專利名稱：濃縮分泌的重組蛋白的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
殼多糖(幾丁質(zhì)，chitin)，一種N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的β-1，4-連接的無(wú)支鏈共聚物，構(gòu)成了地球上繼纖維素之后第二大最豐富的聚合物。它是昆蟲(chóng)外骨骼(Merzendorfer，H.，et al.，J.Exptl.Biol.2064393-4412(2003)，無(wú)脊椎動(dòng)物甲殼類的外殼和真菌細(xì)胞壁(Riccardo，A.，et al.″Native，industrial and fossil chitins，″inChitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser VerlagBasel，Switzerland(1999))的主要成分。殼多糖酶水解殼多糖的β-1，4-糖苷鍵，并且已經(jīng)在原核生物、真核生物和病毒生物體中發(fā)現(xiàn)。在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，殼多糖酶在有效的細(xì)胞分離方面具有形態(tài)學(xué)作用(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.26619758-19767(1991))。此外，植物表達(dá)殼多糖酶以抵抗含殼多糖的病原體。實(shí)際上，殼多糖基因在轉(zhuǎn)基因植物中的異源表達(dá)已顯示出增加對(duì)某些植物病原體的抗性(Carstens，M.，et al.Trans.Res.12497-508(2003)；Itoh，Y.，et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.67847-855(2003)；Kim，J.et al.Trans.Res.12475-484(2003))。根據(jù)氨基酸序列相似性，殼多糖酶屬于糖基水解酶家族18或家族19(Henrissat，B.，et al.Biochem.J.293781-788(1993))。殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域序列的家族性差異反映了它們不同的殼多糖水解機(jī)制，所述水解引起產(chǎn)物的端基構(gòu)型或是保持(家族18)或是翻轉(zhuǎn)(家族19)(Robertus，J.D.，et al.″The structure and action ofchitinases，″inChitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser VerlagBasel，Switzerland(1999))。
大多數(shù)殼多糖酶具有帶有各自獨(dú)立起作用的催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域的模塊結(jié)構(gòu)域組織。O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域常常將這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分開(kāi)，并且起到防止殼多糖酶的蛋白水解作用或幫助殼多糖酶分泌的作用(Arakane，Y.，Q.et al.Insect Biochem.Mol.Biol.33631-48(2003))。根據(jù)蛋白質(zhì)序列相似性，非催化性殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD，也稱作ChBDs)屬于三個(gè)結(jié)構(gòu)類型中的一種(1型、2型或3型)(Henrissat，B.″Classification of chitinases modules，″，Chitin andChitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser VerlagBasel，Switzerland(1999))。取決于不同的殼多糖酶，CBD的存在可以增強(qiáng)(Kuranda，M.，etal.J.Biol.Chem.26619758-19767(1991))或抑制(Hashimoto，M.，et al.J.Bacteriol.1823045-3054(2000))催化結(jié)構(gòu)域引起的殼多糖水解。
CBD的體積小(～5-7kDa)、其對(duì)殼多糖的底物親和特異性和高親和力使得它們被用作將蛋白質(zhì)固定于殼多糖表面的親和標(biāo)簽(Bernard，M.P.，et al.Anal.Biochem.327278-283(2004)；Ferrandon，S.，et al.Biochim.Biophys.Acta.162131-40(2003))。例如，環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)殼多糖酶A13型CBD已被用于將細(xì)菌中表達(dá)的融合蛋白固定在殼多糖珠子上，以便為內(nèi)含肽-介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接提供平臺(tái)(Ferrandon，S.，et al.Biochim.Biophys.Acta.162131-40(2003))和固定于殼多糖包被的微量滴定皿(Bernard，M.P.，et al.Anal.Biochem.327278-283(2004))。由于真核生物蛋白表達(dá)系統(tǒng)能夠進(jìn)行用細(xì)菌系統(tǒng)不可能進(jìn)行的生物學(xué)過(guò)程(例如，蛋白質(zhì)糖基化，分子伴侶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊等)，從真核細(xì)胞分泌CBD-標(biāo)記的蛋白質(zhì)也是被期待的。然而，許多真核細(xì)胞，特別是真菌，分泌內(nèi)源性殼多糖酶，由于其與CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)殼多糖結(jié)合位點(diǎn)，在殼多糖固定化應(yīng)用期間與CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)共同純化，和降解目標(biāo)殼多糖包被表面，使得CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)與殼多糖的固定化變得復(fù)雜。
從宿主細(xì)胞分泌到周圍培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)被大大稀釋，使得從大體積中純化的成本大并且麻煩。需要降低從蛋白質(zhì)在其中分泌的培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)的成本和增加其簡(jiǎn)便性。
存在許多方法從大體積培養(yǎng)基中純化蛋白質(zhì)。這些方法的不同之處在于成本、效率和實(shí)現(xiàn)純化所需的時(shí)間長(zhǎng)度。例如，分泌培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)可以通過(guò)沉淀來(lái)收集。此方法需要加入大量沉淀劑如硫酸銨、丙酮或三氯乙酸，隨后進(jìn)行離心或者過(guò)濾。這些制劑中的許多制劑是有毒的或是揮發(fā)性的，它們都顯著增加了蛋白質(zhì)收集的花費(fèi)。此外，沉淀可以引起蛋白質(zhì)功能的明顯丟失。
另一方法是應(yīng)用各種樹(shù)脂進(jìn)行層析，如陰離子/陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、疏水相互作用樹(shù)脂或尺寸排阻凝膠。通過(guò)層析收獲蛋白質(zhì)需要所有的耗盡培養(yǎng)基(spentculture medium)以緩慢的流速(一般為1-10ml/min)通過(guò)樹(shù)脂。在需要處理大量培養(yǎng)基的情況下，這是非常費(fèi)時(shí)的。例如，以5ml/min速率通過(guò)樹(shù)脂的100升耗盡培養(yǎng)基會(huì)花費(fèi)333小時(shí)來(lái)處理。此外，這些類型的層析樹(shù)脂不能選擇性地僅純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，必須與其它方法在多步驟純化方法中共同應(yīng)用。
特異結(jié)合摻入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的肽序列的親和層析樹(shù)脂常常被應(yīng)用，這是因?yàn)樗鼈兡軌蜻x擇性純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。在一個(gè)典型的策略中，肽序列(例如，肽抗體表位或六組氨酸序列)被工程化改造進(jìn)入所需蛋白質(zhì)的序列中。帶有這些標(biāo)記的、表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)特異地與相應(yīng)的樹(shù)脂(例如，具有固定化抗體的樹(shù)脂或用于六組氨酸結(jié)合的鎳樹(shù)脂)相互作用。雖然這些方法常常從小體積中產(chǎn)生高度純化蛋白質(zhì)，但由于其成本和性能，它們?cè)谔幚泶篌w積時(shí)受到實(shí)用性的限制。例如，抗體親和樹(shù)脂非常昂貴，鎳樹(shù)脂可以使得恰巧含有組氨酸殘基鏈的不需要的蛋白質(zhì)被共同純化。
應(yīng)用包括珠子在內(nèi)的磁載體的磁技術(shù)已經(jīng)被用于從培養(yǎng)基純化蛋白質(zhì)(Safarik et al.Biomagnetic Research and Technology 27(2004))。此方法的問(wèn)題是需要定制每一磁珠試劑，以結(jié)合各個(gè)分泌蛋白質(zhì)。這涉及將親和配體連接到珠子的復(fù)雜的化學(xué)過(guò)程。這在效率和成本上也有障礙。
在一些情況下，已經(jīng)利用了分泌蛋白質(zhì)和底物之間的天然親和性。例如，溶菌酶對(duì)殼多糖有結(jié)合親和性，因而在雞卵清酶暴露于殼多糖時(shí)，它可以被純化(Safarik et al.Journal of Biochemical and Biophysical Methods 27327-330(1993))。
概述 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了得到分泌的重組蛋白的濃縮制備物的方法，包括步驟(a)用含有DNA的載體轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)細(xì)胞，所述DNA編碼含有CBD和目標(biāo)蛋白的融合蛋白；(b)在所述宿主表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，并從其分泌所述融合蛋白；和(c)通過(guò)CBD將所述分泌的融合蛋白結(jié)合到殼多糖制備物，在非變性條件下，所述融合蛋白能夠被洗脫進(jìn)所需的緩沖體積，以獲得分泌的重組蛋白的濃縮制備物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了得到分泌的重組蛋白的濃縮制備物的方法，包括步驟(a)提供穿梭載體，其中所述穿梭載體(i)大腸桿菌中的質(zhì)粒并且整合到酵母表達(dá)細(xì)胞的基因組中，和(ii)含有DNA，所述DNA編碼含有CBD和目標(biāo)蛋白的融合蛋白；(b)用所述穿梭載體轉(zhuǎn)化殼多糖酶缺陷型宿主表達(dá)細(xì)胞，用于在所述酵母表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，并從其分泌所述融合蛋白；和(c)通過(guò)CBD將所述分泌的融合蛋白結(jié)合到殼多糖制備物，以獲得分泌的重組蛋白的濃縮制備物。
兩個(gè)實(shí)施方式均應(yīng)用穿梭載體進(jìn)行示范，在一些實(shí)施方式中，所述載體在大腸桿菌中能夠被克隆但是不表達(dá)，以及能夠在宿主表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)。這種類型的穿梭載體的一個(gè)例子是含有修飾LAC4啟動(dòng)子的穿梭載體，進(jìn)一步通過(guò)pKLAC1來(lái)示范。
兩個(gè)實(shí)施方案也均應(yīng)用殼多糖酶缺陷型的宿主表達(dá)細(xì)胞來(lái)示范。宿主表達(dá)系統(tǒng)可以是酵母細(xì)胞，例如，選白克魯維酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)種的單個(gè)酵母種。當(dāng)酵母細(xì)胞是克魯維酵母各個(gè)種時(shí)，它們可以選自馬克斯克魯維酵母變種脆壁克魯維酵母(fragilis)或乳酸克魯維酵母(lactis)。
在上述實(shí)施方式的例子中，可以在培養(yǎng)期間或培養(yǎng)末期將殼多糖加入培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞。當(dāng)進(jìn)一步培養(yǎng)時(shí)，殼多糖應(yīng)該是無(wú)菌的。殼多糖可以是涂層、膠體、珠、柱、基質(zhì)、片層或膜。當(dāng)殼多糖是珠時(shí)，所述珠可以是有孔的或無(wú)孔的。任選地，殼多糖珠可以被磁化。
當(dāng)通過(guò)施加磁力將融合蛋白結(jié)合于磁化殼多糖時(shí)，融合蛋白可以被回收。融合蛋白與殼多糖的結(jié)合任選地是可逆的，使得融合蛋白可以在不同于結(jié)合條件的非變性條件下從殼多糖釋放。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，克魯維酵母細(xì)胞制備物的特征在于殼多糖酶陰性表型，其中所述表型是表達(dá)分泌的殼多糖酶的殼多糖酶基因中的突變的結(jié)果，所述制備物可以生長(zhǎng)至與野生型克魯維酵母細(xì)胞相似的細(xì)胞密度。細(xì)胞密度是指培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的細(xì)胞干重(Colussi et al.Applied and EnvironmentalMicrobiology 712862-2869(2005))。
優(yōu)選地，克魯維酵母細(xì)胞的制備物能夠表達(dá)和分泌重組的融合蛋白。表達(dá)可以由LAC4啟動(dòng)子或其修飾物來(lái)調(diào)節(jié)，例如，應(yīng)用具有修飾的LAC4啟動(dòng)子的穿梭載體，用于在克魯維酵母中表達(dá)蛋白質(zhì)，而在大腸桿菌中基本上不表達(dá)蛋白質(zhì)。穿梭載體的一個(gè)例子是pKLAC1。
