專利名稱：用于所有組織細胞系的干細胞成熟方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞生物學領域。更具體地，本發(fā)明涉及細胞療法，特別是干細胞療法的領域。本發(fā)明提供了雜交干細胞和其制備及使用的相關方法。本發(fā)明的雜交干細胞可用于治療需要其的哺乳動物中的、有疾病的和受損傷的組織和器官。
背景技術：
自從首次對從人胚細胞分離胚胎干細胞進行描述以來，很多報道并不深入地涉及了對胚胎干細胞和成年干細胞的分離和分析。Bongso，A..et al.(1996)，Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocyst，Hum.Reprod.U.S.A.9，2110-17。
干細胞(胚胎和成年的)能長期自我更新，并能產(chǎn)生具有特定形態(tài)和功能的成熟細胞類型。類似地，與來自胚細胞內(nèi)物質(zhì)的胚胎干(ES)細胞一樣，成年干細胞的來源也共享共同來源。
典型地，成年干細胞共享至少兩種特征i)它們能在長時期內(nèi)制造自身的相同拷貝(長期自我更新)，并且它們能產(chǎn)生具有特征性的形態(tài)和專門化的功能的成熟細胞類型。Stem cellsScientific Progress and FutureResearch Directions，Dept. of Health and Huamn Services，Jun 2001；http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。成年干細胞可能缺少與ES細胞相關的多能性，但是，至少一篇報道表明，成年干細胞展示出了與人們以前所認識的更大的可塑性。Lagasse，E.et al.(2000)，Purifiedhematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo，Nat.Med.6，1229-34。
最終，為展示出可塑性，成年干細胞應當產(chǎn)生具有成熟表型的完全分化細胞。成年干細胞還應當完全整合進它們的新組織環(huán)境，并且能展示出適于該組織的專門化的組織功能。Stem CellsScientific Progress and FutureResearch Directions，見上。
對成年干細胞可塑性進行研究的難處在于建立起成年干細胞來自一類細胞或細胞群。迄今為止，研究得最好的成年干細胞基于骨髓和腦細胞。但是，使用來自骨髓的干細胞(即，造血干細胞、基質(zhì)細胞和/或內(nèi)皮細胞)和腦干細胞(即成神經(jīng)細胞)存在其局限性。例如，使用細胞揀選儀對來自骨髓的造血干細胞進行揀選，所述細胞揀選儀按照多種細胞表面標記來對細胞加以揀選。該方法產(chǎn)生了高度純化至部分純化的細胞類型。在另一個例子中，對神經(jīng)干細胞的純化是困難的，因為這些細胞定位于不同的組織(即，小鼠的側(cè)腦室、嗅球以及海馬體)，而不在一種方便的位置或組織器官中。Altman，J.and Das，G.D.(1965)，Autoradiographic andhistological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats，J.ComplNeurol.，124，319-335；Altman，J.(1969)，Autoradiographic and histologicalstudies of postnatal neurogenesis.IV.Cell proliferation and migration into theanterior forebrain，with special reference to persisting neurogenesis in theolfactory bulb，J.Compl Neurol.，137，433-457。
成年干細胞的其它候選者是皮膚和消化系統(tǒng)中的內(nèi)皮祖細胞、骨骼肌干細胞、上皮細胞前體，以及胰腺和肝中的干細胞。Stem CellsScientificProgress and Future Research Directions，見上。
成年干細胞的另一種類型來自生殖細胞或原性細胞(PSC)，其位于睪丸的生精小管和卵巢內(nèi)層——分別為精原細胞和卵原細胞。精原細胞產(chǎn)生涉及減數(shù)分裂的前體。存在至少兩種類型的精原細胞A型和B型，它們可基于獨特的特征分化。例如，A型精原細胞更呈球形，其具有突出的核仁和均勻分散的常染色質(zhì)。然而，B型精原細胞形狀上趨向于更不規(guī)則、更小，具有淺裂(lobed)核仁。Guillaume E，et al.(2001)，Proteomeanalysis of rat spermatogoniareinvestigation of stathmin spatio-temporalexpression within the testis，MoI.Reprod.Dev.，60(4)439-45。Chiarini-Garcia，H.and Russell，L.D.(2002)，Characterization of mouse spermatogonia bytransmission electron microscopy，Reproduction，123(4)567-77。因此，與其它成年干細胞不同，成年生殖細胞易于定位，以及與其它間質(zhì)細胞區(qū)別開。
