含有α,α-海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的是制備方法，所述制備方法可以將淀粉作為原料，通過連續(xù)的步驟，以優(yōu)異的對淀粉收率，制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末。通過提供含有基于無水物換算的98.0質(zhì)量％以上的α,α-海藻糖的α,α-海藻糖二水合物晶體粉末的制備方法而解決上述課題，所述含有α,α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法含有如下步驟，使異淀粉酶和環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶與來源于節(jié)桿菌屬微生物的α-糖基海藻糖合酶和來源于節(jié)桿菌屬微生物的海藻糖分離酶作用于液化淀粉，接著，使葡糖淀粉酶發(fā)揮作用，得到含有α,α-海藻糖的糖液的步驟，從上述糖液，使α,α-海藻糖二水合物晶體結(jié)晶的步驟，以及，通過離心分離而收集結(jié)晶的α,α-海藻糖二水合物晶體，使其熟化、干燥的步驟，所述方法特征是，通過使用作為上述環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的來源于類芽孢桿菌屬微生物的天然型或者重組型酶或者它們的突變體酶，不經(jīng)過采用柱色譜法的分餾步驟，使得上述糖液中的α,α-海藻糖含量超過基于無水物換算的86.0質(zhì)量％。
【專利說明】含有α, α-海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明，涉及含有α，α-海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法，詳細(xì)地說，涉及含有α，α-海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法和通過所述制備方法得到的含有α，α -海藻糖二水合物晶體的粉末，所述方法從淀粉，通過連續(xù)的步驟，以優(yōu)異收率，適于工業(yè)地制備含有高純度的α，α-海藻糖二水合物晶體的粉末。
【【背景技術(shù)】】
[0002]作為含有α，α-海藻糖(在下文，本說明書簡稱為“海藻糖”。)的二水合物晶體的粉末的制備方法，迄今為止已知多種方法。例如，專利文獻(xiàn)I中公開了制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末的方法，所述方法使β_淀粉酶或者β_淀粉酶和異淀粉酶作用于液化淀粉，接著，使麥芽糖?海藻糖轉(zhuǎn)換酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，將其適宜精制后，使海藻糖結(jié)晶，從而制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末，專利文獻(xiàn)2中公開了制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末的方法，所述方法使異淀粉酶和α-糖基海藻糖合酶(別稱“非還原性碳水化合物合酶”)以及海藻糖分離酶作用于液化淀粉，此外使葡糖淀粉酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，將其適宜精制后，使海藻糖結(jié)晶，從而制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末。
[0003]此外，專利文獻(xiàn)3、4中公開了含有海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法，所述方法在專利文獻(xiàn)2中公開的上述制備方法中，聯(lián)用異淀粉酶和環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(在下文，簡稱為“CGT酶”。)，通過使上述的酶與α-糖基海藻糖合酶以及海藻糖分離酶一同發(fā)揮作用，使得上述含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量升高。此外，專利文獻(xiàn)5、6中，公開了制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末的方法，所述方法使來自屬于硫化葉菌屬(Sulfolobus)的微生物的耐熱性的α-糖基海藻糖合酶，或者耐熱性的α-糖基海藻糖合酶和耐熱性的海藻糖分離酶作用于液化淀粉，得到含有海藻糖的糖液，將其適宜精制后，使海藻糖結(jié)晶，從而制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末。
[0004]在這些公知的制備方法中，采用上述專利文獻(xiàn)3、4中公開的各酶的組合情況下，將液化淀粉作為原料、不經(jīng)過采用柱色譜法的分餾步驟，僅僅通過酶反應(yīng)，可以容易地制備含有海藻糖的糖液，所述糖液海藻糖含量基于無水物換算超過80質(zhì)量％，并且，如此制備的含有海藻糖的糖液的組分除海藻糖以外，大部分是葡萄糖，因此，具有海藻糖結(jié)晶性好的優(yōu)點(diǎn)。因此，在采用上述專利文獻(xiàn)3、4中公開的制備方法的情況下，使海藻糖二水合物晶體由上述含有海藻糖的糖液結(jié)晶，通過離心分離收集晶體的分蜜方式，可以以優(yōu)異收率制備含有較高純度海藻糖二水合物晶體的粉末。