上述克魯維酵母細(xì)胞的制備物可以包括培養(yǎng)基，在其中，克魯維酵母至少能夠生長(zhǎng)或維持。培養(yǎng)基也可以含有無(wú)菌殼多糖。無(wú)菌殼多糖可以是能夠與放置在培養(yǎng)基或與含有培養(yǎng)基的容器接觸的磁體結(jié)合的磁珠形式。


圖1示出了蛋白質(zhì)印跡，其中乳酸克魯維酵母(K.lactis)分泌入耗盡培養(yǎng)基的三種蛋白質(zhì)與針對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)ChilA殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(α-CBD)產(chǎn)生的多克隆抗體交叉反應(yīng)(泳道1)，所述三種蛋白質(zhì)的大致質(zhì)量是＞200、85和50kDa。85kDa蛋白質(zhì)與殼多糖珠結(jié)合，并相應(yīng)于乳酸克魯維酵母殼多糖酶(泳道2)。
圖2(A)示出了多結(jié)構(gòu)域KlCts1p殼多糖酶，其帶有一個(gè)信號(hào)肽(條紋)、一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(灰色)、一個(gè)富含絲氨酸/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(白色)和一個(gè)殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(黑色)。信號(hào)肽切割發(fā)生在A19之后。
圖2(B)示出了KlCts1p屬于糖基水解酶家族18。預(yù)定的KlCts1p催化位點(diǎn)位于氨基酸150-158。這9個(gè)位點(diǎn)中的每一位點(diǎn)的可選氨基酸在括號(hào)中提供。(“X”代表任何氨基酸)。
圖2(C)示出了，KlCts1p含有2類殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。KlCts1p CBD與用SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)軟件預(yù)測(cè)的2類CBD共有序列(SEQ ID NO14)比對(duì)(Letunic，L，et al.Nucl.Acids Res.30242-244(2002)；Schultz，J.，et al.PNAS 955857-5864(1998))。所顯示的是KlCts1p CBD(SEQ ID NO15)與含有預(yù)測(cè)的2類CBD的示范性蛋白的比對(duì)，所述蛋白來(lái)自真菌(番茄葉霉菌(Cladosporium fulvum)(SEQ ID NO16)；品種特異性激發(fā)子(Race-specificelicitor)A4前體)，細(xì)菌(Ralsonia solanacearum(SEQ ID NO17)；Q8XZL0)，線蟲(chóng)(秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)(SEQ ID NO18)；可能的內(nèi)切殼多糖酶)，哺乳動(dòng)物(Homo sapiens(SEQ ID NO19)；殼多糖酶)和昆蟲(chóng)(黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(SEQ ID NO20)；可能的殼多糖酶3)。保守的半胱氨酸殘基以粗體印刷給出。
圖3示出了，乳酸克魯維酵母的缺失突變體不分泌KlCts1p，如殼多糖酶活性所確定。
圖3(A)示出了細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中30℃生長(zhǎng)22、44和68小時(shí)后測(cè)定的殼多糖酶活性?；钚詼y(cè)定為在pH 4.5和37℃下每分鐘從50mM 4MU-GlcNAc3釋放4-MU的速率(相對(duì)熒光單位，RFU/min)。
圖3(B)示出了，在相應(yīng)于缺失突變體的樣品的蛋白質(zhì)印跡中沒(méi)有檢測(cè)到分泌的殼多糖酶(泳道1)，而對(duì)于野生型，則容易地檢測(cè)到殼多糖酶(泳道2)。
圖4(A)示出了，在應(yīng)用α-CBD抗體的蛋白質(zhì)印跡上，存在來(lái)自乳酸克魯維酵母(KLCts1p)的分泌的殼多糖酶。此試驗(yàn)需要分泌的殼多糖酶結(jié)合到殼多糖柱并且隨后在變化pH的緩沖液中洗脫或煮沸2分鐘而洗脫。
圖4(B)示出了，應(yīng)用20mM NaOH，殼多糖酶(KLCts1p)從殼多糖的洗脫幾乎立即發(fā)生。殼多糖結(jié)合的KlCts1p在五個(gè)連續(xù)1ml級(jí)分的20mM NaOH(E0-E4，其中E0表示柱空體積)中洗脫，經(jīng)SDS-PAGE分離并經(jīng)α-CBD蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。
圖4(C)示出了，在20mM NaOH中洗脫的KlCts1p保持殼多糖分解活性。應(yīng)用多種濃度的NaOH從殼多糖微型柱洗脫殼多糖結(jié)合KlCts1p，通過(guò)測(cè)定在pH 4.5和37℃下每分鐘從50mM 4MU-GlcNAc3釋放4-MU/min的速率，分析洗出液的殼多糖酶活性。
圖4(D)示出了，天然KlCBD可以單獨(dú)起作用地或作為融合蛋白的一部分起可洗脫親和標(biāo)簽的作用，其中CBD得自乳酸克魯維酵母，融合蛋白(人血清白蛋白(HSA)-KICBD)在殼多糖酶缺陷型突變體(K.lactis Δcts1細(xì)胞)中表達(dá)，從殼多糖珠子洗脫的條件是20mM NaOH。相比而言，來(lái)自環(huán)形芽孢桿菌的CBD的融合蛋白(HSA-BcCBD)在20mM NaOH中不能類似地從殼多糖珠子洗脫。對(duì)照(B-PB)是通過(guò)煮沸殼多糖珠子洗脫的融合蛋白質(zhì)。
圖5示出了pGBN1(pKLAC1)表達(dá)載體。所需基因被克隆到與駐留在載體中的交配因子α前原分泌前導(dǎo)序列相同的翻譯閱讀框中。存在含有獨(dú)特限制性位點(diǎn)的多接頭，以允許克隆所需基因。
圖6示出了重組蛋白從乳酸克魯維酵母Δcts1細(xì)胞的分泌。
圖6(A)示出了，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)從Δcts1乳酸克魯維酵母細(xì)胞的分泌，表明了產(chǎn)量與野生型細(xì)胞一樣好或者優(yōu)于野生型細(xì)胞。
圖6(B)示出了，HSA-KlCBD融合蛋白從Δcts1乳酸克魯維酵母細(xì)胞的分泌，和在20mM NaOH中所述融合蛋白從殼多糖的洗脫。
圖7是概括了CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)從乳酸克魯維酵母細(xì)胞分泌的流程圖。
圖8示出了，CBD-標(biāo)記人血清白蛋白(HSA-CBD)的SDS-PAGE分離，所述蛋白應(yīng)用在培養(yǎng)生長(zhǎng)的各個(gè)點(diǎn)加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基的磁性殼多糖珠子分離自培養(yǎng)基。
泳道1示出了分子量標(biāo)記。
泳道2示出了HSA-KlCBD，得自作為培養(yǎng)基成分被加入乳酸克魯維酵母培養(yǎng)物72小時(shí)的高壓滅菌殼多糖磁珠。
泳道3示出了HSA-KlCBD，得自被加入乳酸克魯維酵母培養(yǎng)物48小時(shí)的高壓滅菌殼多糖磁珠。
泳道4示出了HSA-KlCBD，得自在收獲前1小時(shí)被加入乳酸克魯維酵母培養(yǎng)物的殼多糖磁珠。
泳道5示出了HSA-KlCBD，得自被加入細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液的磁性殼多糖珠子。
圖9A和9B示出了如何用殼多糖磁珠從稀釋液純化蛋白質(zhì)的示意圖。
圖9A 步驟1對(duì)磁性殼多糖珠子滅菌(例如，高壓、紫外線、輻射、化學(xué)處理等)。
步驟2在用細(xì)胞接種之前，將滅菌后的殼多糖珠子加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間，細(xì)胞分泌標(biāo)記有殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(黑色圓圈)的蛋白質(zhì)(空心圓)。
步驟3分泌的CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)固定于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的磁性殼多糖珠子。
步驟4在培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間的一些時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)暴露于固定珠子的磁場(chǎng)，將含有結(jié)合的CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)的磁性殼多糖珠子從細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離。
步驟5用所需緩沖液或介質(zhì)洗滌珠子。
步驟6從磁場(chǎng)釋放殼多糖珠子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
步驟7a如果可以從殼多糖解離的CBD被用于構(gòu)建融合蛋白，則純化的CBD融合蛋白從磁性殼多糖珠子洗脫。
步驟7b取決于所需用途，不確定地使收獲的蛋白質(zhì)保持固定在殼多糖磁珠上。
圖9B 步驟1用細(xì)胞接種缺乏磁性殼多糖珠子的培養(yǎng)基。
步驟2生長(zhǎng)細(xì)胞分泌標(biāo)記有殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(黑色圓圈)的蛋白質(zhì)(空心圓)。
步驟3可以除去培養(yǎng)物中的細(xì)胞(例如，離心、過(guò)濾、凝絮、使細(xì)胞通過(guò)重力沉降，等)和 步驟4a在培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間的任何點(diǎn)，將無(wú)菌磁性殼多糖珠子直接加入培養(yǎng)物。
步驟4b將磁性殼多糖珠子加入澄清的耗盡培養(yǎng)基。
步驟5a和5b通過(guò)暴露于固定珠子的磁場(chǎng)，從細(xì)胞和/或生長(zhǎng)培養(yǎng)基分離CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)。
步驟6用所需緩沖液或介質(zhì)洗滌珠子。
步驟7從磁場(chǎng)釋放殼多糖珠子-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
步驟8a如果可以從殼多糖解離的CBD被用于構(gòu)建融合蛋白，則純化的蛋白從磁性殼多糖珠子洗脫。
步驟8b取決于所需用途，不確定地使收獲的蛋白質(zhì)保持固定在殼多糖磁珠上。
圖10(a)示出了適于從微量滴定皿中的制備物分離磁珠的磁架。
圖10(b)示出了適于從微量離心管中的制備物分離磁珠的磁架。
圖10(c)示出了適于從標(biāo)準(zhǔn)的50ml實(shí)驗(yàn)室試管中的制備物分離磁珠的磁架。
圖10(d)示出了適于從標(biāo)準(zhǔn)的250ml離心瓶中的制備物分離磁珠的磁架。
圖11(a)示出了適于從培養(yǎng)容器或發(fā)酵罐中的制備物分離磁珠的可浸入電磁體探針的圖。
步驟1和2將電磁體探針(深灰色)浸入含有固定于磁珠(灰色)的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)容器或發(fā)酵罐。
步驟3打開(kāi)電磁體，磁珠被固定在其表面。
步驟4將電磁體(打開(kāi)的)從培養(yǎng)容器或發(fā)酵罐移除，從而分離磁珠。
圖11(b)示出了適于從發(fā)酵罐或培養(yǎng)容器的流出物分離磁珠的磁力設(shè)備的圖示。
步驟1來(lái)自含有培養(yǎng)基、細(xì)胞和與磁珠(灰色)結(jié)合的蛋白質(zhì)的發(fā)酵罐或容器的流出物從發(fā)酵罐流入或通過(guò)磁分離設(shè)備。
步驟2由電磁體或可移動(dòng)永久磁體組成的磁分離設(shè)備從剩余流出物中分離磁珠。
步驟3澄清的流出物流過(guò)磁分離設(shè)備。
圖12示出了，來(lái)自環(huán)形芽孢桿菌的分泌的GluC-CBD融合蛋白可以被獲得，不論磁化殼多糖珠子是在細(xì)胞培養(yǎng)起始或期間或培養(yǎng)物上清液被收獲之后被加入。凝膠示出了通過(guò)在SDS樣品緩沖液中煮沸從磁化殼多糖珠子洗脫后得到的GluC-CBD的量。
泳道1對(duì)照-未染色標(biāo)準(zhǔn)品(Mark 12-Invitrogen，Carlsbad，CA)；泳道2對(duì)照-GluC蛋白；泳道3過(guò)夜溫育GluC-CBD轉(zhuǎn)化的環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞。溫育開(kāi)始時(shí)將磁化殼多糖珠子加入培養(yǎng)基。
泳道4過(guò)夜溫育GluC-CBD轉(zhuǎn)化環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞。收集培養(yǎng)基1小時(shí)前將磁化殼多糖珠子加入培養(yǎng)基。
泳道5過(guò)夜溫育GluC-CBD轉(zhuǎn)化環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞。在收獲并離心培養(yǎng)基之后，將磁化殼多糖珠子加入上清液。
圖13示出了柱狀圖，其中得自殼多糖柱的連續(xù)級(jí)分的熒光素酶的量表明，在非變性條件下，熒光素酶-CBD在級(jí)分2至10中洗脫出來(lái)，在級(jí)分3、4和5中可見(jiàn)最高活性。
發(fā)明詳述 本文描述了在蛋白質(zhì)從形成所述蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞分泌入培養(yǎng)基之后濃縮所述蛋白質(zhì)的方法。所述方法應(yīng)用CBD對(duì)殼多糖的親和力，并且可以通過(guò)應(yīng)用不分泌殼多糖酶的細(xì)胞增強(qiáng)。殼多糖酶陰性細(xì)胞可以作為遺傳修飾的結(jié)果而形成或者可以天然發(fā)生。可以期望的是，這些殼多糖酶缺陷型修飾細(xì)胞可以生長(zhǎng)至與野生型細(xì)胞相似的密度和相似的產(chǎn)量。宿主細(xì)胞可以用編碼與在合適的啟動(dòng)子下表達(dá)CBD的DNA融合的目標(biāo)基因的載體轉(zhuǎn)化，因而相對(duì)大量的目標(biāo)蛋白通過(guò)宿主細(xì)胞分泌入生產(chǎn)培養(yǎng)基中。殼多糖底物可以存在于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，或者在單獨(dú)的反應(yīng)容器中，用于將目標(biāo)蛋白從混合物中拉出。CBD融合蛋白的結(jié)合將分泌的重組蛋白濃縮在殼多糖表面。應(yīng)用許多方法中的任一方法，可以進(jìn)一步濃縮蛋白質(zhì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，磁化殼多糖，將磁場(chǎng)施加于生產(chǎn)培養(yǎng)基，將殼多糖珠子濃縮至磁性表面附近。其它實(shí)施方式包括離心沉淀殼多糖珠。隨后目標(biāo)蛋白可以從濃縮的殼多糖底物被回收。