類似于其它成年身體干細胞，成年生殖細胞是二倍體的(2n)。與其它成年身體干細胞相反，生殖細胞(精原細胞和卵原細胞)含有未受損傷的、未損壞的基因組。然而，身體細胞的DNA受到更多損傷(即，自由基)，這是由于其老化和低速補充導致的。此外，身體干細胞最終會屈服于產(chǎn)生身體組織的分化力量。因此，包含由未受損傷的DNA構(gòu)成的干細胞的方法是優(yōu)選的。
使用成年干細胞體內(nèi)移植的一個持久問題是免疫排斥。因此，迄今為止，干細胞的受體依賴于其細胞不會被受體免疫系統(tǒng)排斥的供體。
因此，提供具有高速長期自我更新能力，同時易于分離和純化，并且能降低體內(nèi)或體外移植的相關免疫排斥的成年干細胞的改進方法將改進與干細胞生物學以及其治療用途相關的現(xiàn)有問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供雜交干細胞(HSC)，其中包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。
可選地，HSC可以包含來自同一動物的摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞。此外，當成年干細胞和原性細胞來自同一動物時，該動物可選地為哺乳動物。在本發(fā)明的一種單獨的實施方式中，HSC在出生后動物中具有生物活性。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，HSC包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞的細胞核。在一種實施方式中，原性細胞是精原細胞。在另一種不同的實施方式中，原性細胞是未分化的精原細胞。在又一種實施方式中，原性細胞是分化的精原細胞?；蛘?，在另一種單獨的實施方式中，原性細胞可以是卵原細胞。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，HSC包含使用電融合與原性細胞融合的摘除了細胞核的成年干細胞?？蛇x地，在不同的實施方式中，HSC包含通過基于病毒的融合方法與原性細胞融合的摘除了細胞核的成年干細胞?；蛘?，HSC包含使用化學融合與原性細胞融合的摘除了細胞核的成年干細胞。此外，HSC可選地包含使用基于機械的融合與原性細胞融合的摘除了細胞核的成年干細胞。
本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種方法，用于制備經(jīng)過修飾的生殖細胞，所述方法包括(a)從第一供體動物獲得成年干細胞；(b)從與第一供體動物相同物種的第二供體動物獲得原性細胞(PSC)；(c)摘除成年干細胞的細胞核；以及(d)將摘除了細胞核的成年干細胞與PSC融合。
在本發(fā)明的一種不同實施方式中，治療組合物包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核?？蛇x地，在另一種實施方式中，治療組合物被用于再生需要其的動物的有疾病的或受損傷的組織。在一種不同的實施方式中，由治療組合物再生的組織是心臟組織。在另一種實施方式中，治療組合物再生肺、肝、神經(jīng)、腎或身體肌肉組織。
在另一種實施方式中，融合的細胞包含摘除了細胞核的成年干細胞和與所述摘除了細胞核的成年干細胞融合的原性細胞或胚胎干細胞。在一種不同的實施方式中，原性細胞與摘除了細胞核的成年干細胞融合?？蛇x地，在另一種實施方式中，胚胎干細胞與摘除了細胞核的成年干細胞融合。
本發(fā)明的其它實施方式包括一種HSC，其中，摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一物種的不同個體。
或者，HSC中，摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一個體。
此外，本發(fā)明的HSC包括下述細胞，其中包含來自同一個體的摘除了細胞核的成年干細胞和胚胎干細胞。
特定術語的定義本文中使用的術語“原性細胞”指二倍體生殖細胞和/或精原細胞和卵原細胞。
本文中使用的術語“精原細胞”指，產(chǎn)生初級精祖細胞的原始雄性細胞。
本文中使用的術語“卵原細胞”指用作為卵子來源的原始雌性細胞。
本文中使用的術語“卵子”是雌性配子，單倍體未受精的卵，其被精子受精時能發(fā)育為新的動物。
