據(jù)基因的核苷酸序列而產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。
0084如本文所用，術(shù)語(yǔ)“過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的菌株”指絲狀真菌宿主細(xì)胞，其表達(dá)并生產(chǎn)葡糖淀粉酶并且進(jìn)一步從該細(xì)胞中分泌該葡糖淀粉酶，以致所分泌的葡糖淀粉酶占所分泌的蛋白的總量的至少40％。
0085在關(guān)于將核酸序列中插入細(xì)胞中的上下文中，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”表示“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括表示將核酸序列整合入真核或原核細(xì)胞，其中該核酸序列可以被整合入該細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)變成自發(fā)復(fù)制子或者被瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
0086如本文所用，術(shù)語(yǔ)“比活”表示酶單位，其被定義為在特定條件下通過(guò)酶制劑每單位時(shí)間轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的摩爾數(shù)。比活被表示為單位(U)/mg蛋白。
0087如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酶單位(enzyme unit)”指在試驗(yàn)條件下每給定的時(shí)間量?jī)?nèi)產(chǎn)生給定量的產(chǎn)物的酶量。在一些實(shí)施方式中，酶單位指在特定試驗(yàn)條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物的酶量。例如，在一種實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶活性單位”(GAU)被定義為在60℃和pH 4.2的試驗(yàn)條件下每小時(shí)由可溶性淀粉底物(4％ds)產(chǎn)生1g葡萄糖所需的酶量。
0088在另一實(shí)施方式中，顆粒淀粉水解酶單位(GSHE U)被定義為在試驗(yàn)條件下，例如在25℃和pH 5.0，每分鐘由顆粒淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，GSHE U被定義為在50℃和pH 4.5下每分鐘由顆粒淀粉底物產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE量。
0089如本文所用，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量(yield)”指使用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的終產(chǎn)物或所需終產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)量高于使用本領(lǐng)域已知的方法所生產(chǎn)的量。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)指終產(chǎn)物的體積，而在其它實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)指終產(chǎn)物的濃度。
0090“ATCC”指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，位于Manassas，VA 20108 (ATCC；<www.atcc.org>)。
0091“NRRL”指the Agricultural Research Service Culture Collection，NationalCenter for Agricultural Utilization Research(以前被稱為USDA Northern RegionalResearch Laboratory，Peoria，ILL)。
0092除非上下文中另作清楚地說(shuō)明，“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“該(the)”均包含表示復(fù)數(shù)。如本文所用，當(dāng)短語(yǔ)“至少”與一系列數(shù)值和術(shù)語(yǔ)組合使用時(shí)，其意味著可應(yīng)用該系列中的每一數(shù)值和術(shù)語(yǔ)。例如，短語(yǔ)“至少85％、90％、95％和99％的序列同一性”被用來(lái)表示至少85％、至少90％、至少95％和/或至少99％的序列同一性。
0093如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”和它的同源詞被使用時(shí)具有包含它們?cè)趦?nèi)的含義；即，相當(dāng)于術(shù)語(yǔ)“包括(including)”和它相應(yīng)的同源詞。
α淀粉酶0094在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，α淀粉酶，諸如具有GSH活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，是從曲霉屬菌株，例如米曲霉、河內(nèi)曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉中獲得的。在某些實(shí)施方式中，α淀粉酶是從河內(nèi)曲霉菌株獲得的酸穩(wěn)定性α淀粉酶。
0095在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶(例如具有GSH活性的asAA)包括與SEQ IDNO3中所闡明的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，asAA包括與SEQID NO3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，asAA包括與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。asAA也可以包括與SEQ ID NO3具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，asAA包括SEQ ID NO3的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO3或者與其具有至少85％同一性的序列被認(rèn)為是完整的asAA。更一般地，完整的α淀粉酶是包括催化結(jié)構(gòu)域、接頭區(qū)和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的α淀粉酶。
0096在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶將包括與SEQ ID NO9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，α淀粉酶將包括與SEQID NO10的SBD具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的SBD。
0097在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，α淀粉酶將包括與SEQ ID NO9至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQ ID NO8至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQ ID NO10至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在某些實(shí)施方式中，催化結(jié)構(gòu)域和SBD是從河內(nèi)曲霉菌株的α淀粉酶獲得的。
0098在其它實(shí)施方式中，α淀粉酶是截短的酶。在一些實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶將包括SEQ ID NO3氨基酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％，在其它實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶將包括與SEQ ID NO3具有至少90％、95％、98％和99％序列同一性的序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％。該酶可以在多肽的羧基末端被截短。在一些實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶包括SEQ ID NO3或者與其具有至少90％序列同一性的序列的至少430、440、450、460和470個(gè)氨基酸。
0099在一些實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶將包括SEQ ID NO9的催化結(jié)構(gòu)域或者與其具有至少97％、98％和99％序列同一性的序列的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％。
0100在一些實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶將包括SEQ ID NO9或者與其具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的序列的催化結(jié)構(gòu)域以及與SEQ ID NO8具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的接頭。在一些實(shí)施方式中，截短的酶將包括與SEQ ID NO9具有至少97％序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域和與SEQ ID NO8具有至少95％序列同一性的接頭。在一些實(shí)施方式中，截短的酶將包括與SEQ ID NO9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域和位于該催化結(jié)構(gòu)域下游的至少大約5、10、20、25、30和35個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方式中，截短的酶將包括如上所定義的催化結(jié)構(gòu)域和接頭，并進(jìn)一步包括與SEQ ID NO10的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的部分SBD。該部分SBD將包括位于接頭下游的至少大約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100個(gè)氨基酸。
0101在其它實(shí)施方式中，包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或者與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的asAA是由與SEQ ID NO1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸編碼。在一種實(shí)施方式中，編碼SEQ ID NO3(AsaA)的asAA的核酸序列是SEQ ID NO1的核酸序列。
重組表達(dá)的酶和宿主細(xì)胞0102在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物被遺傳改造以表達(dá)異源α淀粉酶，諸如與SEQ ID NO3具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的α淀粉酶(例如具有GSH活性的asAA)。微生物也可以被改造以表達(dá)異源葡糖淀粉酶。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主是曲霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬某種的菌株。
0103一些優(yōu)選的真菌宿主細(xì)胞包括構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、綠色木霉、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐鐮刀菌(F.solani)。曲霉菌株在Ward等，(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuur等，(2002)Curr Gene 4189-98中公開(kāi)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主是木霉菌株，特別是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限制性實(shí)例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生株。RL-P37在Sheir-Neiss等，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 2046-53中公開(kāi)。
0104在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主是曲霉菌株。有用的曲霉宿主菌株包括但不限于構(gòu)巢曲霉(Yelton等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Mullaney等，(1985)MoI.Gen.Genet.19937-45和Johnston等，(1985)EMBO J.41307-1311)；黑曲霉(Kelly等，(1985)EMBO J.4475-479)、泡盛曲霉(NRRL 3112、UVK143f(美國(guó)專利號(hào)5,364,770)、ATCC No.22342、ATCC No.44733、ATCC No.14331和ATCC No.11490)和米曲霉(ATCC No.11490)以及它們的衍生株。在一些實(shí)施方式中，曲霉菌株是pyrG突變株并因而需要尿苷用于生長(zhǎng)。一些實(shí)施方式中，曲霉宿主菌株表達(dá)并產(chǎn)生內(nèi)源性α淀粉酶。一些實(shí)施方式中，曲霉宿主菌株是正常表達(dá)并產(chǎn)生內(nèi)源性葡糖淀粉酶的菌株。
0105術(shù)語(yǔ)共表達(dá)指表達(dá)已導(dǎo)入宿主細(xì)胞的多核苷酸，該多核苷酸編碼與SEQ IDNO3具有至少80％序列同一性的α淀粉酶，其中該宿主細(xì)胞或菌株也表達(dá)并產(chǎn)生葡糖淀粉酶，諸如內(nèi)源性葡糖淀粉酶。
0106在一些實(shí)施方式中，曲霉菌株包含野生型葡糖淀粉酶，盡管該菌株可能已被遺傳改造。大量的曲霉菌株表達(dá)并產(chǎn)生葡糖淀粉酶。具體而言，編碼葡糖淀粉酶的基因在許多黑曲霉和泡盛曲霉的菌株中高度表達(dá)。葡糖淀粉酶是分泌性酶，因此成熟形式的葡糖淀粉酶被釋放到外部培養(yǎng)基中。已經(jīng)在培養(yǎng)基中鑒別出兩種形式的成熟葡糖淀粉酶。這些包括包含616個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)形式的葡糖淀粉酶GAI和包含512個(gè)氨基酸的天然蛋白裂解片段GAII。GAII缺少淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。詳見(jiàn)Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381和WO 00/04136，它們?cè)诖吮粚ｉT并入本文作為參考。WO 05/045018的SEQ ID NO24以及USP 6,352,851的SEQ ID NO2和SEQ ID NO13也作為參考，它們?cè)诖吮徊⑷氡疚淖鳛閰⒖?。葡糖淀粉酶結(jié)構(gòu)的詳情已在Libby等，(1994)Protein Engineering 71109-114中進(jìn)行了綜述。
