專利名稱：石榴籽提取物及其制備方法以及在制備藥品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物的提取物，特別涉及一種天然植物種子提取物及其制備方法以及在制備藥品或保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石榴(Punica granatuml)屬石榴科，自古為藥食兩用植物，其果皮、花瓣、葉片均可入藥。石榴皮在我國(guó)歷版藥典中均有收載，現(xiàn)有藥理研究顯示其具有防治性病傳播、抗菌、抗病毒、抗癌等獨(dú)特的活性；石榴花中的熊果酸和谷甾醇被用作收斂劑和止血?jiǎng)?，石榴花提取物可明顯降低大鼠血糖；石榴葉提取物，可顯著提高大鼠的腦微循環(huán)血流量。據(jù)報(bào)道，石榴籽出仁率為29.9％，石榴種仁含油率高達(dá)50.9％，并具有很高的食療價(jià)值；然而對(duì)石榴籽油的藥用性能、其制備方法尚未見報(bào)導(dǎo)。石榴深加工后棄之的石榴籽得不到合理利用，造成了資源的浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種石榴籽油的提取物及其在制備藥品或保健食品中的應(yīng)用，目的是合理利用資源，得到具有保健和多種藥用價(jià)值的石榴籽油；同時(shí)提供石榴籽油的提取分離方法，以提高天然植物石榴籽的提取分離效益。
本發(fā)明的一種石榴籽提取物，以石榴籽為原料經(jīng)提取分離制備所得，含有重量比為65～95％的石榴酸，1～10％的亞油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕櫚酸，1～10％的油酸。
所述的石榴籽提取物，其特征是其含有重量比85～95％的石榴酸，1～5％的亞油酸，1～3％的硬脂酸，2～3％的棕櫚酸，1～4％的油酸，成為石榴籽精油。
所述的石榴籽提取物制備方法，其步驟依次為石榴籽洗凈干燥、破碎、提取分離，得到石榴籽提取物；提取分離采用有機(jī)溶劑浸提法、微波有機(jī)溶劑提取法、超聲有機(jī)溶劑提取法或者超臨界萃取法中的一種。
所述的石榴籽提取物制備方法，其特征是(1)采用微波有機(jī)溶劑提取法時(shí)，將粉碎后的石榴籽粉加入有機(jī)溶劑，放入微波爐，微波爐功率160～600w，處理次數(shù)3～8次，每次30～80s；過濾，收集提取液，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油；；(2)采用超聲有機(jī)溶劑提取法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉用有機(jī)溶劑浸泡0～6小時(shí)，置于超聲萃取瓶中，超聲頻率20～800kHz，超聲強(qiáng)度0.3～15W/cm2，石榴籽粉與溶劑的重量體積比為1∶2～20，提取溫度20～80℃，萃取0.5～3小時(shí)，超聲提取后的提取液經(jīng)過離心或抽濾后，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油；(3)采用超臨界萃取法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉加入到超臨界萃取室，抽提壓力為10～30Mpa，萃取溫度為32～45℃，萃取時(shí)間1～6小時(shí)，CO2流量10～40L/h；所得淺黃色油狀液體即為石榴籽油；(4)采用有機(jī)溶劑浸提法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉用有機(jī)溶劑浸泡，加熱使溶劑微沸，回流1～3小時(shí)，過濾，濾渣再加溶劑重復(fù)提取一次，過濾，合并濾液，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油；所述的石榴籽提取物制備方法，所用有機(jī)溶劑可以為正丁烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、正戊烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的一種或兩種的混合溶劑，固液比為1∶2～1∶7；含石榴籽油的提取液采用真空濃縮回收有機(jī)溶劑時(shí)，其真空度為-0.02～-0.08Mpa，溫度為30～85℃。
所述的石榴籽提取物制備方法，得到石榴籽油提取物后，可以將其與等量的無水乙醇混合，在-10℃～-80℃的低溫下靜置5～15小時(shí)后，抽濾，濾液真空減壓回收乙醇，得石榴籽精油。
所述的石榴籽提取物可以應(yīng)用在制備體內(nèi)外抗氧化的藥品或保健食品中。
所述的石榴籽提取物可以應(yīng)用在制備抗高脂血癥的藥品或保健食品中。
