專利名稱：一種新型Fc融合蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以基因工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種新型Fc融合蛋白及其表達(dá)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、新型Fc融合蛋白的表達(dá)和純化工藝。
背景許多具有藥用意義的生物分子，包括細(xì)胞因子在內(nèi)，只在體內(nèi)產(chǎn)生瞬間及局部的生物作用，其循環(huán)周期相對很短，例如，人血清中的干擾素的半衰期就只有2-8小時(Roche labs.Referon A.Schering Intron A.Physicians’desk Referece，47th edition，pp.2006-2008，2194-2201)。治療疾病時，需要長期頻繁給藥，治療周期長，不僅給患者帶來痛苦，同時也會增加藥物的毒副作用，而且治療費用高，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。為了克服這些缺點，就需要修飾該藥物分子，使其在不減少藥物效力的前提下增加它在血液中的循環(huán)周期時間。
目前，長效細(xì)胞因子的研究途徑主要有三種PEG修飾、脂質(zhì)體包封和融合蛋白Fc技術(shù)。PEG修飾是用大分子水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)修飾細(xì)胞因子，使其自身穩(wěn)定和減少它們在體內(nèi)的新陳代謝速率，其技術(shù)簡單，但是產(chǎn)率低，價格昂貴，而且由于長鏈聚合物空間位阻效應(yīng)，影響了蛋白與受體的結(jié)合而降低活性；脂質(zhì)體包封是用脂質(zhì)技術(shù)包封細(xì)胞因子，細(xì)胞因子是從脂質(zhì)體內(nèi)以緩釋的形式進(jìn)入血液，從而延長其在體內(nèi)的滯留時間；此技術(shù)復(fù)雜，脂質(zhì)體的包封率低，包封過程中易失活，脂質(zhì)體到達(dá)體內(nèi)靶區(qū)或受體時，無法出現(xiàn)高濃度的富集，影響治療效果。Fc融合蛋白技術(shù)是利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，融合表達(dá)細(xì)胞因子-Fc片段(IgG4)。IgG4通過Fc片段與其受體結(jié)合，配體-受體復(fù)合物在體內(nèi)維持20天之久不被分解。此技術(shù)雖然構(gòu)建復(fù)雜，但純化簡單，產(chǎn)率高，半衰期長。Fc融合技術(shù)大大增加融合蛋白的半衰期，應(yīng)用前景好，是長效藥物的發(fā)展方向。
美國Immunex公司和American Home Products公司研制的藥物Enbrel，就是用CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人P75腫瘤壞死因子受體與人IgG1 Fc融合蛋白二具體。該藥于1998年申請上市，在1999年被FDA批準(zhǔn)用于減輕4歲以上中毒到重度的活動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者癥狀的治療。于2002年被FDA批準(zhǔn)用于減輕銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者的癥狀。
本發(fā)明提供了一種新型Fc融合蛋白及其生產(chǎn)方法，采用CHO哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)該新型Fc融合蛋白，通過優(yōu)化發(fā)酵與純化工藝，整個過程穩(wěn)定、快速、簡便，獲得活性高、半衰期延長的Fc融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新型Fc融合蛋白。
本發(fā)明的另一目的就是提供該新型Fc融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種新型Fc融合蛋白的氨基酸序列，其特征在于，其序列為A-B-C或C-B-A，其中A為免疫球蛋白Fc區(qū)，來自人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)(見SEQ ID NO1)，具有在人體血液中穩(wěn)定、高效分泌表達(dá)以及避免諸如補體反應(yīng)及ADCC等優(yōu)勢，B為連接鏈(Linker)(見SEQ ID NO2)，有助于保留蛋白的天然構(gòu)型和生物活性，C為目的蛋白，可以但不僅限于細(xì)胞因子。
在本發(fā)明的第二方面，提供了幾種表達(dá)載體，這些表達(dá)載體可以是酵母表達(dá)載體或哺乳動物表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有上文所述的新型Fc融合蛋白的編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPIC9k/新型Fc融合蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供了幾種工程細(xì)胞，可以是酵母、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組新型Fc融合蛋白的方法，該方法包括步驟c)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出新型Fc融合蛋白；d)分離純化新型Fc融合蛋白。


圖1是重組質(zhì)粒pPIC9K/Fc-IFNa-2b構(gòu)建示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，將人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)Fc區(qū)通過連接鏈與目的蛋白相連，構(gòu)建出新型Fc融合蛋白，并以干擾素a-2b為例，通過蛋白表達(dá)研究，獲得了新型Fc融合蛋白Fc-IFNa-2b。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
將免疫球蛋白Fc區(qū)，來自人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)Fc區(qū)(見SEQ IDNO1)，具有在人體血液中穩(wěn)定、高效分泌表達(dá)以及避免諸如補體反應(yīng)及ADCC等優(yōu)勢，通過連接鏈(Linker)(見SEQ ID NO2)，有助于保留蛋白的天然構(gòu)型和生物活性，與目的蛋白連接，獲得新型Fc融合蛋白。
根據(jù)表達(dá)的宿主細(xì)胞，對新型Fc融合蛋白的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，然后采用常規(guī)分子生物學(xué)方法或全序列合成的辦法獲得所需的序列，然后構(gòu)建到相應(yīng)的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞。通過抗性篩選獲得高表達(dá)工程細(xì)胞。
在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。在本發(fā)明中，工程細(xì)胞表達(dá)的新型Fc融合蛋白表達(dá)條件沒有特別限制?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)條件。