術(shù)語(yǔ)“濃縮的(concentrated)”是指完成一個(gè)程序后的重量與體積的比值大于所述程序之前的該比值。
修飾宿主細(xì)胞，以敲除殼多糖酶表達(dá) 用于分泌重組CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細(xì)胞背景是這樣的宿主細(xì)胞，其(i)不產(chǎn)生會(huì)污染含有CBD的分泌融合蛋白制備物的殼多糖結(jié)合蛋白或殼多糖分解活性；(ii)能夠在培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度；和(iii)能夠有效分泌重組蛋白。不分泌殼多糖酶的宿主細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)包括(i)消除了CBD標(biāo)記蛋白和內(nèi)源性殼多糖酶之間對(duì)殼多糖結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)；(ii)消除了殼多糖固定的融合蛋白受到內(nèi)源性殼多糖酶污染的風(fēng)險(xiǎn)；和(iii)消除了內(nèi)源性殼多糖酶對(duì)目標(biāo)殼多糖底物的降解。
合適的宿主細(xì)胞包括多種昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生系和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以及酵母生產(chǎn)株和細(xì)菌細(xì)胞。
分泌蛋白質(zhì)用于制備目的的細(xì)胞的例子包括大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)各種、芽孢桿菌屬(Bacillus)各種、鏈霉菌屬(Streptomyces)各種等，植物細(xì)胞(例如，擬南芥屬(Arabidopsis)各種、紅豆杉屬(Taxus)各種、長(zhǎng)春花屬(Catharanthus)各種、煙草屬(Nicotiana)各種、稻屬(Oryza)各種、大豆、紫花苜蓿、番茄等)，真菌細(xì)胞(例如，克魯維酵母屬各種、酵母屬各種、畢赤酵母屬各種、漢遜酵母屬各種、耶氏酵母屬各種、脈孢菌屬(Neurospora)各種、曲霉菌屬(Aspergillus)各種、青霉菌屬(Penicillium)各種、假絲酵母屬(Candida)各種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)各種、隱球菌屬(Cryptococcus)各種、鬼傘菌屬(Coprinus)各種、菰黒粉菌屬(Ustilago)各種、Magnaporth各種、木霉菌屬(Trichoderma)各種等等)，昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞，Sf12細(xì)胞，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞、果蠅屬(Drosophila)各種等)，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，原代細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞，NSO細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK-293細(xì)胞，PER-C6細(xì)胞等)。這些細(xì)胞可以在微升體積到多升體積的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。
克魯維酵母各種用于本文中以說(shuō)明與CBD融合的分泌蛋白如何快速和容易地從混合物被分離。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的克魯維酵母屬的酵母包括vander Walt在The Yeasts，ed.N.J.W.Kregervan RijElsevier，New York，NY，p.224(1987)中定義的酵母，并且包括馬克斯克魯維酵母乳酸變種(K.marxiamus var.lactis(K.lactis))、馬克斯克魯維酵母馬克斯變種(K.marxianus var.marxianus(K.fragilis))、馬克斯克魯維酵母drosophilarum變種(K.marxianus var.drosophilarum(K.drosophilarum)和K.waltii和本領(lǐng)域中歸類為克魯維酵母的其它菌株。
在那些天然分泌一種或多種殼多糖酶的宿主細(xì)胞中，可以通過(guò)遺傳修飾產(chǎn)生殼多糖酶缺失突變體。遺傳修飾是指在目標(biāo)基因中抑制、取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基中的任何一種修飾。這種修飾可以在體外實(shí)現(xiàn)(對(duì)分離的DNA)或者在原位實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)遺傳工程技術(shù)，或者可選地通過(guò)將宿主細(xì)胞暴露于誘變劑如輻射(X線、γ射線、紫外線和類似物)或能夠與DNA的堿基的多種官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)劑，例如烷化劑甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS))、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、N-硝基喹啉1-氧化物(N-nitroquinoline 1-oxide(NQO))、雙烷化劑、嵌入劑和類似物。而且，通過(guò)修飾一部分編碼殼多糖酶的區(qū)域和/或所有或部分的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域，目標(biāo)基因的表達(dá)可以被抑制。
遺傳修飾也可以通過(guò)基因斷裂得到。殼多糖酶基因斷裂的一個(gè)例子提供在有關(guān)乳酸克魯維酵母的實(shí)施例1中。本實(shí)施例中描述的方法可以廣泛應(yīng)用于任何克魯維酵母種。
在實(shí)施例1中，編碼KlCts1p的殼多糖酶基因在工業(yè)乳酸克魯維酵母株(GG799)中被斷裂，該菌株優(yōu)選地缺乏乳酸克魯維酵母放毒者質(zhì)粒。斷裂通過(guò)替換一部分殼多糖酶基因發(fā)生，例如，將天然發(fā)生的乳酸克魯維酵母殼多糖酶基因的起始168個(gè)氨基酸替換為選擇性標(biāo)記基因如G418抗性序列盒。
乳酸克魯維酵母GG799Δcts1細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中取得與野生型細(xì)胞相同的高細(xì)胞密度(實(shí)施例2)，不產(chǎn)生具有可檢測(cè)的殼多糖結(jié)合或殼多糖分解活性的蛋白質(zhì)(圖3A)，并且能夠大量分泌重組蛋白(圖6)。這一菌株被證實(shí)很適于用作產(chǎn)生重組CBD標(biāo)記蛋白質(zhì)的宿主。
對(duì)于生產(chǎn)目的，需要?dú)ざ嗵敲戈幮酝蛔兯拗骷?xì)胞在培養(yǎng)中獲得與野生型細(xì)胞相似的高細(xì)胞密度，雖然缺乏具有可檢測(cè)的殼多糖結(jié)合或殼多糖分解活性的分泌蛋白質(zhì)，以及這些細(xì)胞可以大量分泌重組蛋白質(zhì)。因而，殼多糖酶陰性宿主細(xì)胞可以用在發(fā)酵中，以便有效地制備具有工業(yè)用途的與CBD直接連接或通過(guò)接頭肽或連接化學(xué)基團(tuán)與CBD連接的純化重組蛋白質(zhì)。
設(shè)計(jì)和應(yīng)用載體，用于在酵母中表達(dá)和分泌高水平的蛋白質(zhì) 針對(duì)多種酵母的表達(dá)載體的例子描述在Muller et al.Yeast 141267-1283(1998)中，針對(duì)克魯維酵母的表達(dá)載體也描述在US 4,859,596、US5,217,891、US 5,876,988、US 6,051,431、US 6,265,186、US 6,548,285、US 5,679,544和美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/102,475中。
表達(dá)載體可以是外源性的。例如，YEp24是用于在釀酒酵母中進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)的附加型穿梭載體(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。用于此生物體的附加型穿梭載體的其它例子是pRS413、pRS414、pRS415和pRS416。克魯維酵母中的自主復(fù)制載體包括pKD1(Falcone et al.，Plasmids 15248(1986)；Chen et al.，Nucl.Acids Res.144471(1986))，pEW1(Chen et al.，J.General Microbiol.138337(1992))。除了完整的pKD1載體之外，含有pKD1起點(diǎn)和順式作用穩(wěn)定性基因座(cis-acting stability locus(CSL))的更小的載體已經(jīng)被構(gòu)建，并且用于在乳酸克魯維酵母中異源蛋白表達(dá)(Hsieh，et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.4411-416(1998))。其它附加型載體也在乳酸克魯維酵母中復(fù)制。帶有著絲點(diǎn)(cen)和自主復(fù)制序列(ars)的質(zhì)粒已被用于在乳酸克魯維酵母中表達(dá)克隆真菌cDNA(van der Vlug-Bergmans，et al.Biotechnology Techniques 1387-92(1999))。此外，含有乳酸克魯維酵母ARS序列(KARS)的載體已被用于表達(dá)真菌α-半乳糖苷酶(Bergkamp，et al.Curr Genet.21365-70(1992))和植物α-淀粉酶(Strasser et al.Eur.J.Biochem.184699-706(1989))。
其它載體可以被整合入宿主基因組。例如，美國(guó)6,602,682、美國(guó)6,265,186和美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/102,475，描述了整合入克魯維酵母基因組的質(zhì)粒。
載體應(yīng)該含有下列至少一種或多種(i)強(qiáng)酵母啟動(dòng)子；(ii)編碼分泌前導(dǎo)序列的DNA(如果需要蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中)；(iii)編碼待表達(dá)蛋白質(zhì)的基因；(iv)轉(zhuǎn)錄終止序列；和(v)酵母選擇性標(biāo)記基因。這些序列組分典型地在大腸桿菌中在質(zhì)粒載體中裝配，隨后所述載體被轉(zhuǎn)移到酵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。這種類型的載體被稱作穿梭載體。
雖然穿梭載體由于能夠在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之前在大腸桿菌中制備而被優(yōu)選，但是本發(fā)明實(shí)施方式不限于穿梭載體。
例如，能夠整合入酵母基因組的DNA片段可以通過(guò)PCR或解旋酶依賴性擴(kuò)增(Helicase-Dependent Amplication(HDA))構(gòu)建和直接導(dǎo)入酵母細(xì)胞?？蛇x地，表達(dá)載體能夠在不同于大腸桿菌的細(xì)菌中通過(guò)克隆步驟被裝配或者直接在酵母細(xì)胞中裝配。
蛋白質(zhì)在克魯維酵母中，更通常地在酵母中的過(guò)表達(dá)，涉及穿梭載體的構(gòu)建，所述穿梭載體含有帶有適于指導(dǎo)感興趣基因在導(dǎo)入酵母宿主后高水平轉(zhuǎn)錄的序列的DNA片段。例如，當(dāng)PLAC4存在于整合型質(zhì)?；蚋郊有唾|(zhì)粒中時(shí)，其可以起到在酵母中表達(dá)蛋白質(zhì)的強(qiáng)啟動(dòng)子的作用，所述質(zhì)粒如基于pKD1的載體、含2μ質(zhì)粒的載體(2micron-containing vector)和著絲粒載體。分泌前導(dǎo)序列(如果需要蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中)可以含有釀酒酵母(S.cerevisiae)α-MF前原分泌前導(dǎo)肽。也可以應(yīng)用其它原核或真核分泌信號(hào)肽(例如，克魯維酵母α-交配因子前原分泌信號(hào)肽，克魯維酵母殺傷毒素信號(hào)肽)或合成的分泌信號(hào)肽?？蛇x地，分泌前導(dǎo)序列可以從載體中完全省去，以獲得所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)。
穿梭載體允許克隆基因在被引入酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)之前在細(xì)菌中繁殖。然而，利用野生型PLAC4的酵母表達(dá)系統(tǒng)可以受到來(lái)自細(xì)菌宿主細(xì)胞如大腸桿菌的PLAC4控制下的基因的偶然蛋白質(zhì)表達(dá)的不利影響。此啟動(dòng)子活性可以干擾其翻譯產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌有害的基因的克隆效率。
帶有突變的Pribnow盒類似序列的PLAC4變體可以通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生，所述誘變基本上保持它們?cè)诳唆斁S酵母各種中作為強(qiáng)啟動(dòng)子的功能，所述克魯維酵母示范為但不限于乳酸克魯維酵母。這些突變啟動(dòng)子與野生型PLAC4中的非突變Pribnow盒類似序列的作用基本上一樣好，或者優(yōu)于該序列。