本文中使用的術語“卵母細胞”指卵子發(fā)生過程中的發(fā)育中的卵細胞，經(jīng)歷減數(shù)分裂時形成卵子。
本文中使用的術語“干細胞”描述了一種細胞，其能再生，并且還能產(chǎn)生祖細胞，所述祖細胞最終將產(chǎn)生發(fā)育上被限制為特定系代(lineage)的細胞。
本文中使用的術語“生物反應器”指一種專門的腔，用于在體外培養(yǎng)、擴展、保持、維持細胞和使細胞成熟。
本文中使用的術語“雜交干細胞”指，用摘除了細胞核的成年干細胞制造的干細胞，所述摘除了細胞核的成年干細胞具有從原生殖細胞或胚胎干細胞移植來的細胞核。讀者應當注意，通常使用縮寫“HSC”來表示造血干細胞。但是在本文中“HSC”是雜交干細胞的縮寫。
發(fā)明詳述下述描述不作限制用，其僅用于闡述本發(fā)明一般性原理。本詳述的章節(jié)標題和總體概括僅用于方便的目的，而不欲限制本發(fā)明。
本文中使用的術語“雜交干細胞”描述了下述細胞，其中包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。
被描述于此的本發(fā)明涉及對雜交干細胞(HSC)組合物的制備及其用途。HSC組合物通常是通過下述方法制備的向摘除了細胞核的成年干細胞提供具有供體生殖細胞或干細胞的細胞核。HSC具有來自成年干細胞的表面抗原和受體，但是具有來自發(fā)育上更年輕的細胞的細胞核。結(jié)果，本發(fā)明的雜交干細胞是細胞因子、趨化因子和其它細胞信號試劑能接受的，但具有不含衰老相關損傷的細胞核。衰老相關的損傷包括但不限于核酸自由基損傷和端粒變短。
根據(jù)本發(fā)明的教導制造的HSC可用于廣泛的治療應用。例如但不作限制用，本發(fā)明的HSC可用于補充下述動物中的干細胞，所述動物的天然干細胞由于衰老或切除手術(例如癌癥放療和化療)已損耗。在另一種非限制性的例子中，本發(fā)明的HSC可用于器官再生和組織修復。在本發(fā)明的一種實施方式中，HSC可用于恢復受損的肌肉組織，包括營養(yǎng)不良的肌肉以及萎縮事件(例如心肌梗塞)損傷的肌肉。在本發(fā)明的另一種實施方式中，本文公開的HSC組合物可被用于改善動物中創(chuàng)傷或手術后的傷痕。在該實施方式中，本發(fā)明的HSC被全身性施予，優(yōu)選通過靜脈方式，并遷移到新鮮受傷的組織，所述組織由受損細胞分泌的循環(huán)細胞因子給養(yǎng)。
在一種實施方式中，本發(fā)明的HSC利用下述成年干細胞，所述成年干細胞被摘除了細胞核，然后與胚胎干細胞或原性細胞融合。在一種實施方式中，摘除了細胞核的成年干細胞與原性細胞融合。摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞可以來自相同或不同的動物。得到的HSC可由任何動物或動物組合制得，并被轉(zhuǎn)到其它任何動物中，優(yōu)選地，HSC在出生后動物中具有生物活性。
在本發(fā)明的一種實施方式中，原性細胞是精原細胞。原性細胞可以是未分化的精原細胞或分化的精原細胞?；蛘?，在本發(fā)明的一種不同的實施方式中，原性細胞是卵原細胞。
摘除了細胞核的成年干細胞可通過本領域技術人員已知的多種方法與原性細胞融合。例如，此類融合方法包括但不限于，電融合；基于病毒的融合方法；化學融合；以及基于機械的融合。上述方法是本領域技術人員公知的。因此，無需提供對這些已知方法的描述。此外，將摘除了細胞核的成年干細胞與原性細胞融合不限于上面列出的方法。對于本領域技術人員而言，使用其它融合方法獲得同樣的結(jié)果是顯而易見的。
或者，在本發(fā)明的不同實施方式中，HSC可以包含與胚胎干細胞融合的摘除了細胞核的成年干細胞。對該特定的實施方式而言，可利用上面列出的同樣的融合方法來獲得HSC。此外，融合技術不限于上面提到的那些方法。
摘除細胞核和成核(nucleation)的其它方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括，使用顯微外科技術去核和重新成核的機械方法。雖然我們認為細胞融合技術可以提供HSC的最具有生物活性的形式，但是，共同未決的美國專利申請10/346,816號(’816申請)中教導的技術和方法也可用于本發(fā)明。’816申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
根據(jù)本發(fā)明的教導制造的HSC可以是全能的、多能的、專能的或雙能的。HSC可形成至少一種類型的組織，更特別地，HSC能形成至少多于一種類型的組織。一旦建立起了HSC，可以通過本文所述的多種方法來對其進行操作，以產(chǎn)生想要的特征。例如，雜交干細胞可被被擴展并保持于特定培養(yǎng)基中。
HSC的制備物可從同一物種獲得，或者它們可來自不同物種。HSC的轉(zhuǎn)移可進入到相同物種的宿主或不同物種的宿主。