0107在一些實(shí)施方式中，木霉宿主細(xì)胞或曲霉宿主細(xì)胞被遺傳改造以表達(dá)一種具有GSH活性的asAA，其特征是與SEQ ID NO3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQ ID NO9至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQ ID NO8至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQ ID NO10至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在某些實(shí)施方式中，asAA是從河內(nèi)曲霉菌株的α淀粉酶獲得。
0108在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO3多肽、SEQ ID NO9多肽或者如本文所定義的截短的酶的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，編碼asAA的多核苷酸將具有SEQ ID NO1的核酸序列或者與SEQ ID NO1具有至少70％序列同一性的核酸序列。
0109在一些實(shí)施方式中，由經(jīng)過(guò)改造而包含編碼asAA的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的α淀粉酶，相比于通過(guò)在天然宿主中內(nèi)源性表達(dá)asAA而產(chǎn)生的asAA，將具有不同的特性，例如改進(jìn)的特性。這些特性可以包括例如，提高的酶活性、在較低pH水平下的提高的酶穩(wěn)定性或者提高的比活。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的異源產(chǎn)生的asAA可以在3.0至6.0的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大pH活性；還可在3.0至5.0的pH范圍內(nèi)；在3.5至5.0的pH范圍內(nèi)以及還可在3.5至4.5的pH范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方式中，異源產(chǎn)生的asAA，相比于在基本相同的條件下由天然宿主內(nèi)源產(chǎn)生的相應(yīng)asAA，可以在3.0、3.5、4.0、4.5和/或5.0的pH水平具有更大的穩(wěn)定性或殘留活性。在一些實(shí)施方式中，相對(duì)于在特定pH水平的內(nèi)源表達(dá)的asAA，異源產(chǎn)生的asAA的酶穩(wěn)定性水平在相同的pH水平下將是至少0.5、1.0、2.0或2.5倍。在一些實(shí)施方式中，異源表達(dá)的asAA的這些改進(jìn)的或者不同的特性在木霉宿主細(xì)胞中尤為明顯。在一些實(shí)施方式中，異源表達(dá)的asAA將以具有GSH活性的完整asAA的形式被產(chǎn)生，其包括催化結(jié)構(gòu)域、接頭和SBD，例如在圖2中說(shuō)明的成熟多肽(SEQ ID NO3)。在其它實(shí)施方式中，異源表達(dá)的asAA將以截短的asAA的形式被產(chǎn)生，例如，其中SBD從催化結(jié)構(gòu)域部分地或者完全地切除。
0110在其它實(shí)施方式中，經(jīng)遺傳改造以表達(dá)asAA的宿主菌株也可以被遺傳改造為表達(dá)異源葡糖淀粉酶。
0111在本發(fā)明中有用的宿主菌株可以是以前已經(jīng)通過(guò)遺傳工程被操作過(guò)的。在一些實(shí)施中，遺傳改造的宿主細(xì)胞或菌株可以是蛋白酶缺陷型菌株。在其它實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞的各種天然基因的表達(dá)將是已被削弱或失活的。這些基因包括，例如編碼蛋白酶和纖維素水解酶諸如內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)的基因。USP 5,650,322公開(kāi)了cbh1基因和cbh2基因缺失的RL-P37衍生菌株。也參考USP 5,472,864和WO 05001036。
載體0112當(dāng)下面的描述特別提及α淀粉酶諸如asAA時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，相同或相似的方法適用于可用于將編碼GA的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建物和載體。
0113根據(jù)本發(fā)明，包含編碼本發(fā)明所包括的asAA的核酸的DNA構(gòu)建物被構(gòu)建以便將asAA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)表達(dá)載體將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包括可操縱地連接于asAA編碼序列的調(diào)控序列。
0114載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并被復(fù)制的任何載體。參考Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，<www.fgsc.net>)的載體列表。合適的表達(dá)和/或整合載體的其它實(shí)例在Sambrook等，(1989)supra、Ausubel(1987)supra、van den Hondel等，(1991)Bennett and Lasure(Eds.)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press pp.396-428和美國(guó)專利號(hào)5,874,276中提供。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。
0115在一些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明所包括的asAA的核酸被可操縱地連接于合適的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在真菌宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性。該啟動(dòng)子可以來(lái)源于編碼與宿主細(xì)胞同源或者異源的蛋白的基因。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是在木霉宿主或曲霉宿主中有用的。啟動(dòng)子的合適的非限制性實(shí)例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一種實(shí)施方式中，啟動(dòng)子對(duì)宿主細(xì)胞而言是天然啟動(dòng)子。例如，當(dāng)里氏木霉為宿主時(shí)，啟動(dòng)子是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是里氏木霉cbh1，其為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并已以登記號(hào)D86235存儲(chǔ)于GenBank中?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”是在環(huán)境調(diào)控或發(fā)育調(diào)控下具有活性的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，啟動(dòng)子對(duì)真菌宿主細(xì)胞而言是異源的啟動(dòng)子。
0116有用的啟動(dòng)子的其它實(shí)例是那些來(lái)源于編碼泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunberg等，(1984)Mol.Cell Biol.42306-2315、USP 5,364,770、USP6,590,078(例如實(shí)施例3)；Gwynne D等，(1987)BioTechnol.5713-710和Boel等，(1984)EMBO J.31581-1585)、黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、里氏木霉纖維素二糖水解酶1(EPA 137280A1)、米黑根霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶和黑曲霉中性α淀粉酶基因的啟動(dòng)子。
0117在一些實(shí)施方式中，asAA編碼序列可操縱地連接于信號(hào)序列。編碼信號(hào)序列的DNA優(yōu)選地與將被表達(dá)的asAA基因天然相關(guān)。優(yōu)選地，信號(hào)序列由編碼Ak-asaA的河內(nèi)曲霉asaA基因編碼。更優(yōu)選地，該信號(hào)序列與SEQ ID NO2的信號(hào)序列具有至少90％、95％、97％和99％序列同一性。在其它實(shí)施方式中，信號(hào)序列和包括在將被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建物或載體中的啟動(dòng)子是來(lái)自于相同來(lái)源。例如，在一些實(shí)施方式中，信號(hào)序列是cdh1信號(hào)序列，其被可操縱地連接于cdh1啟動(dòng)子。
0118在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體也包括終止序列。在一種實(shí)施方式中，終止序列和啟動(dòng)子序列來(lái)自于相同來(lái)源。在另一實(shí)施方式中，終止序列對(duì)于宿主細(xì)胞而言是同源的。特別合適的終止子序列是來(lái)源于木霉菌株，尤其是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌終止子包括來(lái)自黑曲霉、塔賓曲霉(A.tubingensis)或者泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nunberg等，(1984)supra和Boel等，(1984)supra)。
0119在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于賦予抗微生物劑耐性的標(biāo)記(例如潮霉素、博來(lái)霉素、氯霉素和腐草霉素)。賦予代謝優(yōu)勢(shì)的基因，諸如營(yíng)養(yǎng)選擇性標(biāo)記，也可用于本發(fā)明，包括本領(lǐng)域已知的那些標(biāo)記如amdS、argB和pyr4。在用于轉(zhuǎn)化木霉的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Finkelstein，第6章，BIOTECHNOLOGY OFFILAMENTOUS FUNGI、Finkelstein等Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；和Kinghorn等，(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London)。在某些實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)記是amdS基因，其編碼乙酰胺酶，使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠以乙酰胺為氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇性標(biāo)記的應(yīng)用在Kelley等，(1985)EMBO J.4475-479和Penttila等，(1987)Gene 61155-164中被描述。在一些實(shí)施方式中，載體將包括黑曲霉pyrG基因作為選擇性標(biāo)記，用pyrG標(biāo)記轉(zhuǎn)化后的曲霉菌株將是pyrG突變型菌株。
0120包含帶有編碼α淀粉酶的多核苷酸的DNA構(gòu)建物的表達(dá)載體可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自我復(fù)制或整合進(jìn)宿主DNA中的任何載體。在一些實(shí)施方式中，該表達(dá)載體是質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，考慮了兩種類型的用于獲得基因的表達(dá)的表達(dá)載體。
0121第一種表達(dá)載體包括DNA序列，其中啟動(dòng)子、asAA編碼區(qū)和終止子均來(lái)源于將被表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方式中，基因截短是通過(guò)刪除不需要的DNA序列(例如編碼不想要的結(jié)構(gòu)域的DNA)以留下將在其自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的控制下進(jìn)行表達(dá)的結(jié)構(gòu)域而獲得的。第二種表達(dá)載體是預(yù)組裝的并且包含高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和選擇性標(biāo)記。
0122在一些實(shí)施方式中，asAA基因或者其中一部分的編碼區(qū)被插入這種通用型表達(dá)載體，這樣，它就處于該表達(dá)構(gòu)建物啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。在一些實(shí)施方式中，基因或其中的一部分被插入cbh1強(qiáng)啟動(dòng)子的下游。
0123用于將包含編碼asAA的多核苷酸、啟動(dòng)子、終止子和其它序列的DNA構(gòu)建物連接并將它們插入合適載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。連接一般是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)來(lái)完成的。如果此類位點(diǎn)不存在，則可以根據(jù)常規(guī)的實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭。(參見(jiàn)Sambrook(1989)supra和Bennett and Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp70-76)。此外，可以使用已知的重組技術(shù)構(gòu)建載體(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。
0124在期望獲得含有一個(gè)或多個(gè)失活基因的真菌宿主細(xì)胞的情況下，可以使用已知的方法(例如在美國(guó)專利號(hào)5,246,853、美國(guó)專利號(hào)5,475,101和WO92/06209中公開(kāi)的方法)?；蚴Щ羁梢酝ㄟ^(guò)完全或部分缺失、通過(guò)插入失活或者通過(guò)為預(yù)期目標(biāo)而使基因非功能化(如此防止該基因表達(dá)功能性蛋白)的任何其它手段來(lái)完成。已被克隆的木霉屬某種或其它絲狀真菌宿主諸如曲霉宿主的任何基因均可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實(shí)施方式中，基因缺失可以通過(guò)將將被失活的某形式的期望基因用本領(lǐng)域已知的方法插入質(zhì)粒來(lái)完成。然后將此缺失質(zhì)粒在適當(dāng)?shù)南拗菩悦肝稽c(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))切開(kāi)，所述限制性酶位點(diǎn)位于期望的基因編碼區(qū)的內(nèi)部，并將此基因編碼序列或其中一部分用選擇性標(biāo)記替換。將被缺失的基因的位置的側(cè)翼DNA序列(優(yōu)選地大約0.5至2.0kb)保留在標(biāo)記基因的兩側(cè)。合適的缺失質(zhì)粒一般在其中將具有獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)以使得含缺失基因的片段，包括側(cè)翼DNA序列和選擇性標(biāo)記，能夠以單個(gè)線性片段的形式被去除。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和培養(yǎng)0125將DNA構(gòu)建物或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞包括各種技術(shù)諸如轉(zhuǎn)化；電穿孔；核微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如脂轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鈣溫育沉淀DNA；用DNA包被的微射彈進(jìn)行高速轟擊；和原生質(zhì)體融合。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Ausubel等，(1987)，supra，第9章和Sambrook(1989)supra以及Campbell等，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在木霉中異源蛋白的表達(dá)在美國(guó)專利6,022,725；美國(guó)專利號(hào)6,268,328；Harkki等，(1991)；Enzyme Microb.Technol.13227-233；Harkki等，(1989)Bio Technol.7596-603；歐洲專利244,234；歐洲專利215,594和Nevalainen等，“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes”，MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leong andBerka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148中被描述。對(duì)于轉(zhuǎn)化曲霉菌株，也參考Cao等，(2000)Sci.9991-1001、歐洲專利238023和Yelton等，(1984)Proceedings.Natl.A cad.Sci.USA 811470-1474。
