專利名稱：Pcr阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法及其所用的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測基因突變的方法，特別是PCR(聚合酶鏈DNA擴(kuò)增)阻斷聯(lián)合熒光探針顯示檢測基因突變的方法及其所使用的引物。
背景技術(shù)：
人體癌腫和遺傳性疾病發(fā)生重要原因之一是其遺傳基因發(fā)生突變，而微生物病原對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，重要原因之一也是其遺傳基因發(fā)生突變。因此，檢測微生物病原耐藥基因，可針對(duì)微生物病原對(duì)某種藥物是否耐藥，制定合理用藥方案、指導(dǎo)臨床治療，除對(duì)耐藥基因發(fā)生發(fā)展的控制律的研究提供條件，可杜絕抗生素及合成治療藥物的濫用；檢測遺傳基因突變、人體癌基因突變，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和確診癌腫和遺傳性疾病有重要作用，成為早期發(fā)現(xiàn)和確診癌腫和遺傳性疾病依據(jù)之一。
目前檢測基因突變的方法包括核苷酸序列測定、核苷酸序列雜交、PCR單鏈構(gòu)象法(SSCP)等。核苷酸序列測定所需設(shè)備投資大、檢測成本高，無法推廣。核苷酸序列雜交、PCR單鏈構(gòu)象法不穩(wěn)定、操作繁瑣、在臨床上推廣應(yīng)用價(jià)值不大。
為解決上述檢測基因突變的方法的問題，人們發(fā)明了一種PCR阻滯聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法，如中國《實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志》(2003年第19卷第5期467頁)發(fā)表的文章——“等位基因特異性PCR檢測HBV G1896A變異的缺陷和改進(jìn)”公開的方法。該方法包括根據(jù)目標(biāo)基因制備一種PCR DNA擴(kuò)增引物的步驟、PCR阻滯的步驟、聯(lián)合熒光探針顯示的步驟。該方法的工作原理為在PCR DNA擴(kuò)增引物序列3′端倒數(shù)第2位核苷酸鹼基設(shè)計(jì)并合成原序列錯(cuò)配鹼基，PCR(聚合酶鏈DNA擴(kuò)增)主要依靠3′端倒數(shù)第1-2位核苷酸鹼基配對(duì)進(jìn)行，由于錯(cuò)配鹼基不能配對(duì)，而造成PCR DNA擴(kuò)增阻滯，當(dāng)遇到野生型(不含耐藥基因突變點(diǎn))核苷酸序列時(shí)PCR受到阻滯，使熒光探針中熒光報(bào)告基團(tuán)解離減弱，熒光發(fā)射減弱。而當(dāng)遇到突變型核苷酸序列時(shí)便能擴(kuò)增，PCR未受阻滯，擴(kuò)增結(jié)果使熒光探針報(bào)告基團(tuán)酶解分離而發(fā)熒光。
上述PCR阻滯聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法只能達(dá)到阻滯的效果，而不能達(dá)到阻斷的效果，因此須將PCR的退火溫度提高至68℃，致使PCR擴(kuò)增受到阻斷，但由于68℃是PCR擴(kuò)增為最不適宜的退火溫度，對(duì)于檢測基因突變不具有普遍意義，而且敏感性大為降低，所以沒有在臨床上檢測標(biāo)本的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法及其所用的引物，該方法成本低、敏感性高、穩(wěn)定性好、操作簡單。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法，它包括(1)根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟、(2)在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟、(3)熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟；聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的序列3′端倒數(shù)第2、3位或第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基。
上述方案中，PCR反應(yīng)液中還包括鎂離子、蘇糖醇；其中，鎂離子的濃度在3.5-6.5mM/L之間，蘇糖醇的濃度在1-5mM/L之間。
PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法所用的引物，它的序列3′端倒數(shù)第2、3位或倒數(shù)第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、由于PCR主要依靠3′端倒數(shù)第2-4位核苷酸鹼基與靶基因核苷酸鹼基配對(duì)進(jìn)行，而本發(fā)明引物以及本發(fā)明方法所使用的引物，它的序列3′端倒數(shù)第2、3位或倒數(shù)第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基，錯(cuò)配鹼基使目標(biāo)基因3′端不能配對(duì)，而造成PCR DNA擴(kuò)增阻斷，聚合酶鏈DNA擴(kuò)增不能進(jìn)行，達(dá)到PCR阻斷要求，不能使熒光探針中熒光報(bào)告基團(tuán)解離，檢測結(jié)果非常準(zhǔn)確。
