專利名稱：具有β－葡糖苷酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸的制作方法
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背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明還涉及含有所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞以及生產和使用所述多肽的方法。
相關領域的描述纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4-連接鍵共價鍵合的聚合物。許多微生物產生水解β-連接葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其易受纖維二糖水解酶的攻擊。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-連接二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。
將纖維素原料轉變成乙醇具有如下優(yōu)點，即易于獲得大量原料、避免燃燒或填埋物質、以及乙醇燃料的清潔性。現(xiàn)在認為木材、農業(yè)殘余物、草本作物、和城市固體廢物是生產乙醇的原料。這些物質主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉變成葡萄糖，就容易通過酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。由于容易通過各種酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇，而纖維二糖則不能，因此在水解結束時殘余的任何纖維二糖都代表著乙醇產量的損失。更重要的是，纖維二糖是內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的有效抑制劑。纖維二糖在水解過程中的累積極度不利于乙醇生產。
纖維二糖的累積在酶促水解中已經成為一個主要問題，因為產生纖維素酶的微生物幾乎不產生β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶的量少導致將纖維二糖水解成葡萄糖的能力不足。已有幾種方法用于在將纖維素轉變成葡萄糖時增加β-葡糖苷酶的量。
一種方案是使用幾乎不產生纖維素酶的微生物產生β-葡糖苷酶，且向內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶中外源性的添加β-葡糖苷酶，從而增強水解。然而對于將生物量(biomass)轉變成乙醇的商業(yè)生產而言，所需數(shù)量太昂貴了。
第二種方案是在進行纖維素水解的同時通過酵母進行葡萄糖發(fā)酵。這個過程稱為同步糖化和發(fā)酵(SSF)。在SSF系統(tǒng)中，葡萄糖發(fā)酵從溶液中除去了葡萄糖。然而SSF系統(tǒng)在商業(yè)上尚不可行，因為對于所需要的50℃條件而言，28℃的酵母操作溫度太低了。
克服β-葡糖苷酶不足的第三種方案是在宿主中過度表達β-葡糖苷酶，從而增加β-葡糖苷酶的產量。
Ximenes等人，1996，Current Microbiology 32119-123；Hang和Woodams，1994，Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie 27587-589；以及Kitpreechavanich等人，Agricultural and Biological Chemistry 501703-1712公開了來自煙曲霉(Aspergilllus fumigatus)的β-葡糖苷酶。
在本領域非常有利的是，為了提高工藝效率而使用熱穩(wěn)定的β-葡糖苷酶將纖維素物質轉變成單糖、二糖、和多糖。
本發(fā)明的一個目的是提供具有β-葡糖苷酶活性的新型多肽和編碼所述多肽的核酸。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及選自下列的具有β-葡糖苷酶活性的分離多肽(a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸具有至少85％的同一性；(b)由如下核苷酸序列編碼的多肽，該核苷酸序列在至少高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交；和(c)在SEQ ID NO2第20至863位氨基酸含有一個或多個氨基酸的保守替代、刪除、和/或插入的變體。
本發(fā)明還涉及選自下列的編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分離多核苷酸(a)編碼具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，該氨基酸序列與SEQID NO2第20至863位氨基酸具有至少85％的同一性；(b)與SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸具有至少85％同一性的多核苷酸；和(c)在至少高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及含有多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體、和重組宿主細胞。
本發(fā)明還涉及生產這些具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，包括在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構建體的重組宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；并(b)回收所述多肽。
本發(fā)明還涉及含有具有β-葡糖苷酶活性的多肽的洗滌劑組合物。
本發(fā)明還涉及編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的植物。
本發(fā)明還涉及使用具有β-葡糖苷酶活性的多肽將纖維素物質轉變成單糖、二糖和多糖。
本發(fā)明還涉及包含編碼一種蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作連接由SEQ ID NO1第1至57位核苷酸組成的編碼信號肽的核苷酸序列，其中所述基因對于第一種和第二種核苷酸序列而言是外源的。
附圖簡述

圖1A和1B顯示了煙曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶的基因組DNA序列和推導氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。預測的信號肽標以下劃線，預測的內含子以斜體表示。
圖2顯示了pAlLo1的限制性圖譜。
圖3顯示了pBANe10的限制性圖譜。
圖4顯示了pAILo2的限制性圖譜。
圖5顯示了pEJG97的限制性圖譜。
圖6顯示了pMJ04的限制性圖譜。
圖7顯示了pMJ06的限制性圖譜。
圖8顯示了pMJ09的限制性圖譜。
圖9顯示了pEJG107的限制性圖譜。
圖10顯示了煙曲霉β-葡糖苷酶在50℃和65℃的熱穩(wěn)定性。
圖11顯示了煙曲霉β-葡糖苷酶在70℃的熱穩(wěn)定性。
圖12顯示了煙曲霉β-葡糖苷酶在65℃對纖維二糖的水解。
定義β-葡糖苷酶活性這里術語“β-葡糖苷酶”定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，它催化末端非還原的β-D-葡萄糖殘基水解而釋放β-D-葡萄糖。對本發(fā)明而言，可根據(jù)Venturi等人所描述的基本程序來測定β-葡糖苷酶活性(參見Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol.4255-66)，不同的只是使用不同于這里所描述的條件。一個單位的β-葡糖苷酶活性定義為在50℃、pH5下，在100mM檸檬酸鈉、0.01％吐溫(Tween)-20中每分鐘從4mM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃苷底物中產生1.0μmol對硝基酚。
GH3AA家族β-葡糖苷酶這里術語“GH3AA家族β-葡糖苷酶”定義為根據(jù)Coutinho，P.M.和Henrissat，B.，1999，Carbohydrate-active enzymesanintegrated database approach，在《Recent Advances in CarbohydrateBioengineering》中，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat、和B.Svensson編，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12中描述的家族3糖苷水解酶。
本發(fā)明的多肽具有由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸所示氨基酸序列組成的多肽的至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，且甚至最優(yōu)選至少100％的β-葡糖苷酶活性。
分離的多肽這里使用的術語“分離的多肽”指至少20％純，優(yōu)選至少40％純，更優(yōu)選至少60％純，還更優(yōu)選至少80％純，最優(yōu)選至少90％純，且甚至最優(yōu)選至少95％純的多肽，這是通過SDS-PAGE測定的。
基本上純的多肽這里術語“基本上純的多肽”指一種多肽制劑，其中包含至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、至多3％、甚至更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、且甚至最優(yōu)選至多0.5％重量的與該多肽制劑天然相關的其它多肽物質。因此，優(yōu)選的是基本上純的多肽是制劑中存在的全部多肽物質的重量的至少92％純的，優(yōu)選至少94％純的，更優(yōu)選至少95％純的，更優(yōu)選至少96％純的，更優(yōu)選至少96％的純的，更優(yōu)選至少97％純的，更優(yōu)選至少98％純的，甚至更優(yōu)選至少99％純的，最優(yōu)選至少99.5％純的，且甚至最優(yōu)選100％純的。
優(yōu)選的是本發(fā)明的多肽以基本上純的形式存在。特別是，優(yōu)選多肽是以“基本上純的形式”存在，即該多肽制劑基本上不含其它與之天然相關的多肽物質。例如，這可通過采用眾所周知的重組方法或采用經典的純化方法制備多肽來完成。
這里術語“實質上純的多肽”與術語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”含義相同。
同一性這里用參數(shù)“同一性”來描述兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的相關性。
對本發(fā)明來說，兩種氨基酸序列之間的同一性程度可通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重對比參數(shù)進行測定缺口(gap)罰分10和缺口長度罰分10。成對對比參數(shù)Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口(windows)＝5和對角線＝5。
對本發(fā)明來說，兩種核苷酸序列之間的同一性程度可通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the NationalAcademy of Science USA 80726-730)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重對比參數(shù)進行測定缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對對比參數(shù)Ktuple＝3，缺口罰分＝3，和窗口(windows)＝20。
多肽片段這里術語“多肽片段”定義為從SEQ ID NO2其同源序列的氨基和/或羧基末端或刪除一個或多個氨基酸的多肽，其中所述片段具有β-葡糖苷酶活性。優(yōu)選的是，一種片段含有至少770個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少800個氨基酸殘基，且最優(yōu)選至少830個氨基酸殘基。
子序列這里術語“子序列”定義為由SEQ ID NO1或其同源序列的5′和/或3′末端刪除一個或多個核苷酸的核苷酸序列，其中子序列編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽片段。優(yōu)選的是，子序列含有至少2310個核苷酸，更優(yōu)選至少2400個核苷酸，且最優(yōu)選至少2490個核苷酸。