[0005]具體地說，在上述專利文獻(xiàn)3、4中公開的制備方法中，在使用α-糖基海藻糖合酶以及作為海藻糖分離酶的來自屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的微生物的酶的情況下，屬于節(jié)桿菌屬的微生物繁殖較快，此外，上述酶生產(chǎn)力也高，因此，在適于工業(yè)規(guī)模制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末方面是極其有利的。由于這個(gè)原因，本 申請人:，現(xiàn)在，使用α-糖基海藻糖合酶以及作為海藻糖分離酶的來自屬于節(jié)桿菌屬的微生物的酶，通過上述專利文獻(xiàn)3、4中公開的制備方法，制備含有高純度海藻糖二水合物晶體的粉末(商品名為“卜 > 、株式會社林原銷售、制品規(guī)格的海藻糖純度:98.0質(zhì)量％以上。在下文，稱為“食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末”。)，所述高純度海藻糖二水合物晶體的粉末主要作為食品原料、化妝品原料等銷售。但是，真實(shí)的情況是，在采用本發(fā)明制備方法情況下，目前，即使在將多種酶反應(yīng)條件最優(yōu)化的情況下，通過酶反應(yīng)得到的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量，基于無水物換算也僅僅為約85質(zhì)量％左右，對淀粉收率達(dá)不到40質(zhì)量％。
[0006]—方面，非專利文獻(xiàn)1、2中公開了，通過使來自硫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的耐熱性α -糖基海藻糖合酶、耐熱性海藻糖分離酶以及耐熱性異淀粉酶的各基因分別由大腸桿菌表達(dá)而制備的重組酶、或?qū)⒉课惶禺惖淖儺惲硗鈱?dǎo)入所述重組酶從而制造的突變體酶組合作用于可溶性淀粉，得到海藻糖含量基于無水物換算為87質(zhì)量％左右的含有海操糖的糖液。
[0007]但是，非專利文獻(xiàn)1、2中，作為原料使用的可溶性淀粉是通過經(jīng)由酸處理淀粉除去淀粉粒內(nèi)無定形部分而制備的非常特殊且昂貴的原料，即使得到例如海藻糖含量升高的酶反應(yīng)液，將可溶性淀粉用作含有海藻糖二水合物晶體的粉末的適于工業(yè)的生產(chǎn)用的原料，從成本的角度看，絕對是不可能的。此外，非專利文獻(xiàn)1、2中公開的重組酶或突變體酶沒有作用于可溶性淀粉，而是作用于適于工業(yè)規(guī)模制備中使用的液化淀粉，在這種情況下，通過酶反應(yīng)得到的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量當(dāng)然少于87質(zhì)量％左右，僅為85質(zhì)量％左右，無法預(yù)期，可以將含有海藻糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率提高至目前的制備方法所能得到的收率以上的程度。
[0008]此外，如果僅僅將含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量提高至86.0質(zhì)量％以上，可以考慮，針對含有海藻糖的糖液應(yīng)用使用柱色譜法的柱分餾，收集含有大量海藻糖的級分。但是，如果進(jìn)行柱分餾，僅僅因?yàn)椴襟E增加就導(dǎo)致制備成本，此外，必然損失作為含有大量海藻糖的級分而收集的級分以外的級分中包含的海藻糖，因此，假設(shè)，即使通過柱分餾，得到基于無水物換算的海藻糖含量超過86.0質(zhì)量％的含有海藻糖的糖液，收集由所述糖液結(jié)晶的海藻糖二水合物晶體，制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末，也不能避免對淀粉收率大幅度降低。
[0009]此外，如果僅僅提高單一的對淀粉收率，也可以考慮采用所謂的全糖方式:不采用通過離心分離收集結(jié)晶的晶體的分蜜方式，而將含有結(jié)晶的晶體的糖膏取出并將其放入容器，使全部糖膏進(jìn)行晶體固化，將晶體固化的糖膏粉碎，或者，噴霧干燥糖膏，得到粉末。但是，存在以下不方便，在采用全糖方式情況下，結(jié)晶的海藻糖以及糖膏中包含的葡萄糖的這樣的制備方法中特有的共同的雜質(zhì)均共同被粉末化，因此，得到的含有海藻糖二水合物晶體的粉末中的海藻糖含量不高于糖膏的海藻糖含量以上，不能得到含有高純度的海藻糖二水合物晶體的粉末。
[0010]雖然淀粉是現(xiàn)在較豐富存在、便宜、容易地獲得的原料，但是，不是絕對無限存在的物質(zhì)，限于一年期間地球人類生產(chǎn)的淀粉的總量。同時(shí)，淀粉的用途廣泛，除了迄今為止的適于工業(yè)的用途、食品用，飼料用，或者作為食品原料的用途之外，近年，由于大量需要清潔能量，淀粉也被新用作生物乙醇等的燃料原料。在這樣的情況下，從有效利用有限的資源方面來看，提高制品，即，含有海藻糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率是極其重要的。