2、本發(fā)明方法中，增加了PCR反應(yīng)液鎂離子的濃度，并加入了DDT(蘇糖醇)，能協(xié)助完成PCR DNA擴(kuò)增阻斷功能，能完全阻斷非耐藥基因的PCR DNA擴(kuò)增，因此結(jié)果非常準(zhǔn)確。
3、根據(jù)基因密碼的改變，可測定基因核苷酸序列突變位點(diǎn)和核苷酸鹼基改變狀況。
4、本發(fā)明方法和引物可用于制備PCR熒光探針基因突變檢測試劑盒。應(yīng)用DNA引物，再和dNTP、TagDNA聚合酶、PCR緩和液配制PCR熒光探針檢測基因突變?cè)噭┖校M(jìn)行耐藥基因檢測。
5、根據(jù)PCR阻斷狀況，熒光強(qiáng)度測定，可相對(duì)測定耐藥基因突變程度和其它狀況，測定結(jié)果顯示PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測的陽性和陰性。
本發(fā)明方法和引物，對(duì)于基因突變檢測的準(zhǔn)確性很高，可在極大程度上克服現(xiàn)常規(guī)方法(核苷酸序列測定、核苷酸序列雜交、PCR單鏈構(gòu)象法等)操作較繁瑣、耗時(shí)、準(zhǔn)確性較低的缺點(diǎn)，體現(xiàn)了技術(shù)先進(jìn)性、準(zhǔn)確性，具有廣泛的實(shí)用性，能在臨床上推廣。另外由于本發(fā)明方法在PCR擴(kuò)增最有利的條件下進(jìn)行，克服了現(xiàn)有的PCR阻滯聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法敏感性大為降低的缺點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法實(shí)施例1，該方法為用PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法檢測血清標(biāo)本，看被測血清標(biāo)本是否發(fā)生乙肝病毒G1896A基因突變。
乙肝病毒毒株的基因前C區(qū)1896位點(diǎn)的G-A基因變異，使干襻結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，造成對(duì)干擾素應(yīng)答不敏感。它的基因變異與HBeAg陰性HBV感染流行率與地區(qū)優(yōu)勢基因型相關(guān)。
對(duì)乙肝病毒毒株前C區(qū)1896位點(diǎn)的G-A基因變異檢測，對(duì)合理使用干擾素治療乙肝有重要作用。
本發(fā)明方法實(shí)施例1乙肝病毒(HBV)1896基因突變PCR熒光檢測的步驟依次為1、根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟；2、在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟；3、熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟。
其具體步驟如下1、根據(jù)目標(biāo)基因確定并制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟根據(jù)乙肝病毒(HBV)G1896A變異設(shè)計(jì)、確定并合成PCR擴(kuò)增DNA引物。
相關(guān)乙肝病毒基因野生型未突變核苷酸序列為5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCT TT G-3′；相關(guān)乙肝病毒基因突變型含突變核苷酸序列為5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCT TT A -3′；確定的相關(guān)乙肝病毒基因突變型檢測突變核苷酸引物序列設(shè)計(jì)為5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCA AA A-3′；本發(fā)明方法實(shí)施例1中所使用的引物，它的序列3′端倒數(shù)第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基，即核苷酸引物序列3′端倒數(shù)第2、3、4位核苷酸鹼基應(yīng)為原序列錯(cuò)配鹼基，由TTT換為AAA。
2、在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟(1)采用DNA提取試劑提取被測血清標(biāo)本DNAa、采取被測人的新鮮血液，分離血清成為待測標(biāo)本血清，在-18℃下存放(可保存7-10天)。
b、將待測標(biāo)本血清40μl加入DNA提取液40μl混勻，在100℃下放置10分鐘。12000rpm離心10分鐘，取血清上清液備用。
(2)PCR反應(yīng)準(zhǔn)備a、取具有上述引物PCR反應(yīng)液、PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、DNA提取液、稀釋液、陰性對(duì)照品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品、礦物油備用。