或者，引物(primed)HSC可被用于獲得用于治療異常癥狀和組織修復的療法的細胞。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，治療組合物包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。治療組合物可用于再生需要其的動物的、有疾病的或受損傷的組織。有疾病的或受損傷的組織可以包括下述組織例如，心臟組織、肺組織和其它身體組織。
實施例本文沒有描述的所有細胞類型和其它材料是通過可獲得的來源和/或通過本領域中使用的標準方法獲得的。
除非另有指明，本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常所理解的一樣的含義。
本文中提到的所有公開文獻都通過引用被并入本文，以描述和公開與引用這些參考文獻的目的相關的特定信息，它們不被解釋為承認通過在先的發(fā)明使本發(fā)明預見了這樣的公開內(nèi)容。
在本說明書中，所展示的優(yōu)選實施方式和實施例應被認為是示例性的，而非對本發(fā)明的限制。
實施例1 分離原性細胞(PSC)對哺乳動物或動物進行麻醉，取出性腺，橫切。在顯微鏡扶助下分離初級性細胞(PSC)?；蛘?，還可使用對性腺的活組織打孔，在顯微鏡輔助下分離PSC。在顯微鏡下，PSC具有干細胞的形態(tài)(即，大、圓、光滑)，是從性腺中機械取回的。特別地，從性腺中取回精原細胞和卵原細胞。特別地，取回A型和B型精原細胞。
為獲得(多個)卵子，令動物排卵過度，取回至少一個卵子，將其放置于營養(yǎng)培養(yǎng)基上使其存活。使用微量移液管將卵子固定在合適的位置，使用另一支微量移液管進入卵子，直到尖端鄰近卵子的細胞核。摘除卵子的細胞核可以通過向微量移液管施加小量真空來進行。棄去卵子(ln)細胞核。可用PSC(即，精原細胞和/或卵原細胞)來重復進行(上述)摘除細胞核的方法，不同之處在于此時保留細胞核，棄去胞質(zhì)溶膠。
摘除細胞核和成核的其它方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括其它機械方法以及利用電刺激的方法。
實施例2 分離和純化A型精原細胞下文是用于分離和純化A型精原細胞的說明性實施例。在第1步中，從6天大的供體小鼠(n＝8)取出睪丸，將其放置到具有滅菌磷酸緩沖鹽水(PBS)(含有10％青霉素-鏈霉素)的皮氏培養(yǎng)皿中。
接著，在第2步，在解剖顯微鏡下對睪丸去膜，收集、匯合生精索(seminiferous cord)/小管，將其放到含有下述溶液的圓錐離心管中，所述溶液為Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Specialty Media)中的2mg/ml膠原酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)和10μg/ml Dnase I(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的溶液。
在第3步，離心之后的內(nèi)容物于37℃在搖床上培養(yǎng)30分鐘，其間伴隨偶爾的輕柔吹吸(pipetting)，以將間質(zhì)Leydig細胞與生精小管分開。
在第4步，培養(yǎng)之后，令生精小管下沉到試管底部，移出含有Leydig細胞的上清液。
在第5步，重復一次消化和下沉步驟。
在第6步，用DMEM對生精小管洗兩次，用2mg/ml膠原酶、10μg/ml Dnase I和1mg/ml II型透明質(zhì)酸酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)在振蕩水浴中于37℃進行20-30的分鐘的進一步消化，直到小管周圍細胞(peritubular cells)與生精小管分離。
在第7步，令生精小管下沉，棄去含有小管周圍細胞的上清液。
在第8步，通過向沉淀中加入1ml含有2mg/ml膠原酶、10μg/mlDnase I和1mg/ml III型透明質(zhì)酸酶的DMEM來進行第四次消化，直到獲得單一的細胞懸浮液。這次消化產(chǎn)生了含有Sertoli細胞和A型精原細胞的細胞懸浮液。
在第9步，用DMEM對細胞洗兩次，經(jīng)80μm的尼龍篩(Tetko)過濾。
在第10步，為使A型精原細胞與Sertoli細胞分離，用識別c-kit受體胞外域的大鼠抗小鼠抗體(克隆2B8；Pharmigen)的1∶200稀釋液對細胞混合物進行1小時的培養(yǎng)。為分離來自成年動物的A型精原細胞，推薦使用識別同嗜性粘著分子，Ep-CAM的大鼠抗小鼠抗體(克隆G8.8，Develomental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa，Iowa City，Ia；Anderson et al，1999)的1∶200稀釋液。
