專利名稱：一種從化妝品中提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取DNA的方法，特別涉及一種從化妝品中提取用于化妝品中所含成分檢測(cè)的模板DNA的方法。
背景技術(shù)：
可傳播性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies，TSE)是一類侵襲人類及多種動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性腦病，潛伏期長(zhǎng)，100％致死率，并可在同種動(dòng)物間傳播。自1730年首次報(bào)道羊搔癢病以來，目前已經(jīng)在人類以及20余種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有自然發(fā)生或感染的TSE，其中包括人類的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease，CJD)、FFI(fatal familial insomnia)、Kuru、GSS(Gerstmann-Straussler-Scheinker)以及動(dòng)物的羊scrapie、牛的BSE、騾和麋鹿的CWD、貂的TME、貓的FSE等。
具有美白、祛斑、抗皺、抗衰老作用的化妝品中大多含有從牛、羊的腦及神經(jīng)組織、內(nèi)臟、胎盤和血液中提取的成分，如果制成這些成分的原料來自于感染BSE的臨床前期的牛，或是組織在取材時(shí)遭到了污染，或是加工過程中不能夠很好地滅活感染因子，那么這些污染了BSE感染因子的化妝品在長(zhǎng)期的使用中理論上仍具有危險(xiǎn)性。
為防止瘋牛病通過化妝品傳入我國(guó)，保障我國(guó)人民身體健康和生命安全，我國(guó)頒布了一系列法律條文禁止進(jìn)口和銷售含有發(fā)生“瘋牛病”國(guó)家或地區(qū)牛、羊的腦及神經(jīng)組織、內(nèi)臟、胎盤和血液(含提取物)等動(dòng)物源性原料成份(簡(jiǎn)稱“牛羊動(dòng)物源性原料成份”)的化妝品。
雖然目前國(guó)際國(guó)內(nèi)均沒有檢測(cè)化妝品中牛羊動(dòng)物源性原料成份的方法，但采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)化妝品中的牛羊源性成分從理論上講是較為行之有效的方法。而使用分子生物學(xué)手段檢測(cè)化妝品中的牛羊源性成分首先需要從化妝品中提取出適合檢測(cè)的DNA作為PCR反應(yīng)的模板。但由于化妝品特殊的加工工藝和復(fù)雜的成分組份，使DNA的提取在質(zhì)量和數(shù)量上都具有相當(dāng)?shù)碾y度。目前常規(guī)的DNA提取方法因提取效率、提取質(zhì)量等原因均不能滿足于化妝品中DNA提取的要求，因此，研究開發(fā)針對(duì)化妝品中DNA提取的方法是利用分子生物學(xué)手段檢測(cè)化妝品牛羊源性成分的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從化妝品中提取DNA的方法，該方法能從多種性狀的化妝品中有效提取DNA，為分子生物學(xué)手段進(jìn)行化妝品中牛羊源性成分的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。
化妝品種類眾多、性狀多樣，有液狀、膏狀及固態(tài)等不同性狀的樣品。本發(fā)明建立的化妝品中提取DNA的方法能夠有效提取出多種性狀的化妝品中的DNA，適用范圍廣、簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、效率高，所提DNA適合于化妝品中牛羊源性成分的PCR檢測(cè)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種從化妝品中提取DNA的方法，包括如下步驟1)取膏狀或固體的化妝品樣品放入研缽中，或取液體化妝品樣品放入管中，加入約1-3倍體積的pH 8.0-8.5的核酸裂解液，約1-3倍于化妝品體積的甲醇水溶液或四氫呋喃醇水溶液，并加入蛋白酶至終濃度約為0.1-1mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀；其中，甲醇水溶液為甲醇∶水＝(60-80)∶(20-40)，四氫呋喃醇水溶液為甲醇∶四氫呋喃∶水＝(36-60)∶(75-125)∶(60-100)，上述比例均為體積比；2)置60℃～65℃溫箱中溫浴，使其充分溶解混勻后冷卻至室溫；3)將步驟2)的溶液用等體積的氯仿∶異戊醇溶液提取DNA，吸取上清液；4)用異丙醇或無水己醇沉淀；5)洗滌得到的沉淀物，然后干燥沉淀；6)加入去離子水溶解沉淀；在本發(fā)明的實(shí)施方式中，步驟1)中的核酸裂解液可以是本領(lǐng)域常規(guī)的核酸裂解液，優(yōu)選為10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/L Na2EDTA和2％ SDS，pH8.0-8.5。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟1)中的甲醇水溶液為甲醇∶水＝(70-60)∶(30-40)；更優(yōu)選為甲醇∶水＝70∶30。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟1)中的四氫呋喃醇水溶液為甲醇∶四氫呋喃∶水＝(50-60)∶(100-125)∶(80-100)；更優(yōu)選為甲醇∶四氫呋喃∶水＝60∶125∶100。
本發(fā)明方法中，所述的蛋白酶用于降解化妝品中的蛋白質(zhì)，該蛋白酶優(yōu)選蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶BP，更優(yōu)選為蛋白酶K(proteinaseK)。
進(jìn)一步優(yōu)選在步驟2)之后加入步驟2)所得溶液1/3-1/5體積的5-7.5mol/L的NH4Ac或KAc溶液，劇烈震蕩30-60s，放置冰上5-10min，室溫下離心，吸取澄清的液體至一新管中。
采用PCR擴(kuò)增來檢測(cè)本發(fā)明上述的方法是否從化妝品中提取到了DNA。
線粒體DNA細(xì)胞色素b基因(Cytb)是在動(dòng)物中廣泛存在的基因(Avise JC，1986，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.312(1154)325-42)，而葉綠體核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因(rbcL)是在植物中廣泛存在的基因(Nadot S，et al.，1995，Mol Phylogenet Evol.4(3)257-82)，通常采用檢測(cè)這兩個(gè)基因的存在與否來證明樣品中是否含有動(dòng)植物成分。本發(fā)明人根據(jù)位于這兩個(gè)基因片段的中間區(qū)域序列來設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，如果PCR得到了相應(yīng)的擴(kuò)增片段，則說明本發(fā)明的DNA提取方法能從化妝品中有效提取DNA。
PCR擴(kuò)增使用引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表1，2，3所述。
表1 動(dòng)、植物成分PCR擴(kuò)增引物序列

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件