PCR反應(yīng)液、PCR緩沖液包括鎂離子、蘇糖醇；其中，鎂離子的濃度在3.5-6.5mM/L之間，蘇糖醇的濃度在1-5mM/L之間。
b、陽性標(biāo)準(zhǔn)品變性取強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品各5μl分別加入稀釋液45μl混勻，在100℃下放置10分鐘變性備用。
(3)取出PCR反應(yīng)液、PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶分別在5000rpm下離心數(shù)秒。取5支0.2ml離心管，各離心管中分別加入PCR反應(yīng)液6μl、PCR緩沖液20μl、TaqDNA聚合酶2μl，充分混勻，5000rpm下離心數(shù)秒，備用。
(4)取待測標(biāo)本血清上清液、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品變性液、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品變性液、陰性對(duì)照品變性液各2μl，分別加入已分裝的PCR反應(yīng)管離心管中；空白對(duì)照加dH2O 2μl到已分裝的PCR反應(yīng)管離心管中。各離心管在5000rpm下離心數(shù)秒后，分別加入礦物油20μl。
3、熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟(1)分別將5支離心管置于在PCR熒光檢測儀設(shè)備上，調(diào)控?zé)晒饧ぐl(fā)波長487nm，檢測波長525nm。上機(jī)擴(kuò)增，預(yù)變性94℃，2分鐘，然后93℃，50秒→55℃，120秒，以強(qiáng)陽標(biāo)準(zhǔn)品A1、弱陽標(biāo)準(zhǔn)品A2的基因拷貝數(shù)/ml分別5×108、5×104制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定標(biāo)本基因拷貝數(shù)/ml。
(2)以空白對(duì)照調(diào)0，擴(kuò)增完畢立即測定各管擴(kuò)增后熒光度。
檢測結(jié)果與判斷1、強(qiáng)陽標(biāo)準(zhǔn)品A1、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品A2的基因拷貝數(shù)/ml分別5×108、5×104。
2、測定各離心管擴(kuò)增后熒光度，強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品、臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、待測標(biāo)本熒光度各為A1、A2、N、AX。
3、測量監(jiān)控?zé)晒舛華1＞A2＞N，本次試驗(yàn)有效。
4、待測標(biāo)本AX＞陰性對(duì)照N×1.5值時(shí)，判定為陽性。
5、待測標(biāo)本AX≤陰性對(duì)照N判定為陰性。
6、待測標(biāo)本AX≤陰性對(duì)照N×1.5值，又＞陰性對(duì)照N，可用待測標(biāo)本液，重復(fù)檢測1次，如待測標(biāo)本值仍在此間，判定為陰性。
7、待測標(biāo)本如為陽性，可計(jì)算基因拷貝數(shù)/ml。
基因拷貝數(shù)/ml計(jì)算將PCR熒光檢測儀與電腦聯(lián)機(jī)，輸入擴(kuò)增后的熒光度，擴(kuò)增前的熒光度以0計(jì)，測定基因拷貝數(shù)/ml。
判斷無乙肝病毒血清標(biāo)本和基因野生型血清標(biāo)本檢測為陰性。乙肝病毒(HBV)G1896A變異血清標(biāo)本為陽性。
本發(fā)明方法實(shí)施例2，該方法為用PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法檢測血清標(biāo)本，看被測血清標(biāo)本Kras癌基因12密碼子是否發(fā)生胰腺癌基因突變。
胰腺癌基因突變方式以Kras癌基因12密碼子基因突變GGT→GTT為主。K-ras基因產(chǎn)物為三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白，稱ras蛋白。它參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期演進(jìn)等多種細(xì)胞功能的信號(hào)傳遞。正常情況下，體內(nèi)GTP酶活化蛋白可解離ras蛋白與GTP的結(jié)合。當(dāng)K-ras基因突變，降低了ras蛋白對(duì)GTP酶活化蛋白的敏感性，使ras蛋白持續(xù)與GTP結(jié)合，導(dǎo)致持續(xù)向細(xì)胞核傳遞生長信號(hào)。K-ras基因突變是發(fā)生于胰腺癌中最常見的基因事件。胰腺癌K-ras基因產(chǎn)物為三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白，稱ras蛋白。它參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期演進(jìn)等多種細(xì)胞功能的信號(hào)傳遞。正常情況下，體內(nèi)GTP酶活化蛋白可解離ras蛋白與GTP的結(jié)合。當(dāng)K-ras基因突變，降低了ras蛋白對(duì)GTP酶活化蛋白的敏感性，使ras蛋白持續(xù)與GTP結(jié)合，導(dǎo)致持續(xù)向細(xì)胞核傳遞生長信號(hào)。K-ras基因突變是發(fā)生于胰腺癌中最常見的基因事件。K-ras腫瘤基因基因的突變與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有非常重要的作用。