所述的石榴籽提取物可以應(yīng)用在制備抑制腫瘤的藥品或保健食品中。
申請(qǐng)人采用本發(fā)明實(shí)施例2提取的石榴籽油進(jìn)行了體外抗氧化實(shí)驗(yàn)；利用實(shí)施例5提取的石榴籽油進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)、抗高脂血癥、動(dòng)脈硬化實(shí)驗(yàn)；取實(shí)施例6所得的石榴籽精油進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)效果如下1.體外抗氧化實(shí)驗(yàn)測(cè)定體外抗氧化作用時(shí)，于豬油、色拉油中分別加入0.1％～2％石榴籽油，置于50～90℃恒溫條件下，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定其過氧化值(POV)。
具體實(shí)驗(yàn)方法按0.5％的加入量在50g豬油和色拉油中分別加入0.25g石榴籽油、維生素E，充分搖勻，對(duì)照組不加抗氧化劑，置于60±1℃恒溫箱中，每隔12小時(shí)取樣分析測(cè)定比較其過氧化值(POV)，144小時(shí)后測(cè)定抗氧化效率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗豬油氧化效果比較0.5％石榴籽油為38.48％，0.5％維生素E為34.14％；抗色拉油氧化效果比較0.5％石榴籽油為35.23％，0.5％維生素E為29.30％?？梢姡?.5％石榴籽油的體外抗氧化效果較0.5％維生素E好。
試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)石榴籽油在替代維生素E方面有良好的市場(chǎng)潛力。
2急性毒性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠，體重20±2克，雌雄各半，其40只；實(shí)驗(yàn)方法取本發(fā)明石榴籽油，濃度為100％，按0.2ml/10g體重灌胃，每6小時(shí)一次，24小時(shí)內(nèi)灌胃給藥總量為1ml/10g。灌胃后連續(xù)觀察2周。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果灌胃當(dāng)天小鼠除食量下降外，無異常。第二天食量即恢復(fù)正常，2周內(nèi)無一只小鼠死亡。
試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)按中藥新藥臨床前毒理實(shí)驗(yàn)方法的毒理評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明屬實(shí)際無毒級(jí)。
3.抗高脂血癥與脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料健康雌性Wistar大鼠50只，體重180～200g；基礎(chǔ)飼料Wistar純鼠料；高脂飼料83％基礎(chǔ)飼料，10％蛋黃粉，5％豬油，1％膽固醇，0.5％膽酸鈉，0.2％丙基硫氧嘧啶；以上均由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。
3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模50只大鼠按體重均衡隨機(jī)分為5組，每組10只空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、辛伐他汀組、石榴籽油高、低劑量組?？瞻讓?duì)照組飼基礎(chǔ)飼料；模型對(duì)照組及其余組飼高脂飼料。根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)試結(jié)果，石榴籽油大、小劑量分別為1g/kg和300mg/kg灌胃(將石榴籽油溶于0.5％CMC中)；辛伐他汀組每天按2mg/kg灌胃辛伐他??；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均按10ml/kg灌胃0.5％CMC。各組均飼普通飲水。
3.3觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)12周后，禁食12小時(shí)，按30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，摘眼球取血，不抗凝，頸椎脫臼處死大鼠。血樣3000r/min，離心15min，分離血清，取1ml，冰箱中4℃保存待測(cè)。在每只大鼠肝臟同一部位取1g肝臟，放入液氮中速凍，之后放入-60℃冰箱中保存，用時(shí)取出制成10％的肝勻漿。采用全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肝勻漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)；按試劑盒測(cè)定血清與肝勻漿丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。