為大規(guī)模獲得新型Fc融合蛋白，需要進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試優(yōu)化工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平可達(dá)到500mg/L。
在表達(dá)新型Fc融合蛋白后，對表達(dá)的新型Fc融合蛋白進(jìn)行分離純化。
通常，培養(yǎng)先以離心、過濾等方式獲得培養(yǎng)上清。上清可通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經(jīng)過2-3步純化，可得到新型Fc融合蛋白純品，純化得率30％以上，純度95％以上，純品得率約150mg/L上清液。
純化后新型Fc融合蛋白再經(jīng)活性測定，其比活不低于未融合的目的蛋白活性。
在本發(fā)明的一個實例中，以干擾素a-2b為例，提供了新型Fc融合蛋白及其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
在本發(fā)明的另一個實例中，通過篩選獲得了穩(wěn)定高效表達(dá)新型Fc融合蛋白的菌株。
在本發(fā)明的另一個實例中，經(jīng)過純化工藝優(yōu)化，可得到純品150mg/L。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵上清液可獲得新型Fc融合蛋白純品150mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)延長半衰期。將目的蛋白編碼序列免疫球蛋白Fc區(qū)的N端或C端連接，并在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，使生成的目的蛋白半衰期增加；2)生物活性不喪失。蛋白的天然構(gòu)型及其立體靈活性與生物活性關(guān)系密切，連接體有利于保留各自的天然構(gòu)型及其立體靈活性，從而保留其生物活性；(2)通過控制關(guān)鍵的表達(dá)工藝條件，使表達(dá)水平進(jìn)一步提高。
(3)純化工藝簡便，回收率高。由于是分泌蛋白，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)新型Fc融合蛋白成為可能。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人的“分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)”中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1融合蛋白基因獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)Fc區(qū)通過連接鏈與目的蛋白干擾素a-2b相連，構(gòu)建出新型Fc融合蛋白Fc-IFNa-2b，根據(jù)酵母密碼子偏愛性，對新型Fc融合蛋白Fc-IFNa-2b的編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，然后采用全序列合成的辦法獲得所需的序列，PCR擴(kuò)增IFN-a-2b，在其5’端引入了xhoI酶切位點及α-factor前導(dǎo)肽信號裂解位點前的AAAGGA序列，3’端引入EcoRI酶切位點。將pfu酶擴(kuò)增得到的IFN-a-2b基因產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9(購自Invitrogen公司)分別用XhoI+EcoRI進(jìn)行雙酶切(MBI，2*TangoTM，37℃)，回收大片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆。
大量擴(kuò)增確證的pPIC9/Fc-IFN-a-2b質(zhì)粒，用BamHI+EcoRI雙酶切(MBI，1*TangoTM，37℃)，回收小片段；質(zhì)粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)用相同的酶處理，回收大片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆。
構(gòu)建線路圖如圖1所示。
實施例2高穩(wěn)定表達(dá)新型Fc融合蛋白的菌株的篩選將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K/Fc-IFN-a-2b大量制備，線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞P.pastoris GS115，涂布含有不同濃度抗生素Zeocin的YPDS平板篩選高抗的陽性克隆，并進(jìn)行小搖表達(dá)實驗，篩選得到高穩(wěn)定表達(dá)的工程酵母菌株，分析獲得的高穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞，工程酵母菌株含有編碼SEQ ID NO3氨基酸序列的核苷酸序列。
實施例3純化工藝優(yōu)化對發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，將發(fā)酵液的緩沖體系替換為磷酸鹽溶液(PB)。使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時留取濃縮液，加入PB，繼續(xù)超濾；反復(fù)此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平與pH和PB緩沖液相同。
層析1離子交換層析層析介質(zhì)SP-Sepharose FF方法將超濾后的含F(xiàn)c-IFN-a-2b發(fā)酵液過柱。上樣后用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱，至OD280＜0.05。用0-1M NaCl梯度將目的蛋白洗脫。
層析2分子篩層析層析介質(zhì)Sephacryl S200緩沖液磷酸鹽緩沖液離子交換得到的Fc-IFN-a-2b樣品峰上樣后，用PB溶液恒速過層析柱，收集含活性的蛋白峰。
樣品經(jīng)過此三步純化，即超濾，陰離子交換層析、凝膠過濾層析以后，純度提高至95％以上，可得純品150mg/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>一種新型Fc融合蛋白及其生產(chǎn)方法<160>4<210>1<211>250<212>PRT<213>智人<223>人免疫球蛋白IgG4的Fc片段的氨基酸序列<400>1Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys20 25 30Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro35 40 45Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys50 55 60Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp65 70 75 80Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu85 90 95Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu100 105 110His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn115 120 125Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly130 135 140
