專利名稱：組織工程用臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及組織工程用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的提取和支架的制備方法。
背景技術(shù)：
軟骨組織自身修復(fù)能力非常有限，組織工程技術(shù)為修復(fù)軟骨缺損提供了一種具有良好應(yīng)用前景的方法。主要內(nèi)容包括種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子以及培養(yǎng)環(huán)境，其中用好的方法和技術(shù)，構(gòu)建理想的組織工程支架是成功修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的關(guān)鍵。目前用于軟骨組織工程的支架材料包括天然和人工合成兩種。人工合成支架材料主要為有機(jī)合成材料，以聚乳酸(PLA)、聚羥乙酸(PGA)、聚羥乙酸-乳酸(PLGA)、聚環(huán)氧乙烯(PluronicF-127)等高分子聚合物為主。人工合成材料的缺點(diǎn)是疏水性，不利于細(xì)胞的粘附，降解時(shí)產(chǎn)物呈酸性，在體內(nèi)容易引起炎癥反應(yīng)。天然支架材料主要有膠原、脫鈣骨基質(zhì)、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、藻酸鈣、殼聚糖等。但上述材料在生物學(xué)特性(如結(jié)構(gòu)、成分和生物力學(xué))上與宿主的軟骨組織相比還有很大差距。臍帶包括臍帶外膜、臍動(dòng)脈、臍靜脈以及Wharton膠。人臍帶Wharton膠富含膠原、 透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素，膠原占干重50%以上，其中以I、II、III型膠原為主，還有V型等膠原，占總膠原的95%以上，透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等GAG占臍帶Wharton膠的近50%。軟骨組織也富含膠原和透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等，故人臍帶Wharton膠具有與軟骨極為相似的細(xì)胞外基質(zhì)成分，是制備軟骨組織工程用支架的理想材料。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的是提供應(yīng)用臍帶Wharton膠為材料制備多種新型的組織工程用的多孔海綿支架的方法，所制備支架復(fù)合細(xì)胞后用以修復(fù)軟骨、骨、皮膚、神經(jīng)等組織的缺損。其發(fā)明內(nèi)容包括(一)臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架的制備方法；
(二)應(yīng)用所制備的支架復(fù)合細(xì)胞后植入體內(nèi)修復(fù)軟骨、皮膚、神經(jīng)等組織的方法研究；
(三)用去細(xì)胞Wharton膠制備成水凝膠，采用微創(chuàng)注射法填充小型缺損。以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述本發(fā)明的臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架通過(guò)下述方法制備得到以臍帶為原料，先剝離臍帶外膜及血管組織，余下組織清洗后低滲凍融，然后通過(guò)機(jī)械粉碎、差速離心和酶消化法去除細(xì)胞，收集臍帶去細(xì)胞Wharton膠，將其注入模具，冷凍干燥，交聯(lián)， 得到三維多孔海綿支架。具體而言，上述制備方法可包括如下步驟1)無(wú)菌條件下剝離臍帶外膜及血管組織(兩根動(dòng)脈，一根靜脈)，余下的組織用蒸餾水沖洗后低滲凍融，然后用雙氧水作用，再用蒸餾水漂洗；2)經(jīng)步驟1)處理后的組織通過(guò)機(jī)械粉碎制成勻漿；3)通過(guò)差速離心，結(jié)合顯微鏡觀察，收集無(wú)細(xì)胞的納米級(jí)膠原和GAG (復(fù)合型粘多糖)等成分，即臍帶Wharton膠細(xì)胞外基質(zhì)備用；4)經(jīng)步驟幻處理后的沉淀部分用酶消化液處理去除細(xì)胞，然后通過(guò)差速離心收集去細(xì)胞Wharton膠；5)將步驟幻和4)收集的產(chǎn)物配成一定濃度的漿料注入模具，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)獲得凍干支架，再采用紫外線和碳化二亞胺或京尼平的方法進(jìn)行交聯(lián)得到三維多孔海綿支