等位變體這里術語“等位變體”指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或多種可變形式中的任一種。等位變異可由突變自然引起，并可引起種群內多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽沒有變化)或可編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
分離的多核苷酸這里使用的術語“分離的多核苷酸”指至少20％純的，優(yōu)選至少40％純的，更優(yōu)選至少60％純的，甚至更優(yōu)選至少80％純的，最優(yōu)選至少90％純的，且甚至最優(yōu)選至少95％純的多肽，這是通過瓊脂糖電泳測定的。
基本上純的多核苷酸這里使用的術語“基本上純的多核苷酸”指不含其它外來的或不需要的核苷酸的多核苷酸制劑，并且其存在的形式適于在基因工程蛋白質生產系統(tǒng)內進行使用。因此，基本上純的多核苷酸包含至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、更優(yōu)選至多3％、甚至更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、且甚至最優(yōu)選至多0.5％重量的其它與之天然相關的多核苷酸物質。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)，諸如啟動子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸是從重量上至少90％純的、優(yōu)選至少92％純的、更優(yōu)選至少94％純的、更優(yōu)選至少95％純的、更優(yōu)選至少96％純的、更優(yōu)選至少97％純的、甚至更優(yōu)選至少98％純的、最優(yōu)選至少99％純的、且甚至最優(yōu)選至少99.5％純的。優(yōu)選的是本發(fā)明的多核苷酸以實質上純的形式存在。特別是，優(yōu)選的是這里公開的多核苷酸以″基本上純的形式″存在，即多核苷酸制劑基本上不含其它與之天然相關的多核苷酸物質。這里術語“基本上純的多核苷酸”與術語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”含義相同。多核苷酸可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成、合成來源或其任意組合。
cDNA這里術語“cDNA”定義為DNA分子，它可通過逆轉錄由真核細胞獲得的成熟的、經過剪接的mRNA分子而制備。cDNA缺乏通常在相應基因組DNA中存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄本是mRNA的前體，它在成為成熟剪接的mRNA之前要經過一系列加工步驟。這些步驟包括通過稱為剪接的過程除去內含子序列。因此，由mRNA衍生的cDNA缺乏所有的內含子序列。
核酸構建體這里所使用的術語“核酸構建體”指單鏈或雙鏈的核酸分子，它是由天然存在的基因分離的，或是經過修飾而以非天然存在的方式含有核酸區(qū)段。當核酸構建體含有表達本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”含義相同。
控制序列這里術語“控制序列”定義為包括所有對表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需的或有利的組分。對編碼多肽的核苷酸序列來說，各個控制序列可以是天然的或外來的。這些控制序列包括，但不局限于，前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。為了引入特異限制性位點以便于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)連接，控制序列可以帶有接頭。
可操作連接這里術語“可操作連接”指這樣一種構造，其中控制序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，以使控制序列可指導多肽編碼序列的表達。
編碼序列這里所使用的術語“編碼序列”意指核苷酸序列，它直接規(guī)定了其蛋白質產物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放讀碼框確定，所述開放閱讀框通常起始于ATG起始密碼子或備選起始密碼子諸如GTG和TTG。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。
表達術語“表達”包括生產多肽涉及的所有步驟，包括但不局限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
表達載體這里術語“表達載體”定義為線狀的或環(huán)狀的DNA分子，它含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，且其與提供其表達的其它核苷酸可操作連接。
宿主細胞這里所使用的“宿主細胞”包括易于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導、等等的所有細胞類型。
修飾這里術語“修飾”是指對由SEQ ID NO2或其同源序列第20至863位氨基酸組成的多肽的任何化學修飾以及對編碼該多肽的DNA的基因操作。修飾可以是一個或多個氨基酸的替代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側鏈的替換。
人工變體這里所使用的術語“人工變體”是指具有β-葡糖苷酶活性的多肽，它是由表達經修飾的核苷酸序列SEQ ID NO1或其同源序列或其成熟編碼區(qū)的生物體產生的。經修飾的核苷酸序列可通過人工干預對SEQ ID NO1中所公開的核苷酸序列或其同源序列或其成熟編碼區(qū)進行修飾來獲得。
發(fā)明詳述具有β-葡糖苷酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分離多肽，所述多肽具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸(即成熟多肽)具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％、且甚至最優(yōu)選至少97％的同一性程度(下文的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸相差10個氨基酸、優(yōu)選5個氨基酸、更優(yōu)選4個氨基酸、甚至更優(yōu)選3個氨基酸、最優(yōu)選2個氨基酸、且甚至最優(yōu)選1個氨基酸。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選含有氨基酸序列SEQ ID NO2或其等位變體；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO2。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO2第20至863位氨基酸或其等位變體；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO2第20至863位氨基酸。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQ ID NO2或其等位變體；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQ ID NO2組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸或其等位變體；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQ IDNO2第20至863位氨基酸組成。
在第二個方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有β-葡糖苷酶活性的分離多肽，該多核苷酸在非常低的嚴謹度條件、優(yōu)選低嚴謹度條件、更優(yōu)選中等嚴謹度條件、更優(yōu)選中等-高嚴謹度條件、甚至更優(yōu)選高嚴謹度條件、且最優(yōu)選非常高的嚴謹度條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸；(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列；(iii)，(i)或(ii)的子序列，或(iv)，(i)、(ii)或(iii)的互補鏈發(fā)生雜交(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO1的子序列包含至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。另外，子序列可能編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽片段。
根據(jù)本領域眾所周知的方法，可以使用核苷酸序列SEQ ID NO1或其子序列以及氨基酸序列SEQ ID NO2或其片段來設計核酸探針，用于從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。特別是，遵循標準的Southern印跡程序，可以將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA進行雜交，從而鑒定和分離其中的相應基因。這些探針可以比完整序列短得多，但是長度應當是至少14個、優(yōu)選至少25個、更優(yōu)選至少35個、且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選的是核酸探針的長度是至少100個核苷酸。例如，核酸探針的長度可以是至少200個核苷酸、優(yōu)選至少300個核苷酸、更優(yōu)選至少400個核苷酸、或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？梢允褂蒙踔粮L的探針，例如長度是至少600個核苷酸、優(yōu)選至少700個核苷酸、更優(yōu)選至少800個核苷酸、或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針都可使用。通常將探針進行標記，用于檢測相應的基因(例如用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋這些探針。
因此可從這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA庫中篩選出與上述探針發(fā)生雜交且編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。來自這些其它生物體的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術來分離?？蓪碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移并固定在硝酸纖維素或其它適宜載體材料上。為鑒定與SEQ ID NO1或其子序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。
對本發(fā)明而言，雜交是指在極低至極高的嚴謹度條件下將核苷酸序列與經標記的核酸探針進行雜交，其中核酸探針相當于SEQ ID NO1所示核苷酸序列、SEQ ID NO1所含cDNA序列、其互補鏈、或其子序列。在這些條件下與核酸探針發(fā)生雜交的分子可用X射線膠片檢測。
在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼多肽SEQ ID NO2或其子序列的多核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO1或其互補鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質粒pEJG113中的多核苷酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRL B-30695中，其中其多核苷酸序列編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質粒pEJG113中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質粒包含在大腸桿菌NRRL B-30695中。
對于長度為至少100個核苷酸的長探針來說，極低至極高的嚴謹度條件規(guī)定為遵循標準Southern印跡程序，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml經剪切且經變性的鮭精DNA、和用于極低和低嚴謹度的25％甲酰胺、用于中等和中等-高嚴謹度的35％甲酰胺或高和極高嚴謹度的50％甲酰胺中進行最佳12-24小時的預雜交和雜交。