術(shù)語(yǔ)“突變(mutation)”在本文中意圖于包括下列中的任何在野生型DNA序列中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，真菌表達(dá)宿主是酵母克魯維酵母屬的各個(gè)種，細(xì)菌宿主是大腸桿菌和特征如下的一系列PLAC4變體(a)啟動(dòng)子的-198至-212區(qū)域，例如在位點(diǎn)-201、-203、-204、-207、-209和-210基本上不干擾該啟動(dòng)子作為乳酸克魯維酵母中的強(qiáng)啟動(dòng)子的能力；(b)啟動(dòng)子的-133至-146區(qū)域，例如在位點(diǎn)-139、-140、-141、-142和-144基本上不干擾強(qiáng)啟動(dòng)子活性；或(c)-198至-212和-133至-146區(qū)域可以被并入；(d)產(chǎn)生雜合啟動(dòng)子，其由釀酒酵母(Sc)PGK啟動(dòng)子的283bp(-1至-283)組成，替換乳酸克魯維酵母PLAC4的-1至-283區(qū)域。這些取代在美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/102,475中詳述。
轉(zhuǎn)錄終止序列的一個(gè)例子是TTLAC4。
酵母選擇性標(biāo)記基因可以是，例如，賦予對(duì)抗生素(例如G418、潮霉素B和類似物)的抗性的基因，補(bǔ)充菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因(例如，ura3、trp1、his3、lys2和類似物)或乙酰胺酶(amdS)基因。在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中表達(dá)乙酰胺酶，使得它們?cè)谌狈?jiǎn)單氮源但含有乙酰胺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。乙酰胺酶將乙酰胺分解為氨，其可以被細(xì)胞用作氮源。這種選擇方法的益處是富集了已并入基于pKLAC1的表達(dá)載體的多串連整合的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化子群體，和產(chǎn)生比單個(gè)整合更多的重組蛋白質(zhì)(圖5)。
含有PLAC4突變體的上述載體已被插入大腸桿菌/克魯維酵母整合型穿梭載體，例如，pGBN1和pKLAC1(美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/102,475)，其在轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞后整合入克魯維酵母基因組，隨后指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。
美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/102,475描述了含有突變PLAC4的穿梭載體用于酵母中，特別是克魯維酵母，例子為乳酸克魯維酵母，其較專利US 4,859,596、US5,217,891、US 5,876,988、US 6,051,431、US 6,265,186、US 6,548,285、US 5,679,544中描述的載體提供了改進(jìn)。這種改進(jìn)是由于，修飾的LAC4在酵母中用于表達(dá)和不能夠在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，從而避免了在細(xì)菌克隆宿主細(xì)胞中的毒性所引起的問(wèn)題。
DNA載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入 對(duì)于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞，DNA向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入方法是已經(jīng)確立的(Miller，J.F.Methods Enzymol.235375-385(1994)；Hanahan，D.et al.，MethodsEnzymol.20463-113(1991))。在酵母中，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法包含遺傳雜交、原生質(zhì)體融合、基于鋰的轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或文獻(xiàn)中描述的任何其它技術(shù)，所述文獻(xiàn)例如，Wang et al.Crit Rev Biotechnol.21(3)177-218(2001)；Schenborn et al.Methods MoI Biol.130155-164(2000)；Schenborn et al.Methods MoI Biol.130147-153(2000)。關(guān)于克魯維酵母的轉(zhuǎn)化，在Ito et al.(J.Bacteriol.153163(1983))；Durrens et al.(Curr.Genet 187(1990))；Karube et al.(FEBS Letters 18290(1985))和歐洲專利申請(qǐng)361 991中描述了已確立的技術(shù)。
CBD的性質(zhì)，包含洗脫性質(zhì) CBD作為殼多糖酶的組分，可以得自許多不同來(lái)源，例如，真菌、細(xì)菌、植物和昆蟲(chóng)。來(lái)自殼多糖酶的任何CBD都可以在本文中應(yīng)用，雖然優(yōu)選分離自殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域的CBD。也優(yōu)選能夠在不同于結(jié)合條件的非變性條件下從殼多糖分離的CBD。不是所有CBD都能夠在非交性條件下從殼多糖分離。例如，環(huán)狀芽孢桿菌CBD與殼多糖緊密結(jié)合，所述結(jié)合是不可逆的，除非將突變引入蛋白質(zhì)，如美國(guó)6,897,285、美國(guó)公開(kāi)2005-0196804和2005-0196841中所述。相比而言，克魯維酵母各種產(chǎn)生與殼多糖緊密結(jié)合、但可以在改變的條件如NaOH下可逆分離的CBD(參見(jiàn)例如實(shí)施例5和6)。
克魯維酵母大量產(chǎn)生表達(dá)的分泌的內(nèi)切殼多糖酶(KCBD)，在本文中通過(guò)示例的方式顯示出，它是有效的親和標(biāo)簽，允許可逆地固定或純化嗜堿性蛋白質(zhì)或耐堿性蛋白質(zhì)。KCBD能夠在不存在催化性結(jié)構(gòu)域時(shí)結(jié)合殼多糖(參見(jiàn)例如圖4D)，充當(dāng)克魯維酵母中異源表達(dá)蛋白上的親和標(biāo)簽，如圖4D和6B所示，和在約5mM至500mM范圍的NaOH中從殼多糖解離，而來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的CBD(BcCBD)不能如此。
殼多糖結(jié)合CBD的特性 合成的殼多糖或天然發(fā)生的殼多糖可以用于結(jié)合CBD融合蛋白。合成的殼多糖的例子是乙酰化殼聚糖，聚合的N-乙酰基葡萄糖胺單糖、多糖或寡糖，或聚合的葡萄糖胺單糖、寡糖或多糖，其中葡萄糖胺隨后被化學(xué)乙?；?br> 天然發(fā)生的殼多糖的例子是來(lái)自蟹類、昆蟲(chóng)外骨骼或真菌細(xì)胞壁或本領(lǐng)域已知的任何來(lái)源的殼多糖。
殼多糖可以被任選地固定在圖7所述的基質(zhì)上?；|(zhì)的一個(gè)例子是聚合物如塑料?？蛇x地，殼多糖可以被聚集形成例如懸浮液、膠體、珠、柱、基質(zhì)、片層或膜。在發(fā)酵期間，殼多糖可以被滅菌以加入發(fā)酵培養(yǎng)基，或者在發(fā)酵末期，可以以無(wú)菌形式用于結(jié)合融合蛋白。
利用殼多糖涂覆磁珠濃縮與CBD融合的任何分泌蛋白質(zhì)的一般可應(yīng)用方法 用于結(jié)合分泌的CBD融合蛋白的殼多糖基質(zhì)可以任選地被磁化，以便容易從培養(yǎng)基中移去目標(biāo)蛋白。磁化的殼多糖通過(guò)使殼多糖和磁性材料結(jié)合而制備。磁性材料可以是分散的部分如鐵屑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，磁化殼多糖是珠的形式，雖然磁化殼多糖可以用作任選為惰性的其它材料的涂層。而在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，磁性材料是磁性殼多糖，具有下列性質(zhì)的其它磁性材料可以應(yīng)用(a)能夠結(jié)合目標(biāo)蛋白或與目標(biāo)蛋白融合而表達(dá)；和(b)能夠結(jié)合于可以被磁化的材料。
在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用磁化殼多糖珠子(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)結(jié)合分泌的CBD融合蛋白。珠子的大小不是至關(guān)重要的，雖然直徑為200nm以下的大小形成的珠子具有這樣的優(yōu)勢(shì)，即在施加磁力之前能夠通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器和在培養(yǎng)基中形成膠體(參見(jiàn)，例如5,160,726)。也可以應(yīng)用更大的珠子。殼多糖珠子可以是固體(例如，New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或有孔的(例如，JP 62151430)。而且，珠子可以通過(guò)多種方式被磁化，例如，通過(guò)使鐵屑分散遍布珠子或者形成帶有鐵芯的珠子(通過(guò)用殼多糖涂覆鐵)(參見(jiàn)，例如，5,262,176)。雖然在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本文應(yīng)用的磁化殼多糖是珠子的形式，不用途排除其它形狀和大小的殼多糖表面。
磁性殼多糖珠子也可以在細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間或之后、或從培養(yǎng)物清除生長(zhǎng)細(xì)胞之后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(圖9B)。因此，已經(jīng)顯示，磁化殼多糖珠子可以被滅菌而不明顯改變它們的結(jié)合性質(zhì)。當(dāng)殼多糖珠在生長(zhǎng)期間被加入培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選對(duì)珠進(jìn)行滅菌。
典型地，CBD標(biāo)記蛋白與殼多糖珠的最大結(jié)合(圖9B，步驟4a和4b)會(huì)在4℃、在1小時(shí)內(nèi)發(fā)生，然而，其它溫度和時(shí)間段也是可能的。固定于磁性殼多糖珠子的蛋白質(zhì)在磁場(chǎng)中被收獲(圖9B，步驟5a和5b)，細(xì)胞、污染蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)培養(yǎng)基從珠子洗去(圖9B，步驟6)。如果可洗脫CBD被用作親和標(biāo)簽，殼多糖珠-蛋白質(zhì)復(fù)合物隨后從磁場(chǎng)釋放(圖1B，步驟7)，收獲的蛋白質(zhì)可以不確定地保持固定于殼多糖珠子上(圖9B，步驟8b)或可以從殼多糖解離(圖9B，步驟8a)。
通過(guò)向發(fā)酵容器中的培養(yǎng)基加入磁化殼多糖珠子，可以從而實(shí)現(xiàn)回收目標(biāo)蛋白的有效的一步法。細(xì)胞在含有磁化殼多糖珠子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因而在培養(yǎng)期間，分泌的CBD-標(biāo)記蛋白與珠子結(jié)合，并且可以通過(guò)施加來(lái)自發(fā)酵容器外部的磁體、或者按需要來(lái)自發(fā)酵容器內(nèi)部的磁體的磁力的簡(jiǎn)單步驟從培養(yǎng)基直接收獲(參見(jiàn)圖9-11)。此方法需要磁化殼多糖珠被滅菌。本文示出，來(lái)自發(fā)酵起始或發(fā)酵期間加入的50-70μm大小的滅菌殼多糖珠的產(chǎn)量與珠子在發(fā)酵完成時(shí)加入所得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)量相似(圖8)。
從大體積濃縮分泌蛋白質(zhì)的本方法的一個(gè)引人注目的特征是其普遍性。本方法采用殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域在與其它蛋白質(zhì)融合時(shí)結(jié)合殼多糖的能力，其中所述其它蛋白質(zhì)不受CBD存在的損害。
通過(guò)確認(rèn)分泌融合蛋白的細(xì)胞不天然產(chǎn)生結(jié)合殼多糖的蛋白質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和污染被避免。CBD以顯著的親和力結(jié)合殼多糖。使得所需的蛋白質(zhì)CBD融合蛋白從殼多糖珠回收可以這樣實(shí)現(xiàn)突變CBD，因而結(jié)合可以在被控制條件下逆轉(zhuǎn)，以便釋放融合蛋白(美國(guó)6,897,286)；或者可選地應(yīng)用內(nèi)含肽切割系統(tǒng)或蛋白酶切割，以便從CBD殼多糖復(fù)合物釋放蛋白質(zhì)(WO 2004/053460，美國(guó)5,643,758)。另外，如果在CBD和所需蛋白質(zhì)之間存在蛋白水解切割位點(diǎn)，通過(guò)應(yīng)用蛋白酶消化(例如，腸激酶、genenase、弗林蛋白酶(furin)、因子X(jué)等)，CBD標(biāo)記可以從所需蛋白質(zhì)釋放。
CBD-殼多糖相互作用的強(qiáng)力性質(zhì)使得CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)迅速地固定于任何形式的磁化殼多糖，例如珠子。
當(dāng)磁化殼多糖是珠子形式時(shí)，含有結(jié)合的CBD標(biāo)記蛋白的殼多糖珠子可以在磁場(chǎng)中在數(shù)秒內(nèi)收獲。如果需要，通過(guò)在洗脫緩沖液中溫育，CBD-標(biāo)記蛋白可以從磁化基質(zhì)解離(如果應(yīng)用可洗脫CBD)。本方法的優(yōu)勢(shì)包括改進(jìn)的速度、成本效應(yīng)和簡(jiǎn)便性。
應(yīng)用適于普通實(shí)驗(yàn)室管(例如，96孔微量滴定皿、微量離心管、15mlFalcon管、50ml Falcon管、250ml Nalgene瓶等)的磁分離設(shè)備從數(shù)微升至數(shù)升培養(yǎng)基中收獲CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)(圖3-6)。本方法容易升級(jí)為允許從更大體積的培養(yǎng)基中收獲CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，磁體由稀土金屬構(gòu)建(例如，釹、釤、鈷等)，但是也可以應(yīng)用其它類型的磁體(例如，鐵氧體、陶瓷、電磁體等)。