^K O優(yōu)選的上述步驟1)剝離臍帶外膜和血管組織后的Wharton膠組織部分用蒸餾水清洗后置于三蒸水中，-10°C低滲凍融對(duì)-4他1·，然后用雙氧水(體積百分濃度)作用，其中雙氧水與所作用組織的體積比優(yōu)選為2 1，作用的時(shí)間一般為5-10分鐘，至組織變白，蒸餾水沖洗3-5次。上述步驟幻將組織放入粉碎機(jī)中粉碎5-10分鐘制成勻漿。為防止粉碎機(jī)溫度過(guò)高破壞臍帶組織中的蛋白，每次粉碎的時(shí)間勿超過(guò)1分鐘，粉碎5-10次。上述步驟3)將步驟2)制成的勻漿先1500rpm、4°C離心3_5分鐘，收集上層勻漿 3000rpm、4°C離心10-15分鐘，再收集上層勻漿6000rpm、4°C離心15-20分鐘，此時(shí)的上層勻漿顯微鏡下觀察為納米級(jí)微絲，無(wú)細(xì)胞，收集該上層勻漿9500rpm、4°C離心30-40分鐘，棄上清，收集沉淀。上述步驟4)將步驟3)中1500rpm、3000rpm和6000rpm離心后的下層勻漿合并， 加入0. 25%胰蛋白酶(0. 25%即0. 0025g/mL，指IOOmL溶液中含有0. 25g胰蛋白酶，這是生化領(lǐng)域中將固體配制成溶液試劑的通用濃度表示方法，下同)、0. 5-1% EDTA、0. 迭氮鈉和0. 3%亞硫酸鈉，粉碎后室溫下消化M小時(shí)，然后按步驟幻中差速離心法收集沉淀。上述步驟幻將步驟幻和4)收集的產(chǎn)物用三蒸水清洗后配成一定濃度的漿料(優(yōu)選3-6%的重量百分比濃度)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝箅x心去氣泡，然后將去除氣泡的漿料注入模具中，-40°C預(yù)凍2-4小時(shí)；預(yù)凍支架從模具中取出，迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中升華干燥；將凍干支架置波長(zhǎng)254nm紫外線下交聯(lián)4 Shr ；再在碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的95%乙醇溶液中(濃度為EDC 20 50mM ;NHS 20mM) 4°C下交聯(lián)Mh，或1 %京尼平4°C下交聯(lián)M小時(shí)；然后用三蒸水漂洗，再次冷凍干燥，最后CcT輻照消毒后密封，于 4°C下保存。本發(fā)明中制備臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架用的臍帶來(lái)源可以是人或其它哺乳動(dòng)物。本發(fā)明制備的臍帶去細(xì)胞Wharton膠的成分主要是納米級(jí)微絲膠原，以及透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等GAG成分。本發(fā)明以臍帶為原料，通過(guò)差速離心、酶消化法去細(xì)胞處理進(jìn)而得到徹底脫細(xì)胞的三維多孔海綿支架，所制備的臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架具有可控的微細(xì)結(jié)構(gòu)、適宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，有利于細(xì)胞粘附和種子細(xì)胞均勻分布于支架內(nèi)部，并增殖遷移生長(zhǎng)，植入體內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，具有良好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明支架可用于引導(dǎo)組織再生，修復(fù)受傷后的關(guān)節(jié)、氣管等透明軟骨組織及半月板、骺板、椎間盤等纖維軟骨組織或耳、鼻、喉等彈性軟骨組織；也可制備成復(fù)合支架，修復(fù)軟骨、骨、皮膚、神經(jīng)等組織；還可用臍帶去細(xì)胞Wharton膠制備成水凝膠，采用微創(chuàng)注射法用于軟骨、骨及其他組織缺損的修復(fù)。具體而言，本發(fā)明制備的臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架具備以下優(yōu)點(diǎn)。