專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼甘薯番茄紅素β－環(huán)化酶的cDNA序列的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及甘薯(Ipomoea batatas)中表達(dá)的番茄紅素β-環(huán)化酶(Ipomoea batatasLycopene β-cyclase)cDNA核苷酸序列。
背景技術(shù)：
β-胡蘿卜素(β-Carotene)的生物合成主要發(fā)生于高等植物、藻類(lèi)、真菌和細(xì)菌體內(nèi)，動(dòng)物體內(nèi)不能從頭合成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素是維生素A(Vitamin A)的前體，在人體內(nèi)可根據(jù)需要轉(zhuǎn)化為維生素A。它具有營(yíng)養(yǎng)、著色的雙重作用，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)認(rèn)定的A類(lèi)優(yōu)秀有營(yíng)養(yǎng)的食品添加劑(foodadditives)。近年來(lái)，越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究表明，β-胡蘿卜素可抗多種癌癥，特別是可降低肺癌發(fā)病率。β-胡蘿卜素在淬滅自由基，增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防心血管疾病等保護(hù)人類(lèi)健康方面起著重要的作用。
天然β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體比例高，目前化學(xué)合成法還無(wú)法合成β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體，而順式異構(gòu)體已被臨床證明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全反式異構(gòu)體。
類(lèi)胡蘿卜素合成是一個(gè)十分龐大的次生代謝途徑，β-胡蘿卜素的合成從牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)開(kāi)始，依次經(jīng)八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶、ζ-胡蘿卜素脫氫酶和番茄紅素β-環(huán)化酶的催化，最終合成β-胡蘿卜素，番茄紅素β-環(huán)化酶是β-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶之一。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專(zhuān)利申請(qǐng)中提及的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶的核苷酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶的cDNA序列。
在本發(fā)明中，“分離的”cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在產(chǎn)生本發(fā)明的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA時(shí)，可以將甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發(fā)明的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
獲得有關(guān)的序列后，用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過(guò)先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。
表2列出了本發(fā)明的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA與辣椒的β-胡蘿卜素環(huán)化酶基因(GenBank Accession No.X86221)序列的同源比較圖。
下面結(jié)合具體步驟，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些步驟僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列步驟中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆》、《實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
步驟1甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的克隆1.組織分離(isolation)紅心甘薯品種金山72來(lái)源于福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院薯類(lèi)研究室，在大田種植90天，取幼嫩塊根，用液氮速凍。
2.總RNA的分離(total RNA isolation)和檢測(cè)取根部，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，電泳圖譜呈現(xiàn)出3條清晰可區(qū)分的條帶，其中28SRNA∶18SRNA比值約為2∶1，表明總RNA基本上未降解，可用于甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的全長(zhǎng)克隆。
3.番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分四個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCR根據(jù)黃水仙、玉米、番茄、胡蘿卜、辣椒等植物的番茄紅素β-環(huán)化酶基因的核酸保守序列，設(shè)計(jì)保守引物，正向與反向引物分別為lyc-b基因?yàn)镾EQ ID NO.1與SEQ ID NO.2。采用RT-PCR的方法(TaKaRa試劑盒)，得到保守序列l(wèi)yc-bcon(478bp)，連接到T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，lyc-b基因的保守序列與已知番茄(Lycopersicon esculentum)、煙草(N.tabacum)、辣椒(C.annuum)的番茄紅素β-環(huán)化酶基因的同源性分別為82％、81％、80％，初步認(rèn)為它是甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的一個(gè)片段；(2)3’-RACE反轉(zhuǎn)錄總RNA，得到第一鏈cDNA。