表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用 對(duì)于用作藥物、用于食品或工業(yè)的蛋白質(zhì)，需要從混合物中生產(chǎn)和分離目標(biāo)蛋白?，F(xiàn)存的或需要的基于發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白質(zhì)列表非常巨大。幾個(gè)例子包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、淀粉酶、脂酶、酰胺酶、糖苷酶、木聚糖酶、蟲(chóng)漆酶、木質(zhì)素酶、凝乳酶和類似物，或者其任何片段或衍生物，血液衍生物(如血清白蛋白，α球蛋白或β球蛋白，凝血因子例如因子VIII、因子IX、馮維勒布蘭德因子，纖連蛋白，α-1抗胰蛋白酶，和類似物，或者其任何片段或衍生物)，胰島素及其變體，淋巴因子如白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF和類似物)，TNF和類似物，或者其任何片段或衍生物，生長(zhǎng)因子(如生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、FGF、EGF、PDGF、TGF和類似物，或其任何片段或衍生物)，載脂蛋白及其分子變體，用于產(chǎn)生疫苗的抗原多肽(肝炎、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、皰疹病毒和類似物)，單鏈抗體(ScFv)或可選的多肽融合物，如，特別是含有融合于穩(wěn)定部分的生物活性部分的融合物。
上下文引用的所有參考文獻(xiàn)，以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/616,420和60/690,470，并入本文作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1用于下述實(shí)施例的材料和方法酵母株，培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件 乳酸克魯維酵母和釀酒酵母菌株(表1)在YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、和2％葡萄糖)或YPGal培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％半乳糖)中30℃常規(guī)培養(yǎng)。
表1用于本研究的酵母菌株


*Research Genetics，Invitrogen，Carlsbad，CA 乳酸克魯維酵母和釀酒酵母的轉(zhuǎn)化應(yīng)用電穿孔實(shí)現(xiàn)。乳酸克魯維酵母的轉(zhuǎn)化子通過(guò)在含有200mg G418/ml的YPD瓊脂中生長(zhǎng)而選擇，而釀酒酵母轉(zhuǎn)化子通過(guò)在含有補(bǔ)充菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型所需的合適補(bǔ)充物的SD培養(yǎng)基(0.67％酵母氮基，2％葡萄糖)或SGal培養(yǎng)基(0.67％酵母氮基，2％半乳糖)中生長(zhǎng)而獲得。
分泌的乳酸克魯維酵母殼多糖結(jié)合蛋白的檢測(cè)和分離 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)與多克隆抗殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(α-CBD)交叉反應(yīng)的分泌的乳酸克魯維酵母蛋白質(zhì)，所述抗體針對(duì)來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌殼多糖酶A1的殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。
(a)在生長(zhǎng)48-96小時(shí)后，通過(guò)以4000×g離心10分鐘，從乳酸克魯維酵母GG799中分離耗盡培養(yǎng)基。
離心之后，在4-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上(DaiichiPharmaceutical Corp.，Montvale，NJ)，通過(guò)SDS-PAGE分離耗盡培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到Protran硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell Bioscience，Keene，NH)。使膜在含有0.05％Tween 20(PBS-T)和5％脫脂奶粉(w/v)的磷酸鹽緩沖液中4℃封閉過(guò)夜，并用α-CBD多克隆抗體(1∶2000，在含有5％脫脂奶粉的PBS-T中)探測(cè)，隨后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗-兔二抗(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)；1∶2000，在含有5％脫脂奶粉的PBS-T中)探測(cè)。蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物應(yīng)用LumiGloTM檢測(cè)試劑(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)可視化。
(b)為了分離結(jié)合殼多糖的分泌蛋白質(zhì)，使乳酸克魯維酵母GG799細(xì)胞在20ml YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)。通過(guò)離心從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，將耗盡培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有1ml水洗殼多糖珠子的新鮮試管中(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)并于室溫下溫育，同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。通過(guò)離心收獲殼多糖珠，用10ml水洗滌。移去大約50μl體積的蛋白質(zhì)結(jié)合殼多糖珠，并在蛋白質(zhì)加樣緩沖液中煮沸2分鐘以洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)，隨后洗脫的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離，并接受應(yīng)用α-CBD多克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡分析或是接受氨基末端蛋白質(zhì)測(cè)序。
乳酸克魯維酵母殼多糖酶衍生殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KlCts1p CBD)的殼多糖結(jié)合性質(zhì)的分析 使來(lái)自20ml乳酸克魯維酵母GG799耗盡培養(yǎng)基的KlCts1p結(jié)合于1ml體積的殼多糖珠，如上述。用10ml水洗滌KlCts1p結(jié)合珠并重懸浮于1.5ml水中。通過(guò)將KlCts1p結(jié)合珠的100μl等分試樣分散到各個(gè)一次性柱(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)，制備微型柱。使1ml體積(～10個(gè)床體積)的下列緩沖液通過(guò)各個(gè)微型柱50mM醋酸鈉，pH 3.0；50mM醋酸鈉，pH 5.0；100mM甘氨酸-NaOH，pH 10.0；未緩沖的20mMNaOH，pH 12.3；5MNaCl和8M尿素。然后應(yīng)用2ml水洗滌每一柱，隨后將珠子重懸浮于200μl水中，轉(zhuǎn)移到微量離心管并通過(guò)短暫離心收集。通過(guò)在50ml的3×SDS-PAGE加樣緩沖液(New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)中煮沸5分鐘，洗脫保持結(jié)合于殼多糖的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分離洗脫蛋白質(zhì)并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)，如上述。
以相同的方式應(yīng)用不同濃度的NaOH(0-40mM)進(jìn)行KlCts1p洗脫。如上述制備殼多糖結(jié)合KlCts1p的等分試樣(100μl)，并將其分配到微量過(guò)濾杯(Millipore，Billerica，MA)，所述杯已插入1.5ml微量離心管中，從而形成旋轉(zhuǎn)柱。以15,800×g微量離心1分鐘，收集流過(guò)物(flow-through)并棄去。隨后將珠子重懸浮于每一所需濃度(0-40mM)的100μl NaOH中，以15,800×g離心1分鐘，收集洗出液。如下測(cè)定每一洗出液中的殼多糖酶活性。
乳酸克魯維酵母殼多糖酶基因(KlCTS1)的斷裂 應(yīng)用基于PCR的方法構(gòu)建由ADH2啟動(dòng)子-G418抗性基因序列盒組成的線性DNA斷裂片段，其每一端具有80-82bp的KlCTS1 DNA。當(dāng)在KlCTS1基因座進(jìn)行整合時(shí)，此片段使編碼KlCts1p的起始168個(gè)氨基酸的DNA替換為G418抗性序列盒。應(yīng)用含有與ADH-G418序列(無(wú)下劃線)雜交的DNA并且具有由KlCTS1 DNA序列(下劃線)構(gòu)成的尾部的引物，5′-CCAGTAATGCAACTATCAATCATTGTGTTAAACTGGTCACCAGAAATACAAGATATCAAAAATTACTAATACTACCATAAGCCATCATCATATCGAAG-3′(SEQ IDNO1)和5′-CCAAACTAGCGTATCCGGTTGGATTATTGTTTTCGATATCGAAATCGAAACCATCGACGACAGCAGTGTCGAATGGTCTTTCCCCGGGGTGGGCGAAGAACTCC-3′(SEQ ID NO2)，應(yīng)用Taq DNA聚合酶，從含ADH2-G418的載體pGBN2擴(kuò)增斷裂DNA片段。用擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799細(xì)胞，在含有200mgG418/ml的YPD瓊脂上選擇菌落。使用KlCTS1特異性正向引物5′-GGGCACAACAATGGCAGG-3′(SEQ ID NO3)(設(shè)計(jì)在整合位點(diǎn)上游)和G418特異性反向引物5′-GCCTCTCCACCCAAGCGGC-3′(SEQ ID NO4)，應(yīng)用全細(xì)胞PCR，從已在KlCTS1基因座正確整合該斷裂DNA片段的細(xì)胞擴(kuò)增～600bp的診斷性DNA片段。在以此方式測(cè)定的20個(gè)轉(zhuǎn)化子中，2個(gè)Dcts1乳酸克魯維酵母菌株被鑒定和進(jìn)一步表征。
KlCTS1在釀酒酵母中的異源表達(dá) 為了在釀酒酵母中表達(dá)KlCTS1，用下列引物PCR擴(kuò)增該基因5′-GGCGGATCCGCCACCATGTTTCACCCTCGTTTACTT-3′(BamH I位點(diǎn)用下劃線示出)(SEQ ID NO5)和5′-ACATGCATGCCTAGAAGACGACGTCGGGTTTCAA-3′(Sph I位點(diǎn)用下劃線示出)(SEQ ID NO6)，并克隆入pMW20(31)的BamH I-Sph I位點(diǎn)，使KlCTS1的表達(dá)位于半乳糖可誘導(dǎo)/葡萄糖可阻遏的釀酒酵母GAL10啟動(dòng)子的控制下。通過(guò)轉(zhuǎn)化將此表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入釀酒酵母Δcts1菌株RG6947。為了誘導(dǎo)KlCtsp1產(chǎn)生，在30℃中使2ml起始培養(yǎng)物在含有20mg尿嘧啶/ml的SD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，隨后用每一培養(yǎng)物1ml接種20ml YPD和20ml YPGal培養(yǎng)物。使每一培養(yǎng)物在30℃振蕩下生長(zhǎng)過(guò)夜，隨后分析耗盡培養(yǎng)基的殼多糖酶產(chǎn)生和通過(guò)顯微鏡分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
殼多糖酶活性測(cè)定 應(yīng)用1-4GlcNAc殘基的殼多糖寡糖作為底物，每一寡糖與4-甲基傘形酮(4-methyl umbelliferone(4-MU))衍生化作為底物4-甲基傘形基-N-乙酰-β-D-殼三糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-chitotrioside(4MU-GlcNAc))、4-甲基傘形基N，N′-二乙酰-β-D-殼四糖苷(4-methylumbelliferylN，N′-diacetyl-β-D-chitotetraoside(4MU-GlcNAc2))、4-甲基傘形基N，N’，N”-三乙酰-β-D-殼三糖苷(4-methylumbelliferyl N，N’，N”-triacetyl-β-D-chitotrioside(4MU-GlcNAC3))或者與4-甲基傘形基-N，N’，N”，N-四乙酰-β-D-殼四糖苷衍生化(4-methylumbelliferyl N，N’，N”，N-tetraacetyl-β-D-chitotetraoside(4MU-GlcNAc4))(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO and EMD Biosciences，San Diego，CA)。通過(guò)應(yīng)用Genios熒光微量滴定板讀數(shù)器(Tecan，San Jose，CA)和340nm/465nm激發(fā)/發(fā)射濾波器于37℃測(cè)定4-MU的釋放，測(cè)定殼多糖酶活性。96孔黑色微量滴定板的每孔中的反應(yīng)混合物是100ml并且含有50mM底物、1×McIlvaine′s緩沖液(在不同試驗(yàn)中的pH范圍是4-7)和5-10ml樣品。記錄起始釋放速率，酶單位計(jì)算為每分鐘釋放4-MU的皮摩爾數(shù)(pmol)。在用于反應(yīng)的條件下，制備4-MU(Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于從熒光單位進(jìn)行轉(zhuǎn)變。