在第11步，在Orbitron旋轉(zhuǎn)儀(Boekel Scientific)上對細胞進行30分鐘的培養(yǎng)。然后對細胞懸浮液加以離心，去除上清液，然后用DMEM對沉淀洗兩次，以去除任何過量的抗體。
在第12步，將細胞重新懸浮于4ml培養(yǎng)基中。然后，用涂布有綿羊抗大鼠免疫球蛋白G(Dynabeads；Dynal)的M-450磁性珠粒與細胞懸浮液按照4粒珠粒/目標細胞的比例混合，混合在34℃于搖床上進行1小時。用施加到離心管壁的磁體從懸浮液中獲取c-kit陽性細胞。c-kit陽性細胞(A型精原細胞)粘到壁上。收集A型精原細胞，將其重新懸浮于5ml的培養(yǎng)基中。
實施例3 分離和純化成年干細胞下文是針對分離和純化成年動物干細胞，特別地，專能成年祖細胞(MAPC’S)的過程的說明性實施例。首先，在第1步中，從5-8周齡的供體取股骨和脛骨，將其放置于冰上的HBSS+(Gibco-BRL 14170161)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES緩沖液(Gibco-BRL 15630080)中。骨頭應不含肌肉和脂肪組織。在沖洗之前將骨頭切開，以消除BMC的損失。此外，所有時間都將骨頭保持于冰上，直到進行操作。
接著，在第2步，使用3cc注射器(裝有HBSS+(Gibco-BRL14170161)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES緩沖液(Gibco-BRL15630080))，用22號針頭來沖洗脛骨和股骨。(取決于所用供體的數(shù)量，沖洗骨頭時，最好試著不用超過15ml的HBSS+，從而使全部樣品可裝入一支15ml的圓錐管)。用18號針頭和3cc注射器，通過上下沖洗懸浮液，重新懸浮BMC。以足夠大的力度來沖洗懸浮液，使得團塊分開，但力度不要大到令細胞受損。所有可能的時候都將樣品和培養(yǎng)基放在冰上。
在第3步，通過Ficoll-Hypaque分離來收集骨髓單核細胞(BMMNC)。
在第4步，將BMMNC以1×105/cm2涂開于涂布有10μg/ml纖連蛋白(FN；Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的培養(yǎng)皿上。
在第5步，制造MAPC培養(yǎng)基，其由下述成分構(gòu)成60％DMEM-LG(Gibco，BRL)，40％MCDB-201(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，其中具有1X胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)，1X亞油酸-牛血清清蛋白(LA-BSA)，10-9M地塞米松(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，10-4M2-磷酸抗壞血酸酯(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，100個單位的青霉素，1000個單位的鏈霉素(Gibco BRL)，具有2％胎牛血清(FCS；Hyclone Laboratories)，含有10ng/mL hPDGF-BB(R&D Systems)、10ng/mL mEGF(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)以及1000個單位/mL的mLIF(Chemicon)。
在第6步，將BMMNC培養(yǎng)物保持為5×103/cm2，3-4周后，使用微磁珠分離器(Miltenyi Biotec)收獲細胞，除去CD45+/Terr119+細胞。
在第7步，將CD45-/Terr119-(～20％)以10個細胞/孔放置于FN(10ng/mL)處理過的96孔板，按照0.5-1.5×103/cm2的密度涂開。大約1％的孔產(chǎn)生持續(xù)生長的MAPC培養(yǎng)物。
最后，在第8步，MAPC可通過CD3、Gr-1、Mac-1、CD19、CD34、CD44、CD45、cKit和主要組織相容性復合體(MHC)組I和組II的陰性來表征。
實施例4 對成年干細胞進行細胞核摘除下文是針對摘除成年干細胞細胞核的說明性實施例。首先，在第1步，在適合的生長需求和培養(yǎng)基下，將按照上文實施例3所述分離的成年干細胞培養(yǎng)至大約1×106的滿盤度(confluency)。
接著，在第2步，為摘除細胞核，對細胞進行胰蛋白酶處理，將其重新懸浮于預熱過的培養(yǎng)基中(37℃)，培養(yǎng)基中含有濃度為10μg/ml的細胞松弛素B。
在第3步，于37℃以8,500 rpm對細胞懸浮液進行30分鐘的離心。
離心之后，在第4步，移開核質(zhì)沉淀，用培養(yǎng)基洗一次胞質(zhì)。
在最后的第5步，用熒光DNA染料Hoechst 33528(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)對胞質(zhì)進行染色，以檢驗摘除細胞核的效率。