比較各組HDL-C/TC，動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C。
3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1可知，12周后，血清TC、TG、LDL-C三項(xiàng)指標(biāo)，高脂模型組均顯著高于空白對(duì)照組(p＜0.01)；表明所造的高脂模型成功。與高脂模型組相比石榴籽油大劑量組使血清LDL-C指標(biāo)下降，有顯著性差異(p＜0.05)，其它幾項(xiàng)無顯著性差異(p＞0.05)；石榴籽油小劑量組使血清TC、TG、LDL-C三項(xiàng)指標(biāo)均下降，有極顯著性差異(p＜0.01)；辛伐他汀組的TC、TG、LDL-C三項(xiàng)指標(biāo)均下降，有極顯著性差異(p＜0.01)。
表1 各組大鼠血脂含量的比較(mmol/L)

注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；與高脂模型組比較△P＜0.05；△△P＜0.01由表2可知，與空白對(duì)照組比較，高脂模型組HDL-C/TC下降，而AI升高，均有顯著性差異(P＜0.05)。與高脂模型組比較，石榴油大、小劑量組能使血清中HDL-C/TC升高(P＜0.01)，而AI下降(P＜0.05)。
表2 各組大鼠HDL-C/TC、AI的比較


注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；與高脂模型組比較△P＜0.05；△△P＜0.01由表3可知，高脂模型組肝臟TC、TG顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。與高脂模型組比較小劑量組、辛伐他汀組使TC下降(P＜0.05)；而小劑量組TG無顯著差異；大劑量組TC、TG均無顯著性差異。
表3 各組大鼠肝臟TC、TG的比較(mmol/L)

注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；與高脂模型組比較△P＜0.05；△△P＜0.01由表4可知，高脂模型組血清與肝臟MDA均高于空白對(duì)照組，而SOD活力均降低，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。與高脂模型組比較，石榴油大劑量組能使血清中SOD活力顯著增加(P＜0.05)，其它無顯著性差異；石榴油小劑量組與辛伐他汀組均能降低血清與肝臟中MDA的含量(P＜0.05，P＜0.01)，顯著升高血清SOD活力(P＜0.01)。石榴油小劑量組與辛伐他汀組比較無顯著性差異。
表4 各組大鼠血清與肝臟MDA、SOD的比較

注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；與高脂模型組比較△P＜0.05；△△P＜0.014.預(yù)防腫瘤試驗(yàn)4.1MTT試驗(yàn)選用EMT6乳腺癌細(xì)胞株，于10％胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化處理后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·ml-1，按每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板，24h后吸棄上清，加入不同濃度藥物培養(yǎng)液，作用24h。另配制2.5g·L-1的噻唑藍(lán)，用完全培養(yǎng)液調(diào)整噻唑藍(lán)濃度，按每孔100μl、試藥終濃度為0.1、，0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg·L-1，加入上述培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，再加入150μl二甲基甲砜，作用3min后，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定490nm時(shí)的吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率[公式細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100％]。結(jié)果表明石榴籽油對(duì)體外培養(yǎng)的EMT6細(xì)胞株有一定的殺滅作用。