對于長度為至少100個核苷酸的長探針來說，最后優(yōu)選在至少45℃(極低嚴謹度)、更優(yōu)選在至少50℃(低嚴謹度)、更優(yōu)選在至少55℃(中等嚴謹度)、更優(yōu)選至少在60℃(中等-高嚴謹度)、甚至更優(yōu)選在至少65℃(高嚴謹度)、且最優(yōu)選在至少70℃(極高嚴謹度)下將載體材料用2×SSC、0.2％SDS洗滌3次，每次15分鐘。
對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針來說，嚴謹度條件規(guī)定為遵循標準Southern印跡程序，在比根據(jù)Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 481390)計算的Tm計算值低大約5℃至大約10℃的溫度下，在每毫升0.9M NaCl、0.09MTris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt氏溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP、和0.2mg/ml酵母RNA中進行最佳12至24小時的預雜交、雜交、和雜交后的洗滌。
對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針來說，將載體材料在比Tm計算值低大約5℃至10℃的溫度下在6X SCC加0.1％SDS中洗滌1次15分鐘，然后用6X SSC洗滌兩次，每次15分鐘。
在第三個方面，本發(fā)明涉及SEQ ID NO2或其同源序列或其成熟多肽的含有一個或多個氨基酸保守替代、刪除、和/或插入的人工變體。優(yōu)選的是，氨基酸改變的性質較小，也就是說不會明顯影響蛋白質折疊和/或活性的保守氨基酸替代；一般是1個至大約30個氨基酸的小段刪除；小段氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基；可達大約20-25個殘基的小段接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而易于純化的小段延伸，諸如多組氨酸序列段、抗原性表位、或結合結構域。
保守替代的例子在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)各組內。通常不改變特異活性的氨基酸替代是本領域所熟知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在《The Proteins》中所述(1979，Academic Press，New York)。最常發(fā)生的替代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
除20種標準氨基酸之外，也可用非標準氨基酸(諸如4-羥基脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和α-甲基絲氨酸)來替代野生型多肽的氨基酸殘基?？捎糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸，并非由遺傳密碼編碼的氨基酸，和非天然氨基酸來替代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|合成后受到修飾，和/或在它們的側鏈上具有與標準氨基酸不同的化學結構?？苫瘜W合成非天然氨基酸，優(yōu)選的是可在市場上買到的，包括2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。
可供選擇的，氨基酸改變是本質是改變多肽的物理化學特性的氨基酸改變。例如，氨基酸改變可提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳pH等等。
可根據(jù)本領域已知方法來確定親本多肽中的關鍵氨基酸，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后一技術中，在分子中的每個殘基處引入單一的丙氨酸突變，并對得到的突變體分子檢驗生物學活性(即β-葡糖苷酶活性)從而確定對分子活性至關重要的氨基酸殘基。也可參見Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708。也可結合假定接觸位點氨基酸的突變，通過諸如核磁共振、結晶學、電子衍射、或光親和標記測定，對結構進行物理學分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學相互作用。例如參見de Vos等人，1992，Science 25506-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS Lett.30959-64。也可從與本發(fā)明多肽相關多肽的同一性分析來推斷關鍵氨基酸的身份。
可用已知的誘變、重組、和/或改組方法來進行單一或多個氨基酸的替代和檢測，隨后進行相應的篩選程序，諸如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 24153-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所公開的?？墒褂玫钠渌椒òㄒ族ePCR、噬菌體展示(例如Lowman等人，1991，Biochem.3010832-10837；U美國專利號5,223,409；WO 92/06204)、和區(qū)域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等人，1986，Gene 46145；Ner等人，1988，DNA 7127)。
可將誘變/改組方法與高通量、自動篩選方法相結合，用于檢測由宿主細胞表達的克隆的、經誘變多肽的活性?？墒褂帽绢I域的標準方法從宿主細胞回收編碼活性多肽的經誘變DNA分子并迅速測序。這些方法可快速測定所研究多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并可應用于結構未知的多肽。
SEQ ID NO2第20至863位氨基酸中氨基酸替代、缺失、和/或插入的總數(shù)為10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、甚至更優(yōu)選3、最優(yōu)選2、且甚至最優(yōu)選1。
具有β-葡糖苷酶活性的多肽的來源可從任何屬的微生物中獲得本發(fā)明的多肽。對本發(fā)明來說，這里所使用的與指定來源相關的術語“從...中獲得”是指由核苷酸序列編碼的多肽是由來源或來自于來源的核苷酸序列已經插入其中的菌株產生的。在一個優(yōu)選的方面，從指定來源獲得的多肽分泌到細胞外。
本發(fā)明的多肽可以是真菌多肽，且更優(yōu)選酵母多肽，諸如假絲酵母屬(Candida)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽，諸如小枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短柄霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptocoecus)、Filibasidium屬、鐮孢屬(Fusarium)、腐質菌屬(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix屬、鏈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillum)、Piromyces屬、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉屬(Thielavia)、Tolypocladium屬、或木霉屬(Trichoderma)多肽。
在一個優(yōu)選的方面，多肽是具有β-葡糖苷酶活性的卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、道拉斯糖酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地糖酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一個優(yōu)選的方面，多肽是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、谷孢鐮孢(Fusarium cereals)、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporium)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、近念珠狀鐮孢(Fusarium torulasum)、單端孢鐮孢(Fusarium trichothecioides)、有毒鐮孢(Fusarium venenatum)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在另一個優(yōu)選的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)多肽。
在一個更優(yōu)選的方面，多肽是煙曲霉多肽，SEQ ID NO2的多肽。
對上述物種，應理解的是，不管已知的種名是什么，本發(fā)明既包括完全階段和不完全階段，還包括其它分類學等價物，例如無性型。本領域技術人員可很容易地識別出適當?shù)葍r物的身份。
這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏機構為公眾所得到，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)、和農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心北部研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern RegionalResearch Center，NRRL)。
此外，利用上述探針可從其它來源，包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)中分離出的微生物中鑒定和獲得這些多肽。從自然環(huán)境中分離微生物的技術在本領域技術是熟知的。然后可通過類似地篩選這樣一種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得多核苷酸。一旦用探針檢測出編碼多肽的多核苷酸序列，就可通過本領域技術人員所熟知的技術(例如參見Sambrook等人，1989，同上)分離或克隆此多核苷酸。
本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。可通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。對于產生融合多肽的技術在本領域是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列使之處于同一閱讀框中，并使融合多肽的表達受相同啟動子和終止子的控制。
多核苷酸本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列為SEQ ID NO1所示。在另一個更加優(yōu)選的方面，核苷酸序列是質粒pEJG113中所含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30695中。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個更加優(yōu)選的方面，核苷酸序列是質粒pEJG113中所含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質粒包含在大腸桿菌NRRL B-30695中。本發(fā)明還涵蓋編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO1因遺傳密碼的簡并性而不同。本發(fā)明還涉及編碼具有β-葡糖苷酶活性的SEQ ID NO2之片段的SEQ ID NO1之子序列。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一處突變的突變型多核苷酸，其中突變型核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸組成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術在本領域是已知的，包括從基因組DNA中分離，從cDNA中制備，或者兩者的組合。例如，通過利用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或用抗體篩選表達文庫以檢測出具有共同結構特征的克隆DNA片段，可以實現(xiàn)從這些基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸序列。例如參見Innis等人，1990，PCRA Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。還可以使用其它核酸擴增程序，諸如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活轉錄(LAT)、和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？蓮那箤倬昊蛘吡硗獾幕蛳嚓P的生物體中克隆得到多核苷酸，因此它可以是例如核苷酸序列中多肽編碼區(qū)的等位或物種變體。