第一輪PCR(引物為GR3(SEQ ID NO.9)+SEQ ID NO.3)第二輪PCR(GR3N(SEQ ID NO.10)+SEQ ID NO.4)得到lyc3(584bp)其它過(guò)程如同(1)所示。
測(cè)序結(jié)果已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列與已知煙草(C.annuum)和番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(C.annuum)的番茄紅素β-環(huán)化酶基因的同源性分別為82％、82％、81％，故可進(jìn)一步確認(rèn)它是甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的片段。
(3)5’-RACE第一輪PCR(GR5(SEQ ID NO.11)+SEQ ID NO.5)第二輪PCR(GR5N(SEQ ID NO.12)+SEQ ID NO.6)得到lyc5(924bp)其它過(guò)程如同(1)所示。
(4)PCR擴(kuò)增番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的編碼區(qū)通過(guò)組合使用上述3種方法，拼接候選的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA序列，在該序列(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)正向引物lycF(SEQ ID NO.7)和反向引物lycR(SEQ ID NO.8)，以總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的Pyrobest酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃ 5min，隨之以94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10min。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1,728bp。(其它過(guò)程同(1))。
因此，組合上述4種方法得到的結(jié)果，獲得了甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA序列(表1)。
BLAST的結(jié)果證明從甘薯中新得到的基因確為番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA。由于已知的同源番茄紅素β-環(huán)化酶能夠催化番茄紅素環(huán)化形成β-胡蘿卜素，故推測(cè)該系列基因具有相同的功能。
步驟2甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的長(zhǎng)度為1,847bp，開(kāi)放讀框位于276-1781位核苷酸，詳細(xì)序列見(jiàn)表1。將甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果與番茄(Lycopersiconesculentum)的番茄紅素β-環(huán)化酶基因(GenBank Accession No.X86221)在核苷酸水平上有74％的相同性，可以認(rèn)為兩者在功能上有很高相似性。
步驟3
甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的功能分析在該步驟中，將甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的編碼序列構(gòu)建入植物表達(dá)載體之中，并轉(zhuǎn)化煙草，以分析各基因的功能。
1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA序列(表1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出各個(gè)基因完整編碼閱讀框的引物，分別在正反引物上引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)正反引物分別引入BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)。以步驟1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，保證甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的閱讀框完全正確。用內(nèi)切酶BamHI和KpnI進(jìn)行37℃酶切3h，回收目的片段1,728bp；植物表達(dá)載體p2300用BamHI和KpnI內(nèi)切酶37℃酶切3h，回收目的片段。將經(jīng)酶切的甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的目的片段與經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶切過(guò)的p2300表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)20h，進(jìn)行重組子的PCR鑒定和酶切鑒定。
2.植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)取四份感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，加入含甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶cDNA的植物表達(dá)載體約1μg，輕輕混勻；(2)于液氮中速凍2分鐘，37℃溫育5分鐘；(3)分別加入500μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃輕搖2-4小時(shí)，消除感受態(tài)；(4)分別取50-200μl菌液，分別涂布于含適當(dāng)抗生素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
(5)鑒定呈陽(yáng)性的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種到含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素的20ml液體YEB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)30個(gè)小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋20-30倍。