顯微鏡方法 收獲約1-2OD600單位的細(xì)胞并于冰上將其固定在1ml的2.5％(v/v)戊二醛中1小時(shí)。細(xì)胞用水洗滌兩次，并重懸浮于約100ml封固劑(mounting medium)(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5％N-丙基沒(méi)食子酸，80％甘油)中。在膜染色試驗(yàn)中，將熒光增白劑(Calcofluor white)(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)加入到封固劑，至終濃度100mg/ml。應(yīng)用光相位Normaski成像或熒光DAPI濾波器裝置，用ZeissAxiovert 200M顯微鏡觀察細(xì)胞。
細(xì)胞殼多糖測(cè)定 用KOH提取細(xì)胞，通過(guò)殼多糖酶將堿性不溶性物質(zhì)中的殼多糖水解為GlcNAc，用于通過(guò)前述Morgan-Elson試驗(yàn)進(jìn)行定量(Bulik，D.A.，et al.EukaryotCell 2886-900(2003))。
實(shí)施例2乳酸克魯維酵母殼多糖酶(KlCts1p)的鑒定和生物化學(xué)特征 在對(duì)乳酸克魯維酵母GG799耗盡培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡分析中，應(yīng)用針對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌ChilA殼多糖酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(α-CBD)產(chǎn)生的多克隆抗體，以便鑒定含有交叉反應(yīng)的殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然分泌的乳酸克魯維酵母蛋白(圖1)。
在4-20％聚丙烯酰胺Tris-甘氨酸SDS凝膠上分離10ml未濃縮的乳酸克魯維酵母GG799耗盡培養(yǎng)基(生長(zhǎng)96小時(shí))中的分泌蛋白質(zhì)，并應(yīng)用針對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌殼多糖酶A1殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的多克隆抗體，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡篩選殼多糖結(jié)構(gòu)域的存在情況(泳道1)。在SDS-PAGE分離之前，將分泌蛋白質(zhì)結(jié)合于殼多糖珠并通過(guò)煮沸2分鐘而直接洗脫到SDS-PAGE加樣緩沖液(泳道2)。
為了檢測(cè)這些蛋白質(zhì)中的任何蛋白質(zhì)是否能夠結(jié)合殼多糖，將耗盡培養(yǎng)基與殼多糖珠子混合并在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。殼多糖珠子用水洗滌，通過(guò)煮沸將結(jié)合蛋白質(zhì)直洗脫到SDS-PAGE加樣緩沖液中。蛋白質(zhì)印跡表明，僅85kDa的a-CBD交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)能夠結(jié)合殼多糖(圖1，泳道2)。對(duì)以此方式從殼多糖珠子直接純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行N-端蛋白質(zhì)測(cè)序，鑒定出天然蛋白質(zhì)的起始20個(gè)氨基酸(FDINAKDNVAVYWGQASAAT)(SEQ ID NO7)。利用此氨基酸序列作為針對(duì)探針序列數(shù)據(jù)庫(kù)的待詢序列進(jìn)行tBLASTn搜索，鑒定出部分測(cè)序的乳酸克魯維酵母基因，所述基因的翻譯精確匹配于待詢序列并且與釀酒酵母細(xì)胞外殼多糖酶Cst1p(ScCts1p)具有明顯的同源性。
克降KlCTS1和序列分析 在本工作開(kāi)始時(shí)，乳酸克魯維酵母基因組的序列還未被報(bào)道。因此，應(yīng)用DNA印跡雜交和錨定PCR的結(jié)合來(lái)克隆通過(guò)應(yīng)用tBLASTn算法的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索被初始鑒定的部分KlCTS1序列(見(jiàn)上文)的其余部分。KlCts1p序列與近來(lái)報(bào)道的乳酸克魯維酵母基因組序列中的乳酸克魯維酵母ORF KLLA0C04730g的翻譯產(chǎn)物一致(Dujon B.，et a1.Nature 43035-44(2004))。
KlCTS1編碼分子量是85kDa的、具有551個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，如SDS-PAGE所確定。KlCTS1p與釀酒酵母Cts1p殼多糖酶有53％的同一性和82％的相似性，并且具有由信號(hào)肽、催化結(jié)構(gòu)域、富含絲氨酸/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域和殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的相似的模塊型結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(圖2A)。Signal P軟件(Nielson et al.Protein Eng.101-6(1997))預(yù)測(cè)出存在在A19后切割的信號(hào)肽(圖2A)。這與從純化的分泌KlCts1p測(cè)定的、起始于F20的氨基端蛋白質(zhì)序列一致。預(yù)測(cè)的KlCts1p催化結(jié)構(gòu)域和其它殼多糖酶的催化結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸同源性表明，KlCts1p屬于殼多糖酶家族18(圖2B)。此外，SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件(Letunic，I.，et al.Nucl.AcidsRes.30242-244(2002)和Schultz，J.，et al.PNAS 955857-5864(1998))表明存在含有6個(gè)保守半胱氨酸殘基的C端2型殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖2C)。
比較KlCts1p和釀酒酵母殼多糖酶(ScCts1p)的催化性質(zhì)。因?yàn)獒劸平湍窩ts1p的最適pH為酸性(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.26619758-19767(1991))，首先選擇pH 4.5來(lái)定義KlCts1p的底物偏好。如圖3B所示，來(lái)自兩種酵母的殼多糖酶既水解4MU-GlcNAc3又水解4MU-GlcNAc4底物。然而，乳酸克魯維酵母殼多糖酶不同于ScCts1p，不同之處在于其相對(duì)于4MU-GlcNAc3優(yōu)選4MU-GlcNAc4的程度。對(duì)于從菌株CBS2359和CBS683分泌的殼多糖酶，觀察到與乳酸克魯維酵母菌株GG799所示相似的結(jié)果。此外，KCts1p在pH 4.5時(shí)顯示出最大活性，這比ScCts1p顯示最大活性的pH值的堿性高約0.5pH單位(圖3C)。
KlCts1p CBD-殼多糖親和試驗(yàn) 在一系列條件下檢測(cè)KlCts1p和殼多糖珠的締合。圖4A示出了KlCts1p與殼多糖的締合在5M NaCl和pH 3、pH 5以及pH 10的緩沖液中是穩(wěn)定的。在8M尿素中——該條件通常使蛋白質(zhì)變性，僅僅約60％的殼多糖結(jié)合KlCts1p從殼多糖珠解離。然而，在20mM NaOH中，pH 12.3時(shí)，觀察到完全解離。殼多糖結(jié)合KlCts1p的洗脫曲線顯示，在起初兩個(gè)級(jí)分(包含空體積)中洗脫出等量蛋白質(zhì)，這表明KlCts1p-殼多糖締合的去穩(wěn)定在20mM NaOH中立即發(fā)生(圖4B)。令人驚訝地，以此方式洗脫的KlCts1p保持殼多糖分解活性(圖4C)。事實(shí)上，殼多糖結(jié)合前和用20mM NaOH洗脫后對(duì)殼多糖酶活性的測(cè)定表明，接近100％的殼多糖酶活性被恢復(fù)。
為了測(cè)定KlCts1p CBD是否可以起如下作用i)獨(dú)立于KlCts1p催化結(jié)構(gòu)域；和ii)作為異源表達(dá)蛋白質(zhì)上的親和標(biāo)簽，含有與來(lái)自KlCts1p(KlCBD)的氨基酸470-551的CBD融合的C端的人血清白蛋白(HSA)從乳酸克魯維酵母分泌。為了對(duì)照，HAS也被融合到環(huán)狀芽孢桿菌殼多糖酶A1 3型CBD(BcCBD)并以相同方式從乳酸克魯維酵母分泌。如實(shí)施例1所述將CBD融合蛋白結(jié)合到殼多糖珠子，測(cè)定在20mM NaOH存在時(shí)它們的殼多糖親和力。圖4D顯示，在20mM NaOH中，HSA-KlCBD融合蛋白從殼多糖珠子完全解離，而甚至在用20mM NaOH大量洗滌之后，HSA-BcCBD融合蛋白仍與殼多糖結(jié)合。這些結(jié)果表明，KlCBD獨(dú)立于KlCts1p催化結(jié)構(gòu)域起作用，其在20mM NaOH中從殼多糖解離是固有的性質(zhì)。而且，這些數(shù)據(jù)表明了這樣的可能性，即KlCBD能夠被用作可洗脫親和標(biāo)簽，以便純化或可逆性地殼多糖固定嗜堿性或耐堿性蛋白質(zhì)。
KlCTS1的斷裂 為了測(cè)定乳酸克魯維酵母中的KlCts1p的體內(nèi)功能，在單倍體細(xì)胞中斷裂KlCTS1等位基因。應(yīng)用基于PCR的方法裝配含有卡那霉素選擇性標(biāo)記序列盒的DNA斷裂片段，如材料和方法和所述。應(yīng)用此片段將乳酸克魯維酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為G418抗性。通過(guò)全細(xì)胞PCR篩選已在KlCts1基因座處整合了斷裂DNA片段的轉(zhuǎn)化子。在所測(cè)定的20個(gè)菌落中，2個(gè)菌落正確地整合了斷裂DNA片段(數(shù)據(jù)未顯示)，表明KlCTS1對(duì)于乳酸克魯維酵母的生存不是必需的。此外，乳酸克魯維酵母Dcts1不能分泌殼多糖酶，如由耗盡培養(yǎng)基中缺乏KlCts1p(圖5A)和殼多糖分解活性(圖3A)所證明。
測(cè)定乳酸克魯維酵母野生型(GG799)和Δcts1細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。在YPD培養(yǎng)基中，Δcts1菌株生長(zhǎng)為小簇的松散塊狀細(xì)胞，其在短暫超聲波處理后容易地分散成單個(gè)細(xì)胞。對(duì)用殼多糖結(jié)合染料熒光增白劑(Calcofluor white)染色的細(xì)胞的熒光顯微鏡分析表明，Δcts1細(xì)胞通過(guò)膜連接(圖5B，右圖)，表明這些細(xì)胞在胞質(zhì)分裂期間不能降解膜殼多糖。對(duì)釀酒酵母Δcts1細(xì)胞觀察到相似的表型(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.26619758-19767(1991))。因此，KlCTS1恢復(fù)釀酒酵母Δcts1細(xì)胞正常細(xì)胞分離的能力被檢測(cè)。將KlCTS1置于釀酒酵母表達(dá)載體中GAL10半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。表達(dá)KlCTS1的釀酒酵母Δcts1細(xì)胞在含半乳糖培養(yǎng)基中分泌KlCTS1(圖6A)，并且不形成細(xì)胞聚集物(圖6B)?？傮w考慮，這些數(shù)據(jù)表明，KlCTS1和ScCTS1編碼參與細(xì)胞分離的功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)，推測(cè)細(xì)胞分離是通過(guò)促進(jìn)膜殼多糖降解實(shí)現(xiàn)。
乳酸克魯維酵母殼多糖酶缺失突變體的特性 測(cè)定Δcts1細(xì)胞生長(zhǎng)至高培養(yǎng)密度的能力。有關(guān)乳酸克魯維酵母Δcts1細(xì)胞的聚集表型使通過(guò)600nm處吸光度(OD600)測(cè)定的細(xì)胞密度偏差至野生型細(xì)胞的65％以下。然而，生長(zhǎng)48小時(shí)的野生型和Acts1細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生幾乎相同的細(xì)胞干重。此外，兩個(gè)菌株間的細(xì)胞總殼多糖沒(méi)有顯著差異。在KOH提取細(xì)胞殼多糖和殼多糖酶水解后，菌株GG799產(chǎn)生每毫克干細(xì)胞21.8±1.9納摩爾(nmoles)GlcNAc，Δcts1菌株產(chǎn)生每毫克干細(xì)胞20.8±1.0納摩爾(nmoles)GlcNAc。因此，雖然它們具有溫和的生長(zhǎng)表型，但Δcts1細(xì)胞保持能夠在培養(yǎng)中獲得與野生型細(xì)胞相同的細(xì)胞密度，這表明此菌株背景將適于商業(yè)生產(chǎn)CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3pGBN2-HSA-KlCBD的制備 為了產(chǎn)生KlCts1p的CBD和人血清白蛋白(HSA)的融合，應(yīng)用DeepVentTMDNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，用引物5′-GGAAGATCTGACTCCTGGGCTGTTACAAGA-3′(Bgl II位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQID NO8)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCbCTAGAAGACGACGTCGGGTTTCAAATA-3’(Not I位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQ ID NO9)，擴(kuò)增編碼KlCts1p的C端81個(gè)氨基酸的DNA片段。將KlCts1p-CBD片段克隆入乳酸克魯維酵母整合型表達(dá)質(zhì)粒pGBN2(NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的Bgl II-Not I位點(diǎn)，產(chǎn)生pGBN2-KlCBD。用引物5′-CCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3′(Xho I位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQ ID NO10)和5′-CGCGGAICCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3′(BamH I位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQ ID NO11)擴(kuò)增HAS，并克隆入pGBN2-KlCBD的Xho I-Bgl II位點(diǎn)。當(dāng)整合到乳酸克魯維酵母基因組中時(shí)，得到的表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生由釀酒酵母a-交配因子前原分泌前導(dǎo)序列(存在于pGBN2中)、HAS、和KlCBD組成的單個(gè)多肽。