實施例5 對摘除了細胞核的成年干細胞進行Hoechst 33528染色下文是針對對摘除了細胞核的成年干細胞進行Hoechst 33528染色的說明性實施例。首先，在第1步，摘除細胞核后，立即將成年干細胞放置于預熱至37℃的培養(yǎng)基中。
在本方法的第2步，向培養(yǎng)基中加入Hoechst 33528，至終濃度為5μg/ml。
接著，在第3步，對細胞進行很好的混合，將其在37℃水浴中精確培養(yǎng)90分鐘，其中，每幾分鐘混合一下細胞。
在第4步，90分鐘的培養(yǎng)期后，在300xg于4℃進行3分鐘離心，使細胞離心下來，將沉淀重新懸浮于預冷的(4℃)HBSS(Gibco-BRL14170161)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES緩沖液(Gibco-BRL15630080)中。
在第5步，將染色的細胞保持于4℃，以使Hoechst染料從FACS細胞的滲漏最小化，并且測定較之未用細胞松弛素B處理的對照細胞的百分比細胞核摘除率。用UV激光在350nm處激發(fā)Hoechst染料，用450/20BP濾光器(Hoechst Blue)和675 EFLP光學濾光器(Hoechst Red)來測量其熒光。
實施例6 制造HSC在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，使用微量移液管將摘除了細胞核的卵子保持在合適的位置，使用另一支微量移液管將來自供體細胞(干細胞的原性細胞)插入到摘除了細胞核的成年干細胞中，以形成本發(fā)明的HSC。
使用組織培養(yǎng)領域普通技術人員公知的技術，可將摘除了細胞核的或成核的干細胞和/或細胞核供體細胞和HSC保持為冷藏狀態(tài)。在稍后解凍并使用這樣貯存的細胞。
使細胞重新核化的其它方法，包括細胞融合方法，全都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例6 HSC擴展生物反應器腔在本發(fā)明的一種實施方式中，使用傳統(tǒng)的生物反應器來進行HSC擴展。例如，提供具有至少一個腔的生物反應器，優(yōu)選地，至少兩個腔。腔被用于培養(yǎng)、擴展、保持、維持和分化本發(fā)明的HSC。所述的腔可被限制為一個，但是，優(yōu)選地，至少兩個腔。所述腔由二氧化硅或玻璃構(gòu)成。但是，用于構(gòu)造類似生物腔的其它材料也可使用。
通過管道使腔互相連接，再進一步通過管道與多種輔助系統(tǒng)連接，包括蠕動泵微型充氧器(micro-oxygenator)、CO2儲備容器和分子篩過濾器。管道由氯丁橡膠或用于生物系統(tǒng)中的其它類似制備材料構(gòu)成。管道可以具有不同的直徑，從1/8英寸到1/3英寸。但是，對于類似用途而言，更小或更大直徑的管道是可能的。不同尺寸的管道適應不同大小的腔裝置。管道允許管道中的流體培養(yǎng)基在腔之間流動，所述培養(yǎng)基包含營養(yǎng)物質(zhì)，由此包含大分子和小分子。營養(yǎng)物質(zhì)的流由兩個蠕動泵驅(qū)動，或者，由具有多個頭的至少一個泵驅(qū)動。每個蠕動泵或多頭式蠕動泵的每個頭驅(qū)動一個方向上的流體流動。但是，使用至少兩個泵，允許進出腔的雙向流體流動。
此外，pH傳感器和pH計被用于控制酸/堿平衡。ph傳感器先與ph計相連，ph計進而浸到腔中培養(yǎng)基的表面以下。pH傳感器探測腔中培養(yǎng)基中pH的升降，并將向pH計傳遞刺激。pH計依次含有與CO2閥連接的線，該閥進一步連接腔上的裝置。例如，當腔中培養(yǎng)基中pH低的時候，刺激回到pH計，開啟(多個)CO2閥，由此令CO2從CO2儲備容器流入腔中。
輔助系統(tǒng)包括通過CO2閥提供CO2的CO2儲備容器。此外，還使用微型充氧器(Aqua Pro)和泵。類似CO2儲備容器，微型充氧器通過閥門和管道被連接。來自管道的流體流經(jīng)微型充氧器，被向空間注入氧氣的進口和側(cè)端口充氧；由此使流體充滿氣體，提高細胞存活率。
此外還有分子透析過濾器，其類似于微型充氧器和附件，流體流經(jīng)該過濾器，特定大小的分子受到限制，例如，至少大約60kDa的分子被限制離開流體。透析過濾器在逆流系統(tǒng)和單向流系統(tǒng)上工作。
此外，高純水(即，去離子的、UV處理的和經(jīng)微濾的)被用于維持系統(tǒng)中的恰當水含量?？赏ㄟ^任何可獲得的滅菌方式將高純水加入到腔中的培養(yǎng)基中。
用于腔中的培養(yǎng)基是適合用于支持初級細胞生長的任何標準細胞培養(yǎng)基。例如，作為細胞生物學和細胞培養(yǎng)技術領域普通技術人員已知的、包含至少M15高葡萄糖DMEM、大約15-20％胎牛血清(FBS)、1X 1-谷氨酰胺、1X青霉素/鏈霉素、1X非必要氨基酸和其它生長因子的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