3.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及再生(1)取無(wú)菌煙草葉片，切除葉片邊緣與中脈，于Ms+1.0mg/L NAA固體培養(yǎng)基中28℃預(yù)培養(yǎng)2天；(2)重新取出材料，放入無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋過(guò)的帶有目的基因的農(nóng)桿菌中，浸泡15分鐘，然后在有28℃搖床中低速搖15分鐘；(3)取出小葉片，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，于MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)兩天；(4)把小葉片，用加500mg/L Cb的無(wú)菌水洗兩次，無(wú)菌濾紙吸去多余菌液后，轉(zhuǎn)入含100mg/LKm和500mg/L Cb分化培養(yǎng)基M1中，28℃光下培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長(zhǎng)出芽，其間每15天繼代一次；(5)將長(zhǎng)至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2Ms上誘導(dǎo)生根。
(6)經(jīng)鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草后，繼續(xù)培養(yǎng)成苗。
4.轉(zhuǎn)基因煙草葉片類(lèi)胡蘿卜素的提取(1)取各轉(zhuǎn)基因煙草葉片，迅速冷凍干燥，制成凍干粉，置真空干燥箱中避光保存，并盡快測(cè)定。
(2)準(zhǔn)確稱(chēng)取凍干粉1.000g于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮∶乙醇＝3∶2)45mL，搖勻，蓋上瓶塞，用超聲波提取20分鐘，過(guò)濾于50mL容量瓶中并定容。取20mL濾液置分液漏斗中，加入10mL石油醚混勻，加入10mL蒸餾水進(jìn)行分配，取石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，剩余水加入10mL石油醚進(jìn)行再分配，合并2次石油醚相置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40-45℃蒸干，用2.0mL異丙醇溶解，過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。
5.高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草葉片類(lèi)胡蘿卜素(1)β-胡蘿卜素標(biāo)樣的制備β-胡蘿卜素標(biāo)淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時(shí)，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，此時(shí)濃度為0.004mg/ml。
(2)番茄紅素標(biāo)樣的制備番茄紅素標(biāo)淮品(Sigma公司產(chǎn)品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液轉(zhuǎn)入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，濃度為0.04mg/ml，冰箱保存。臨用時(shí)，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，此時(shí)濃度為0.004mg/ml。
(3)測(cè)定方法流動(dòng)相乙腈∶三氯甲烷(92∶8)。檢測(cè)波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)測(cè)定，470nm(0-min)和450nm(8-13min)。流速1.0mL/min。柱溫35℃。觀測(cè)樣品在470nm與450nm處有吸收峰的大小變化。
本發(fā)明涉及的記號(hào)及序列分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1TATGGGGTTTGGGTGGATGAATT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2TCCATACCG/aAAG/aCAG/aAAGAACTC(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征；(A)長(zhǎng)度25bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3AGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCA(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4GCATTGAAGAAGACGAGCGTTGT(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.5CTTATCGTACTGAACCAGGCATCT(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.6CCACAGTTGCTTGAATCGTCACA(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29bp
(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.7CGGGATCCGACATGGTAAGCCTACAACTG(8)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.8GGGGTACCAACCAAAGTGCAAATCAA(9)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.9GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG(10)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.10CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(11)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(12)SEQ ID NO.12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.12GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