本發(fā)明方法實(shí)施例2的步驟依次為1、根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟；2、在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟；3、熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟。
其具體步驟如下1、根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟相關(guān)Kras癌基因野生型未突變核苷酸序列為5′-cttgt ggTag ttgga gctg g t-3′相關(guān)Kras癌基因突變型含突變核苷酸序列為5′-Cttgt ggTag ttgga gctg t t-3′相關(guān)Kras癌基因基因突變型檢測突變核苷酸引物序列設(shè)計(jì)為5′-Cttgt ggTag ttgga gcaa t-3′本發(fā)明方法實(shí)施例2中所使用的引物，它的序列3′端倒數(shù)第2、3位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基，即核苷酸引物序列3′端倒數(shù)第2-3位核苷酸鹼基應(yīng)為原序列錯(cuò)配鹼基，由tg換為aa。
2、在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟，該步驟中只有標(biāo)本DNA提取與本發(fā)明實(shí)施例1不同，其它步驟均相同。
標(biāo)本DNA提取將待測標(biāo)本全血加抗凝劑，混勻，5000rpm離心10分鐘，取沉淀細(xì)胞加入DNA提取液50μl混勻，100℃10分鐘，12000rpm離心10分鐘，取血清上清液備用。
3、熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟；同本發(fā)明實(shí)施例1。
檢測結(jié)果與判斷同本發(fā)明實(shí)施例1。
判斷無胰腺癌外周血標(biāo)本檢測Kras癌基因12密碼子基因突變?yōu)殛幮?，胰腺癌?biāo)本檢測基因突變?yōu)殛栃浴?br> 權(quán)利要求
1.PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法，它包括(1)根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟、(2)在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟、(3)熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟；其特征在于聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的序列3′端倒數(shù)第2、3位或第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于PCR反應(yīng)液中還包括鎂離子、蘇糖醇；其中，鎂離子的濃度在3.5-6.5mM/L之間，蘇糖醇的濃度在1-5mM/L之間。
3.PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法所用的引物，其特征在于它的序列3′端倒數(shù)第2、3位或倒數(shù)第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基。
全文摘要
本發(fā)明涉及PCR阻斷聯(lián)合熒光探針檢測基因突變的方法及其所用的引物，方法包括(1)根據(jù)目標(biāo)基因制備聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的步驟、(2)在具有上述引物的PCR反應(yīng)液進(jìn)行聚合酶鏈DNA擴(kuò)增阻斷的步驟、(3)熒光探針核酸雜交及熒光報(bào)告基團(tuán)被酶解離、PCR熒光檢測的步驟。本發(fā)明聚合酶鏈DNA擴(kuò)增引物的序列3′端倒數(shù)第2、3位或第2、3、4位核苷酸鹼基為原序列錯(cuò)配鹼基。本發(fā)明方法以及本發(fā)明方法所使用的引物，能達(dá)到阻斷PCR DNA擴(kuò)增要求，不能使熒光探針中熒光報(bào)告基團(tuán)解離，檢測結(jié)果非常準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1769489SQ200510019639
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李亦武, 糜克永 申請(qǐng)人:湖北迪亞生物工程有限責(zé)任公司