(1)人或動(dòng)物的臍帶組織為廢棄物，材料來(lái)源廣泛，無(wú)倫理學(xué)限制，成本低；(2)臍帶Wharton膠的組織結(jié)構(gòu)和生化成分與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)極為相似，經(jīng)脫細(xì)胞處理后仍然保留原組織成分，富含膠原和透明質(zhì)酸，其中膠原占干重50%以上，透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等GAG成分占近50%，類似于天然關(guān)節(jié)軟骨的組成成分，為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供最接近天然的細(xì)胞外微環(huán)境；(3)具有良好的生物相容性；(4)制備流程簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)性好，經(jīng)物理、化學(xué)交聯(lián)后，制備出的支架產(chǎn)品具有一定的生物力學(xué)強(qiáng)度；(5)支架可根據(jù)需要設(shè)計(jì)制備成所需的孔隙率和特定大小的孔徑(如200-300微米)，孔相互連通，有利于種子細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部并分布均勻，利于種子細(xì)胞粘附、增殖、遷移及代謝。


圖Ia是實(shí)施例步驟3b人臍帶Wharton膠粉碎后3000rpm、4°C離心10分鐘，取上清涂片、奧辛蘭染色后放大100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像。圖Ib是實(shí)施例步驟3c 6000rpm、4°C離心15-20分鐘后取上清涂片，在光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像。圖2a是實(shí)施例步驟3d 9500rpm、4°C離心30分鐘后取下層做冰凍切片奧辛蘭染色，在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像；圖2b是實(shí)施例步驟3d 9500rpm、4°C離心30分鐘后取下層涂片，在掃描電子顯微鏡下觀察到的圖像。圖3a是實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架的大體觀；圖3b是實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架用掃描電子顯微鏡觀察到結(jié)構(gòu)圖像。圖4a是實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton支架I型膠原免疫組織化學(xué)染色后在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像；圖4b是實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton支架II型膠原免疫組織化學(xué)染色后在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像。圖5是將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞接種于實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton支架，培養(yǎng) 48小時(shí)，經(jīng)奧辛蘭染色后在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下觀察到的圖像。圖6a和6b是將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞接種于實(shí)施例制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton支架，培養(yǎng)48小時(shí)后掃描電子顯微鏡觀察到的圖像，其中圖6b的放大倍數(shù)高于圖6a。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證目的，絕不限制本發(fā)明的范圍。
一、制備方法根據(jù)下述步驟制備臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海綿支架1、取人的臍帶，無(wú)菌條件下，剝離臍帶外膜及血管組織(兩根動(dòng)脈，一根靜脈)，余下組織剪碎(l-2cm)，蒸餾水沖洗3次，然后浸泡在三蒸水中置-10°C，低滲凍融24小時(shí)，再用雙氧水浸泡攪動(dòng)5-10分鐘，隨后蒸餾水沖洗3-5次，其中雙氧水與組織的體積比為 2 1，目的是使組織膨松，有利于組織中細(xì)胞破碎脫出。2、加三蒸水于組織中(所加三蒸水與組織的體積比約1 1)，倒入粉碎機(jī)中，低溫層析柜中粉碎5-10次，每次1分鐘，制成勻漿，其中每次粉碎的時(shí)間勿超過(guò)1分鐘，防止粉碎機(jī)溫度過(guò)高破壞臍帶組織中的蛋白。3、順序進(jìn)行下述步驟a d的差速離心a.將步驟2制成的勻漿放入50ml離心管中，1500rpm、4°C離心5分鐘，取上層勻漿涂片、甲苯胺蘭染色，顯微鏡下觀察為毫米、微米級(jí)毛球、細(xì)胞、納米微絲等混懸勻漿；b.