本發(fā)明還涉及具有如下核苷酸序列的編碼活性多肽的多核苷酸，該核苷酸序列與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列(即第58至2580位核苷酸)具有至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、甚至更優(yōu)選至少為95％、且最優(yōu)選至少97％的同一性程度。
為了合成與本發(fā)明多肽實質上類似的多肽，可能必需修飾編碼多肽的核苷酸序列。術語與多肽“實質上類似”是指多肽的非天然存在形式。這些多肽可能因某些改造而區(qū)別于從其天然來源分離的多肽，例如在比活、熱穩(wěn)定性、最佳pH等方面不同的變體?？梢栽赟EQ ID NO1多肽編碼區(qū)所呈現(xiàn)的核苷酸序列基礎上構建變體序列，例如其子序列，和/或通過引入，它們不會導致由核苷酸序列編碼的多肽具有另一種氨基酸序列、而是使之符合意圖用來生產酶的宿主生物體的密碼子使用率的核苷酸取代，或通過引入可導致不同氨基酸序列的核苷酸替代。對于核苷酸替代的一般說明可參見例如Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 295-107。
對本領域技術人員而言，很明顯的是這些種替代可在分子功能的關鍵區(qū)域外面進行并且仍然可得到活性多肽?？筛鶕?jù)本領域的已知方法來鑒別對于由本發(fā)明的分離多核苷酸所編碼的活性多肽來說至關重要因此優(yōu)選不進行替代的氨基酸殘基，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后一種技術中，在分子中每一帶正電荷殘基處引入突變，然后對得到的突變分子檢測β-葡糖苷酶活性以鑒定對分子活性至關重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可通過三維結構分析來確定，其中三維結構可由諸如核磁共振分析、晶體學、或光親和標記這類技術進行測定(例如參見de Vos等人，1992，Science 255306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸，它在極低的嚴謹度條件、優(yōu)選低嚴謹度條件、更優(yōu)選中等嚴謹度、更優(yōu)選中等-高嚴謹度條件、甚至更優(yōu)選高嚴謹度條件、且最優(yōu)選極高嚴謹度條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈；或本文所述其等位變體和子序列發(fā)生雜交(Sambrook等人，1989，同上)。
本發(fā)明還涉及通過(a)在極低、低、中等、中等-高、高、或極高嚴謹度條件下將一群DNA與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸來獲得的編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分離多核苷酸。
核酸構建體本發(fā)明還涉及包含可操作連接至一種或多種控制序列的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構建體，所述控制序列在適當宿主細胞中在與控制序列相容的條件下指導編碼序列的表達。
可利用多種方法操作編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸以提供多肽的表達。根據(jù)表達載體的不同，可能希望或必需在將多核苷酸序列插入載體之前對其進行操作。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是為本領域所熟知的。
控制序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，即受到宿主細胞識別、用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列包含調節(jié)多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中表現(xiàn)出轉錄活性的任意核苷酸序列，包括突變的、截短的、和雜合的啟動子，并且其可從編碼與宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因中獲得。
在絲狀真菌宿主細胞中指導本發(fā)明核酸構建體轉錄的啟動子的適當實例是來自米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、有毒鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、有毒鐮孢Daria(WO 00/56900)、有毒鐮孢Quinn(WO 00/56900)、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)、瑞氏木霉β-葡糖苷酶、瑞氏木霉纖維二糖水解酶I、瑞氏木霉內切葡聚糖酶I、瑞氏木霉內切葡聚糖酶II、瑞氏木霉內切葡聚糖酶III、瑞氏木霉內切葡聚糖酶IV、瑞氏木霉內切葡聚糖酶V、瑞氏木霉木聚糖酶I、瑞氏木霉木聚糖酶II、瑞氏木霉β-木糖苷酶基因的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構酶的雜合啟動子)；及其突變、截短、和雜合的啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子是從啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒糖酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、啤酒糖酵母磷酸丙糖異構酶(TPI)、啤酒糖酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所獲得的。Romanos等人在1992，Yeast 8423-488中描述了其它對酵母宿主細胞有用的啟動子。
控制序列也可以是適當?shù)霓D錄終止子序列，所述序列可由宿主細胞識別來終止轉錄。終止子序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的3′端。任一在所選擇的宿主細胞中起作用的終止子都可用于本發(fā)明。
對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸酯(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得。
對于酵母宿主細胞終止子優(yōu)選從啤酒糖酵母烯醇化酶、啤酒糖酵母細胞色素C(CYC1)、和啤酒糖酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中獲得。Romanos等人在1992同上引文中描述了其它對酵母宿主細胞有用的終止子。
控制序列還可以是適當?shù)那皩蛄?，它是對宿主細胞翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的5′端。任一在所選擇的宿主細胞中起作用的前導序列都可用于本發(fā)明。
對于絲狀真菌宿主細胞前導序列優(yōu)選從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉磷酸丙糖異構酶基因中獲得。
對于酵母宿主細胞優(yōu)選的前導序列可從啤酒糖酵母烯醇化酶(ENO-1)、啤酒糖酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒糖酵母α-因子、和啤酒糖酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因中獲得。
控制序列也可是聚腺苷酸化序列，它是可操控連接于核苷酸序列3′端的序列，當轉錄時可被宿主細胞識別為將聚腺苷殘基添加到轉錄的mRNA上的信號。任一在所選擇的宿主細胞中起作用的聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。
對于絲狀真菌宿主細胞聚腺苷酸化序列優(yōu)選來自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸酯合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
Guo和Sherman等人在1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990中描述了對酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列還可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端并指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5′端可固有的包含信號肽編碼區(qū)，此信號肽編碼區(qū)在翻譯讀碼框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)段天然連接。或者，編碼序列的5′端可以包含對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。如果編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)，則需要外來的信號肽編碼區(qū)。或者，外來的信號肽編碼區(qū)可簡單地替換天然信號肽編碼區(qū)以便增進多肽的分泌。然而，任一可指導表達的多肽進入所選擇宿主細胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是來自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶、Humicola insolens內切葡聚糖酶V、和Humicolalanuginosa脂肪酶的基因。
在一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO2第1至19位氨基酸的SEQ ID NO1第1至58位核苷酸。
對于酵母宿主細胞有用的信號肽來自于啤酒糖酵母α-因子和啤酒糖酵母轉化酶的基因。Romanos等人在1992年同上引文中描述了其它有用的信號肽編碼區(qū)。
控制序列也可是前肽編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽稱為前酶或前多肽(或有時候稱作酶原)。前多肽一般是無活性的，并可通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可來自枯草桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草桿菌中性蛋白酶(nprT)、啤酒糖酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉漆酶的基因(WO 95/33836)。
當信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)位于靠近多肽氨基末端的位置，信號肽區(qū)位于靠近前肽區(qū)的氨基末端位置。
還可能需要加上調節(jié)序列以使多肽的表達可以相對于宿主細胞的生長進行調節(jié)。調節(jié)系統(tǒng)的實例是能響應化學或物理刺激(包括存在調節(jié)化合物)而引起基因表達的開啟或關閉的那些。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例是允許基因擴增的那些。在真核生物系統(tǒng)中，這些包括在氨甲喋呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬存在時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調節(jié)序列可操作連接。
表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⒈疚乃龅母鞣N核酸和控制序列連接起來產生重組表達載體，此重組表達載體可包括一個或多個適當?shù)南拗莆稽c使得在這些位點可插入或替換編碼多肽的核苷酸序列。或者，本發(fā)明的核苷酸序列可通過將核苷酸序列或含有序列的核酸構建體插入適當?shù)谋磉_載體進行表達。構建表達載體時，將編碼序列置于載體中以使編碼序列與適當?shù)谋磉_控制序列可操作連接。
重組體表達載體可以是可方便地接受重組DNA操作并能引起核苷酸序列表達的任一載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇一般取決于載體與引入此載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質粒。