表1編碼甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶的cDNA序列<110>福建農(nóng)林大學(xué)<120>編碼甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶的cDNA序列<160>1<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>1847<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<221>gene<222>(1)…(1847)<400>Full length sequence of lycopene β-cyclase gene from Ipomoea batatas1GAAAACTGCT CACCACACCA CAAGCTTCTC CTCCCACGAA CCAAAACAAT GAGATTTCTT61 TTTGTTCACT CACCTCCTGC GACATGGTAA GCCTACAACT GTCTACCTAT GCTGTCCTTC121 AATTTTCTAA TTTTCTCTAC TAATTTATGT GGGATTTCTT GAAATTTTAG TCCAACCCAT181 TTCACTATAT CCCTATTTAT TCCCTCCTGT ATTCCTTGTT CTTTGTACAT ACATACTGTT241 TATCTTGAAA CCCCAGATTG TAGTGTGGAA GGGTGATGGA TACTCTGCTA AAAACCCCTA301 ATGAGCTTGA ATTTCTGCAC CCACATCATG GGTTTGCAGT TAAAGCTAGT GCCTTTACCT361 CCCTGAAGCC TCAAAAACAG GAAATTAGGA TTGGTTCATT GAAATCTTGC AGGAATTTTG421 GCCGTGTTAA GGCCAGCAGT AGTGCCCTAT TAGAACTTGT GCCTGTGACC AAGAAAGAGA481 ATCTTGATTT TGAGCTCCCT ATGTTTGAAC CCTCTAAAGG GATTGTTGTG GATCTAGCTG541 TGGTTGGGGG TGGCCCTGCT GGGCTTGCAG TGGCTCAGCA GGTTTCACAA GCTGGGCTAT601 CAGTTTGTTC AATTGACCCC TCTCCCAAAT TGATTTGGCC CAATAACTAT GGAGTTTGGG661 TGGATGAATT CGAGGCCATG GATTTGTTGG ATTGCCTCGA TACCACGTGG TCTGGAGCTA721 TGGTGTATAT TGATGACCGC ACGACTAAAG ATCTTGACAG GCCTTATGGG CGGGTTAACA781 GGAAGAAACT CAAATCGAAA ATGATGCAGA AATGCATTGC GAATGGTGTT AAGTTTCATC841 AAGCCAAGGT TATAAGGGTG ATCCATGAAG AATCGAAATC CATGTTGATT TGCAGTGATG901 GTGTGACGAT TCAAGCAACT GTGGTTCTTG ATGCAACTGG CTTTTCTAGA TGCCTGGTTC961 AGTACGATAA GCCTTATAAT CCGGGCTATC AAGTTGCGTA TGGCATTCTG GCAGAAGTGG1021 AGGAACACCC TTANGATTTG AATAAGATGG TTTTCATGGA TTGGCGAGAC TCTCACCTAA
1081 ACAGTAACTT GGAGCTAAAG GAGAGAAATA AAAGAATCCC GACCTTTCTT TATGCCATGC1141 CATTTTCCTC GCAGAGGATA TTCCTTGAAG AAACCTCGCT AGTGGCTCGT CCCGGCTTAG1201 ATATGAAGGA TATTCAGGAA AGAATGGTGG CTCGTTTAAG GCACTTAGGT ATCAACGTCA1261 AGAGCATTGA AGAAGACGAG CGTTGTGTTA TCCCAATGGG AGGTCCCCTA CCCGTGATAC1321 CCCAACGAGT TGTTGGAATT GGCGGTACTG CAGGTATGGT TCATCCCTCG ACCGGATATA1381 TGGTGGCGAG GACTCTGGCT GCAGCTCCGG TTGTTGCCAA CGCAATCATT CAGTACCTAG1441 GTTCCGAGAG AAGTCTTCTG GGCAACGAAT TATCAGCATC TGTTTGGAAA GACCTGTGGC1501 CAATAGAGAG GAGGCGGCAA AGGGAATTCT TTTGTTTTGG TATGGATATT CTACTGAAGC1561 TCGATTTGCC AGCCACAAGA AGATTTTTTG ATGCGTTTTT TGATCTAGAA CCCCGTTATT1621 GGCATGGATT TCTATCATCC CGGCTGTTTC TTCGTGAGCT CATATTTTTT GGTCTCTCGC1681 TTTTCTCTCA TGCCAGTAAT ACTTCTAGGT TAGAGATAAT GACCAAGGGC ACTTTGCCTC1741 TGGTAAACAT GATCAACAAT TTGTTACAGG ATATAGATTA AGTAATTTTG ATTTGCACTT1801 TGGTTGGAAA TTATGTATGT AGCAATTCCT ATGTCCCAAA AAAAAAA
表2 Percent Identity74％in nt overlap1GAAAACTGCTCACCACACCACAAGCTTCTCCTCCCACGAACCAAAACAATGAGATTTCTT|||| || || || ||| |1........................CTTAATTATAGAAATACTTAAGATATATCATTGCCC61 TTTGTTCACTCACCTCCTGCGACATGGTAAGCCTACAACTGTCTACCTATGCTGTCCTTC||| ||| | | |||| || | | | | | | |37 TTTAATCATTTATTTTTAACTCTTTTAAGTGTTTAAAGATTGATTCTTTGTACATGTTCT121 AATTTTCTAATTTTCTCTACTAATTTATGTG...GGATTTCTTGAAATTTTAGTCCAACC|| | | ||| | | || | || ||||| | | ||| | ||97 GCTTCATTTGTGTTGAAAATTGAGTTGTTTTCTTGAATTTTGCAAGAATATAGGGGACCC178 CATTTCACTATATCCCTATTTA..TTCCCTCCTGTATTCCTTGTTCTTT...GTACATA.