0126優(yōu)選地，遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子用載體系統(tǒng)構(gòu)建，由此編碼α淀粉酶(例如，與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的asAA)的核酸被穩(wěn)定整合進(jìn)宿主菌株染色體中。然后可以通過(guò)已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化子。
0127在一種非限制性實(shí)例中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子通過(guò)其在含乙酰胺的固體培養(yǎng)基上更快的生長(zhǎng)速度以及形成光滑的而非邊緣粗糙的圓形克隆而與非穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子相區(qū)別。此外，在一些情況下，進(jìn)一步的穩(wěn)定性測(cè)試可以通過(guò)使轉(zhuǎn)化子在固體的非選擇性培養(yǎng)基(即，缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，從該培養(yǎng)基收獲孢子，以及確定隨后發(fā)芽并在含乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的這些孢子的百分比來(lái)進(jìn)行。可選地，本領(lǐng)域已知的其它方法可以被用于選擇轉(zhuǎn)化子。
0128在一種實(shí)施方式中，用于轉(zhuǎn)化的木霉屬某種或曲霉屬某種的制備包括來(lái)自真菌菌絲體的原生質(zhì)體的制備。(參見(jiàn)Campbell等(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實(shí)施方式中，菌絲體是從萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)孢子獲得的。將菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理，產(chǎn)生原生質(zhì)體。然后通過(guò)懸浮培養(yǎng)基中存在的滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體加以保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在大約0.8M至大約1.2M之間變化。在一些實(shí)施方式中，可以優(yōu)選使用山梨醇，在其它實(shí)施方式中，可以優(yōu)選使用硫酸鎂(例如在懸浮培養(yǎng)基中大約1.2M的山梨醇溶液或者在懸浮培養(yǎng)基中大約0.8M的硫酸鎂溶液)。
0129宿主菌株對(duì)DNA的攝入可以由鈣離子濃度決定。一般而言，大約10mMCaCl2至50mM CaCl2可以被用在攝取溶液中。在攝取溶液中除了對(duì)鈣離子的需求，一般被包括的其它化合物是緩沖體系諸如TE緩沖液(10Mm Tris，pH 7.4；1mMEDTA)或10mM MOPS，pH 6.0緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。
0130通常在轉(zhuǎn)化中使用含有宿主細(xì)胞或原生質(zhì)體諸如木霉屬某種或曲霉屬某種的原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，所述原生質(zhì)體或細(xì)胞已經(jīng)以約105至約107個(gè)/mL，優(yōu)選地大約2×106個(gè)/mL，以及大約1×107的密度經(jīng)過(guò)滲透性處理。在一些實(shí)施方式中，將大約100μL體積的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞的適當(dāng)溶液(例如1.2M山梨醇；50mM CaCl2)與期望的DNA混合。在一些實(shí)施方式中，將高濃度的PEG加入攝取溶液中。可以向原生質(zhì)體懸浮液中加入0.1至1體積的25％PEG 4000。然而，優(yōu)選地向原生質(zhì)體懸浮液中加入大約0.25體積。添加劑諸如二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到攝取溶液中并幫助轉(zhuǎn)化。類似的方法可用于其它真菌宿主細(xì)胞。(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6,022,725和6,268,328，兩者被并入本文作為參考)。
0131一般地，然后將混合物在大約0℃溫育10至30分鐘。向混合物中加入額外的PEG以進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)所需基因或DNA序列的攝取。在一些實(shí)施方式中，加入轉(zhuǎn)化混合物體積的5至15倍體積的25％PEG 4000；但是，更多或更少的體積都可能是合適的。25％PEG 4000優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約10倍。加入PEG后，可以將轉(zhuǎn)化混合物在室溫或者在冰上溫育，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加入到熔化的小量等份生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括生長(zhǎng)選擇條件(例如乙酰胺或抗生素)時(shí)，其僅允許轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)。
0132一般而言，細(xì)胞被培養(yǎng)在含生理鹽和營(yíng)養(yǎng)劑的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中(參見(jiàn)，例如，Pourquie，J.等，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.等，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen，M.等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。普通的商業(yè)配制培養(yǎng)基(例如Yeast Malt Extract(YM)肉湯、Luria Bertani(LB)肉湯和Sabouraud Dextrose(SD)肉湯)也可以用于本發(fā)明。
0133培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的(例如將培養(yǎng)物在搖床培養(yǎng)器或發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中大約28℃下溫育直至達(dá)到所需的asAA表達(dá)水平)。給定的絲狀真菌的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的并且可以在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從該真菌的來(lái)源諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌遺傳學(xué)保存中心(FungalGenetics Stock Center)找到。
0134在建立了真菌生長(zhǎng)之后，將細(xì)胞暴露于可有效引起或者允許表達(dá)和分泌α淀粉酶以及如本文所定義的α淀粉酶(例如asAA)和葡糖淀粉酶的條件下。當(dāng)具有GSH活性的asAA的編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下時(shí)，向培養(yǎng)基中加入有效濃度的誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以誘導(dǎo)asAA表達(dá)。
酶活性的鑒定0135為了評(píng)價(jià)α淀粉酶(例如具有GSH活性的asAA)的表達(dá)，可以在蛋白水平、RNA水平或通過(guò)使用特別地針對(duì)α淀粉酶活性和/或產(chǎn)生的功能性生物分析進(jìn)行分析，所述α淀粉酶是由用編碼本發(fā)明所包括的α淀粉酶的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系表達(dá)的。一般而言，所應(yīng)用的分析包括Northern印跡、斑點(diǎn)印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，或使用適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)進(jìn)行的原位雜交以及常規(guī)的Southern印跡和放射自顯影。
0136此外，本發(fā)明所包括的酶的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以在樣品中直接測(cè)量，例如，通過(guò)直接測(cè)量培養(yǎng)基中的還原糖諸如葡萄糖的試驗(yàn)，以及通過(guò)測(cè)量葡糖淀粉酶的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生的試驗(yàn)。對(duì)分析GSH活性有用的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過(guò)任何簡(jiǎn)便的方法諸如通過(guò)使用葡萄糖試劑盒No 15-UV(Sigma Chemical Co.)或儀器諸如Technicon Autoanalyzer來(lái)確定。也參考葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒，它們可從Instrumentation Lab.(Lexington，MA)商業(yè)獲得。
0137此外，基因表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗(yàn)，例如通過(guò)Western印跡或ELISA來(lái)評(píng)估。這樣的免疫試驗(yàn)可以用于定性地和定量地評(píng)價(jià)asaA的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于實(shí)施此類方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。
0138α淀粉酶活性可以例如，通過(guò)使用在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所述的DNS法來(lái)測(cè)量。葡糖淀粉酶活性可以例如通過(guò)3，5-二硝基唾液酸(DNS)法來(lái)分析(參見(jiàn)Goto等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)。
0139在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，由木霉或曲霉宿主產(chǎn)生的asAA(例如，與SEQ ID NO3具有至少80％序列同一性的α淀粉酶)將是每升培養(yǎng)基1克以上的蛋白(g/L)、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，以及100g/L培養(yǎng)基以上。
0140在一些實(shí)施方式中，分泌的葡糖淀粉酶的量將是宿主菌株的總的分泌蛋白的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％和95％。在其它實(shí)施方式中，分泌的葡糖淀粉酶的量將是總的分泌蛋白的50％以上。在一些實(shí)施方式中，分泌的葡糖淀粉酶的量將是總的分泌蛋白的50％以下。在一些實(shí)施方式中，分泌的葡糖淀粉酶的量將大于由曲霉菌株分泌的asAA的量。在一些實(shí)施方式中，來(lái)自曲霉菌株的分泌的葡糖淀粉酶與分泌的asAA之比(GA/asAA)將是至少1/1、至少2/1、至少4/1、至少6/1和至少8/1。在一些實(shí)施方式中，該比率將是8/1以上。
0141在具體的實(shí)施方式中，宿主是過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的宿主菌株。在一些實(shí)施方式中，過(guò)量表達(dá)的宿主菌株將是曲霉屬某種菌株，諸如黑曲霉菌株。在一些實(shí)施方式中，過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的曲霉屬菌株是表達(dá)野生型葡糖淀粉酶的菌株。過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的宿主菌株的一種實(shí)施方式是重組的黑曲霉菌株，其包含編碼內(nèi)源性葡糖淀粉酶的多核苷酸和編碼異源性α淀粉酶的多核苷酸，所述α淀粉酶與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4具有至少90％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，產(chǎn)生的葡糖淀粉酶是全長(zhǎng)的黑曲霉葡糖淀粉酶，在其它實(shí)施方式中，該葡糖淀粉酶是截短的黑曲霉葡糖淀粉酶，諸如美國(guó)專利6,352,851的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13。
純化酶的方法0142一般而言，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的根據(jù)本發(fā)明的酶(諸如α淀粉酶或葡糖淀粉酶)，被分泌進(jìn)培養(yǎng)基并可以通過(guò)例如從細(xì)胞培養(yǎng)基中除去不想要的組分而加以分離或純化。在一些情況下，酶可以以細(xì)胞內(nèi)的形式產(chǎn)生，這使得從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收成為必要。在此類情況下，酶從細(xì)胞中純化，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。實(shí)例包括，但不限于，親合層析法(Tilbeurgh等，(1984)FEBS Lett.16215)；離子交換層析法(Goyal等，(1991)Biores.Technol.3637；Fliess等，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhai等，(1984)J.Appl.Biochem.6336和Ellouz等，(1987)Chromatography 396307)，包括使用具有高分辨力的物質(zhì)進(jìn)行的離子交換(Medve等，(1998)J.Chromatography A 808153；疏水相互作用層析法(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865123；二相分配法(two-phase partitioning)(Brumbauer等，(1999)Bioseparation 7287)；乙醇沉淀法；反相HPLC；硅膠層析法或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析法諸如DEAE；聚焦層析法(chromatofocusing)；SDS-PAGE；硫酸胺沉淀法；和使用例如Sephadex G-75進(jìn)行的凝膠過(guò)濾。