[0011]【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】[0012]【專利文獻(xiàn)】
[0013]【專利文獻(xiàn)1】特開平7-170977號公報(bào)
[0014]【專利文獻(xiàn)2】特開平7-213283號公報(bào)
[0015]【專利文獻(xiàn)3】特開平8-73504號公報(bào)
[0016]【專利文獻(xiàn)4】特開2000-228980號公報(bào)
[0017]【專利文獻(xiàn)5】特開平8-66188號公報(bào)
[0018]【專利文獻(xiàn)6】特開平8-66187號公報(bào)
[0019]【非專利文獻(xiàn)】
[0020]【非專利文獻(xiàn)I】7r > (Fang)等人、'7' \ — f卟?才7'.7*夕''丨J力卟予二 9卟.7*
>F'.7 — K.^ ^ 7-卜 'J 一 (Journal of Agricultural and Food Chemistry) >2007 年、第55卷、5588至5594頁
[0021]【非專利文獻(xiàn)2】7r > (Fang)等人、'7' \ — f卟?才7'.7*夕''丨J力卟予二 9卟.7*
>F'.7— K.^ ^ 7-卜 'J 一 (Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2008 年、第56卷、5628至5633頁
[0022]【發(fā)明概述】
[0023]【發(fā)明解決的課題】
[0024]本發(fā)明的目的是，克服上述以往含有海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法中的不方便，保持海藻糖的純度，顯著提高含有海藻糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率，因此，本發(fā)明的課題是提供含有海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法和通過所述制備方法制備的新的含有海藻糖二水合物晶體的粉末，所述方法可以將淀粉作為原料、通過連續(xù)的步驟、以優(yōu)異收率、適于工業(yè)的規(guī)模制備含有高純度的海藻糖二水合物晶體的粉末。
[0025]【為了解決課題的手段】
[0026]為了解決上述的課題，本發(fā)明人，針對上述專利文獻(xiàn)3、4中公開的制備方法使用的多種酶的組合，反復(fù)進(jìn)行多種研究和嘗試失敗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)作為α -糖基海藻糖合酶以及海藻糖分離酶，使用來源于微生物培養(yǎng)容易、酶生產(chǎn)力也高的屬于節(jié)桿菌屬的微生物的酶時(shí)，作為與這些酶一同使用的CGT酶，不采用迄今使用的來源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌屬(Geobacillus stearothermophilus) Tc_91 株(FERM BP-11273)的 CGT 酶，而使用來源于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)微生物的天然型或者重組型CGT酶或者它們的突變體酶，從而使海藻糖生成反應(yīng)效率更加優(yōu)異地進(jìn)行，不經(jīng)過采用柱色譜法的分餾步驟，可以將葡糖淀粉酶處理步驟后的含有海藻糖的糖液中的海藻糖含量提高至，基于無水物換算的86.0質(zhì)量％水平以上，優(yōu)選87.0質(zhì)量％以上。發(fā)現(xiàn)，然后，按照常規(guī)方法，將如此得到的含有海藻糖的糖液脫色、脫鹽，濃縮，使海藻糖二水合物晶體結(jié)晶、通過離心分離收集得到的晶體，使其熟化，干燥，可以以比以往更加高的對淀粉收率制備含有高純度的海藻糖二水合物晶體的粉末，所述粉末含有基于無水物換算的98.0質(zhì)量％以上的海藻糖，從而完成本發(fā)明。
[0027]即，本發(fā)明通過提供含有基于無水物換算的98.0質(zhì)量％以上的海藻糖的海藻糖二水合物晶體的制備方法，解決上述課題，所述制備方法是含有海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法，所述方法含有如下步驟:使異淀粉酶、以及CGT酶、和來源于節(jié)桿菌屬微生物的α-糖基海藻糖合酶、和來源于節(jié)桿菌屬微生物的海藻糖分離酶作用于液化淀粉，接著，使葡糖淀粉酶發(fā)揮作用，從而得到含有海藻糖的糖液的步驟，從上述糖液使海藻糖二水合物晶體結(jié)晶的步驟，以及，通過離心分離而收集結(jié)晶的海藻糖二水合物晶體，使其熟化、干燥的步驟，所述方法特征是，通過使用作為上述CGT酶的來源于類芽孢桿菌屬微生物的天然型或者重組型酶或者它們的突變體酶，不經(jīng)過采用柱色譜法的分餾步驟，使得上述糖液中的海藻糖含量超過基于無水物換算的86.0質(zhì)量％。