||||| | ||| || | | ||| || | | | ||| | | |||157 CATTTGTGTTGAAAATTGAGCAGCTTTCTTTGTGTTTTGTTCGATTTTTCAAGAATATAG232 ...CATACTGTTTATCTTGAAACCCCAGATTGTAG..TGTGGAAGGGTGATGGATACTCT| | | | | | ||| |||| | ||| | |||||||| ||217 GACCCCATTTTCTGTTTTCTTGAGATAAATTGCACCTTGTTGGGAAAATATGGATACGCT287 GCTAAAAACCCCTAATGAGCTTGAATTTCTGCACCCACATCATGGGTTTGCAGTTAAAGC| | |||||| || | |||||||||||||| ||| |||| |||||||277 CTTGAGAACCCCAAACAATCTTGAATTTCTGCA.........TGGATTTGGTGTTAAAGT347 TAGTGCCTTTACCTCCCTGAAGCCTCAAAAACAGGAAATTAGGATTGGTTCATTGAAATC||||||||||| ||| ||||| |||| ||||| || ||| ||||328 TAGTGCCTTTAGCTCTGTGAAGTCTCAGAAGTTTGGTGCTAAGA..AGTTTTGTGAAGGT407 TTGCAGG..AATTTTGGCCGTGTTAAGGCCAGCAGTAGTGCCCTATTAGAACTTGTGCCT||| | ||| | |||| ||||| || |||||||| || || || ||||| |||386 TTGGGGAGTAGAAGTGTCTGTGTGAAGGCTAGTAGTAGTGCTCTTTTGGAGCTTGTACCT465 GTGACCAAGAAAGAGAATCTTGATTTTGAGCTCCCTATGTTTGAACCCTCTAAAGGGATT| ||| || || || ||||||||||||||||| ||||||| ||| || || |||||| ||446 GAGACAAAAAAGGAAAATCTTGATTTTGAGCTTCCTATGTATGACCCTTCAAAAGGGGTT525 GTTGTGGATCTAGCTGTGGTTGGGGGTGGCCCTGCTGGGCTTGCAGTGGCTCAGCAGGTT||||||||||| |||||||| || ||||| ||||| || ||||| || || ||||| |||506 GTTGTGGATCTTGCTGTGGTCGGTGGTGGTCCTGCAGGTCTTGCTGTTGCACAGCAAGTT585 TCACAAGCTGGGCTATCAGTTTGTTCAATTGACCCCTCTCCCAAATTGATTTGGCCCAAT|| |||| || || || |||||||| ||||| || ||| |||||||| ||||| |||566 TCTGAAGCAGGACTTTCTGTTTGTTCGATTGATCCGAATCCTAAATTGATATGGCCTAAT
645 AACTATGGAGTTTGGGTGGATGAATTCGAGGCCATGGATTTGTTGGATTGCCTCGATACC|||||||| ||||||||||||||||| ||||| ||||| ||||| ||||| || ||| |626 AACTATGGTGTTTGGGTGGATGAATTTGAGGCTATGGACTTGTTAGATTGTCTTGATGCT705 ACGTGGTCTGGAGCTATGGTGTATATTGATGACCGCACGACTAAAGATCTTGACAGGCCT|| |||||||| || |||||| |||||||||| |||||||||||| | || |||686 ACTTGGTCTGGTGCAGCGGTGTACATTGATGATAAAACAACTAAAGATCTTAATAGACCT765 TATGGGCGGGTTAACAGGAAGAAACTCAAATCGAAAATGATGCAGAAATGCATTGCGAAT||||| |||||||| | ||| | | ||||||||||||||||||||||| || ||||746 TATGGAAGGGTTAACCGAAAGCAGTTGAAATCGAAAATGATGCAGAAATGTATACTGAAT825 GGTGTTAAGTTTCATCAAGCCAAGGTTATAAGGGTGATCCATGAAGAATCGAAATCCATG|||||||| || ||||||||||| ||||||| ||| |||||||| ||||| |||||||||806 GGTGTTAAATTCCATCAAGCCAAAGTTATAAAGGTAATCCATGAGGAATCTAAATCCATG885 