圖1A醇水溶液法提取的化妝品DNA植物成分的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中1.分子量Marker；2.陽性對(duì)照(大豆DNA)；3.美加凈人參防皺霜；4.空白對(duì)照?qǐng)D1B醇水溶液法提取的化妝品DNA動(dòng)物成分的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中1.分子量Marker；2.陽性對(duì)照(牛肉DNA)；3.美加凈人參防皺霜；4.空白對(duì)照?qǐng)D2A呋喃醇水溶液法提取的化妝品DNA植物成分的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中1.分子量Marker；2.陽性對(duì)照(大豆DNA)；3.山莓草本精華洗發(fā)露；4.空白對(duì)照?qǐng)D2B呋喃醇水溶液法提取的化妝品DNA動(dòng)物成分的PCR擴(kuò)增結(jié)果其中1.分子量Marker；2.陽性對(duì)照(牛肉DNA)；3.山莓草本精華洗發(fā)露；4.空白對(duì)照
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11)稱取1g美加凈人參防皺霜放入干凈的研缽中，加入3倍化妝品體積的pH 8.2的核酸裂解液(10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/LNa2EDTA，2％ SDS)，3倍于化妝品體積的甲醇水溶液(70∶30)及5mg/ml蛋白酶K至終濃度為0.5mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀，確保其內(nèi)無塊狀物質(zhì)。
2)置65℃溫箱中溫浴2h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)取出冷卻至室溫。加入1/3體積的5mol/L NH4Ac溶液，劇烈震蕩30s，冰上放置10min，室溫下12000rpm離心10min，吸取較澄清的水相至一新的Eppendorf管中。
4)加入與步驟3)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
5)加入體積量是上述步驟4)所得液體2.5倍的冰預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻后-20℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
6)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
7)加入50μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
取10μl上述方法獲得的DNA溶液進(jìn)行植物成分的擴(kuò)增檢測(cè)。采用引物Plant159進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和3。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，見圖1A。陽性對(duì)照采用Wizrad Genomic DNA Purification試劑盒(Promega公司)方法提取的大豆DNA，經(jīng)引物Plant159在相同反應(yīng)體系和條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？瞻讓?duì)照為采用引物Plant159進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增，但是以雙蒸水作為加入的模板。電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明的DNA提取方法能從化妝品中有效地提取出植物源性DNA。
取10μl上述方法獲得的DNA溶液進(jìn)行動(dòng)物成分的擴(kuò)增檢測(cè)。采用引物Anm138進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和3。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，見圖1B。陽性對(duì)照采用Wizrad Genomic DNA Purification試劑盒(Promega公司)方法提取的牛肉DNA，經(jīng)引物Anm138進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增。空白對(duì)照為采用引物Anm138進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增，但是以雙蒸水作為加入的模板。電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明的DNA提取方法能從化妝品中有效地提取出動(dòng)物源性DNA。
實(shí)施例21)量取1.2ml液體山莓草本精華洗發(fā)露(取樣前搖勻)放入兩個(gè)Eppendorf管中，分別加入1倍體積的pH 8.0的核酸裂解液(2％(w/v)CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L Na2EDTA)，1倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝60∶125∶100)和1/10體積的鏈霉蛋白酶(5mg/ml)至酶終濃度為1mg/ml，充分混勻。
2)置60℃溫箱中溫浴1h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分混合。
3)加入與步驟2)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
4)加入0.8倍體積冰預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后4℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
5)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
6)加入30μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
取10μl上述方法獲得的DNA溶液進(jìn)行植物成分的擴(kuò)增檢測(cè)。采用引物Plant159進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和3。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，見圖2A。陽性對(duì)照采用Wizrad Genomic DNA Purification試劑盒(Promega公司)方法提取的大豆DNA，經(jīng)引物Plant159進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增?？瞻讓?duì)照為采用引物Plant159進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增，但是以雙蒸水作為加入的模板。電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明的DNA提取方法能從化妝品中有效地提取出植物源性DNA。