[0028]根據(jù)本發(fā)明人確認(rèn)，通過上述本發(fā)明制備方法制備的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的海藻糖純度相當(dāng)良好，流動(dòng)性良好，是與以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末相比毫不遜色的粉末，所述粉末，與以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末同樣，可以在作為食品原料、化妝品原料等廣泛的領(lǐng)域中使用。
[0029]此外，作為CGT酶的供給源的屬于上述類芽孢桿菌屬的微生物，包括例如，依利諾斯類芽抱桿菌(Paenibacillus illinoisensis)、飼料類芽抱桿菌(Paenibacilluspabuli),或者,溶淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus),其中，依利諾斯類芽孢桿菌或者飼料類芽孢桿菌，因?yàn)楫a(chǎn)生提高海藻糖生成反應(yīng)反應(yīng)液中的海藻糖含量效果大的CGT酶，所以是優(yōu)選的，尤其是優(yōu)選依利諾斯類芽孢桿菌。
[0030]此外，作為上述CGT酶，尤其是，適宜地使用的是具有下述(a)至(d)中顯示的部分氨基酸序列的酶:
[0031](a) Gly-Ser-X1-Ala-Ser-Asp ；
[0032](b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn ；
[0033](c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys ； [0034](d) Val-Asn-Ser-Asn-X2-Tyr0
[0035](其中，X1意指Ala或者Ser,X2意指Ala或者Thr。)
[0036]此外，為了舉例說明作為本發(fā)明使用的CGT酶的其他適宜的酶，可以舉出具有序列表序列編號1、2、3、12或者13中的任一個(gè)所示的氨基酸序列的CGT酶。
[0037]本發(fā)明人，進(jìn)一步反復(fù)進(jìn)行嘗試經(jīng)歷失敗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)由含有基于無水物換算的超過86.0質(zhì)量％、優(yōu)選87.0質(zhì)量％以上的海藻糖的上述含有海藻糖的糖液使海藻糖二水合物結(jié)晶時(shí)，如果應(yīng)用下文所述的控制冷卻法或者擬似控制冷卻法，與通過使含有海藻糖的糖液的溫度自然降低的自然冷卻法而使海藻糖二水合物結(jié)晶的情況相比，可以進(jìn)一步提高得到的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率。即，本發(fā)明也通過提供如下含有海藻糖二水合物晶體的粉末的制備方法，解決上述的課題，所述方法，在上述本發(fā)明制備方法中，使上述海藻糖二水合物晶體結(jié)晶的步驟，通過控制冷卻法或者擬似控制冷卻法進(jìn)行。
[0038]此外，雖然當(dāng)應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法時(shí)，提高對淀粉收率的原因不確定，但是，通過控制冷卻法或者擬似控制冷卻法，在結(jié)晶初期中，抑制冷卻導(dǎo)致的突然的過飽和度的上升和第二次的晶體核的形成，大小幾乎一致的微小晶體核多數(shù)生成，在微小晶體核多數(shù)都出現(xiàn)的結(jié)晶后期中通過快速冷卻，使得大小一致的多數(shù)晶體核同時(shí)成長，因此，得到含有微晶體少的粒徑連續(xù)的晶體的糖膏，采用離心分離容易地收集晶體，通過較少量的水可以洗滌收集的晶體，因此，可以推測的是，也減少洗滌時(shí)的海藻糖的損失。
[0039]另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如上所述地，在海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶時(shí)，通過應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法制備的含有海藻糖二水合物晶體的粉末，與通過自然冷卻法制備的含有海操糖水合物晶體的粉末和以往食品級含有海操糖二水合物晶體的粉末相t匕，出人意料地在固結(jié)難方面出色。然后，確認(rèn)這樣的出色的物性是由含有海藻糖二水合物晶體的粉末的海藻糖純度和海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度的差異造成的，從而完成關(guān)于含有海藻糖二水合物晶體的粉末本身的本發(fā)明。
[0040]即，本發(fā)明通過提供含有海藻糖二水合物晶體的粉末，解決上述的課題，所述粉末通過本發(fā)明制備方法得到，所述方法當(dāng)使海藻糖二水合物晶體結(jié)晶時(shí)，應(yīng)用上述控制冷卻法或者擬似控制冷卻，所述海藻糖二水合物晶體的粉末含有基于無水物換算的99.0質(zhì)量％以上且99.6質(zhì)量％以下的海藻糖、基于粉末X射線衍射圖譜算出的海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度是90.0%以上且96.0%以下。