TTGATTTGCAGTGATGGTGTGACGATTCAAGCAACTGTGGTTCTTGATGCAACTGGCTTT||||| |||| ||||||| | || ||||| || || ||||| || ||||||||||||||866 TTGATATGCAATGATGGTATTACTATTCAGGCGACAGTGGTGCTCGATGCAACTGGCTTC945 TCTAGATGCCTGGTTCAGTACGATAAGCCTTATAATCCGGGCTATCAAGTTGCGTATGGC||||||| || |||||||| |||||||||||||| || || |||||||| || ||||||926 TCTAGATCTCTTGTTCAGTATGATAAGCCTTATAACCCCGGGTATCAAGTAGCTTATGGC1005 ATTCTGGCAGAAGTGGAGGAACACCCTTANGATTTGAATAAGATGGTTTTCATGGATTGG||| |||| ||||| || || ||||| | ||| | || |||||||||||||||||||||986 ATTTTGGCTGAAGTTGAAGAGCACCCCTTTGATGTAAACAAGATGGTTTTCATGGATTGG1065 CGAGACTCTCACCTAAACAGTAACTTGGAGCTAAAGGAGAGAAATAAAAGAATCCCGACC|| |||||||| | || | ||| | ||||| ||||||||||||| ||||| || ||1046 CGCGACTCTCATTTGAAGAACAACGTTGAGCTCAAGGAGAGAAATAGTAGAATACCAACT1125 TTTCTTTATGCCATGCCATTTTCCTCGCAGAGGATATTCCTTGAAGAAACCTCGCTAGTG|| |||||||||||||||||||| || | |||||||| |||||||||||||| || ||1106 TTCCTTTATGCCATGCCATTTTCATCCAACAGGATATTTCTTGAAGAAACCTCACTTGTT1185 GCTCGTCCCGGCTTAGATATGAAGGATATTCAGGAAAGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCAC|||||||| || || | |||| | |||||||| ||| ||||||||||||||||||| |||1166 GCTCGTCCTGGTTTGGGTATGGATGATATTCAAGAACGAATGGTGGCTCGTTTAAGTCAC1245 TTAGGTATCAACGTCAAGAGCATTGAAGAAGACGAGCGTTGTGTTATCCCAATGGGAGGT|| || || || || |||||||||||||| || || | |||||| || |||||||| |||1226 TTGGGGATAAAAGTTAAGAGCATTGAAGAGGATGAACATTGTGTAATACCAATGGGTGGT1305 CCCCTACCCGTGATACCCCAACGAGTTGTTGGAATTGGCGGTACTGCAGGTATGGTTCAT
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權(quán)利要求
1.編碼甘薯番茄紅素β-環(huán)化酶的cDNA序列，其特征是從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列的長(zhǎng)度為1,847bp，其中開(kāi)放閱讀框位于276-1779位核苷酸，具體如下1 GAAAACTGCT CACCACACCA CAAGCTTCTC CTCCCACGAA CCAAAACAAT GAGATTTCTT61TTTGTTCACT CACCTCCTGC GACATGGTAA GCCTACAACT GTCTACCTAT GCTGTCCTTC121 AATTTTCTAA TTTTCTCTAC TAATTTATGT GGGATTTCTT GAAATTTTAG TCCAACCCAT181 TTCACTATAT CCCTATTTAT TCCCTCCTGT ATTCCTTGTT CTTTGTACAT ACATACTGTT241 TATCTTGAAA CCCCAGATTG TAGTGTGGAA GGGTGATGGA TACTCTGCTA AAAACCCCTA301 ATGAGCTTGA ATTTCTGCAC CCACATCATG GGTTTGCAGT TAAAGCTAGT GCCTTTACCT361 CCCTGAAGCC TCAAAAACAG GAAATTAGGA TTGGTTCATT GAAATCTTGC AGGAATTTTG421 GCCGTGTTAA GGCCAGCAGT AGTGCCCTAT TAGAACTTGT GCCTGTGACC AAGAAAGAGA481 