載體可以是自主復制載體，即載體可以染色體外實體的形式存在，其復制獨立于染色體的復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復制的手段?；蛘?，載體可以是這樣的一種載體，它在引入宿主細胞時，整合到基因組中并與整合的染色體一起復制。此外，可使用單一載體或質粒，或是一起含有待引入宿主細胞基因組的全部DNA的兩種或多種載體或質粒，或者轉座子。
本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種選擇標記，所述選擇標記允許易于挑選轉化的、轉染的、轉導的等細胞。選擇標記是一種基因，其產物提供抗微生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型至原養(yǎng)型等等。
適于酵母宿主細胞的標記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在絲狀宿主細胞中使用的選擇標記包括但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、和trpC(鄰氨基苯甲酸酯合酶)，以及其等價物。優(yōu)選用于曲霉屬細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細胞基因組中或者允許載體在細胞中不依賴于基因組自主復制的元件。
對整合到宿主細胞基因組來說，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸序列或任何其它載體元件通過同源或非同源重組整合到基因組中?；蛘?，載體可包含附加的核苷酸序列用于指導通過同源重組在染色體確定位置整合進入宿主細胞基因組中。為提高在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與對應靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10,000個堿基對、優(yōu)選400-10,000個堿基對、且最優(yōu)選800-10,000個堿基對，從而提高同源重組的幾率。整合元件可以是任何與宿主細胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。
對自主復制來說，載體還可包含能使載體在所討論的宿主細胞中自主復制的復制起點。復制起點可以是任何在細胞中起作用的調節(jié)自主復制的質粒復制因子。這里的術語“復制起點”或“質粒復制因子”是指能使質粒或載體在活體內復制的核苷酸序列。
可用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2μm復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。
在絲狀真菌細胞中可用的復制起點的實例有AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene 9861-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Research 159163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分離和包含基因的質?；蜉d體的構建可根據(jù)WO 00/24883中所公開的方法來完成。
可將本發(fā)明多核苷酸一個以上的拷貝插入宿主細胞中以提高基因產物的產量。提高多核苷酸拷貝數(shù)可通過將序列的至少一個附加拷貝整合進宿主細胞基因組中或通過將可擴增的選擇標記基因加入多核苷酸來獲得，在其中包含選擇標記基因的擴增拷貝的細胞，以及因此多核苷酸的附加拷貝可在適當?shù)倪x擇試劑存在下通過培養(yǎng)此細胞篩選出。
用于連接上述元件以構建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領域技術人員所熟知的(例如參見Sambrook等人，1989，引文同上)。
宿主細胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細胞，它們可有利地用于多肽的重組生產。如前所述，可將含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細胞以使載體保持為染色體的整合體或作為自主復制的染色體外載體。術語“宿主細胞”包括所有那些由于在復制期間出現(xiàn)的突變而不同于親本細胞的親本細胞的后代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴于編碼多肽的基因和它的來源。
宿主細胞可以是真核細胞，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞。這里所使用的“真菌”包括子囊菌門(Acomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等人在《Ainsworth and BisbysDictionary of The Fungi》，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如參見Hawksworth等人在1995，同上引文的第171中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，如上引文)。
在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。這里所使用的“酵母”包括產子囊酵母(內孢霉目Endomycetales)、產擔孢子酵母、和屬于不完全真菌的酵母(芽生菌綱Blastomycetes)。由于酵母的分類今后還會變化，對于本發(fā)明來說，酵母應該是如在《Biology and Activities of Yeast》(Skinner，F(xiàn).A.、Passmore，S.M.、和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980)中所定義的。
在一個甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、或Yarrowia屬細胞。
在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾斯伯糖酵母、啤酒糖酵母、糖化糖酵母、道拉斯糖酵母、克魯弗糖酵母、諾第糖酵母、或卵形糖酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門的所有絲狀體(如Hawksworth等人，1995，在上述引文中所定義的)。絲狀真菌通常是以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、及其他復合多糖組成的菌絲壁為特征。營養(yǎng)生長表現(xiàn)為菌絲伸長，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母諸如啤酒糖酵母的營養(yǎng)生長表現(xiàn)為單細胞菌體的出芽而碳代謝可以是發(fā)酵性的。
在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是小枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬(Bjerkandera)、Ceriporiopsis屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球酵母屬、Filibasidium屬、鐮孢屬、腐質菌屬、Magnaporthe屬、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix屬、脈孢霉菌、擬青霉屬、青霉屬、phanerochaete屬、射脈菌屬(Phlebia)、Piromyces屬、側耳菌屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、熱子囊菌屬、草根霉屬、Tolypocladium屬、拴菌屬(Trametes)、或木霉屬的細胞。
在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰色鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢霉、產紫青霉、Phanerochaete chrysosporium、輻射射脈菌(Phlebia radiata)、Pleurotuseryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、瑞氏木霉、或綠色木霉細胞。
真菌細胞可以本身已知的方式通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、和細胞壁再生的過程進行轉化。EP 238023和Yelton等人，1984，Proceedingsofthe National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了適合曲霉屬和木霉屬宿主細胞轉化的過程。Malardier等人，1989，Gene 78147-159和WO 96/00787中描述了轉化鐮孢屬物種的適當方法?？衫肂ecker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編的《Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology》，Methods in Enzymology，Vol.194，pp 182-187，AcademicPress公司，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153163；及Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA751920中所描述的程序轉化酵母。
生產方法本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞能夠在其野生型產生多肽；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，所述細胞是曲霉屬細胞，更優(yōu)選的是煙曲霉細胞。
本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下突變型核苷酸序列的宿主細胞，所述突變型核苷酸序列在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一處突變，其中突變型核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸組成的多肽，和(b)回收所述多肽。
在本發(fā)明的生產方法中，利用本領域眾所周知的方法在適于生產所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，細胞培養(yǎng)可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在適當?shù)呐囵B(yǎng)基和可使所述多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、補料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)來進行。培養(yǎng)可通過本領域已知的程序在含有碳和氮源以及無機鹽的合宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行。適宜的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應商獲得，或者可根據(jù)已公布的配方來制備(例如參見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么可從細胞裂解產物中進行回收。
可利用本領域已知的對所述多肽特異的方法來檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異抗體的使用、酶產物的形成、或酶底物的消失。例如，酶試驗可用來測定本文所述多肽的活性。
所得多肽可通過本領域已知的方法回收。例如，多肽可通過常規(guī)流程從培養(yǎng)基中回收，包括但不局限于離心、過濾、萃取、噴射-干燥、蒸發(fā)、或沉淀。
本發(fā)明的多肽可通過本領域已知的多種程序純化，包括但不局限于層析(例如離子交換、親合、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、差異溶解(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如參見《Protein Purification》，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH出版，NewYork，1989)，以獲得基本上純的多肽。