收集步驟a后的上層勻漿3000rpm、4°C離心10分鐘，取上層勻漿涂片、奧辛蘭染色，顯微鏡下觀察見微米級(jí)顆粒、納米級(jí)微絲，有一定量的細(xì)胞，如圖Ia所示，在細(xì)胞周圍包繞奧辛蘭陽(yáng)性物_酸性粘多糖(透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等)及微絲；c.收集步驟b后的上層勻漿6000rpm、4°C離心15-20分鐘，取上層勻漿涂片，光學(xué)顯微鏡下觀察已無(wú)細(xì)胞，如圖Ib所示，只看到納米微絲，無(wú)細(xì)胞；d.收集步驟c后的上層勻漿9500rpm、4°C離心30分鐘，棄上清，收集沉淀，冰凍切片進(jìn)行奧辛蘭染色鏡下觀察，呈蘭綠色、無(wú)細(xì)胞(圖2a)，涂片掃描電鏡顯示均為納米級(jí)微絲(圖2b)，用三蒸水混勻洗三次(pH7)后的沉淀置4°C保存?zhèn)溆谩?、在上述步驟a、b和c離心后的下層沉淀(毫米、微米級(jí)微球及單細(xì)胞)中加酶消化液(各成分的終濃度為0. 25%胰蛋白酶、0. 5-l%EDTA,0. 迭氮鈉、0. 3%亞硫酸鈉)， 入粉碎機(jī)中粉碎攪拌，然后室溫中酶解消化24小時(shí)；然后4°C下進(jìn)行差速離心1500rpm離心5分鐘，收集上層勻漿3000rpm離心10分鐘，再收集上層勻漿6000rpm離心15-20分鐘， 再次收集上層勻漿9500rpm離心30分鐘，棄上清，收集沉淀，用三蒸水混勻洗三次(pH7) 后，沉淀物置4°C備用。5、將步驟3和4收集的沉淀物配成3-6%濃度(重量百分比濃度)的漿料，充分?jǐn)嚢杈鶆?，離心去氣泡，然后將離心后的漿料注入模具中，-40°C預(yù)凍4小時(shí)，預(yù)凍支架從模具中取出，迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中升華干燥，在真空(< IOOmTorr)下升華24_48h。將凍干后支架置于波長(zhǎng)254nm紫外線下交聯(lián)4 8h，再在碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)的95%乙醇溶液中(濃度為EDC 20_50mM和NHS 20mM) 4°C下交聯(lián)24h，或采用1 % 的京尼平交聯(lián)24h，三蒸水漂洗6次(pH7)，冷凍干燥，密封、Co6tl消毒后，4°C下保存。其中， EDC、NHS用95%乙醇配成交聯(lián)溶液，利于支架增加強(qiáng)度，減小降解速度過(guò)快的不足，京尼平交聯(lián)毒性低，交聯(lián)后均用三蒸水漂洗6次以去除支架中殘留的交聯(lián)液。二、性能檢測(cè)(一 )理化性能檢測(cè)本發(fā)明制備的人臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架外觀如圖3a所示，用掃描電鏡觀察， 可見所制備的支架孔徑大小分布較均勻，并且孔隙相互貫通，孔徑多為200-300微米，支架孔隙率為90-96% (見圖3b)。
( 二)組織化學(xué)染色觀察所制備的支架I、II型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性，支架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)呈棕黃色(見圖 ^，4b)。(三)支架的生物相容性通過(guò)倒置顯微鏡觀察看到，軟骨方向誘導(dǎo)后的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞接種于支架，培養(yǎng)3 小時(shí)后細(xì)胞大部分黏附于多孔支架空隙中，24小時(shí)后可見支架孔隙被細(xì)胞填滿。培養(yǎng)4 后細(xì)胞在支架孔隙中分布均勻，奧辛蘭染色呈陽(yáng)性(圖5)，表明其含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等酸性粘多糖；經(jīng)掃描電鏡觀察，呈多邊形類軟骨樣細(xì)胞，生長(zhǎng)良好，并可見基質(zhì)分泌(圖 6a 禾口 6b)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程用臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架的制備方法，是以臍帶為原料，先剝離臍帶外膜及血管組織，余下組織清洗后低滲凍融，然后通過(guò)機(jī)械粉碎、差速離心和酶消化法去除細(xì)胞，收集臍帶去細(xì)胞Wharton膠，將其注入模具，冷凍干燥，交聯(lián)，得到三維多孔海綿支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，該方法具體包括如下步驟1)無(wú)菌條件下剝離臍帶外膜及血管組織，余下組織用蒸餾水沖洗后冷凍，然后用雙氧水作用，再用蒸餾水漂洗；2)經(jīng)步驟1)處理后的組織通過(guò)機(jī)械粉碎制成勻漿；3)將步驟幻制得的勻漿經(jīng)差速離心，結(jié)合顯微鏡觀察，收集無(wú)細(xì)胞的臍帶Wharton膠4)經(jīng)步驟幻處理后的帶細(xì)胞部分用酶解液處理去細(xì)胞，然后通過(guò)差速離心收集去細(xì)胞 