ATCTTGATTT TGAGCTCCCT ATGTTTGAAC CCTCTAAAGG GATTGTTGTG GATCTAGCTG541 TGGTTGGGGG TGGCCCTGCT GGGCTTGCAG TGGCTCAGCA GGTTTCACAA GCTGGGCTAT601 CAGTTTGTTC AATTGACCCC TCTCCCAAAT TGATTTGGCC CAATAACTAT GGAGTTTGGG661 TGGATGAATT CGAGGCCATG GATTTGTTGG ATTGCCTCGA TACCACGTGG TCTGGAGCTA721 TGGTGTATAT TGATGACCGC ACGACTAAAG ATCTTGACAG GCCTTATGGG CGGGTTAACA781 GGAAGAAACT CAAATCGAAA ATGATGCAGA AATGCATTGC GAATGGTGTT AAGTTTCATC841 AAGCCAAGGT TATAAGGGTG ATCCATGAAG AATCGAAATC CATGTTGATT TGCAGTGATG901 GTGTGACGAT TCAAGCAACT GTGGTTCTTG ATGCAACTGG CTTTTCTAGA TGCCTGGTTC961 AGTACGATAA GCCTTATAAT CCGGGCTATC AAGTTGCGTA TGGCATTCTG GCAGAAGTGG1021 AGGAACACCC TTANGATTTG AATAAGATGG TTTTCATGGA TTGGCGAGAC TCTCACCTAA1081 ACAGTAACTT GGAGCTAAAG GAGAGAAATA AAAGAATCCC GACCTTTCTT TATGCCATGC1141 CATTTTCCTC GCAGAGGATA TTCCTTGAAG AAACCTCGCT AGTGGCTCGT CCCGGCTTAG1201 ATATGAAGGA TATTCAGGAA AGAATGGTGG CTCGTTTAAG GCACTTAGGT ATCAACGTCA1261 AGAGCATTGA AGAAGACGAG CGTTGTGTTA TCCCAATGGG AGGTCCCCTA CCCGTGATAC1321 CCCAACGAGT TGTTGGAATT GGCGGTACTG CAGGTATGGT TCATCCCTCG ACCGGATATA1381 TGGTGGCGAG GACTCTGGCT GCAGCTCCGG TTGTTGCCAA CGCAATCATT CAGTACCTAG1441 GTTCCGAGAG AAGTCTTCTG GGCAACGAAT TATCAGCATC TGTTTGGAAA GACCTGTGGC1501 CAATAGAGAG GAGGCGGCAA AGGGAATTCT TTTGTTTTGG TATGGATATT CTACTGAAGC1561 TCGATTTGCC AGCCACAAGA AGATTTTTTG ATGCGTTTTT TGATCTAGAA CCCCGTTATT1621 GGCATGGATT TCTATCATCC CGGCTGTTTC TTCGTGAGCT CATATTTTTT GGTCTCTCGC1681 TTTTCTCTCA TGCCAGTAAT ACTTCTAGGT TAGAGATAAT GACCAAGGGC ACTTTGCCTC1741 TGGTAAACAT GATCAACAAT TTGTTACAGG ATATAGATTA AGTAATTTTG ATTTGCACTT1801 TGGTTGGAAA TTATGTATGT AGCAATTCCT ATGTCCCAAA AAAAAAA
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼甘薯番茄紅素β－環(huán)化酶的cDNA核苷酸序列，從紅心甘薯塊根分離克隆而得，其全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為1,847bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?,728bp，詳細(xì)序列如表1。甘薯番茄紅素β－環(huán)化酶催化番茄紅素環(huán)化形成β－胡蘿卜素，是甘薯β－胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，因此該cDNA序列有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/61GK1757733SQ200510080848
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者陳選陽(yáng), 鄭金貴, 許明, 劉峰, 黃志偉 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)