β-葡糖苷酶活性的消除或降低本發(fā)明還涉及生產親本細胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列或其部分，這導致在突變體細胞產生的多肽比在相同條件下培養(yǎng)的親本細胞少。
可使用本技術領域眾所周知的方法通過降低或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變體細胞，例如插入、破壞、替換、或缺失。在一個優(yōu)選的方面，將核苷酸序列失活。例如，要修飾或失活的核苷酸序列可以是對活性必需的編碼區(qū)或其部分，或編碼區(qū)表達所需要的調控元件。這種調控或控制序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響核苷酸序列表達的部分。可修飾的其它控制序列包括但不局限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子、和轉錄激活因子。
核苷酸序列的修飾或失活可通過將親本細胞誘變，并選擇所述核苷酸序列的表達降低或消除的突變體細胞來進行。所述誘變可以是特異的或隨機的，例如通過使用適宜的物理或化學誘變劑、通過使用適宜的寡核苷酸、或通過對DNA序列PCR產生誘變來進行。此外，誘變可通過使用這些誘變劑的任意組合來進行。
適于本發(fā)明目的的物理或化學的誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。
當使用這些試劑時，誘變一般是在適宜條件下在所選的誘變處理試劑的存在下通過保溫用于誘變的親本細胞并篩選和/或選擇展示基因表達降低或不表達的突變體細胞來進行的。
核苷酸序列的修飾或失活可通過在基因中或在其轉錄或翻譯所需要的調控元件中引入、替換、或消除一個或多個核苷酸來進行。例如，可插入或消除核苷酸從而形成終止密碼子的引入、起始密碼子的消除、或開放讀碼框的改變。這些修飾或滅活可根據(jù)本領域已知的方法通過定點誘變或PCR產生誘變來完成。雖然大體上，修飾可在活體內進行，即直接在表達要被修飾的核苷酸序列的細胞上進行，優(yōu)選的是如下面實例中所示在活體外進行修飾。
適宜的消除或降低細胞核苷酸序列表達的方法的實例是以基因替換、基因缺失、或基因破壞技術為基礎的。例如，在基因破壞方法中，將相當于內源核苷酸序列的核酸在活體外進行誘變以產生缺陷的核酸序列，然后將其轉化到親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷的核酸序列替換內源核苷酸序列。所希望的是，缺陷的核苷酸序列還編碼可用于選擇核苷酸序列已經修飾或破壞了的轉化體的標記。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，例如用本文所述選擇標記來破壞核苷酸序列。
或者，核苷酸序列的修飾或失活可通過已建立的反義技術使用與核苷酸序列互補的序列來進行。更具體地說，細胞核苷酸序列的表達可通過引入與基因核苷酸序列互補的序列來降低或消除，其中所述基因可在細胞中轉錄并能與細胞中所產生的mRNA發(fā)生雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA發(fā)生雜交的條件下，所翻譯蛋白質的量由此降低或消除。
本發(fā)明此外涉及在編碼所述多肽的多核苷酸序列或其控制序列中包含破壞或缺失的親本細胞的突變體細胞，這導致突變體細胞產生的所述多肽比親本細胞少或不產生多肽。
這樣構建的多肽缺陷的突變體細胞作為宿主細胞用于同源和/或異源多肽的表達尤其有效。因此，本發(fā)明還涉及生產同源或異源多肽的方法，包括(a)在有助于生產多肽的條件下培養(yǎng)突變體細胞；和(b)回收所述多肽。這里的術語“異源多肽”是指對宿主細胞來說不是天然的多肽，經過修飾改變了天然序列的天然蛋白，或是經過重組DNA技術處理宿主細胞從而定量改變了其表達的天然蛋白。
在另一個方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生成本發(fā)明多肽和目的蛋白質產物二者的細胞來生產基本上沒有β-葡糖苷酶活性的蛋白質產物的方法，其中在發(fā)酵完成之前、當中、或之后通過往發(fā)酵液中加入有效量的可抑制β-葡糖苷酶活性的試劑，并從發(fā)酵液中回收目的產物，以及任選進行回收產物的進一步純化。
在另一個方面，本發(fā)明涉及通過下列步驟來生產基本上沒有β-葡糖苷酶活性的蛋白質產物的方法，在允許產物表達的條件下培養(yǎng)細胞，并使所得培養(yǎng)液進行pH和溫度聯(lián)合處理以便實質上降低β-葡糖苷酶活性，并從培養(yǎng)液中回收產物?；蛘?，pH和溫度聯(lián)合處理可在從培養(yǎng)液中回收的酶制品上進行。pH和溫度聯(lián)合處理可任選結合使用用β-葡糖苷酶抑制劑的處理。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，可能消除至少60％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％、還更優(yōu)選至少95％、且最優(yōu)選至少99％的β-葡糖苷酶活性。通過使用所述方法可實現(xiàn)完全消除β-葡糖苷酶活性。
pH和溫度聯(lián)合處理優(yōu)選在pH為5和溫度為70℃進行足夠的一段時間以達到預期的效果，其中一般30-60分鐘就足夠了。
可使用本領域已知的方法進行培養(yǎng)和目的產物的純化。
本發(fā)明用于生產基本上不含β-葡糖苷酶的產物的方法在真核多肽的生產中特別有利，尤其是真菌蛋白質，諸如酶。例如，酶可選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維分解酶、氧化還原酶、或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、苯酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。β-葡糖苷酶缺陷的細胞還可用于表達藥學感興趣的異源蛋白，諸如激素、生長因子、受體等等。
應理解的是術語“真核多肽”不僅包括天然多肽，還包括經過氨基酸替代、刪除或添加的修飾或是用以提高活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等等其它類似修飾的多肽，例如酶。
在另一個方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產的基本上沒有β-葡糖苷酶活性的蛋白產物。
組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的組合物。優(yōu)選的是，組合物富集了這類多肽。術語“富集”是指組合物的β-葡糖苷酶活性已經提高，例如富集因子為至少1.1。
所述組合物可包含本發(fā)明的多肽作為主要的酶組分，例如單一組分組合物?；蛘?，組合物可含有多種酶活性，諸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。通過屬于下列屬的微生物可產生附加的酶，例如曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢；腐質菌屬，優(yōu)選Humicolainsolens或Humicola lanuginosa；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、瑞氏木霉、或綠色木霉。
可根據(jù)本領域已知的方法來制備多肽組合物，并且所述多肽組合物可以液體或干燥組合物的形式存在。例如，多肽組合物可以顆?；蛭⒘５男问酱嬖凇？梢员绢I域已知的方法穩(wěn)定包含在組合物中的多肽。
在下面所給的實施例中優(yōu)選使用本發(fā)明的多肽組合物。本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可根據(jù)本領域已知的方法來確定。
生物量降解為單糖、二糖、和多糖本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽和宿主細胞可用于從生物量生產單糖、二糖、和多醣，作為化學或發(fā)酵原料，用于生產乙醇、塑料、或其他產品或中間體。具有β-葡糖苷酶活性的多肽可以是除去或未除去細胞的粗級發(fā)酵液的形式，或是半純化或純化酶制品的形式?；蛘撸景l(fā)明的宿主細胞可在生物量的發(fā)酵過程中用作具有β-葡糖苷酶活性的多肽的來源。
生物量可包括但不局限于木材資源、城市固體廢物、廢紙、和作物殘余(例如參見Wiselogel等人，1995，《Handbook on Bioethanol》(Charles E.Wyman編)，pp.105-118，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 503-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25695-719；Mosier等人，1999，Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics，在《Advances inBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，T.Scheper主編，Vol.65，pp.23-40，Springer-Verlag，New York)。
在生物量初生(primary)細胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三豐富的是果膠。細胞停止生長之后產生的次生細胞壁也包含多糖，而且它通過與半纖維素共價交聯(lián)的聚合木質素得到強化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此為線狀的β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包含多種化合物，諸如具有多種取代基的復雜分支結構的木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖木聚糖、和甘露聚糖。雖然纖維素通常是多形的，但在植物組織中發(fā)現(xiàn)的纖維素主要是以平行葡聚糖鏈的不溶性的晶體矩陣形式存在。半纖維素通常與纖維素以及另外的半纖維素以氫鍵結合，這有助于穩(wěn)定細胞壁的基質。
主要有三大類別的葡糖水解酶用于分解纖維素生物量(1)“內切-1，4-β-葡聚糖酶”或1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，它隨機地作用于可溶的和不溶的1，4-β-葡聚糖底物。
(2)“外切-1，4-β-D-葡聚糖酶”，包括可從1，4-β-D-葡聚糖中釋放葡萄糖并緩慢水解D-纖維二糖的1，4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC 3.2.1.74)和可從1，4-β-葡聚糖中釋放D-纖維二糖的纖維二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC 3.2.1.91)。
(3)“β-D-葡糖苷酶”或β-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)，它可從纖維二糖和可溶性纖維糊精以及一系列糖苷中釋放出D-葡萄糖單位。
這三類酶一起協(xié)同作用，導致從生物量中有效地解晶并水解天然纖維素，產生還原糖。
本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽可用于聯(lián)合上述酶以進一步降解生物量底物的纖維素組分(例如參見Brigham等人，1995，在《Handbook onBioethanol》中(Charles E.Wyman編)，pp.119-141，Taylor & Francis，Washington D.C.；Lee，1997，Journal of Biotechnology 561-24)。
可通過酶促降解生物量并將釋放的糖類轉化成乙醇來制備乙醇。這種乙醇通常稱為生物乙醇或生物燃料。它可以濃度從不到1％直至100％(燃料替代物)用作燃料添加劑或增量劑。
洗滌劑組合物本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽可添加到洗滌劑組合物中并因此成為它的一種組分。
例如，可以將本發(fā)明的洗滌劑組合物配制成手洗或機洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預處理污染織物的洗衣添加劑組合物和漂洗時添加的織物柔軟劑組合物，或配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗滌劑組合物，或用于手洗或機洗洗碟操作的洗滌劑組合物。
在一個具體的方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的洗滌劑添加劑。
洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物中可包含一種或多種其它的酶，諸如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)、和/或過氧化物酶。
通常，酶組分的性質應該與所選擇的洗滌劑相容(即最佳pH、與其它酶和非酶組分的相容性等等)，并且所述酶組分應該以有效量存在。
蛋白酶適宜的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物起源的。優(yōu)選微生物起源的。包括經化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，特別是那些來源于芽孢桿菌屬的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、和枯草桿菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如起源于豬或牛的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于WO 89/06270和WO 94/25583中)。
有用的蛋白酶的實例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、和WO 98/34946中所描述的變體，特別是在一個或多個如下位置發(fā)生替代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274。
優(yōu)選的市場上可買到的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novozymes A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、和FN3TM(GenencorInternational Inc.)。
脂肪酶
適宜的脂肪酶包括細菌或真菌起源的那些。包括經化學修飾的或經蛋白質工程改造的變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質菌屬(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216中所描述的H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO 96/13580中所描述的H.insolens；假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如產堿假單胞菌(P.alkaligenes)或類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、司徒茨氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種菌株SD 705(WO 95/06720)和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢桿菌屬(Bacillus)脂肪酶，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(Dartois等人，1993，Biochemica etBiophysics Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)、或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
其它實例有諸如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、和WO 97/07202中所描述的脂肪酶變體。
優(yōu)選的市場上可買到的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶適宜的淀粉酶(α和/或β)包括細菌和真菌起源的那些。包括經化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。淀粉酶包括例如芽孢桿菌屬例如地衣形芽孢桿菌(B.licheniformis)特定菌株來源的α-淀粉酶，詳細說明描述在GB1,296,839中。
有用的淀粉酶的實例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、和WO 97/43424中所描述的變體，特別是在一個或多個如下位置發(fā)生替代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。
市場上可買到的淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(GenencorInternationalInc.)。
纖維素酶適宜的纖維素酶包括細菌或真菌起源的那些。包括經化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。適宜的纖維素酶包括來自下列屬的纖維素酶芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質菌屬、鐮孢屬、草根霉屬、小枝頂孢屬，例如在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757、和WO 89/09259中公開的由Humicola insolens、嗜熱毀絲霉、和尖孢鐮孢產生的真菌纖維素酶。
尤其適宜的纖維素酶是有益于保護顏色的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實例有EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纖維素酶。其它實例有諸如在WO 94/07998、EP 0 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307、和PCT/DK98/00299中描述的纖維素酶變體。
市場上可購買到的纖維素酶包括CelluzymeTM、CarezymeTM(NovozymesA/S)、ClazinaseTM、Puradax HATM(Genencor國際公司)、和KAC-500(B)TM(Kao公司)。
過氧化物酶/氧化酶適宜的過氧化物酶/氧化酶包括源自植物、細菌、或真菌的那些。包括經化學修飾或蛋白質工程改造的變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變體，如在WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中所描述的那些。
市場上可買到的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
可通過添加含一種或多種酶的獨立的添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑將酶組分包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨立的添加劑或組合添加劑，可配制成例如顆粒、液體、漿體等形式。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑為顆粒劑，尤其是無粉塵的顆粒劑；液體，尤其是穩(wěn)定的液體；或漿體。
例如可如在美國專利US 4,106,991和4,661,452中所公開的方法制備無粉塵顆粒劑，并可任選使用本領域已知的方法進行包衣。蠟質包衣材料的實例有平均摩爾質量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；具有15-80個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20個碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單-、雙-和三甘油酯。GB 1483591中給出了適于通過流化床技術應用的成膜包衣材料的實例。例如，液體酶制品可根據(jù)既定的方法通過加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定。受保護的酶可根據(jù)EP 238,216中所公開的方法制備。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可采用任一種方便的形式，例如條、片、粉末、顆粒、膏、或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或者是不含水的。
洗滌劑組合物可含有一種或多種表面活性劑，可以是非離子的，包括半極性和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子的。表面活性劑的含量一般為0.1％-60％重量。
當洗滌劑包含陰離子表面活性劑時，它通常含有大約1％到大約40％的陰離子表面活性劑，諸如線狀的烷基苯磺酸酯、α-石蠟磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、二級烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。
當洗滌劑中包含非離子型表面活性劑時，它通常含有大約0.2％到大約40％的非離子型表面活性劑，諸如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗滌劑可包含0-65％的洗滌劑助洗劑或絡合劑，諸如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如購自Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例有羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯諸如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可包含漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可含有H2O2來源諸如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可將其與形成過酸的漂白活化劑諸如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬狨ハ嘟M合?；蛘撸紫到y(tǒng)可包含過氧酸，例如酰胺、亞胺、或砜型。
可使用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明洗滌劑組合物的酶組分，例如多元醇，諸如丙二醇或丙三醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸，或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物諸如4-甲酰苯基硼酸；且所述的組合物可如WO92/19709和WO 92/19708中所描述的方法來配制。
洗滌劑還可包含其它的常規(guī)洗滌劑成分，諸如包括粘土的織物調節(jié)劑、泡沫促進劑、抑泡劑、防蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染色劑、殺菌劑、光漂白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑、或芳香劑。
在洗滌劑組合物中的任一酶組分，尤其是本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽都可以相當于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白質的量加入，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白質，尤其每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白質。
還可將本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽添加到如WO 97/07202所公開的洗滌劑制劑中，這里收入所述文獻作為參考。
植物本發(fā)明還涉及經編碼本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列轉化而以可回收量表達和生產多肽的轉基因植物、植株部分、或植物細胞。所述多肽可從植物或植株部分回收?；蛘?，將含有重組多肽的植物或植株部分就此用于改善食物或飼料的質量，例如提高營養(yǎng)價值、可口性和流變性、或破壞抗營養(yǎng)因子。
轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例有草，例如草地草(藍草，早熟禾屬(Poa))；草料草，諸如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；溫帶草，例如剪股穎屬(Agrostis)；和谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