以相似方式裝配產(chǎn)生HAS的對(duì)照構(gòu)建體，所述HAS含有來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌殼多糖酶A1的羧基端3型CBD(BcCBD)。應(yīng)用引物5′-GGAAGATCTACGACAAATCCTGGTGTATCCGCT-3′(Bgl II位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQ ID NO12)和5′ATAAGAATGCGGCCGCTTATTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAAC-S′(Not I位點(diǎn)以下劃線示出)(SEQ ID NO13)PCR擴(kuò)增來(lái)自pTYB1(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的BcCBD。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGBN2的Bgl II-Not I位點(diǎn)，產(chǎn)生pGBN2-BcCBD。擴(kuò)增HAS并克隆入pGBN2-BcCBD的Xho I-Bgl II位點(diǎn)，如上述。
實(shí)施例4在乳酸克魯維酵母Δcts1細(xì)胞中產(chǎn)生和分泌HSA-CBD 載體pGBN2-HSA-KlCBD(5μg)應(yīng)用SacII線性化并通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母Δcts1細(xì)胞。在含有5mM乙酰胺的酵母碳基瓊脂培養(yǎng)基(DifcoTM，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)上，于30℃生長(zhǎng)4天，選擇轉(zhuǎn)化子。應(yīng)用單獨(dú)的轉(zhuǎn)化子起始2ml YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)培養(yǎng)，于30℃生長(zhǎng)過(guò)夜。應(yīng)用過(guò)夜培養(yǎng)物的1∶100稀釋液接種2ml YPGal(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％半乳糖)培養(yǎng)物。振蕩下于30℃接種培養(yǎng)物48小時(shí)。以15,800×g離心1ml培養(yǎng)物2分鐘以去除細(xì)胞，制備耗盡培養(yǎng)基。將20ml澄清的耗盡培養(yǎng)基的等分試樣轉(zhuǎn)移到新試管中，混合以10ml的3×蛋白質(zhì)加樣緩沖液并于95℃加熱10分鐘。在10-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上分辨20ml等分試樣，通過(guò)考馬斯染色檢測(cè)分泌的HSA-KlCBD融合蛋白。
實(shí)施例5用殼多糖珠純化HSA-KlCBD 為了通過(guò)將融合蛋白固定于殼多糖而分離分泌的HSA-KlCBD，使含有整合HSA-KlCBD表達(dá)片段的乳酸克魯維酵母Dcts1細(xì)胞(見(jiàn)上文)在20ml YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)。通過(guò)離心將細(xì)胞從培養(yǎng)基中去除，耗盡培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有1ml水洗殼多糖珠(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的新鮮試管中并在室溫下溫育1小時(shí)，同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)。離心收獲殼多糖珠，用10ml水洗滌并重懸浮于1ml水中。通過(guò)在SDS加樣緩沖液中煮沸約50ml體積的蛋白質(zhì)結(jié)合殼多糖珠2分鐘，隨后微量離心2分鐘以去除殼多糖珠，洗脫固定的HSA-KlCBD。上清液中洗脫的HSA-KlCBD通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯染色或應(yīng)用a-CBD或a-HAS抗體的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行觀察。此外，通過(guò)使5ml的20mM NaOH穿過(guò)柱子，HSA-KlCBD可以從殼多糖珠洗脫。以此方式產(chǎn)生的HAS不含有偶然結(jié)合于殼多糖或降解殼多糖的內(nèi)源性乳酸克魯維酵母蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6應(yīng)用磁化殼多糖珠濃縮HSA-KlCBD 在培養(yǎng)物生長(zhǎng)各個(gè)階段，應(yīng)用CBD-標(biāo)記人血清白蛋白(CBD-taggedhuman serum albumin(HSA-CBD))證明CBD-標(biāo)記蛋白與磁性殼多糖珠的締合情況(參見(jiàn)圖8)。用已在30℃生長(zhǎng)24小時(shí)的2ml起始培養(yǎng)物的100ml接種乳酸克魯維酵母菌株GG799Δcts1 PCKl3的4個(gè)25ml YPGal(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％半乳糖)培養(yǎng)物。
培養(yǎng)物1在接種之前，將已經(jīng)通過(guò)高壓滅菌滅菌20分鐘的1ml沉淀的殼多糖磁珠加入培養(yǎng)基中。于30℃溫育培養(yǎng)物72小時(shí)，同時(shí)以～300r.p.m.振蕩。
培養(yǎng)物2在生長(zhǎng)24小時(shí)時(shí)，將1ml無(wú)菌磁性殼多糖珠子加入培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基于30℃溫育另外48小時(shí)(總共72小時(shí))，同時(shí)以～300r.p.m.振蕩。
培養(yǎng)物375小時(shí)后，將1ml殼多糖磁珠加入第三培養(yǎng)物，隨后室溫下輕輕振蕩1小時(shí)。
培養(yǎng)物4通過(guò)以5000r.p.m.離心5分鐘使第四培養(yǎng)物清除細(xì)胞，隨后將1ml磁性殼多糖珠子加入澄清的耗盡培養(yǎng)基，隨后室溫下輕輕振蕩1小時(shí)。
將每一培養(yǎng)物倒入標(biāo)準(zhǔn)的50ml加蓋實(shí)驗(yàn)室試管中。通過(guò)將試管插入50ml的磁力設(shè)備30秒(圖9)隨后倒出上清液而收獲磁珠。隨后從磁場(chǎng)移去試管，磁性殼多糖顆粒沉淀應(yīng)用40ml水洗滌并在磁場(chǎng)中重新分離。此洗滌步驟總共重復(fù)3次，隨后將珠子轉(zhuǎn)移到四個(gè)加螺帽的微量離心管中。為了洗脫結(jié)合的HSA-CBD，將每一試管中的珠子重懸浮于含有二硫蘇糖醇的250ml的3×蛋白質(zhì)加樣緩沖液中(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，并于98℃加熱5分鐘。5ml每一樣品中的洗脫蛋白質(zhì)在10-20％SDS-PAGE凝膠中分離，通過(guò)考馬斯染色觀察(圖8)。觀察每一樣品中的洗脫HSA-CBD，表明磁性殼多糖珠子在培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間或之后成功地捕獲CBD-標(biāo)記蛋白質(zhì)。在每一培養(yǎng)物中的捕獲HSA-CBD的產(chǎn)量估計(jì)為4mg/L。
實(shí)施例7應(yīng)用磁化殼多糖珠子濃縮分泌的GluC-CBD蛋白 為了檢測(cè)磁珠濃縮培養(yǎng)基中CBD融合蛋白的能力，使用編碼融合蛋白(GluC-CBD，其中GluC是來(lái)自金黃色葡萄球菌的內(nèi)源性蛋白)的DNA轉(zhuǎn)化的環(huán)狀芽孢桿菌的20ml過(guò)夜培養(yǎng)物，在125ml瓶中生長(zhǎng)。將編碼GluC的DNA插入含有環(huán)狀芽孢桿菌CBD的質(zhì)粒pGNB5。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(Harwood and Cutting，Molecular Biological Methods，ed.John Wiley & Sons Ltd.，New York，NY，pp.33-35，67，1990)。為了比較目的，培養(yǎng)4個(gè)培養(yǎng)物一個(gè)含有表達(dá)GluC內(nèi)切蛋白酶的質(zhì)粒，三個(gè)含有針對(duì)融合蛋白(GluC-CBD)的質(zhì)粒。對(duì)于所有試驗(yàn)，向培養(yǎng)物中加入5％珠體積。作為對(duì)照，使含有GluC構(gòu)建體的培養(yǎng)物在磁珠存在的情況下生長(zhǎng)過(guò)夜，以檢測(cè)非特異性結(jié)合(圖12，泳道2)。在不同時(shí)間將磁珠加入三個(gè)GluC-CBD培養(yǎng)物，觀察溫育時(shí)間是否影響結(jié)合能力。培養(yǎng)物1于整個(gè)生長(zhǎng)周期存在珠子的情況下37℃振蕩下培養(yǎng)過(guò)夜(圖12，泳道3)。對(duì)于培養(yǎng)物2，磁珠在37℃生長(zhǎng)16小時(shí)后加入并37℃振蕩下溫育1小時(shí)(圖12，泳道4)。培養(yǎng)物3于37℃振蕩下培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)離心去除細(xì)胞(10,000rpm，10分鐘)。將磁珠加入上清液并于振蕩下室溫溫育1小時(shí)(圖12，泳道5)。在所有情況下，應(yīng)用磁分離架(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)收獲珠子，用10ml LB肉湯洗滌三次，隨后用10ml的1MNaCl洗滌兩次。將珠子懸浮于1mI的1MNaCl中，轉(zhuǎn)移到1.5ml eppendorf管，并以10,000rpm離心1分鐘以便去除液體。將珠子懸浮于帶有DTT的100ml 3×SDS樣品緩沖液中，煮沸5分鐘去除蛋白質(zhì)。通過(guò)在10,000rpm離心2分鐘，從緩沖液中分離珠子。在10-20％Tricine凝膠上分析樣品，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用考馬斯蘭染色。洗脫蛋白質(zhì)的鑒定通過(guò)N端測(cè)序證實(shí)。結(jié)果表明，分泌的GluC-CBD融合蛋白是磁性殼多糖珠子結(jié)合的主要蛋白，并且可以通過(guò)在SDS加樣緩沖液中煮沸被有效地洗脫。結(jié)果也顯示，珠子可以在試驗(yàn)期間的任何時(shí)間點(diǎn)加入而不改變它們的效力。
實(shí)施例8熒光素酶的生產(chǎn)和從殼多糖珠的洗脫 將編碼野生型乳酸克魯維酵母CBD的基因克隆入載體pKLAC1的NotI/StuI限制性位點(diǎn)，產(chǎn)生載體pKLAC1-KlCBD。隨后將編碼Gaussia熒光素酶(GLuc)的基因克隆入載體pKLAC1-KlCBD的XhoI/NotI限制性位點(diǎn)，產(chǎn)生與載體來(lái)源的分泌信號(hào)的N端融合和與KlCBD基因的C端融合。將此構(gòu)建體線性化并轉(zhuǎn)化入乳酸克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞。得自分泌GLuc-KlCDB的乳酸克魯維酵母細(xì)胞的1升耗盡培養(yǎng)基與20ml床體積的殼多糖室溫下混合1小時(shí)。將殼多糖珠倒入柱子，隨后用10柱體積(200ml)的水洗滌。用20mM NaOH洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。在含有1ml 1M Tris-Cl pH 7.5的試管中收集4ml洗脫級(jí)分，以便在洗出液從柱子中出來(lái)時(shí)中和該洗出液。分析25微升每一洗脫級(jí)分的1∶40稀釋液中的熒光素酶活性，表示為RLU(相對(duì)光單位)。圖13示出，活性GLuc在級(jí)分2至10中被洗脫，最高活性可見(jiàn)于級(jí)分3、4和5中。
序列表<110>新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs，Inc.)C.H.塔龍P.A.科盧西<120>濃縮分泌的重組蛋白的方法和組合物<130>NEB-247-PCN<150>+60/690,470<151>2005-06-14<150>60/690,470<151>2005-06-14<150>PCT/US2005/035697<151>2005-10-03<150>60/616,420<151>2004-10-06<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>98<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1ccagtaatgc aactatcaat cattgtgtta aactggtcac cagaaataca agatatcaaa60aattactaat actaccataa gccatcatca tatcgaag98<210>2<211>104<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2ccaaactagc gtatccggtt ggattattgt tttcgatatc gaaatcgaaa ccatcgacga60cagcagtgtc gaatggtctt tccccggggt gggcgaagaa ctcc 104<210>3<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3gggcacaaca atggcagg 18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4gcctctccac ccaagcggc 19