發(fā)酵0143在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，表達(dá)異源α淀粉酶的真菌細(xì)胞在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)。典型的分批發(fā)酵是一個(gè)密閉的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)即被設(shè)定，并且在發(fā)酵過(guò)程中不被人為改變。因此，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，培養(yǎng)基用所需的生物(一種或多種)接種。在此方法中，允許發(fā)酵在不向系統(tǒng)中添加任何組分的條件下發(fā)生。一般地，分批發(fā)酵由于涉及碳源的添加而被稱為“分批”，并且通常嘗試控制諸如pH和氧濃度的因子。分批系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物和生物材料(biomass)的組成不斷變化直至發(fā)酵終止。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞經(jīng)延滯期發(fā)展到快速生長(zhǎng)的指數(shù)期并最終到達(dá)生長(zhǎng)速率降低或停止的靜止期。如果不加處理，靜止期的細(xì)胞最終會(huì)死亡。一般而言，指數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)大量生產(chǎn)終產(chǎn)物。
0144對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的分批系統(tǒng)的一種改動(dòng)是“補(bǔ)料分批發(fā)酵(fed-batch fermentation)”系統(tǒng)，其也可用于本發(fā)明。在對(duì)典型的分批系統(tǒng)的此種改動(dòng)中，隨發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，底物被逐步加入。當(dāng)降解物阻遏容易抑制細(xì)胞的代謝時(shí)，以及在期望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。在補(bǔ)料分批系統(tǒng)中實(shí)際底物濃度的測(cè)量是困難的，因此根據(jù)可測(cè)量的因素諸如pH、溶解氧和廢氣諸如CO2的分壓來(lái)進(jìn)行評(píng)估。分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見(jiàn)和熟知的。
0145連續(xù)發(fā)酵是一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)，其中成分確定的發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)地加入生物反應(yīng)器中，并且同時(shí)移去等量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵一般將培養(yǎng)物保持在固定的高密度，其中細(xì)胞主要處于指數(shù)期生長(zhǎng)。
0146連續(xù)發(fā)酵使得能夠?qū)τ绊懠?xì)胞生長(zhǎng)和/或終產(chǎn)物濃度的一種因素或任何數(shù)量的因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，在一種實(shí)施方式中，限制性營(yíng)養(yǎng)物諸如碳源或氮源被保持在固定的比率，而所有其它參數(shù)能夠保持適度。在其它系統(tǒng)中，影響生長(zhǎng)的大量因素可以被連續(xù)改變，而通過(guò)培養(yǎng)基濁度來(lái)測(cè)量的細(xì)胞濃度被保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力保持穩(wěn)定狀態(tài)的生長(zhǎng)條件。因此，由于排出的培養(yǎng)基而造成的細(xì)胞損失必須與發(fā)酵中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度相平衡。連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因素的調(diào)節(jié)方法以及使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物領(lǐng)域熟知的。
組合物0147根據(jù)本發(fā)明的特別有用的酶組合物是淀粉水解酶組合物(例如顆粒淀粉水解組合物)，其包括與SEQ ID NO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的α淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶(例如asAA)是通過(guò)異源表達(dá)asAA，諸如在木霉或曲霉宿主中異源表達(dá)河內(nèi)曲霉的酸穩(wěn)定性α淀粉酶而獲得的。在一些實(shí)施方式中，曲霉宿主是過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的宿主。
0148本發(fā)明的另一種有用的酶組合物是淀粉水解酶組合物(例如顆粒淀粉水解組合物)，其包括與SEQ ID NO9的序列具有至少97％、98％和99％序列同一性的截短的α淀粉酶(例如asAA)。
0149在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物將包括α淀粉酶的組合，其包括a)具有GSH活性的完整asAA，其包含與SEQ ID NO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一性的序列，和b)截短的α淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，截短的α淀粉酶將是與SEQ ID NO9的序列具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的序列。
0150在一些實(shí)施方式中，與酶組合物中具有GSH活性的asAA(完整型+截短型)的總量相比，具有GSH活性的完整asAA的量將是至少大約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和98％。在其它實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物中，具有GSH活性的完整asAA與具有GSH活性的截短的asAA之比將是大約10％比90％、20％比80％、30％比70％、35％比65％、40％比60％、45％比55％、50％比50％、55％比45％、60％比40％、65％比35％、70％比30％、80％比20％和90％比10％(完整型/截短型)。在一些實(shí)施方式中，完整型與截短型之比將是在大約40％比60％和大約60％比40％之間。
0151在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶以及可選地通過(guò)在宿主中共表達(dá)而產(chǎn)生的葡糖淀粉酶將以無(wú)細(xì)胞濾液的形式被利用(例如，其中asAA從培養(yǎng)基中分離)，在其它實(shí)施方式中，α淀粉酶是在含有真菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中被利用，所述真菌宿主細(xì)胞表達(dá)并分泌該α淀粉酶(例如具有GSH活性的asAA)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括包含具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的發(fā)酵介質(zhì)或培養(yǎng)基，所述酸穩(wěn)定性α淀粉酶由木霉細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生，所述木霉細(xì)胞包含編碼該asAA的異源多核苷酸，所述asAA與SEQ ID NO3具有至少90％的序列同一性。
0152在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的發(fā)酵介質(zhì)或培養(yǎng)基，所述asAA由曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生，所述曲霉細(xì)胞包含編碼asAA的異源多核苷酸，所述asAA與SEQ ID NO3具有至少90％的序列同一性。
0153在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶的發(fā)酵介質(zhì)或培養(yǎng)基，其中所述α淀粉酶和葡糖淀粉酶兩者是由曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)物共表達(dá)的，所述細(xì)胞包含編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的α淀粉酶的異源多核苷酸和編碼葡糖淀粉酶的內(nèi)源多核苷酸。
0154在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中的α淀粉酶和葡糖淀粉酶被進(jìn)一步回收。這些酶可以被配制為用于許多種應(yīng)用的酶組合物。這些應(yīng)用和組合物中的一些包括但不限于例如淀粉水解與糖化組合物、清潔和去污劑組合物(例如洗衣去污劑、洗碟去污劑和硬表面清潔組合物)、動(dòng)物飼料組合物、烘焙用途，諸如面包和蛋糕的生產(chǎn)、釀造用途、保健用途、紡織用途、環(huán)境廢棄物的轉(zhuǎn)化過(guò)程、生物制漿加工過(guò)程和生物材料(biomass)轉(zhuǎn)化用途。
0155具體而言，本發(fā)明所包含的組合物被應(yīng)用于淀粉轉(zhuǎn)化，諸如在用于果糖糖漿的葡萄糖、專用糖(specialty sugars)的生產(chǎn)中，以及在醇類和其它終產(chǎn)物(例如有機(jī)酸、抗壞血酸)的生產(chǎn)中。
0156如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的組合物和方法中所使用的α淀粉酶(例如具有GSH活性的asAA)的量將取決于該α淀粉酶的酶促活性。在一些實(shí)施方式中，存在于酶組合物中的本發(fā)明所包含的α淀粉酶的范圍是每克ds 0.001至80 SSU、0.001至60 SSU、以及0.01至40 SSU；以及0.01至30 SSU；以及0.01至20 SSU；以及0.01至15 SSU；以及0.05至15 SSU，以及0.01至10 SSU。
0157根據(jù)本發(fā)明的有用的酶組合物為如上所述的酶組合物，其進(jìn)一步包括第二葡糖淀粉酶(secondary glucoamylase)。第二葡糖淀粉酶是從不同于包含編碼本發(fā)明所包括的α淀粉酶的異源多核苷酸(例如，編碼與SEQ IDNO3具有至少90％序列同一性的α淀粉酶的多核苷酸)的曲霉宿主的來(lái)源獲得的葡糖淀粉酶。
0158在根據(jù)本發(fā)明的組合物中可以有用的葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)，可以是野生型葡糖淀粉酶或經(jīng)遺傳修飾的淀粉酶，包括變體和雜交體葡糖淀粉酶。一般而言，葡糖淀粉酶可以來(lái)自細(xì)菌、植物和真菌來(lái)源。可用在本發(fā)明的組合物和方法中的優(yōu)選葡糖淀粉酶是由絲狀真菌和酵母的若干菌株產(chǎn)生的。具體而言，由曲霉和木霉的菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是重要的。這些葡糖淀粉酶的來(lái)源包括黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其變體(Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136，WO 05/045018，參見(jiàn)SEQ ID NO25和美國(guó)專利6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921和WO 05/052148，參見(jiàn)SEQ ID NO5)；米曲霉葡糖淀粉酶及其變體(Hata等，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和Aspergillus shirousami(參見(jiàn)Chen等，(1996)Prof.Eng.9499-505；Chen等，(1995)Prot.Eng.8575-582和Chen等，(1994)Biochem J.302275-281)。葡糖淀粉酶也從Talaromyces菌株，諸如來(lái)自于T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和T.thermophilus的菌株(WO 99/28488；USP No.RE32,153和USP No.4,587,215)及其變體；根霉屬菌株，諸如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)菌株及其變體；毛霉屬菌株；木霉屬菌株，諸如里氏木霉和綠色木霉菌株；以及腐質(zhì)霉菌株，諸如灰腐質(zhì)霉菌株獲得。(參見(jiàn)Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等，(1996)Prot.Eng.9499-505；Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；美國(guó)專利號(hào)4,514,496；美國(guó)專利號(hào)4,092,434；WO 05/052148，參見(jiàn)SEQ ID NO2和3，以及Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。在本發(fā)明中有用的其它葡糖淀粉酶包括從羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)獲得的葡糖淀粉酶及其變體(USP 4,727,026；WO 04/111218和WO 05/045028的SEQ ID NO26)。
0159商業(yè)上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如由黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，來(lái)自Genencor InternationalInc)或者根霉屬某種(商品名CU.CONC，來(lái)自Shin Nihon Chemicals，Japan)生產(chǎn)。也可以是商用的消化酶，商品名GLUCZYME，來(lái)自Amano Pharmaceuticals，Japan(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98663-671)。其它酶包括根霉屬某種的三種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即，“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。Gluc1在本發(fā)明中尤其有用。