4.2體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)分別取傳代6～7d的EMT6帶瘤小鼠，無菌抽取腹水，0.05％臺(tái)盼蘭染色鏡檢細(xì)胞活力在95％以上。以滅菌生理鹽水分別稀釋瘤液至6×107個(gè)·ml-1的細(xì)胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2ml，隨機(jī)分組并開始灌胃(ig)給藥(5-Fu為腹腔注射ip)，實(shí)驗(yàn)分組陽性對(duì)照組(5-Fu)、石榴籽油20、40、80mg·kg-1劑量治療組及NS對(duì)照組。觀察指標(biāo)稱量給藥(12d)前后體重、瘤重。試驗(yàn)結(jié)果表明石榴籽油給藥12d，對(duì)EMT6瘤株的在小鼠體內(nèi)的增殖有抑瘤作用，瘤重均低于生理鹽水組。
4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)本發(fā)明的石榴籽油，安全無毒副作用，可加工制備作為抗氧化(體內(nèi)、體外)、防衰老、抗高血脂癥、動(dòng)脈硬化的保健食品和藥品。此外，還有防治乳腺癌的作用。
所述石榴籽油還可繼續(xù)加工成膠囊、片劑、丸劑等藥品及保健品，并具有抗體內(nèi)外氧化，抗高脂血癥，抗動(dòng)脈硬化以及預(yù)防腫瘤等方面的保健和醫(yī)藥作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1100g石榴籽洗凈通風(fēng)干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圓底燒瓶中，加入120ml石油醚，將燒瓶放人微波爐中，功率320w，間歇處理210s(輻射3次，每次70s)，取出用抽濾瓶過濾。濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收真空度-0.02Mpa，溫度30℃?；厥帐兔巡⒌玫绞褡延?1g，氣相色譜檢測(cè)石榴酸66.6％；10.0％的亞油酸，9.5％的硬脂酸，4.7％的棕櫚酸，9.2％的油酸。
實(shí)施例2100g石榴籽洗凈通風(fēng)干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圓底燒瓶中，加入300ml正己烷，將燒瓶放人微波爐中，調(diào)功率160w，間歇輻射250s(輻射5次，每次50s)，取出用抽濾瓶過濾。濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收真空度-0.05Mpa，溫度45℃。石油醚回收并得到石榴籽油12.5g。氣相色譜檢測(cè)石榴酸71％；10％的亞油酸，7.5％的硬脂酸，4.5％的棕櫚酸，7.0％的油酸。
實(shí)施例3
100g石榴籽洗凈通風(fēng)干燥，粉碎，石榴籽粉放入500ml圓底燒瓶中，加入420ml乙醚將燒瓶放人微波爐中，調(diào)功率600w，間歇輻射90s(輻射8次，每次30s)，取出用抽濾瓶過濾。濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收真空度-0.08Mpa，溫度40℃。石油醚回收并得到石榴籽油11.6g。氣相色譜檢測(cè)石榴酸65.5％；9.7％的亞油酸，10.0％的硬脂酸，5.0％的棕櫚酸，9.8％的油酸。
實(shí)施例4取100克石榴籽粉置于超聲瓶中，加入0.6L正己烷浸泡2小時(shí)，超聲提取的頻率為20kHz，超聲強(qiáng)度2W/cm2，提取溫度40℃，萃取1小時(shí)。抽濾，濾液減壓濃縮得淡黃色的石榴籽油12.4g。氣相色譜檢測(cè)石榴酸74.4％；8.3％的亞油酸，7.5％的硬脂酸，3.5％的棕櫚酸，6.3％的油酸。
實(shí)施例5取100克石榴籽粉進(jìn)行CO2超臨界萃取，萃取溫度40℃，萃取壓力為28Mpa，萃取時(shí)間2h，CO2流量10L/h，分離釜I壓力9Mpa，溫度50℃，分離釜II壓力6Mpa，溫度50℃，得淡黃色的石榴籽油12.6g。氣相色譜檢測(cè)石榴酸75.8％；9.2％的亞油酸，6.3％的硬脂酸，3.2％的棕櫚酸，5.5％的油酸。
實(shí)施例6取實(shí)施例四所得的石榴油10克，加入無水乙醇10ml，充分混勻，-15℃凈置8小時(shí)，抽濾脫蠟，濾液減壓回收乙醇，得石榴籽精油8.5克。氣相色譜檢測(cè)石榴酸95.0％；1.0％的亞油酸，1.0％的硬脂酸，2.0％的棕櫚酸，1.0％的油酸。
權(quán)利要求
1.一種石榴籽提取物，以石榴籽為原料經(jīng)提取分離制備所得，含有重量比為65～95％的石榴酸，1～10％的亞油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕櫚酸，1～10％的油酸。