[0041] 此外，根據(jù)本發(fā)明人確認(rèn)，含有基于無水物換算的99.0質(zhì)量％以上且99.6質(zhì)量％以下的海藻糖、基于粉末X射線衍射圖譜算出的海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度是90.0%以上且96.0%以下的含有海藻糖二水合物晶體的粉末，海藻糖含量與以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末具有相同程度或稍高程度，同時(shí)，海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度與食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末相比顯著更高，是可以與以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末區(qū)分開的新粉末。
[0042]此外，雖然不確定通過應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法，得到固結(jié)難的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的原因，但是，推測可能原因是，通過控制冷卻法或者擬似控制冷卻法，如上所述，得到了含有微晶體少的粒徑連續(xù)的晶體的糖膏，因此，得到的粉末的海藻糖的純度和海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度提高。所述推測也通過以下事實(shí)得到支持:通過應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法得到的本發(fā)明的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的海藻糖二水合物晶體結(jié)晶度，與自然冷卻得到的粉末和以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末的海藻糖二水合物晶體結(jié)晶度相比，顯著更高。
[0043]【發(fā)明的效果】
[0044]通過本發(fā)明制備方法，使用培養(yǎng)容易、酶生產(chǎn)力也高的來自屬于節(jié)桿菌屬的微生物的α -糖基海藻糖合酶和海藻糖分離酶，將淀粉作為原料，通過連續(xù)的步驟，可以以優(yōu)異的對淀粉收率、適于工業(yè)的規(guī)模制備含有高純度的海藻糖二水合物晶體的粉末。因此，造成的出色的優(yōu)點(diǎn)是，歸功于作為原料的淀粉資源的有效利用。具體地說，存在如下優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)使海藻糖二水合物晶體從含有海藻糖的糖液結(jié)晶時(shí)，在應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法的情況下，可以進(jìn)一步提聞制備的含有海操糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率。此外，通過應(yīng)用控制冷卻法或者擬似控制冷卻法的本發(fā)明制備方法制備的含有海藻糖二水合物晶體的粉末，與以往食品級含有海藻糖二水合物晶體的粉末相比，是海藻糖純度以及海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度更高、在固結(jié)難方面出色的粉末。
[0045]【附圖的簡要說明】
[0046]【圖1】是基本上由海藻糖二水合物晶體組成的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的由特征X射線產(chǎn)生的粉末X射線衍射圖譜的一個(gè)例子。
[0047]【圖2】是基本上由無定形部分組成的海藻糖粉末的由特征X射線產(chǎn)生的粉末X射線衍射圖譜的一個(gè)例子。
[0048]【圖3】是基本上由海藻糖二水合物晶體組成的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的由同步加速器放射光產(chǎn)生的粉末X射線衍射圖譜的一個(gè)例子。
[0049]【圖4】是基本上由無定形部分組成的海藻糖粉末的由同步加速器放射光產(chǎn)生的粉末X射線衍射圖譜的一個(gè)例子。[0050]【圖5】是顯示各種冷卻圖譜的圖。
[0051]【圖6】是表示含有來源于依利諾斯類芽孢桿菌NBRC15379株的CGT酶的基因的重組DNA “pRSET-1PI”的構(gòu)成以及相同的重組DNA的制限酶識別部位的圖。
[0052]【發(fā)明實(shí)施方式】
[0053]1.術(shù)語的定義
[0054]本說明書中以下的術(shù)語具有以下含義。
[0055]<對淀粉收率>