0160一些GA酶也是顆粒淀粉水解酶(GSHE)(參見(jiàn)例如Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。這些GA-GSHEs不僅具有葡糖淀粉酶活性，而且能夠水解顆粒(生)淀粉。GA-GSHEs已從真菌細(xì)胞，尤其絲狀真菌細(xì)胞諸如腐質(zhì)霉屬某種、曲霉屬某種、木霉屬某種和根霉屬某種回收。米根霉GA-GSHE已在Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP 4,863,864中描述。也參考雪白根霉?；腋|(zhì)霉GA-GSHE被Allison等，(1992)Curr.Genet.21225-229、Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39846-852、Campos等，(1995)App.And Environ.Microbiol.612436-2438以及歐洲專利號(hào)171218描述。泡盛曲霉河內(nèi)變種GA-GSHE被Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem 53923-929描述。Aspergillus shirousami的GA-GSHE被Shibuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用于本發(fā)明的一種具體GA-GSHE制劑包括可從Biocon India，Ltd，India獲得的以名稱“M1”銷售的酶制劑。
0161在一種實(shí)施方式中，GA-GSHE酶可以來(lái)自于灰腐質(zhì)霉菌株，具體地是灰腐質(zhì)霉嗜熱變種菌株(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,618,579)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，灰腐質(zhì)霉GA-GSHE酶是從真菌中回收的，所述真菌包括ATCC 16453、NRRL(USDANorthern Regional Research Laboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL 15220、NRRL15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224和NRRL 15225，以及它們的遺傳改變菌株。這些種生產(chǎn)出免疫學(xué)上相同的酶促葡糖淀粉酶制劑(參見(jiàn)EP 0 171218)。
0162在酶組合物中有用的葡糖淀粉酶量可以在下列范圍內(nèi)0.001至30.0GAU/g ds、以及0.001至25.0 GAU/g ds、以及0.01至25.0 GAU/g ds、以及0.1至25.0 GAU/g ds、以及0.01至20 GAU/g ds、以及0.01至15 GAU/g ds、以及0.01至10 GAU/g ds、以及0.1至10 GAU/g ds，以及0.05至5.0 GAU/g ds。GA-GSHE制劑的活性可以按葡糖淀粉酶的活性定義。
0163一些有用的酶促組合物包括α淀粉酶諸如與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的asAA和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖淀粉酶的混合物。另一種有用的酶促組合物包括與SEQ ID NO3具有至少98％序列同一性的asAA和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖淀粉酶的混合物。另一種有用的酶促組合物包括與SEQ IDNO9具有至少98％序列同一性的α淀粉酶和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖淀粉酶的混合物。
0164在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所包含的α淀粉酶的活性(SSU)與GA活性(GAU)之比將在范圍40∶1至1∶40、以及30∶1至1∶30、以及20∶1至1∶20、以及15∶1至1∶15之內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該比率(SSU/GAU)將在大約20∶1至1∶10；大約10∶1至1∶10；大約10∶1至1∶5；大約5∶1至1∶5、大約4∶1至1∶4；大約3∶1至1∶3；大約2∶1至1∶4以及大約2∶1至1∶2的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，SSU與GAU之比將是在大約4∶1至2∶1之間。
0165在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶，諸如與SEQ ID NO3具有至少80％序列同一性的具有GSH活性的asAA，將以每克干固體大約0.001至30 SSU的量或者以每克漿液干固體內(nèi)容物0.01至15.0 SSU的量與顆粒淀粉底物漿液混合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所包含的asAA以每克漿液干固體內(nèi)容物大約0.01至10.0SSU、大約0.01至5.0 SSU；大約0.05至10.0 SSU；大約0.05至5.0 SSU；大約0.1至10.0 SSU；大約0.1至5.0 SSU；大約0.1至2.0 SSU；大約0.25至2.5 SSU；大約0.5至5.0 SSU；大約0.5至2.5 SSU；以及大約0.5至1.5 SSU的量加入。
0166如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本發(fā)明的方法和組合物中使用的葡糖淀粉酶的量決定于該葡糖淀粉酶的酶促活性。在一些實(shí)施方式中，可以按每克(ds)漿液加入0.001至15.0 GAU量的葡糖淀粉酶，該漿液被調(diào)至含20-45％干固體。在一些實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶按每克(ds)漿液0.001至10 GAU；0.01至10.0 GAU；0.01至5.0 GAU；0.05至5.0 GAU；0.1至10.0 GAU；0.1至5.0 GAU；0.1至2.0 GAU；0.25至1.5 GAU葡糖淀粉酶的量加入。在一種實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶的劑量范圍將是每克(ds)漿液0.1至2.0 GAU。
0167其它的酶可以被包括在本發(fā)明所包括的組合物和方法中。這些可用于本發(fā)明的其它的酶包括脫枝酶(debranching enzymes)諸如支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。此類酶水解α-1，6-糖苷鍵。因此，在淀粉水解過(guò)程中，脫枝酶從淀粉的非還原性端去除連續(xù)的葡萄糖單位。另一種可以被用于本發(fā)明組合物中的酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。這些是外切作用型產(chǎn)麥芽糖淀粉酶，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉以及相關(guān)葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷鍵的水解。這些酶中的一些的特征為具有4.5至7.0的最適pH范圍和40℃至65℃的最適溫度范圍。商用的β-淀粉酶可以獲得，例如來(lái)自Genencor International Inc.的SPEZYME BBA和OPTIMALT。
0168其它酶可以包括第二α淀粉酶，即由本發(fā)明所包括的α淀粉酶(即，與SEQID NO3具有至少80％序列同一性的α淀粉酶)的異源表達(dá)之外的來(lái)源所提供的α淀粉酶。α淀粉酶的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌的α淀粉酶及其變體。特定的非限制性實(shí)例包括來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)及其變體或雜交體的α淀粉酶(USP 5,093,257、USP 6,093,562、USP 5,736,499、USP 5,958,739、USP6,436,888、USP 6,867,031、WO 96/39528、WO 96/23874和WO 05/001064)。商業(yè)上可用的α淀粉酶是SPEZYME FRED和SPEZYME ETHYL(Genencor InternationalInc.)。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTases)(例如E.C.2.4.1.19)及其變體也可以用于本發(fā)明(USP 5,278,059、USP 5,545,587和WO 05/003337)。
0169可以使用的進(jìn)一步其它的酶是蛋白酶，諸如真菌或細(xì)菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如，從曲霉、木霉、毛霉和根霉，諸如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉(M.miehei)獲得的蛋白酶。其它的酶包括但不限于纖維素酶，諸如內(nèi)切葡聚糖酶；半纖維素酶，諸如甘露聚糖酶；脂酶(例如E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶、果膠酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶、α1，6葡萄糖苷酶(例如E.C.3.2.1.20)和角質(zhì)酶(例如E.C.3.1.1.74)。
0170將被包括在本發(fā)明方法中的這些酶的有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
0171在一些實(shí)施方式中，可以將抗微生物劑加入本發(fā)明的組合物和發(fā)酵培養(yǎng)基中?？刮⑸飫┦菤⑺牢⑸锘蛘咭种莆⑸锷L(zhǎng)的化合物。
0172在一種實(shí)施方式中，包含本發(fā)明所包括的asaA以及與之相組合的葡糖淀粉酶的酶組合物將被用于生產(chǎn)乙醇。在一些實(shí)施方式中，至少8％、10％、12％、14％、16％和18％的乙醇將使用本發(fā)明的組合物來(lái)生產(chǎn)。在一些實(shí)施方式中，乙醇將在同步糖化發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，包含由同一曲霉菌株產(chǎn)生的α淀粉酶和葡糖淀粉酶的酶組合物將與顆粒淀粉底物漿液和產(chǎn)乙醇微生物同時(shí)混合，該混合物將在單一的步驟中發(fā)酵。該漿液可以含有大約10-50％ds；大約10-45％；大約15-40％；大約20-40％；大約25-40％；或者大約25-35％ds。
0173顆粒淀粉底物可以從包括莖、谷粒、根和塊莖的任何植物部分獲得。特別優(yōu)選的植物來(lái)源包括玉米；小麥；黑麥；高梁；稻米；粟；燕麥；木薯(cassava)；豆類，諸如大豆和豌豆；馬鈴薯；甘薯；香蕉；甘蔗和木薯粉(tapioca)。
0174特別考慮的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。來(lái)自谷物的淀粉可以是碾磨的或完整的，包括玉米固體，諸如玉米仁、玉米麩和/或玉米碎塊(cobs)。此外，谷物可以被分離(fractionated)(例如，玉米中的胚乳、纖維或胚芽或者麩質(zhì)，小麥中的淀粉A或淀粉B)。淀粉可以是高度精制的生淀粉或來(lái)自淀粉精制工藝的給料(feedstock)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知可利用的方法，它們可被用來(lái)制備在本發(fā)明所包括的方法中使用的顆粒淀粉底物。這些方法中的一些包括完整谷類顆粒的干磨法，其使用錘磨和輥磨，以及濕磨法。
0175各種淀粉可商業(yè)獲得。例如，玉米淀粉可從Cerestar、Sigma和KatayamaChemical Industry Co.(日本)獲得；小麥淀粉可從Sigma獲得；甘薯淀粉可從WakoPure Chemical Industry Co.(日本)獲得；以及馬鈴薯淀粉可從Nakaari ChemicalPharmaceutical Co.(日本)獲得。
0176各種文獻(xiàn)已報(bào)道了在谷類谷物中存在的淀粉量，參考The Alcohol Textbook，3rdEd.K.Jacques et al.，Eds.1999，Nottingham University Press。例如，玉米含大約60-68％的淀粉；燕麥含大約55-65％的淀粉；粟含大約75-80％的淀粉；小麥含大約60-65％的淀粉；以及精米含大約70-72％的淀粉。
0177在一些實(shí)施方式中，將顆粒淀粉底物制漿(一般用水)，所述漿液包含i)大約10％至大約55％的干固體內(nèi)容物(ds)；ii)大約15％至大約50％的干固體內(nèi)容物；iii)大約20％至大約45％的干固體內(nèi)容物；iv)大約25％至大約45％的干固體內(nèi)容物；v)大約30％至大約45％的干固體內(nèi)容物；vi)大約30％至大約40％的干固體內(nèi)容物；以及vii)大約30％至大約35％的干固體內(nèi)容物。在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉漿液與本發(fā)明的酶組合物在低于顆粒淀粉底物中淀粉的糊化溫度的溫度下接觸以產(chǎn)生葡萄糖。
0178本發(fā)明的方法所使用的精確溫度取決于所使用的具體淀粉底物。一般的淀粉糊化溫度范圍在Swinkels 32-38頁(yè)STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，eds Van Beynum等，(1985)Marcel Dekker Inc.，NY和THE ALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，F(xiàn)UEL AND INDUSTRIAL ALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，eds Jacques等，1999，Nottingham University Press，UK中公開(kāi)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的方法將在至少大約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的溫度進(jìn)行。在其它實(shí)施方式中，該溫度將是在大約25-65℃之間、在大約30-65℃之間、在大約35-65℃之間、在大約40-65℃之間和在大約45-65℃之間。在其它實(shí)施方式中，該溫度將是在大約25-45℃之間、在大約25-40℃之間和在大約30-35℃之間。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉底物與本發(fā)明的組合物在低于該底物中的淀粉的糊化溫度的溫度下接觸，在一些實(shí)施方式中，含淀粉的底物從未經(jīng)歷用于液化的熱條件。
0179在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所包括的方法將在pH 3.0至7.0之間；在pH3.0至6.0之間；在pH 3.0至5.0之間；在pH 3.5至6.0之間；在pH 3.5至5.0之間；和在pH 3.5至4.5的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。
0180在一些實(shí)施方式中，本方法的停留時(shí)間(residence time)是大約2至300小時(shí)，但更典型地是2至120小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，該過(guò)程進(jìn)行大約5至100小時(shí)。在其它實(shí)施方式中，該過(guò)程進(jìn)行大約5至80小時(shí)。仍在其它實(shí)施方式中，該過(guò)程進(jìn)行至少5小時(shí)但在100小時(shí)以下。在其它實(shí)施方式中，該過(guò)程進(jìn)行至少10小時(shí)但在100小時(shí)以下。
0181在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的干固體被水解。在一些實(shí)施方式中。顆粒淀粉底物被徹底水解。在一些實(shí)施方式中，至少90％的顆粒淀粉在100小時(shí)內(nèi)被水解。在某些實(shí)施方式中，至少90％的顆粒淀粉底物在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)被水解。在其它實(shí)施方式中，至少95％的顆粒淀粉底物在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)被水解。