實施例7 針對表面受體表達篩選HSC按照下文所述，針對表面受體和抗原表達來篩選本發(fā)明的HSC。適當?shù)臄U展時間段過去后，從生物反應器移出細胞。合適的擴展時間段被定義為至少一次細胞群倍增(population doubling)。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)是基于共振能量轉(zhuǎn)移(RET)的技術。已有報道，能量轉(zhuǎn)移效率高度依賴于供體和受體部分之間的距離以及它們相互之間的相對定位。在大多數(shù)基于RET的試驗中，供體和受體之間典型的有效距離為10至100埃，該范圍與大多數(shù)生物相互作用相關(BRET；Packard BioScience，BioSignal PackardInc.，Meriden，CT)。使用BRET和FRET技術，針對受體的一定數(shù)量以及它們在細胞上的位置篩選HSC。使用BRET和FRET的可視鑒定可在大屏幕或監(jiān)視器上看到。這些投影系統(tǒng)是本領域內(nèi)標準的。
或者，其它針對受體位點進行篩選的方法也包括在本發(fā)明內(nèi)，雖然本文中沒有描述。
最后，HSC將發(fā)育出在成熟干細胞上觀察到的全部，或接近全部，或大多數(shù)受體位點。
實施例8 轉(zhuǎn)入需要的受體如前文所討論的，本發(fā)明的HSC有大量的用途。例如，遭受萎縮事件(例如心肌梗塞)影響的患者具有不再存活的心肌膜(myocardium)區(qū)域。受損的心肌膜最終替代死亡的心肌細胞，所述心肌膜具有帶纖維的受驚組織，其不僅缺乏收縮功能，并且還會抵抗收縮。結(jié)果，患者心臟變得越來越?jīng)]用，喪失了其將足夠質(zhì)量的血液泵向身體組織的能力。最終，發(fā)生充血性心力衰竭，患者死亡。近來，細胞治療技術已被用于治療充血性心力衰竭，這是通過將造血干細胞、骨骼成肌細胞(見，例如，美國專利號[USPN]6,579,523和6,682,730，其整體內(nèi)容通過引用并入本文，特別是兩篇專利的第14欄，第7行至第18欄第45行)和間質(zhì)干細胞(見，例如USPN 6,387,639，其整體內(nèi)容通過引用并入本文，特別是實施例1)直接注射進受損心肌膜或其附近來實現(xiàn)的。適合將本發(fā)明的HSC提供給需要其的心臟的方法包括為了穿刺進心臟腔特別設計，或改造的經(jīng)皮導管，例如，USPN 6,544,230(其整體內(nèi)容通過引用并入本文)中公開的那些等。
在一種實施方式中，本發(fā)明的HSC被用于恢復或提高心肌膜受損區(qū)域的收縮功能?？墒褂米⑸鋵Ч?，通過直接注射將按照本發(fā)明的教導制造的HSC施予心肌膜，或者可施予一條或多條冠狀動脈，令其遷移到受損組織。在另一種實施方式中，HSC被施予到冠狀動脈的外膜組織。
在本發(fā)明的另一種實施方式中，在體內(nèi)將HSC全身性地注射進宿主的循環(huán)系統(tǒng)。在該實施方式中，HSC遷移到受損組織的區(qū)域，例如，肝、肺和腦。此外，可在創(chuàng)傷和手術之后全身性地施予本發(fā)明的HSC。本發(fā)明的有新生能力的HSC將導致迅速康復和最小的疤痕。
再次說明，本說明書描述了本發(fā)明的特定實施方式，本領域普通技術人員可以在不偏離本發(fā)明思想下設計出本發(fā)明的變化。
權(quán)利要求
1.一種雜交干細胞(HSC)，包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。
2.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一動物。
3.如權(quán)利要求2所述的HSC，其中，所述動物是哺乳動物。
4.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和胚胎干細胞來自同一動物。
5.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞具有來自原性細胞的細胞核。
6.如權(quán)利要求5所述的HSC，其中，所述原性細胞是精原細胞。
7.如權(quán)利要求5所述的HSC，其中，所述原性細胞是未分化的精原細胞。
8.如權(quán)利要求5所述的HSC，其中，所述原性細胞是分化的精原細胞。
9.如權(quán)利要求5所述的HSC，其中，所述原性細胞是卵原細胞。
10.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，使用電融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