<210>5<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5ggcggatccg ccaccatgtt tcaccctcgt ttactt 36<210>6<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6acatgcatgc ctagaagacg acgtcgggtt tcaa34<210>7<211>20<212>PRT<213>乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)<400>7Phe Asp Ile Asn Ala Lys Asp Asn Val Ala Val Tyr Trp Gly Gln Ala1 5 10 15Ser Ala Ala Thr20<210>8<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8ggaagatctg actcctgggc tgttacaaga 30<210>9<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9ataagaatgc ggccgcctag aagacgacgt cgggtttcaa ata 43<210>10<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10ccgctcgaga aaagagatgc acacaagagt gaggttgct 39
<210>11<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11cgcggatcct aagcctaagg cagcttgact tgc 33<210>12<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12ggaagatcta cgacaaatcc tggtgtatcc gct 33<210>13<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13ataagaatgc ggccgcttat tgaagctgcc acaaggcagg aac 43<210>14<211>57<212>PRT<213>人工的<220>
<223>2類殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域共有序列<400>14Gln Asp Cys Thr Asn Ala Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Gly Glu Cys1 5 10 15Glu Pro Gln Phe Leu Thr Cys Ser Gly Gly Ile Ala Arg Ile Met Asp20 25 30Cys Pro Ala Asp Leu Ile Tyr Asn Glu Pro Leu Leu Ile Cys Asp Trp35 40 45Arg His Asn Val Ile Gly Cys Glu Gly50 55<210>15<211>48<212>PRT<213>乳酸克魯維酵母<400>15Cys Ser Asp Gly Glu Ile Ser Cys Thr Ala Asp Gly Lys Ile Ala Ile1 5 10 15Cys Asn Tyr Gly Ala Trp Val Tyr Thr Glu Cys Ala Ala Gly Thr Thr20 25 30
Cys Phe Ala Tyr Asp Ser Gly Asp Ser Val Tyr Thr Ser Cys Asn Phe35 40 45<210>16<211>64<212>PRT<213>番茄葉霉菌(Cladosporium fulvum)<400>16Thr Lys Cys Met Gly Pro Lys Asp Cys Leu Tyr Pro Asn Pro Asp Ser1 5 10 15Cys Thr Thr Tyr Ile Gln Cys Val Pro Leu Asp Glu Val Gly Asn Ala20 25 30Lys Pro Val Val Lys Pro Cys Pro Lys Gly Leu Gln Trp Asn Asp Asn35 40 45Val Gly Lys Lys Trp Cys Asp Tyr Pro Asn Leu Ser Thr Cys Pro Val50 55 60<210>17<211>68<212>PRT<213>Ralstonia solanacearum<400>17Phe Lys Cys Pro Ala Pro Ser Gly Arg Tyr Leu Val Asp Asp Gly Thr1 5 10 15Asn Asn Arg Gly Pro Asn Gln Val Pro Arg Thr Asn Cys Thr Arg Ala20 25 30Tyr Ala Val Cys Asp Ala Gln Ser His Ala Thr Leu Asp His Cys Pro35 40 45Ser Gly Gln Val Phe Asp Lys Arg Phe Ser Thr Cys Val Val Lys Asp50 55 60Ala Cys Asp Glu65<210>18<211>54<212>PRT<213>秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)<400>18Phe Lys Cys Thr Lys Asp Gly Phe Phe Gly Val Pro Ser Asp Cys Leu1 5 10 15Lys Phe Ile Arg Cys Val Asn Gly Ile Ser Tyr Asn Phe Glu Cys Pro20 25 30Asn Gly Leu Ser Phe His Ala Asp Thr Met Met Cys Asp Arg Pro Asp35 40 45Pro Ser Lys Cys Ala Lys
50<210>19<211>48<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Cys Ala Gly Arg Ala Asn Gly Leu Tyr Pro Val Ala Asn Asn Arg Asn1 5 10 15Ala Phe Trp His His Cys Val Asn Gly Val Thr Tyr Gln Gln Ash Cys20 25 30Gln Ala Gly Leu Val Phe Asp Thr Ser Cys Asp Cys Cys Asn Trp Ala35 40 45<210>20<211>52<212>PRT<213>黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)<400>20Leu Glu Cys Thr Glu Gly Asp Tyr Tyr Pro His Arg Asn Cys Arg Lys1 5 10 15Tyr Tyr Ile Cys Asn Lys Ala Leu Val Pro Ser Glu Cys Gly Gly Asp20 25 30Leu His Trp Asp Gly Ile Lys Lys Leu Cys Asp Trp Pro Glu Asn Val35 40 45Gln Cys Val Thr50
權(quán)利要求
1.得到分泌的重組蛋白質(zhì)的濃縮制備物的方法，包括(a)用含有DNA的載體轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)細(xì)胞，所述DNA編碼包括殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和目標(biāo)蛋白的融合蛋白；(b)在所述宿主表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，并從所述宿主表達(dá)細(xì)胞分泌所述融合蛋白；和(c)通過(guò)CBD將所述的分泌的融合蛋白結(jié)合到殼多糖制備物，所述融合蛋白能夠在非變性條件下洗脫入所需的緩沖液體積，以便得到所述分泌的重組蛋白的濃縮制備物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)中的所述載體是穿梭載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在所述載體中編碼所述目標(biāo)蛋白的所述DNA在大腸桿菌(E.coli)中轉(zhuǎn)錄是沉默的，在所述宿主表達(dá)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄是活化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述穿梭載體具有修飾的LAC4啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述穿梭載體是PKIAC1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主表達(dá)細(xì)胞是殼多糖酶-缺陷型細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述宿主表達(dá)細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述酵母細(xì)胞是選自克魯維酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)的單個(gè)種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述酵母細(xì)胞是克魯維酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述克魯維酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)變種脆壁克魯維酵母(fragilis)或乳酸克魯維酵母(lactis)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主表達(dá)細(xì)胞處于培養(yǎng)中，因而所述融合蛋白被分泌到所述培養(yǎng)基中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，還包括在培養(yǎng)期間將殼多糖加入所述培養(yǎng)基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述殼多糖是無(wú)菌的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或11的方法，其中，在培養(yǎng)之后，所述殼多糖被加入所述混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或13的方法，其中所述殼多糖是選自涂層、膠體、珠、柱、基質(zhì)、片層或膜的形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或13的方法，其中所述殼多糖是殼多糖珠，所述珠或是有孔的或是無(wú)孔的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述殼多糖珠被磁化。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中在步驟(d)中，回收與所述殼多糖結(jié)合的結(jié)合的融合蛋白還包括施加磁力。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述融合蛋白和殼多糖的所述結(jié)合是可逆的，因而在不同于結(jié)合條件的非變性條件下，所述融合蛋白可以從所述殼多糖釋放。
20.得到分泌的重組蛋白質(zhì)的濃縮制備物的方法，包括(a)提供穿梭載體，其中所述穿梭載體(i)能夠整合到酵母宿主細(xì)胞的基因組中，和(ii)含有DNA，所述DNA編碼含有殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)蛋白的融合蛋白；(b)用所述穿梭載體轉(zhuǎn)化殼多糖酶缺陷型宿主表達(dá)細(xì)胞，用于在所述酵母宿主表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，并從所述酵母宿主表達(dá)細(xì)胞分泌所述融合蛋白；和(c)通過(guò)CBD將所述分泌的融合蛋白結(jié)合到殼多糖制備物，以獲得所述分泌的重組蛋白的濃縮制備物。
21.克魯維酵母細(xì)胞制備物，特征在于殼多糖酶陰性表型，其中所述表型是編碼分泌的殼多糖酶的殼多糖酶基因中的突變的結(jié)果，所述制備物能夠生長(zhǎng)至與野生型克魯維酵母細(xì)胞相似的細(xì)胞密度。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的克魯維酵母細(xì)胞制備物，還能夠表達(dá)和分泌重組蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的克魯維酵母細(xì)胞制備物，其中所述表達(dá)由LAC4啟動(dòng)子或其修飾物調(diào)節(jié)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的克魯維酵母細(xì)胞制備物，包括穿梭載體，所述穿梭載體具有修飾的Lac4啟動(dòng)子，用于在克魯維酵母中表達(dá)蛋白質(zhì)而在大腸桿菌中基本上不表達(dá)蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的克魯維酵母細(xì)胞制備物，其中所述穿梭載體是pKLACI。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的克魯維酵母細(xì)胞制備物，還包括培養(yǎng)基，在所述培養(yǎng)基中，所述克魯維酵母至少能夠生長(zhǎng)或維持，所述培養(yǎng)基還包括無(wú)菌殼多糖。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的克魯維酵母細(xì)胞制備物，其中所述無(wú)菌殼多糖是磁珠形式。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的克魯維酵母細(xì)胞制備物，其中所述制備物包含在容器中，所述容器任選地含有磁體或與磁體接觸，用于可逆地結(jié)合所述殼多糖珠。
全文摘要
描述了涉及獲得分泌的重組蛋白的濃縮制備物的方法和組合物。這些蛋白質(zhì)以帶有殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin－binding domain(CBD))的融合蛋白的形式表達(dá)。所述融合蛋白能夠在殼多糖存在的情況下被濃縮。也描述了含有修飾的LAC4啟動(dòng)子的穿梭載體；殼多糖酶－陰性宿主細(xì)胞；能夠在非變性條件下從殼多糖洗脫的CBD；和滅菌的殼多糖，其可以被任選地磁化以促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的回收。
文檔編號(hào)C12N9/24GK101061225SQ200580039210
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月6日
發(fā)明者C·H·塔龍, P·A·科盧西 申請(qǐng)人:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司