取10μl上述方法獲得的DNA溶液進(jìn)行動(dòng)物成分的擴(kuò)增檢測(cè)。采用引物Anm138進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和3。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，見圖2B。陽性對(duì)照采用Wizrad Genomic DNA Purification試劑盒(Promega公司)方法提取的牛肉DNA，經(jīng)引物Anm138進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增?？瞻讓?duì)照為采用引物Anm138進(jìn)行相同反應(yīng)體系和條件的PCR擴(kuò)增，但是以雙蒸水作為加入的模板。電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明的DNA提取方法能從化妝品中有效地提取出動(dòng)物源性DNA。
實(shí)施例31)稱取1g膠狀茶樹油洗面奶放入干凈的研缽中，加入2倍體積的pH 8.5的核酸裂解液(10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/L Na2EDTA，2％ SDS)，2倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝36∶80∶95)及5mg/ml的胃蛋白酶至酶的終濃度為0.1mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀，確保其內(nèi)無塊狀物質(zhì)。
2)置65℃溫箱中溫浴1.5h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)取出冷卻至室溫。加入1/5體積的7.5mol/L KAc溶液，震蕩60s，冰上放置5min，室溫下12000rpm離心10min，吸取較澄清的水相至一新的Eppendorf管中。
4)同實(shí)施例1。
5)加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻后-20℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
6)同實(shí)施例1。
7)加入20μl去離子水溶解沉淀，4℃保存。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出洗面奶中的DNA成分。
實(shí)施例41)稱取1g美潤(rùn)護(hù)手霜放入干凈的研缽中，加入3倍于護(hù)手霜體積的pH8.5的核酸裂解液(2％(w/v)CTAB，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L Na2EDTA)，3倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝40∶125∶60)及5mg/ml的蛋白酶BP至酶的終濃度為0.3mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀，確保其內(nèi)無塊狀物質(zhì)。
2)置62℃溫箱中溫浴1h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)加入與步驟2)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
4)加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻后-20℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
5)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
6)加入20μl去離子水溶解沉淀，4℃保存。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出護(hù)手霜中的DNA成分。
實(shí)施例51)稱取2ml牛奶沐浴露放入Eppendorf管中，加入2倍牛奶沐浴露體積的pH 8.2的核酸裂解液(10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/LNa2EDTA，2％ SDS)，2倍于牛奶沐浴露體積的甲醇水溶液(甲醇∶水＝60∶40)及5mg/ml的蛋白酶K至酶的終濃度為1mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀。
2)置60℃溫箱中溫浴2h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)取出冷卻至室溫。加入1/3體積的6mol/L KAc溶液，劇烈震蕩30s，冰上放置10min，室溫下12000rpm離心10min，吸取較澄清的水相至一新的Eppendorf管中。
4)加入與步驟3)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
5)加入等體積冰預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后4℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
6)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
7)加入50μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出牛奶沐浴露中的DNA成分。
實(shí)施例61)稱取1g的綿羊酯日霜放入Eppendorf管中，加入2倍化妝品體積的pH 8.2的核酸裂解液(10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/LNa2EDTA，2％ SDS)，2倍化妝品體積的甲醇水溶液(甲醇∶水＝80∶20)及5mg/ml的蛋白酶K至酶的終濃度為1mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀，確保其內(nèi)無塊狀物質(zhì)。
2)置60℃溫箱中溫浴2h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)加入與步驟2)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
4)加入0.8倍體積冰預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后4℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
5)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
6)加入50μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出綿羊酯日霜中的DNA成分。
實(shí)施例71)稱取1g美潤(rùn)護(hù)手霜放入干凈的研缽中，加入3倍于護(hù)手霜體積的pH8.5的核酸裂解液(2％(w/v)CTAB，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L Na2EDTA)，2倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝36∶125∶100)及5mg/ml的蛋白酶BP至酶的終濃度為0.3mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀，確保其內(nèi)無塊狀物質(zhì)。