0182葡萄糖的產(chǎn)率(總的溶解干固體的百分比)可以是至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。在一些實(shí)施方式中，葡萄糖可以被用于生產(chǎn)高果糖糖漿。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，持續(xù)產(chǎn)生葡萄糖，并且基本上所有的葡萄糖都被用在生產(chǎn)終產(chǎn)物諸如乙醇和聯(lián)產(chǎn)物(co-products)諸如DDGS的過(guò)程中。(參考MOLECULAR STRUCTURE AND FUNCTION OF FOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCH ET AL，APPLIED SCIENCE PUBLISHERS，LONDON)。葡萄糖也可以被用于生產(chǎn)其它終產(chǎn)物的發(fā)酵過(guò)程中，所述終產(chǎn)物包括但不限于有機(jī)酸、酶、丙三醇、氨基酸、抗壞血酸中間產(chǎn)物和其它復(fù)雜化合物諸如激素和抗生素。
實(shí)驗(yàn)0183提供以下實(shí)施例是為了顯示和進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式和方面，而不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限定。實(shí)際上，應(yīng)考慮為這些教導(dǎo)對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化本文描述的工藝體系是有用的。
0184在以下的公開(kāi)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)部分中，應(yīng)用下列縮略語(yǔ)0185具有GSH活性的asAA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；AkAA(具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的酸穩(wěn)定性α淀粉酶，有時(shí)可與asaA互換使用)；GA(葡糖淀粉酶)；wt％(重量百分比)；℃(攝氏度)；rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))；H2O(水)；dH2O(去離子水)；dlH2O(去離子水，Milli-Q過(guò)濾)；aa(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時(shí))；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；DO(溶解氧)；鄰苯二甲酸鹽緩沖液(鄰苯二甲酸鈉水溶液，20mM，pH 5.0)；PBS(磷酸緩沖鹽溶液[150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2])；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)；w/v(重量與體積之比)；w/w(重量比)；v/v(體積比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，Palo Alto，CA)；DDGS(蒸餾間干谷物及固體(Distilleries DryGrain plus Solids))；MT(公噸)；和EtOH(乙醇)。
0186下列試驗(yàn)和方法被用于下面提供的實(shí)施例葡糖淀粉酶試驗(yàn)0187使用熟知的、基于葡糖淀粉酶催化對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解為葡萄糖和對(duì)硝基苯酚的能力的試驗(yàn)測(cè)量葡糖淀粉酶活性。在堿性pH下，硝基苯酚形成黃色，該顏色與葡糖淀粉酶活性成比例，在400nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并與酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，測(cè)量結(jié)果表示為GAU。
0188酸穩(wěn)定性α淀粉酶活性的測(cè)量是基于在pH 4.5，50℃一小等份的酶樣品對(duì)可溶性馬鈴薯淀粉底物(4％ds)的水解程度進(jìn)行的。還原糖的含量是使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所述的DNS法進(jìn)行測(cè)量的。一個(gè)單位的酶活(SSU，可溶性淀粉單位)相當(dāng)于在特定溫育條件下每分鐘釋放1mg葡萄糖的還原力。
總淀粉含量的測(cè)定0189酶-酶淀粉液化和糖化法(雙酶法(dual enzyme method))被用來(lái)確定總淀粉含量。在典型的分析中，將2g干樣品放入100ml Kohlraucsh燒瓶中并加入45mlpH 7.0的MOPS緩沖液。將此漿液充分?jǐn)嚢?0分鐘。加入1.0ml SPEZYME FRED(1∶50稀釋于水中)并加熱至沸騰3-5分鐘。將燒瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121℃保持15分鐘。高壓滅菌后，將燒瓶放入95℃水浴中，并加入1ml 1∶50稀釋的SPEZYMEFRED，溫育45分鐘。將pH調(diào)至pH 4.2并將溫度降至60℃。隨后加入20ml乙酸鹽緩沖液，pH 4.2。通過(guò)加入1.0ml 1∶100稀釋OPTIDEX L-400(葡糖淀粉酶，來(lái)自Genencor International Inc.)進(jìn)行糖化，并繼續(xù)在60℃溫育18小時(shí)。通過(guò)在95℃加熱10分鐘終止酶反應(yīng)。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)HPLC分析確定總糖組成。室溫下未經(jīng)酶處理的樣品水提取物中的可溶性淀粉水解產(chǎn)物被從總糖中扣除。
殘留淀粉的碘檢測(cè)0190將啤酒(發(fā)酵肉湯)樣品在2ml塑料離心管中離心。倒盡上清液，將含沉淀的離心管放進(jìn)冰浴中。向此沉淀中加入若干滴0.025N碘溶液(0.1N碘，來(lái)自VWR目錄號(hào)VW3207-1，4×稀釋)并混合。陽(yáng)性(+)淀粉表現(xiàn)為由藍(lán)到紫的顏色范圍，且顏色的強(qiáng)度直接與淀粉濃度成正比。陰性結(jié)果(-)保持淡黃色。
總蛋白的分析0191樣品制備物中的總氮(N)使用Kjeldhal法(American Assoc.Cereal Chemists(AACC)，(1983)，Methods 22B60 8th Ed.St Paul，MN)確定。蛋白含量按6.25×總N計(jì)算。
乙醇和碳水化合物的測(cè)定0192樣品的乙醇和碳水化合物(carbohydrate)組成是使用在此所述的HPLC法確定的a)將1.5mL Eppendorf離心管裝入發(fā)酵罐啤酒并在冰上冷卻10分鐘；b)將樣品管在Eppendorf桌面離心機(jī)中離心1分鐘；c)將0.5mL上清液樣品轉(zhuǎn)移至含0.05mL Kill溶液(1.1N H2SO4)的測(cè)試管中，靜置5分鐘；d)向測(cè)試管樣品中加入5.0mL水，然后經(jīng)0.45μm尼龍注射式過(guò)濾器濾入HPLC管中；然后運(yùn)行HPLC。
0193HPLC條件a)乙醇系統(tǒng)柱Phenomenex Rezex有機(jī)酸柱(RHM-單糖)#00H-0132-KO(相當(dāng)于Bio-Rad 87H)；柱溫60℃；流動(dòng)相0.01 N H2SO4；流速0.6mL/分鐘；檢測(cè)器RI；注入體積20μLb)碳水化合物系統(tǒng)柱Phenomenex Rezex碳水化合物(RCM-單糖)#00H-0130-KO (相當(dāng)于Bio-Rad 87H)；柱溫70℃；流動(dòng)相納米純DI H2O；流速0.8mL/分鐘；檢測(cè)器RI；注入體積10μL(3％DS物質(zhì))。
0194該柱根據(jù)糖的分子量進(jìn)行分離，所述糖被命名為DP1(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(具有大于3的聚合度的寡糖)。
實(shí)施例中所用的在里氏木霉中異源表達(dá)的asaA的制備
0195在表達(dá)asaA的里氏木霉(按照實(shí)施例2和3制備)發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將生物材料(biomass)離心分離，并將清澈的培養(yǎng)物濾液用截留分子量為10,000的超濾膜進(jìn)行濃縮。使用該具有90SSU/g的超濾濃縮液。
實(shí)施例中使用的黑曲霉葡糖淀粉酶的制備如下0196經(jīng)挑選的如美國(guó)專利3,249,514中所述的黑曲霉菌株被使用。發(fā)酵后，使用包括過(guò)濾和離心的傳統(tǒng)分離方法分離真菌菌絲體。將清澈的濾液在5℃通過(guò)超濾濃縮至特定活性。
實(shí)施例0197克隆河內(nèi)曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因。
0198從河內(nèi)曲霉菌絲體的過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。按照制造商的真菌說(shuō)明書(shū)使用FastDNA Kit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM實(shí)驗(yàn)方案。為了均質(zhì)化，將樣品在FastPrep設(shè)備上以速度4.0處理30秒。根據(jù)A.Kaneko等(Kaneko等，(1996)，J.Ferm Bioeng 81292-298)的asaA序列，設(shè)計(jì)PCR引物。
0199(A).為了構(gòu)建里氏木霉表達(dá)載體，正向克隆引物alph 6的序列為CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQ ID NO.6)，反向克隆引物Akaa3的序列為CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQ ID NO.7)。正向引物中含有用于定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。將該基因用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)從基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)。
0200通過(guò)凝膠抽提(凝膠純化試劑盒，Qiagen)，將2.36 kb PCR產(chǎn)物純化，并按Invitrogen Gateway系統(tǒng)方案將其克隆進(jìn)pENTR/D。然后將該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌(Invitrogen)中，用卡那霉素進(jìn)行選擇。將來(lái)自若干克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶進(jìn)行消化以確認(rèn)正確大小的插入片段。將來(lái)自若干克隆的α淀粉酶基因插入片段進(jìn)行測(cè)序(Sequetech，Mountain View，CA)(SEQ ID NO1)。將來(lái)自一個(gè)克隆pENTR/D_Akaa#11的質(zhì)粒DNA與pTrex3g/amdS目的載體DNA一起加入到LR克隆酶(clonase)反應(yīng)(Invitrogen Gateway系統(tǒng))中。在LR克隆酶反應(yīng)中進(jìn)行的重組，用pENTR/D載體中的河內(nèi)曲霉asaA替換目的載體中的CmR和ccdB基因。此重組在目的載體的cbhl啟動(dòng)子和終止子之間定向插入asaA。48bp和50bp的重組位點(diǎn)序列分別保留在α淀粉酶的上游和下游。將LR克隆酶反應(yīng)的等份樣品轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌中，并過(guò)夜生長(zhǎng)，用羧芐青霉素進(jìn)行選擇。將來(lái)自若干克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性消化以確認(rèn)正確的插入片段大小。為了從該細(xì)菌質(zhì)粒中移走真菌序列盒，按照Stratagene QuickChange方案將EcoRI位點(diǎn)加入到amdS基因的3′。整個(gè)真菌盒的序列被確證。將來(lái)自克隆pTrex3g_Akalpha#1的質(zhì)粒DNA(圖4)用EcoRI消化以釋放出包括cbhI啟動(dòng)子asaAcbhI終止子amdS的表達(dá)盒。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)瓊脂糖抽提純化此7.8kb的序列盒，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)衍生自可公開(kāi)獲得的菌株QM6a的里氏木霉菌株，如下面進(jìn)一步描述的。
0201(B).為了構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體，正向克隆引物alpha7的序列為5′-GCGCGCTACGTAATGAGAGTGTCGACTTC(SEQ ID NO11)，反向克隆引物rsh46r的序列為5′GCGCGCTACGTACTACCTCCACGTATC(SEQ ID NO12)。將該基因用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)從基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)。
0202通過(guò)凝膠抽提(凝膠純化試劑盒，Qiagen)，將2.36 kb PCR產(chǎn)物純化，并按照制造商的方案將其克隆進(jìn)pCR-BluntII-TOPO(Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒，Invitrogen)。將該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)One ShotTop10 E.coli(Invitrogen)，用卡那霉素進(jìn)行選擇。將來(lái)自若干克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶進(jìn)行消化以確證正確大小的插入片段。將來(lái)自若干克隆的α淀粉酶插入片段(SEQ ID NO1)進(jìn)行測(cè)序(Sequetech，Mountain View，CA)。將已測(cè)序的2.36 kb asaA基因用限制性酶SnaBI從載體(克隆TOPO-SnaBaa23)中切下，并通過(guò)凝膠抽提進(jìn)行純化。將含黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)以及塔賓曲霉葡糖淀粉酶終止子的載體pSL898-MunI(圖5A)用SnaBI消化，該酶在葡糖淀粉酶的啟動(dòng)子和終止子之間打開(kāi)質(zhì)粒。載體pSL898-MunI還包括用于檢測(cè)真菌轉(zhuǎn)化子的構(gòu)巢曲霉乙酰胺(amdS)選擇標(biāo)記，這是通過(guò)用乙酰胺作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)的。載體消化之后用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics Corp.)將載體去磷酸化。然后將分離的2.36kb的、側(cè)翼為SnaBI的asaA用T4DNA連接酶(Roche Diagnostics Corp.)連接進(jìn)該載體，均按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)One Shot Top 10大腸桿菌(Invitrogen)，用卡那霉素進(jìn)行選擇。用XhoI消化克隆以確認(rèn)插入片段的方向。SnaBI位點(diǎn)在該平末端連接中被改變。然后用PCR(Pfu Turbo DNA聚合酶)將ApaI位點(diǎn)增加到真菌表達(dá)盒的5′和3′端。正向引物a17序列為GGGCCCATTTTGAATAGCTCGCCCGCTG(SEQ ID NO13)，反向引物a18r序列為GGGCCCCAATTGCCTAATGCTATGTGCAAG(SEQ ID NO14)。將PCR產(chǎn)物按照制造商的說(shuō)明書(shū)克隆進(jìn)pCR-BluntII-TOPO(溫育過(guò)程增加至室溫下1小時(shí))并轉(zhuǎn)化進(jìn)One ShotTop 10大腸桿菌，用卡那霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確，對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Sequetech，Mountain View，CA)。