Wharton 膠；5)將步驟幻和4)收集的產(chǎn)物配成一定濃度的漿料注入模具，冷凍干燥獲得凍干支架，先進(jìn)行紫外線交聯(lián)，然后再采用碳化二亞胺或京尼平方法進(jìn)行交聯(lián)得到三維多孔海綿支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)剝離臍帶外膜和血管組織后的余下組織用蒸餾水清洗后置三蒸水中，-10°C低滲凍融M-48小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，低滲凍融后用雙氧水作用5-10 分鐘至組織變白，再蒸餾水漂洗3-5次，其中雙氧水與所作用組織的體積比為2 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟幻在組織中加蒸餾水，放入粉碎機(jī)中粉碎5-10次制成勻漿，每次粉碎時(shí)間不超過(guò)1分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)差速離心先1500rpm、 4°C離心3-5分鐘，然后收集上層勻漿3000rpm、4°C離心10-15分鐘，再收集上層勻漿 6000rpm、4°C離心15-20分鐘，此時(shí)的上層勻漿顯微鏡下觀察為納米級(jí)微絲，無(wú)細(xì)胞，收集該上層勻漿9500rpm、4°C離心30-40分鐘，棄上清，收集沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)將步驟3)中1500rpm、 3000rpm和6000rpm離心后的下層勻漿合并，加入0. 25%胰蛋白酶、0. 5-1% EDTA、0. 迭氮鈉和0. 3%亞硫酸鈉，粉碎后室溫下消化M小時(shí)，然后1500rpm、4°C離心3_5分鐘，收集上層勻漿3000rpm、4°C離心10-15分鐘，再收集上層勻漿6000rpm、4°C離心15-20分鐘，再次收集上層勻漿9500rpm、4°C離心30-40分鐘，棄上清，收集沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟幻中所述漿料攪拌均勻后離心去氣泡，然后將去除氣泡的漿料注入模具中，-40°C預(yù)凍2-4小時(shí)；預(yù)凍支架從模具中取出， 迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中升華干燥；將凍干支架置波長(zhǎng)254nm紫外線下交聯(lián)4 他；再在含20-50mM碳化二亞胺與20mM N-羥基琥珀酰亞胺的95%乙醇溶液中4°C下交聯(lián)Mh，或京尼平4°C下交聯(lián)M小時(shí)；然后用三蒸水漂洗，再次冷凍干燥，最后CcT輻照消毒后密封，于4°C下保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟幻中漿料的重量百分比濃度是3 6%。
10.一種組織工程用支架，是根據(jù)權(quán)利要求1 9所述制備方法制得的臍帶去細(xì)胞Wharton膠三維多孔海 綿支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了組織工程用臍帶去細(xì)胞Wharton膠支架及其制備方法。以臍帶為原料，剝離臍帶外膜和血管組織后通過(guò)低滲凍融，機(jī)械粉碎，差速離心，酶解消化去除細(xì)胞，收集臍帶Wharton膠，將其注入模具，經(jīng)冷凍干燥，交聯(lián)得到多種三維多孔海綿支架及復(fù)合支架。該方法所用材料來(lái)源廣泛，成本低，工藝簡(jiǎn)單，所制備的支架具有可控的微細(xì)結(jié)構(gòu)、適宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，有利于細(xì)胞粘附和種子細(xì)胞均勻分布進(jìn)入支架內(nèi)部，并增殖遷移生長(zhǎng)，可廣泛地應(yīng)用于軟骨、骨、皮膚及神經(jīng)等組織工程領(lǐng)域，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102198292SQ20101013499
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者劉舒云, 盧世璧, 張莉, 彭江, 眭翔, 袁玫, 許文靜, 趙斌, 郭全義, 黃靖香 申請(qǐng)人:盧世璧