2.如權(quán)利要求1所述的石榴籽提取物，其特征是其含有重量比85～95％的石榴酸，1～5％的亞油酸，1～3％的硬脂酸，2～3％的棕櫚酸，1～4％的油酸，成為石榴籽精油。
3.權(quán)利要求1所述的石榴籽提取物制備方法，其步驟依次為石榴籽洗凈干燥、破碎、提取分離，得到石榴籽提取物；提取分離采用有機(jī)溶劑浸提法、微波有機(jī)溶劑提取法、超聲有機(jī)溶劑提取法或者超臨界萃取法中的一種。
4.如權(quán)利要求3所述的石榴籽提取物制備方法，其特征是(1)采用微波有機(jī)溶劑提取法時(shí)，將粉碎后的石榴籽粉加入有機(jī)溶劑，放入微波爐，微波爐功率160～600w，處理次數(shù)3～8次，每次30～80s；過濾，收集提取液，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油；；(2)采用超聲有機(jī)溶劑提取法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉用有機(jī)溶劑浸泡0～6小時(shí)，置于超聲萃取瓶中，超聲頻率20～800kHz，超聲強(qiáng)度0.3～15W/cm2，石榴籽粉與溶劑的重量體積比為1∶2～20，提取溫度20～80℃，萃取0.5～3小時(shí)，超聲提取后的提取液經(jīng)過離心或抽濾后，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油；(3)采用超臨界萃取法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉加入到超臨界萃取室，抽提壓力為10～30Mpa，萃取溫度為32～45℃，萃取時(shí)間1～6小時(shí)，CO2流量10～40L/h；所得淺黃色油狀液體即為石榴籽油；(4)采用有機(jī)溶劑浸提法時(shí)，粉碎后的石榴籽粉用有機(jī)溶劑浸泡，加熱使溶劑微沸，回流1～3小時(shí)，過濾，濾渣再加溶劑重復(fù)提取一次，過濾，合并濾液，真空蒸發(fā)回收有機(jī)溶劑，得石榴籽油。
5.如權(quán)利要求4所述的石榴籽提取物制備方法，其特征在于所用有機(jī)溶劑為正丁烷、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、正戊烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮中的一種或兩種的混合溶劑，固液比為1∶2～1∶7；含石榴籽油的提取液采用真空濃縮回收有機(jī)溶劑時(shí)，其真空度為-0.02～-0.08Mpa，溫度為30～85℃。
6.如權(quán)利要求5所述的石榴籽提取物制備方法，其特征在于得到石榴籽油提取物后，將其與等量的無水乙醇混合，在-10℃～-80℃的低溫下靜置5～15小時(shí)后，抽濾，濾液真空減壓回收乙醇，得石榴籽精油。
7.權(quán)利要求1或2所述的石榴籽提取物在制備體內(nèi)外抗氧化的藥品或保健食品中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的石榴籽提取物在制備抗高脂血癥的藥品或保健食品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的石榴籽提取物在制備抑制腫瘤的藥品或保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
石榴籽提取物及其制備方法以及在制備藥品中的應(yīng)用，屬于天然植物的提取物，目的是得到具有保健和多種藥用價(jià)值的石榴籽油；同時(shí)提供其提取分離方法，以提高提取分離效益。本發(fā)明石榴籽提取物，以石榴籽為原料經(jīng)提取分離制備所得，含有重量比為65～95％的石榴酸，1～10％的亞油酸，1～10％的硬脂酸，2～5％的棕櫚酸，1～10％的油酸。石榴籽提取物制備方法，步驟依次為石榴籽洗凈干燥、破碎、采用有機(jī)溶劑浸提法、微波有機(jī)溶劑提取法、超聲有機(jī)溶劑提取法或者超臨界萃取法中的一種提取分離。所述石榴籽提取物應(yīng)用于制備體內(nèi)外抗氧化、防治高血脂癥和抑制腫瘤的藥品或保健食品，可進(jìn)一步加工成軟膠囊、微囊粉劑或乳劑。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1785218SQ200510019859
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日
發(fā)明者敖明章, 余龍江, 李文敏 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)