0203大腸桿菌克隆#31，pSL902_AkAA(圖5B)被用來(lái)生成用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。用限制性酶ApaI消化該質(zhì)粒以使表達(dá)盒線性化，其包括構(gòu)巢曲霉amdS、黑曲霉glaA啟動(dòng)子、河內(nèi)曲霉α淀粉酶(SEQ ID NO1)以及黑曲霉glaA終止子。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)瓊脂糖抽提法將此7.2kb序列盒純化，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)黑曲霉菌株，該菌株包含來(lái)自于ATCC 14916的內(nèi)源性葡糖淀粉酶。
實(shí)施例2基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化里氏木霉
0204將里氏木霉孢子懸液涂布到MABA轉(zhuǎn)化培養(yǎng)板的～6cm直徑中心(150μl的5×107-5×108個(gè)孢子/ml懸液)。然后，將培養(yǎng)板在生物學(xué)通風(fēng)櫥(biological hood)中風(fēng)干。將stopping screen(BioRad 165-2336)和macrocarrier holder(BioRad 1652322)浸入到70％乙醇中，并風(fēng)干。將DriRite干燥劑放置到小培養(yǎng)皿中(6cm Pyrex)，用Whatman濾紙覆蓋。將含有macrocarrier(BioRad 165-2335)的macrocarrier holder平放在濾紙上面，代替培養(yǎng)皿的蓋子。
0205通過(guò)向Eppendorf管中加入60mg鎢M-10顆粒(microcarrier，0.7微米，Biorad#1652266)，制備鎢顆粒懸液。加入1ml乙醇(100％)。將鎢在乙醇溶液中渦旋振蕩，并讓其浸泡15分鐘。以最大速度將Eppendorf管進(jìn)行短暫微量離心，以使鎢發(fā)生沉淀。倒空乙醇，用無(wú)菌蒸餾水洗滌三次。在第三次將洗滌水倒空之后，將鎢重新懸浮在1ml的無(wú)菌50％甘油中。鎢被新鮮制備，至少每?jī)芍芤淮巍?br> 0206對(duì)于每次轉(zhuǎn)化，通過(guò)將25μl的懸浮鎢加入到1.5ml Eppendorf管中，制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)物。隨后，按次序加入0.5-5μl DNA(XbaI-消化的表達(dá)盒)、25μl 2.5MCaCl2、10μl 0.1M亞精胺。將反應(yīng)連續(xù)地渦旋振蕩5-10分鐘，使鎢保持懸浮。然后，短暫地微量離心Eppendorf管，并倒空液體。用200μl的70％乙醇洗滌鎢沉淀，短暫地微量離心，以形成沉淀，并倒空液體。用200μl的100％乙醇洗滌沉淀，短暫微量離心以形成沉淀，并倒空液體。將鎢沉淀重懸于24μl 100％乙醇中。將該Eppendorf管放置到超聲水浴中15秒，將8μl等份試樣轉(zhuǎn)移到干燥的macrocarriers的中心。讓macrocarriers在干燥的培養(yǎng)皿中干燥。
0207將氦罐(He tank)打開(kāi)到1500psi。1100psi rupture discs(BioRad 165-2329)被用于PDS-1000/He型基因槍微粒傳送系統(tǒng)(Model PDS-1000/He Biolistic ParticleDelivery System(BioRad))中。當(dāng)鎢溶液干燥時(shí)，將stopping screen和macrocarrierholder插入到PDS-1000中。MABA平板，其含有靶里氏木霉孢子，被放置到stoppingscreen下面6cm處。在該腔上被抽至29英寸Hg柱的真空，并維持。啟動(dòng)該氦基因槍微粒傳送系統(tǒng)。該腔被排氣，取出MABA平板，在28℃溫育直至出現(xiàn)克隆(5天)。
0208關(guān)于此實(shí)施例2，下列溶液被制備。
0209每升改良型amdS基因槍瓊脂(MABA)包括部分I，1000×鹽，1.0ml；Noble瓊脂，20g，在500ml dH2O中制成。將pH調(diào)至6.0并高壓滅菌。部分II，乙酰胺，0.6g；CsCl，1.68g；葡萄糖，20g；KH2PO4，15g；MgSO4·7H2O，0.6g；和CaCl2·2H2O，0.6g，在500ml dH2O中制成。將pH調(diào)至4.5并用0.2微米濾器過(guò)濾除菌；放入50℃爐加熱，加入瓊脂，混合并倒入板中，室溫保存。
02101000×鹽/升＝FeSO4·7H2O，5g；MnSO4·H2O，1.6g；ZnSO4·7H2O，1.4g；CoCl2·6H2O，1g，用dH2O加至1L，并用0.2微米濾器過(guò)濾除菌。
實(shí)施例3
PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化里氏木霉0211將形成孢子的菌絲體(生長(zhǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上，Difco，30℃，5天)的1-2cm2瓊脂塊接種于250ml的4-擋板搖瓶中的50ml YEG(5g/L酵母提取物+20g/L葡萄糖)肉湯中，在30-37℃于200rpm溫育16-20小時(shí)。通過(guò)將搖瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移至50ml錐形管中，并在2500rpm旋轉(zhuǎn)離心10分鐘，回收菌絲體。棄去上清液并將菌絲體沉淀轉(zhuǎn)入250ml、0.22m CA或PES Coming過(guò)濾瓶中，該過(guò)濾瓶裝有40ml經(jīng)過(guò)濾的β-D-葡聚糖酶溶液。將該溶液在30℃、200rpm溫育2小時(shí)以生成原生質(zhì)體。經(jīng)無(wú)菌Miracloth(CalBiochem，La Jolla，CA)，將原生質(zhì)體過(guò)濾收集至50ml錐形管中。2000rpm離心5分鐘，沉淀原生質(zhì)體，棄去上清液。將原生質(zhì)體沉淀用50ml 1.2M山梨醇清洗一次；離心(2000rpm，5分鐘)并棄去上清液。用25ml山梨醇/CaCl2清洗沉淀。使用血球計(jì)數(shù)器對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后通過(guò)2000rpm離心5分鐘使其沉淀。棄去上清液，將原生質(zhì)體沉淀重懸于一定體積的山梨醇/CaCl2中，其體積足以產(chǎn)生原生質(zhì)體濃度為1.25×108/ml的原生質(zhì)體溶液。
0212對(duì)于每次轉(zhuǎn)化，將20μg表達(dá)載體DNA的等份樣品(體積不大于20μl)轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中，置于冰上。在每個(gè)管中加入原生質(zhì)體懸浮液(200μl)和50μl PEG溶液。將其溫和混勻并在冰上溫育20分鐘。向每支轉(zhuǎn)化管中加入PEG(2ml)溶液并在室溫下溫育5分鐘。向每支離心管中加入4ml山梨醇/CaCl2溶液(總體積6.2ml)并溫和混勻。然后向3支熔化的(50℃)頂部瓊脂管中的每支中加入2ml的轉(zhuǎn)化混合物。將各份頂層瓊脂混合物倒入單獨(dú)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)板上并在30℃溫育四至七天。
0213對(duì)于使用amdS選擇的轉(zhuǎn)化，使用了乙酰胺/山梨醇培養(yǎng)板和頂層瓊脂。選擇培養(yǎng)板與轉(zhuǎn)化培養(yǎng)板相同，但沒(méi)有山梨醇。通過(guò)將分離的集落轉(zhuǎn)移至含乙酰胺的新鮮的選擇培養(yǎng)基，將推定的轉(zhuǎn)化子純化。
0214培養(yǎng)基和溶液制備如下。40ml β-D-葡聚糖酶溶液-將600mg β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，San Mateo，CA)和400mg MgSO4·7H2O溶解于40ml1.2M山梨醇。200ml PEG混合物-將50g PEG 4000(BDH Laboratory SuppliesPoole，England)和1.47g CaCl2·2H2O溶解于200ml dlH2O。PEG混合物被新鮮制備，至少每月一次。山梨醇/CaCl2溶液-將50mM CaCl2溶解于1.2M山梨醇。乙酰胺/山梨醇瓊脂-部分I將0.6g乙酰胺(Aldrich，99％純度)、1.68g CsCl、20g葡萄糖、20g KH2PO4、0.6g MgSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、1ml 1000×鹽(見(jiàn)下)溶解于200ml dlH2O中，調(diào)至pH 5.5，用dH2O定容至體積達(dá)300ml，將其過(guò)濾除菌。部分II將20g Noble瓊脂和218g山梨醇加入1L量筒，用dlH2O定容至體積(700ml)，并高壓滅菌。將部分II加入部分I，達(dá)到終體積1L。(1000×鹽-將5gFeSO4·7H2O、1.6g MnSO4·H2O、1.4g ZnSO4·7H2O和1g CoCl2·6H2O合并，用dlH2O將體積定容至1L。然后過(guò)濾滅菌。
實(shí)施例4PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化黑曲霉0215將裝有100ml WCWM或WCWM+CD肉湯的250ml 4-擋板搖瓶用-80℃儲(chǔ)存的黑曲霉菌株菌絲體接種，其過(guò)量表達(dá)野生型的內(nèi)源性葡糖淀粉酶并衍生自ATCC 14916。在30℃，300rpm使培養(yǎng)物生長(zhǎng)48-72小時(shí)。將10％轉(zhuǎn)移至新WCWM或WCWM+CD搖瓶中。使此第二階段培養(yǎng)物在30℃、300rpm生長(zhǎng)24至72小時(shí)。經(jīng)無(wú)菌Miracloth濾器收集菌絲體，并用溶液A清洗，或者在IEC擺桶式離心機(jī)中將菌絲體離心下來(lái)(2000rpm)。在無(wú)菌條件下將清洗過(guò)的菌絲體轉(zhuǎn)移到40ml原生質(zhì)體溶液中并在30℃、200rpm溫育1-2小時(shí)，顯微鏡觀察監(jiān)測(cè)原生質(zhì)體化進(jìn)展。經(jīng)無(wú)菌Miracloth將原生質(zhì)體化反應(yīng)濾入兩個(gè)50ml無(wú)菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45ml。將原生質(zhì)體在2500rpm離心5分鐘以獲得沉淀并棄去上清。用20ml體積的溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸于10ml溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)器對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清。在溶液B中重懸原生質(zhì)體以產(chǎn)生～1×107/100μl。在冰上，將100μl原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的15ml管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)一管。以不超過(guò)10μl的體積加入10μgDNA。加入溶液C(12.5μl)，溫和混勻并在冰上溫育20分鐘。
0216將MMSA頂層瓊脂(每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)3管，每管10ml)熔化并保持在55℃。從冰中移出原生質(zhì)體，并向每管中加入溶液C(1ml)和溶液B(2ml)，溫和混勻各管。向3個(gè)頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入1ml原生質(zhì)體混合物，并將頂層瓊脂倒在MMSA板上。為每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)重復(fù)此過(guò)程，并將板在30℃溫育4-7天。
0217溶液A(每500ml)-0.44g K2HPO4；0.34g KH2PO4；48.156g無(wú)水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至終體積500ml，pH 5.5。將溶液過(guò)濾滅菌并在室溫下保存。
0218原生質(zhì)體化溶液-將180單位的β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products，Inc.，CA)或者450mg β-D-葡聚糖酶和150mg Driselase(InterSpex Products，Inc.)溶解于40ml溶液A中，并將溶液過(guò)濾滅菌，0.2微米。
0219溶液B(每500ml)-5ml 1M Tris，pH 7.5；2.77gCaCl2(FW 110.99)；109.32g山梨醇(FW 182.2；1.2M)；加入dlH2O至終體積500ml。將此溶液過(guò)濾滅菌并在室溫下保存。
0220溶液C(每500ml)-250g PEG 4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH 7.5；加入dlH2O至終體積500ml。將此溶液過(guò)濾滅菌。
0221MMS瓊脂-將6g/LNaNO3；0.52g/L KCl；1.52g/L KH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素(見(jiàn)下)；10g/L瓊脂(頂層瓊脂中的低熔點(diǎn)瓊脂糖)溶解于1L dlH2O。高壓滅菌。滅菌后，在無(wú)菌條件下加入10ml 50％葡萄糖和1.25ml 20％MgSO4·7H2O。
0222MMSA瓊脂，MMS中的硝酸鹽用0.59g/L乙酰胺和3.4g/L CsCl代替。
0223痕量元素溶液-將1g/L FeSO4·7H2O；8.8g/L ZnSO4·7H2O；0.4g/LCuSO4·5H2O；0.15g/L MnSO4·4H2O；g/L Na2B4O7·10H2O；50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O溶解于250ml dlH2O中。混勻并加入0.2ml濃HCl，溶解并用dlH2O定容至1L，過(guò)濾滅菌。
0224WCWM肉湯(1升)＝(NH4)2SO4，3.5g；DIFCO酵母提取物，4g；馬鈴薯葡萄糖淀粉(Potato Dextrose Starch)，6g；Mazu，1ml和Cerelose，2.2g。
0225WCWM+CD(1升)＝(NH4)2SO4，3.5g；Tastone 210酵母提取物，4g；馬鈴薯葡萄糖肉湯，20g；和DIFCO Czapek Dox，20g。