11.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，通過基于病毒的融合方法使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
12.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，使用化學融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
13.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，使用基于機械的融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
14.如權(quán)利要求1所述的HSC，其中，所述HSC在出生后動物中具有生物活性。
15.一種治療組合物，其中包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。
16.如權(quán)利要求15所述的治療組合物，其中，所述治療組合物用于再生需要此類治療的動物的、有疾病的或受損傷的組織。
17.如權(quán)利要求15所述的治療組合物，其中，所述有疾病的組織是心臟組織。
18.如權(quán)利要求15所述的治療組合物，其中，所述有疾病的組織是肺組織。
19.一種融合干細胞，包含摘除了細胞核的成年干細胞；以及與所述摘除了細胞核的成年干細胞融合的原性細胞或胚胎干細胞。
20.如權(quán)利要求19所述的融合干細胞，其中，所述原性細胞與所述摘除了細胞核的成年干細胞融合。
21.如權(quán)利要求20所述的融合干細胞，其中，使用電融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
22.如權(quán)利要求20所述的融合干細胞，其中，通過基于病毒的融合方法使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
23.如權(quán)利要求20所述的融合干細胞，其中，使用化學融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
24.如權(quán)利要求20所述的融合干細胞，其中，使用基于機械的融合使所述摘除了細胞核的成年干細胞與所述原性細胞融合。
25.如權(quán)利要求29所述的融合干細胞，其中，所述胚胎干細胞與所述摘除了細胞核的成年干細胞融合。
26.一種雜交干細胞(HSC)，包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自原性細胞的細胞核。
27.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一動物。
28.如權(quán)利要求27所述的HSC，其中，所述動物是哺乳動物。
29.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述原性細胞是精原細胞。
30.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述原性細胞是未分化的精原細胞。
31.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述原性細胞是分化的精原細胞。
32.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一物種的不同個體。
32.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和原性細胞來自同一個體。
33.如權(quán)利要求26所述的HSC，其中，所述原性細胞是卵原細胞。
34.一種雜交干細胞(HSC)，包含摘除了細胞核的成年干細胞，所述成年干細胞具有來自胚胎干細胞的細胞核。
35.如權(quán)利要求34所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和胚胎干細胞來自同一物種。
36.如權(quán)利要求34所述的HSC，其中，所述動物是哺乳動物。
37.如權(quán)利要求34所述的HSC，其中，所述摘除了細胞核的成年干細胞和胚胎干細胞來自同一個體。
全文摘要
本發(fā)明提供了雜交干細胞，其中包含摘除了細胞核的成年干細胞，其具有來自原性細胞或胚胎干細胞的細胞核。原性細胞可以是來自供體動物或哺乳動物的精原細胞或卵原細胞。摘除了細胞核的成年干細胞可以通過多種方法與原性細胞或胚胎干細胞融合，所述方法包括但不限于，電融合、基于病毒的融合方法、化學融合或基于機械的融合。
文檔編號C12N5/074GK1973032SQ200580018782
公開日2007年5月30日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月8日
發(fā)明者昌西·B·賽亞 申請人:普里梅真比奧特斯公司