2)置62℃溫箱中溫浴1h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分溶解混勻。
3)加入與步驟2)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
4)加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻后-20℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
5)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
6)加入20μl去離子水溶解沉淀，4℃保存。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出護(hù)手霜中的DNA成分。
實(shí)施例81)量取1.2ml液體山莓草本精華洗發(fā)露(取樣前搖勻)放入兩個(gè)Eppendorf管中，分別加入1倍體積的pH 8.0的核酸裂解液(10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/L Na2EDTA，2％ SDS)，1倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝60∶75∶60)和蛋白酶K(5mg/ml)至酶終濃度為1mg/ml，充分混勻。
2)置60℃溫箱中溫浴1h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分混合。
3)加入與步驟2)所得的液體等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
4)加入0.8倍體積冰預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后4℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
5)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
6)加入30μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出洗發(fā)露中的DNA成分。
實(shí)施例91)量取1.2ml液體山莓草本精華洗發(fā)露(取樣前搖勻)放入兩個(gè)Eppendorf管中，分別加入1倍體積的pH 8.0的核酸裂解液(2％(w/v)CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/L NaCl，20mmol/L Na2EDTA)，1倍體積的四氫呋喃溶液(甲醇∶四氫呋喃∶水＝60∶75∶98)和鏈霉蛋白酶(5mg/ml)至酶終濃度為1mg/ml，充分混勻。
2)置60℃溫箱中溫浴1h，期間每隔10min輕輕顛倒混勻數(shù)一次，確保其充分混合。
3)取出冷卻至室溫。加入1/5體積的7.5mol/L KAc溶液，震蕩60s，冰上放置5min，室溫下12000rpm離心10min，吸取較澄清的水相至一新的Eppendorf管中。
4)加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液，振蕩混勻，室溫下12000rpm離心10min，小心吸取上清液至一新的1.5ml Eppendorf管中。
5)加入0.8倍體積冰預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后4℃靜置過夜。室溫下12000rpm，離心20min，棄上清，留沉淀。
6)加入500μl冰預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，室溫下12000rpm離心10min，棄上清，除去殘留的乙醇，干燥沉淀。
7)加入20μl去離子水溶解沉淀，得到含DNA的溶液。
PCR檢測(cè)，證明了上述方法能有效提取出洗發(fā)露中的DNA成分。
權(quán)利要求
1.一種從化妝品中提取DNA的方法，包括如下步驟1)取膏狀或固體的化妝品樣品放入研缽中，或取液體化妝品樣品放入管中，加入1-3倍體積的pH8.0-8.5的核酸裂解液，1-3倍于化妝品體積的甲醇水溶液或四氫呋喃醇水溶液，并加入蛋白酶至終濃度為0.1-1mg/ml，充分研磨直至完全溶解成液狀或稀糊狀；其中，甲醇水溶液為甲醇∶水＝(60-80)∶(20-40)，四氫呋喃醇水溶液為甲醇∶四氫呋喃∶水＝(36-60)∶(75-125)∶(60-100)，上述比例均為體積比；2)置60℃～65℃溫箱中溫浴，使其充分溶解混勻后冷卻至室溫；3)將步驟2)的溶液用等體積的氯仿-異戊醇溶液抽提蛋白等雜質(zhì)，吸取上清液；4)用異丙醇或無水乙醇沉淀；5)洗滌得到的沉淀物，然后干燥沉淀；6)加入去離子水溶解沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的核酸裂解液為10mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/LNa2EDTA和2％SDS，pH值為8.0-8.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的甲醇水溶液為甲醇∶水＝(70-60)∶(30-40)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的甲醇水溶液為甲醇∶水＝70∶30。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的四氫呋喃醇水溶液為甲醇∶四氫呋喃∶水＝(50-60)∶(1 00-125)∶(80-100)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的四氫呋喃醇水溶液為甲醇∶四氫呋喃∶水＝60∶125∶100。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，步驟1)中的蛋白酶為蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶BP。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從化妝品中提取DNA的方法，其特征在于，在步驟2)之后進(jìn)一步加入1/3-1/5體積的5-7.5mol/L的NH4Ac或KAc溶液，劇烈震蕩30-60s，放置冰上5-10min，室溫下離心，吸取澄清的液體至一新管中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從化妝品中提取DNA的方法。該方法通過往化妝品樣品中加入核酸裂解液、甲醇水溶液或四氫呋喃醇水溶液及蛋白酶，充分研磨混合物至液狀或稀糊狀，然后使其溫浴，抽提蛋白等雜質(zhì)，將上清液沉淀，干燥沉淀物，然后加入去離子水溶解沉淀。本發(fā)明建立的化妝品中提取DNA的方法能夠有效提取出多種性狀的化妝品中的DNA，適用范圍廣、簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、效率高，所提DNA適合在檢測(cè)化妝品中所含成分的PCR擴(kuò)增中作為模板。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1904060SQ20051008791
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者陳穎, 錢增敏, 王晶, 王媛, 吳亞君, 徐寶梁 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所