實(shí)施例5用編碼AkAA的asaA基因轉(zhuǎn)化的里氏木霉和黑曲霉的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中酶的表達(dá)(A).木霉克隆0226一般而言，遵循如在Foreman等(Foreman等，(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的發(fā)酵方案。更具體而言，對(duì)于每個(gè)菌株進(jìn)行兩組發(fā)酵，如圖6A所示。將含5％葡萄糖的0.8 L Vogels基本培養(yǎng)基(Davis等，(1970)METHODS IN ENZYMOLOGY 17A1，pg 79-143和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM，Oxford University Press，(2000))用1.5ml冷凍孢子懸浮液進(jìn)行接種。48小時(shí)后，將每一培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至14L Biolafitte發(fā)酵罐中的6.2L相同培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐在25℃、750 RPM以及每分鐘8標(biāo)準(zhǔn)升氣流的條件下運(yùn)行。在最初的葡萄糖被耗盡后一小時(shí)，開(kāi)始給予25％(w/w)的乳糖給料并以碳限制的方式給料以防止乳糖積累。用葡萄糖氧化酶分析試劑盒或者帶有β-半乳糖苷酶的葡萄糖己糖激酶分析試劑盒分別對(duì)葡萄糖和乳糖的濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述β-半乳糖苷酶被添加用于切割乳糖(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)。
0227以規(guī)律的時(shí)間間隔取樣以監(jiān)測(cè)發(fā)酵的進(jìn)程。在International EquipmentCompany(Needham Heights，MA)臨床用離心機(jī)上，將采集的樣品在50ml離心管中以3/4速度旋轉(zhuǎn)離心。在還原性條件下，用MOPS(嗎啉丙磺酸)SDS電泳緩沖液和LDS樣品緩沖液對(duì)樣品上清液在4-12％BIS-TRIS SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳(圖6A)。
0228在其它發(fā)酵中，對(duì)樣品上清液進(jìn)行的處理基本如上所述。但是，不同比例的完整型和截短型Tr-asaA被獲得。圖6B，泳道2示出50至90kD之間的三條主要條帶。用本領(lǐng)域已知的改進(jìn)方法將膠中的這三條主要條帶消化(Hellman等，(1995)Anal.Biochem.224451-455)。肽被抽提，用反向HPLC分離，并測(cè)定肽質(zhì)量和ms/ms碎裂方式。所獲得的肽圖證實(shí)了兩條較低分子量的條帶為截短型。一個(gè)條帶代表截短型asAA，其中剪切是發(fā)生在SEQ ID NO3的434位氨基酸和580位氨基酸之間，第二條帶代表截短型asAA，其中剪切是發(fā)生在SEQ ID NO3的大約581位氨基酸。每一條帶都表現(xiàn)出α淀粉酶和顆粒淀粉水解活性。
(B).曲霉克隆0229葡糖淀粉酶和河內(nèi)曲霉α淀粉酶兩者的表達(dá)在黑曲霉轉(zhuǎn)化子(按如上所述獲得)中被分析。葡糖淀粉酶活性和α淀粉酶活性通過(guò)HPLC用來(lái)自轉(zhuǎn)化子的樣品上清液來(lái)測(cè)量。在被分析的27個(gè)轉(zhuǎn)化子中，至少22個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生0.5mg/ml以上的AkAA。此外，至少22個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生至少25％的親本對(duì)照的葡糖淀粉酶(根據(jù)活性)。這些轉(zhuǎn)化子中的至少6個(gè)產(chǎn)生1.5mg/ml以上的AkAA。這些結(jié)果中的一些在下面的表1中示出。
表1葡糖淀粉酶和河內(nèi)曲霉α淀粉酶在黑曲霉中的共表達(dá)

實(shí)施例6從天然曲霉宿主和里氏木霉宿主獲得的AkAA的pH穩(wěn)定性的比較0230將如上所述在里氏木霉中重組產(chǎn)生的AkAA樣品(Tr-asaA)和天然asaA的樣品用pH 4.5的20mM乙酸鹽緩沖液稀釋至相等的蛋白濃度。反應(yīng)在50℃，3至7的pH水平，在100mM檸檬酸鹽/NaOH緩沖液中進(jìn)行30分鐘。將1.0mL反應(yīng)物加入到樣品管中的5mL含10％的玉米淀粉(Cargill Foods，MN)的pH 4.5的100mM乙酸鹽中。將管在50℃搖蕩20分鐘。然后加入0.5mL 2.0％NaOH。將管旋轉(zhuǎn)離心，并用二硝基水楊酸(DNS)試驗(yàn)對(duì)0.5mL上清液中的還原糖進(jìn)行分析(Goto等，(1994)supra)。結(jié)果在圖7中描述。r-asaA在pH 3.9表現(xiàn)出100％的殘留活性。相比之下，n-asaA在pH 4.5表現(xiàn)出100％的殘留活性。
實(shí)施例7在SSF中用表達(dá)AkAA的里氏木霉由非熟化的碾碎的全玉米底物(non-cookedwhole ground corn substrate)生產(chǎn)乙醇0231對(duì)里氏木霉產(chǎn)生的AkAA在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物濾液所含的兩個(gè)葡糖淀粉酶水平(0.5和1.0 GAU/g)進(jìn)行評(píng)價(jià)。葡糖淀粉酶從黑曲霉組合物獲得。百分之三十六的玉米粉漿液被制備，含干玉米漿(2.5％的玉米粉)。將漿液的pH用稀硫酸調(diào)至4.8。漿液的總干固體為33.85％。在含100gm醪(漿液)的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。加入所需水平的酶，然后加入3ml增殖的酵母的漿體以開(kāi)始發(fā)酵。該酵母接種物是通過(guò)將0.26gm干Fali酵母加入到100gm含GA活性的醪中而制備的，所述GA活性為每克原材料固體0.9 GAU。將此漿液放入32℃水浴中，溫和混合大約17小時(shí)。在各時(shí)間間隔，取出發(fā)酵樣品(啤酒)用于HPLC分析。72小時(shí)后，終止發(fā)酵，并將啤酒在60℃干燥以獲得蒸餾器干谷物和可溶物(the distillers dry grains plussolubles，DDGS)。
0232測(cè)定DDGS的淀粉含量，并辨認(rèn)出終止發(fā)酵之后啤酒中的不溶性固體，通過(guò)加入碘對(duì)其中的淀粉進(jìn)行檢測(cè)。表2總結(jié)了乙醇水平、醪固體的碘染色以及DDGS的淀粉百分比(％)。
表2在酵母發(fā)酵條件下將顆粒玉米淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉倪^(guò)程中asaA的作用


實(shí)施例8通過(guò)葡糖淀粉酶和α淀粉酶對(duì)顆粒淀粉底物的轉(zhuǎn)化0233將不同來(lái)源的商業(yè)上的α淀粉酶與Tr-asaA在同步糖化發(fā)酵條件下進(jìn)行比較，其中存在商業(yè)GA來(lái)源的葡糖淀粉酶，量為0.5GAU/g ds。使用如前面所述的可溶性淀粉底物(SSU)分析法，測(cè)定商業(yè)上的α淀粉酶的活性。
0234如實(shí)施例7中所述，使用碾碎的全玉米進(jìn)行乙醇發(fā)酵。以每克碾碎玉米1.0 SSU的量加入各種來(lái)源的α淀粉酶，以每克0.5GAU的量加入葡糖淀粉酶。
0235α淀粉酶包括里氏木霉表達(dá)和產(chǎn)生的AkAA，具有SSU/ml，90；SPEZYMELTAA(解淀粉芽孢桿菌)，具有SSU/ml，2,759；SPEZYME FRED(地衣芽孢桿菌)，具有SSU/ml，4,842；SPEZYME Ethyl(嗜熱脂肪芽胞桿菌)，具有SSU/ml，22,082；以及CLARASE L(米曲霉)，具有SSU/ml，23,087。
0236在發(fā)酵過(guò)程中取樣并分析乙醇含量。發(fā)酵后，分離不溶性固體(DDGS)，并測(cè)定在pH 5.0時(shí)玉米醪中的殘留淀粉含量。結(jié)果在表3中被概括。
表3平均％v/v EtOH

實(shí)施例9
底物處理對(duì)乙醇產(chǎn)量和蒸餾器干酒糟固體(DDGS)的影響0237碾碎的全玉米底物經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的干磨工藝處理以便用于燃料酒精發(fā)酵，其中使用錘磨機(jī)來(lái)減小顆粒尺寸。制備出三種不同的醪。
0238處理1(Trt1)是高溫處理，其涉及用3.5U/g SPEZYME ETHYL在pH 5.6，按照現(xiàn)有工藝程序通過(guò)噴射蒸煮將含0.9％干玉米漿(dry corn steep，DCS)的36％ds玉米粉漿液分批液化。將漿液放入90℃浴中1.5小時(shí)，混合，然后冷卻至30℃，用稀硫酸將pH調(diào)至5.0。進(jìn)一步用水將漿液稀釋至32.71％ds。
0239處理2 (Trt2)是低溫處理。醪是通過(guò)將用稀硫酸將pH調(diào)至5.0的含0.9％DCS的36％玉米粉漿液在60℃溫育3小時(shí)而制成的。溫育前，加入0.05 GAU/g的葡糖淀粉酶。
0240處理3(Trt3)是室溫處理(未加熱處理)-玉米漿液是在室溫下獲得，然后被用于發(fā)酵，所述發(fā)酵使用每克玉米0.5 GAU的葡糖淀粉酶以及每克玉米1.0 SSU的由里氏木霉產(chǎn)生的AkAA。
0241然后對(duì)每組處理進(jìn)行酵母發(fā)酵，如實(shí)施例7中所述。
0242發(fā)酵后，測(cè)定乙醇產(chǎn)量，并通過(guò)離心分離出每一處理組的不溶性同體，將其在60℃干燥，并測(cè)定總碳水化合物含量和氮含量。結(jié)果在表4中示出。
表4在使用酵母進(jìn)行的乙醇發(fā)酵條件下碾碎的全玉米底物的不同處理組的乙醇產(chǎn)量和DDGS組成的比較

實(shí)施例10用黑曲霉α淀粉酶和葡糖淀粉酶的共表達(dá)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乙醇0243乙醇的產(chǎn)生(％v/v)被評(píng)價(jià)，其中葡糖淀粉酶劑量水平為0.75 GAU/g ds，并且對(duì)于轉(zhuǎn)化子#10，α淀粉酶劑量水平為9.90 SSU/g ds，對(duì)于轉(zhuǎn)化子#26，α淀粉酶劑量水平為4.29 SSU/g ds(參見(jiàn)實(shí)施例5B，轉(zhuǎn)化子#10和轉(zhuǎn)化子#26)。含33％DS的100g玉米漿是由Azure玉米粉(8.95％含水量)制成的。將漿液的pH調(diào)至pH 4.5，并在125ml燒瓶中添加1mL的20％Fali酵母(400ppm)，在32℃進(jìn)行發(fā)酵。在24、48和70小時(shí)，測(cè)量上清液中的乙醇(％v/v)表5

權(quán)利要求
1.一種曲霉真菌菌株，包含編碼葡糖淀粉酶的DNA和編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的異源α淀粉酶的DNA，其中所述葡糖淀粉酶和所述異源α淀粉酶均由所述曲霉真菌菌株表達(dá)并分泌。
2.權(quán)利要求1所述的曲霉菌株，其中所述異源α淀粉酶與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性。
3.權(quán)利要求1所述的曲霉菌株，其中所述菌株是黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)或者泡盛曲霉(A.awamori)菌株。
4.權(quán)利要求3所述的曲霉菌株，其中所述曲霉菌株是黑曲霉菌株。
5.權(quán)利要求3所述的曲霉菌株，其中所述菌株是過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的菌株。
6.一種培養(yǎng)基，包含權(quán)利要求1所述的曲霉菌株。
7.一種酶組合物，包含權(quán)利要求1所述的曲霉菌株。
8.一種酶組合物，包含權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基。
9.一種曲霉菌株，包含a)編碼內(nèi)源葡糖淀粉酶的DNA和b)編碼與SEQ IDNO3具有至少95％序列同一性的異源α淀粉酶的DNA，其中所述曲霉菌株表達(dá)所述葡糖淀粉酶和所述異源α淀粉酶，并且過(guò)量產(chǎn)生所述葡糖淀粉酶。
10.一種培養(yǎng)基，包含權(quán)利要求9所述的曲霉菌株。
11.一種用曲霉細(xì)胞生產(chǎn)α淀粉酶的方法，包括將能夠表達(dá)與SEQ ID NO3或者SEQ ID NO4具有至少90％序列同一性的異源α淀粉酶多肽的曲霉細(xì)胞在適于表達(dá)和生產(chǎn)所述異源α淀粉酶的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)所述異源α淀粉酶。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述曲霉細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼內(nèi)源葡糖淀粉酶的多核苷酸，并且其中所述葡糖淀粉酶被表達(dá)和生產(chǎn)。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述曲霉是黑曲霉菌株。
14.權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括回收所生產(chǎn)的α淀粉酶和葡糖淀粉酶。
15.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述曲霉菌株是過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的菌株。
16.一種用絲狀真菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)酸穩(wěn)定性α淀粉酶和葡糖淀粉酶的方法，包括a)通過(guò)用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，在絲狀宿主中共表達(dá)葡糖淀粉酶和α淀粉酶，所述DNA構(gòu)建物包含在所述宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子被可操縱地連接于編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的α淀粉酶的多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞還表達(dá)和產(chǎn)生葡糖淀粉酶；b)將所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中，以使所述α淀粉酶和所述葡糖淀粉酶被表達(dá)，和c)生產(chǎn)所述α淀粉酶和所述葡糖淀粉酶。
17.權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述生產(chǎn)的葡糖淀粉酶和α淀粉酶。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的絲狀宿主細(xì)胞是曲霉菌株。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的曲霉菌株是黑曲霉菌株。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的曲霉菌株是過(guò)量產(chǎn)生葡糖淀粉酶的菌株。
21.一種水解淀粉的方法，包括將含淀粉底物與權(quán)利要求7所述的酶組合物在用于淀粉水解的合適條件下接觸并獲得水解的淀粉。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的淀粉是顆粒淀粉。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的接觸是在低于所述的底物中的顆粒淀粉的糊化溫度的溫度下進(jìn)行的。
24.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的底物是谷物或其分離的部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及異源α淀粉酶和內(nèi)源葡糖淀粉酶在曲霉菌株中的共表達(dá)和生產(chǎn)以及包含它們的酶組合物。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101084308SQ200580040659
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者T·L·鮑德溫, K·A·克萊森, N·頓－科爾曼, S·E·蘭茲 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司