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu145 150 155 160Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr165 170 175Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn180 185 190Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe195 200 205Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn210 215 220Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr225 230 235 240Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys245 250<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<223>連接肽<400>2Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>3<211>431<212>PRT<213>人工序列<223>Fc-IFN-a-2b融合蛋白氨基酸序列<400>3Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys20 25 30Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro35 40 45Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys50 55 60Val Val Vsl Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp65 70 75 80Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Als Thr Ths Pro Arg Glu85 90 95Glu Gln Phe Asn Ser Thr Thr Tvr Arg Val Ser sel Leu Thr Val Leu100 105110His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Gls Glu Tvr Lvs Cys Lvs Val Ser Asn115 120 125Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly130 135 140Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu145 150 155 160Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr165 170 175Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn180 185 190Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe195 200 205Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn210 215 220Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr225 230 235 240
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr260 265 270His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg275 280 285Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Les Asp Arg His Asp Phe Gly Phe290 295 300Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro305 310 315 320Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys325 330 335Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr340 345 350Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly355 360 365Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala370 375 380Va1 Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu TTr Leu lys Glu Lys Lys385 390 395 400Tyt Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser405 410 415Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu420 425 430 43權(quán)利要求
1.一種新型Fc融合蛋白氨基酸序列，其特征在于，其氨基酸序列為A-B-C或C-B-A，其中，A為免疫球蛋白，來自人免疫球蛋白gamma-4(IgG4)Fc片段；B為連接鏈(Linker)，序列為GGSGGSGGGGSGGGGS；C為目的表達(dá)蛋白，可以但不僅限于細(xì)胞因子。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，它是一種酵母或真核表達(dá)載體。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是酵母或真核細(xì)胞。
6.一種新型Fc融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的工程細(xì)胞，從而表達(dá)出新型Fc融合蛋白；b)分離純化出表達(dá)的新型Fc融合蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達(dá)條件為(1).發(fā)酵或培養(yǎng)液通過簡單離心或超濾獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的離子交換層析、分子篩層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型Fc融合蛋白，及穩(wěn)定生產(chǎn)該新型Fc融合蛋白的方法，以及有關(guān)的表達(dá)載體與工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。構(gòu)建的新型Fc融合蛋白基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)非常穩(wěn)定，表達(dá)和純化得率高，具有穩(wěn)定性好、表達(dá)水平高、生產(chǎn)工藝簡便的優(yōu)點。獲得的新型Fc融合蛋白活性高、半衰期延長。本發(fā)明可高效、簡便、低成本的獲得半衰期延長的新型Fc融合蛋白。
文檔編號C12N15/09GK1974601SQ20051011081
公開日2007年6月6日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日
發(fā)明者任軍, 黃陽濱, 孫九如, 游磊, 黃智華, 應(yīng)勛 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司