[0056]本說明書所說的“對淀粉收率”是以百分率)表示的比例，所述比例是得到的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的基于無水物換算的質(zhì)量與單位質(zhì)量的比例，所述單位質(zhì)量是原料淀粉的基于無水物換算的單位質(zhì)量。此外，在本說明書中，將淀粉作為原料，使酶作用于淀粉，通過所謂的生成海藻糖、使生成的海藻糖被結(jié)晶、收集、熟化、干燥的一系列的連續(xù)的步驟，制備含有海藻糖二水合物晶體的粉末，這被作為前提，因此，本說明書所說的“對淀粉收率”含義是，由使酶作用于淀粉而得到的從含有海藻糖的糖液最初結(jié)晶的、所謂的由第一晶體制備的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的對淀粉收率，本說明書所說的“對淀粉收率”不包含由第二晶體以后制備的含有海藻糖二水合物晶體的粉末，所述第二晶體是將收集結(jié)晶的晶體之后殘留的糖液或由糖膏分離的糖漿等返回糖液而進(jìn)行再度結(jié)晶的、所謂的第二晶體。此外，在 添加晶種而進(jìn)行結(jié)晶的情況下，對淀粉收率的算出中的晶種的量，在本說明書的通篇，包含在得到的含有海藻糖二水合物晶體的粉末的量中。
[0057]〈CGT酶的活性>
[0058]在本說明書中“CGT酶的活性”如以下一樣定義。即，對于含0.3% (w/v)可溶性淀粉、20mM醋酸緩沖液(pH5.5)、ImM氯化鈣的底物水溶液5ml，加適宜稀釋的酶液0.2ml,將底物溶液保持在40°C，反應(yīng)第O分鐘及反應(yīng)第10分鐘各采樣0.5ml底物溶液，立即加至
0.02N硫酸溶液15ml而停止反應(yīng)之后，向各硫酸溶液各加0.2ml的0.1N碘溶液而呈色，10分鐘后，由吸光光度計(jì)各自測定波長660nm中的吸光度，由下述式[I]作為淀粉分解活性算出。CGT酶的活性I單位定義為在這樣的測定條件下，使溶液中的淀粉15mg的碘呈色完全地消失的酶的量。
[0059]式[I]:
[0060]【數(shù)學(xué)公式I】
[0061]
【權(quán)利要求】
1.含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法，所述晶體粉末含有基于無水物換算的98.0質(zhì)量％以上的α，α-海藻糖，所述方法含有如下步驟:使異淀粉酶和環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶與來源于節(jié)桿菌屬微生物的α-糖基海藻糖合酶和來源于節(jié)桿菌屬微生物的海藻糖分離酶作用于液化淀粉，接著，使葡糖淀粉酶發(fā)揮作用，得到含有α, α-海藻糖的糖液的步驟，從上述糖液，使α，α -海藻糖二水合物晶體結(jié)晶的步驟，以及，通過離心分離而收集結(jié)晶的α，α-海藻糖二水合物晶體，使其熟化、干燥的步驟，所述方法特征是，通過使用作為上述環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的來源于類芽孢桿菌屬微生物的天然型或者重組型酶或者它們的突變體酶，不經(jīng)過采用柱色譜法的分餾步驟，使得上述糖液中的α，α-海藻糖含量超過基于無水物換算的86.0質(zhì)量％。
2.權(quán)利要求1所述的含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法，其中，上述類芽孢桿菌屬微生物是依利諾斯類芽孢桿菌、飼料類芽孢桿菌，或者，溶淀粉類芽孢桿菌。
3.權(quán)利要求1或者2所述的含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法，其中，上述環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是具有下述(a)至(d)顯示的部分氨基酸序列的酶:
(a)Gly-Ser-X1-Ala-Ser-Asp ；
(b)Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Asn-Asn；
(c)Lys-Met-Pro-Ser-Phe-Ser-Lys；
(d)Val-Asn-Ser-Asn-X2-Tyr, (其中，X1意指Ala或者Ser，X2意指Ala或者Thr)。
4.權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法，其中，上述環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是具有序列表序列編號1、2、3、12或者13中的任一個(gè)所示的氨基酸序列的環(huán)麥芽糖糊精-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。
5.權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末的制備方法，通過控制冷卻法或者擬似控制冷卻法進(jìn)行上述使α，α-海藻糖二水合物晶體結(jié)晶的步驟。
6.通過權(quán)利要求5所述的制備方法得到的含有α，α-海藻糖二水合物的晶體粉末，含有基于無水物換算的99.0質(zhì)量％以上且99.6質(zhì)量％以下的α，α-海藻糖，基于粉末X射線衍射圖譜算出的α，α-海藻糖二水合物晶體的結(jié)晶度是90.0%以上且96.0%以下。
【文檔編號】C07H3/04GK103946386SQ201280055581
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月21日
【發(fā)明者】澀谷孝, 伊澤精祐 申請人:株式會社林原