雙子葉植物的實例有煙草，豆科作物諸如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、豆、和大豆，和十字花科植物(十字花科Brassicaceae)，諸如花椰菜、油菜籽、和親緣很近的模式生物體擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
植株部分的實例有莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖，以及含有這些部分的單獨組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、脈管組織、分生組織。特殊的植物細胞小室，諸如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細胞質也認為是植株部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，也認為是植株部分。類似的，植株部分，諸如有利于本發(fā)明應用的特定的分離組織和細胞也認為是植株部分，例如胚、胚乳、糊粉、和種皮。
這些植物、植株部分、和植物細胞的后代也包括在本發(fā)明范圍之內。
表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞的構建可根據(jù)本領域已知的方法進行。簡而言之，植物或植物細胞的構建可通過將一種或多種編碼本發(fā)明多肽的表達構建體摻入植物宿主基因組中并將所得的經修飾植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞來進行。
表達構建體方便的是核酸構建體，它含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸且該多核苷酸可操作連接在所選定的植物或植株部分中表達此核苷酸序列所需的適當調控序列。而且，表達構建體可包含用于鑒定整合了此表達構建體的宿主細胞的選擇標記，和將此構建體導入所討論的植物所需要的DNA序列(后者取決于所用導入DNA的方法)。
例如，根據(jù)希望在何時、在何處、和怎樣表達多肽來選擇調控序列，諸如啟動子和終止子序列和任選的信號或轉運序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成性的或可誘導的，或者是發(fā)育、階段、或組織特異的，基因產物可以是靶向特定組織或植株部分諸如種子或葉。調控序列有例如Tague等人，1988，Plant Physiology 86506所述。
對于組成性表達，可使用35S-CaMV、玉米泛蛋白1、和水稻肌動蛋白1啟動子(Franck等人，1980，Cell 21285-294；Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18675-689；Zhang等人，1991，Plant Cell 31155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織諸如種子、馬鈴薯塊莖、和果實(Edwards和Coruzzi，1990，Ann Rev Genet 24275-303)，或來自于代謝庫組織諸如分生組織(Ito等人，1994，Plant Mol Biol 24863-878)，種子特異性啟動子諸如來自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白啟動子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，來自蠶豆(Viciafaba)豆球蛋白B4和未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等人，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或者本領域已知的任何其它種子特異啟動子，例如WO 91/14772中所述。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，諸如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)，或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等人，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)，或者傷口誘導性啟動子諸如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，Plant MolecularBiology 22573-588)。同樣，啟動子可通過非生物處理例如溫度、干旱、或鹽度變化來誘導，或通過外源施加能激活啟動子的物質，例如乙醇、雌激素、植物激素諸如乙烯、脫落酸和赤霉酸以及重金屬來誘導。
還可使用啟動子增強子元件，從而在植物中獲得本發(fā)明多肽的更高表達。例如，啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如Xu等人，1993，在同上引文中所公開的利用水稻肌動蛋白1基因的第一個內含子來增強表達。
選擇標記基因和表達構建體的任何其它部分可選自本領域可利用的那些范圍。
可根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術將核酸構建體摻入植物基因組中，包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化、和電穿孔法(Gasser等人，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等人，1989，Nature 338274)。
目前，根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)介導的基因轉移是選擇用于產生轉基因雙子葉植物的方法(其綜述可參見Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)，而且也可用于轉化單子葉植物，盡管這些植物常使用其它轉化方法。目前，選擇用于產生轉基因單子葉植物的方法是粒子轟擊(以轉化用DNA包被的金或鎢微粒)胚的愈傷組織或發(fā)育中的胚(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10667-674)。如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21415-428中所描述的，單子葉植物轉化的替代方法是基于原生質體轉化來進行的。
在轉化后，根據(jù)本領域熟知的方法選出已摻入了表達構建體的轉化體，并使其再生成為完整植株。通常轉化程序設計成在再生期間或在后代中選擇性清除選擇基因，例如通過兩種不同T-DNA構建體的共轉化或通過特異重組酶進行的選擇基因的位點特異切除來進行。
本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下，培養(yǎng)含有如下多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有β-葡糖苷酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。
信號肽本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質的基因且該基因與如下核苷酸序列可操作連接的核酸構建體，所述核苷酸序列由SEQ ID NO1第1至58位核苷酸組成并編碼由SEQ ID NO2第1至19位氨基酸組成的信號肽，其中基因對于第一和第二氨基酸序列而言是外源的。
本發(fā)明還涉及含有這種核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。
本發(fā)明還涉及生產所述蛋白質的方法，包括(a)在有助于生產所述蛋白質的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。
對宿主細胞所述蛋白質可以是天然的或異源的。在這里術語“蛋白質”不是指規(guī)定長度的編碼產物，而是涵蓋肽、寡肽、和蛋白質。術語“蛋白質”還涵蓋兩種或多種多肽組合形成編碼產物。蛋白質還包括雜合多肽，它包括來自于至少兩種不同蛋白質的部分或完整多肽序列的組合，其中所述一種或多種蛋白質對宿主細胞可以是異源的或天然的。蛋白質還包括上述蛋白質和雜合蛋白的天然存在的等位的和改造的變異。
優(yōu)選的是，蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道分子。在一個更優(yōu)選的方面，蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、或連接酶。在一個甚至更優(yōu)選的方面，蛋白質是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
所述基因可從任何原核的、真核的、或其它來源中獲得。
本發(fā)明可通過下列實施例進一步說明，這些實施例不應視為限制本發(fā)明的范圍。
實施例材料用作緩沖液和底物的化學制品至少是試劑級的商品。
菌株使用米曲霉Jal250菌株(WO 99/61651)用于煙曲霉β-葡糖苷酶的表達。使用煙曲霉PaHa34作為GH3A家族β-葡糖苷酶的來源。
培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基每升含39g馬鈴薯葡萄糖(Difco)。
PDA平板每升含39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂。
MDU2BP培養(yǎng)基每升含45g麥芽糖，1g MgSO4·7H2O，1g NaCl，2g K2SO4，12g KH2PO4，7g酵母提取物，2g尿素和0.5ml AMG微量金屬溶液，pH調至5.0。
AMG微量金屬溶液每升含14.3g ZnSO4·7H2O，2.5g CuSO4·5H2O，0.5gNiCl2·6H2O，13.8g FeSO4·7H2O，8.5g MnSO4·H2O，和3g檸檬酸。
Cove平板每升含342.3g蔗糖，20ml Cove鹽溶液，10ml 1M乙酰胺，10ml5M CsCl2，和25g Noble瓊脂。
Cove鹽溶液每升含26g KCl，26g MgSO4·7H2O，76g KH2PO4，和50mlCOVE微量金屬溶液。
Cove微量金屬溶液每升含0.04g Na2B4O7·10H2O，0.4g CuSO4·5H2O，1.2gFeSO4·7H2O，0.7g MnSO4·H2O，0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
CIM培養(yǎng)基每升含20g纖維素，10g玉米漿干粉，1.45g(NH4)2SO4，2.08gKH2PO4，0.28g CaCl2，0.42g MgSO4·7H2O，和0.42ml微量金屬溶液，pH調至6.0。
微量金屬溶液每升含41.2mg FeCl3·6H2O，11.6mg ZnSO4·7H2O，5.4mgMnSO4·H2O，2.0mg CuSO4·5H2O，0.48mg H3BO3，和67.2mg檸檬酸。
實施例1煙曲霉基因組序列中糖基水解酶家族GH3A基因的鑒定利用檢索棘孢曲霉β-葡糖苷酶蛋白質序列(登記號P48825)的檢索，進行煙曲霉部分基因序列(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)的tblastn搜索(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res 253389-3402)?；诎被崴脚c檢索序列的高度相似性，鑒定得出幾種基因是假定GH3A家族同系物。選擇氨基酸水平與檢索序列具有大于70％同一性的約3000bp的一個基因組區(qū)域用于進一步地研究。
實施例2煙曲霉基因組DNA的提取將煙曲霉在帶擋板的搖瓶中在250ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中于37℃以240rpm進行培養(yǎng)。通過過濾收獲菌絲體，在TE(10mM Tris-1mM EDTA)中洗滌兩次，并在液氮下冷凍。用研缽和研棒將冷凍的菌絲體研磨成細粉，將其重懸于含10mM Tris、100mM EDTA、1％Triton X-100、0.5M胍-HCl、和200mM NaCl的pH8.0的緩沖液中。以20mg/升的濃度加入不含DNA酶的RNA酶A，開將裂解液于37℃保溫30分鐘。通過離心除去細胞碎片，并使用Qiagen Maxi 500柱(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)分離DNA。將柱子在10ml QBT中平衡，用30ml QC洗滌，并用15ml QF洗脫(所有緩沖液購自QIAGEN公司，Chatsworth，CA)。將DNA用異丙醇沉淀，用70％乙醇洗滌，并通過離心回收。將DNA重懸于TE緩沖液。
實施例3pAILo2表達載體的構建通過修飾pBANe6(美國專利6,461,837)構建pAILo1表達載體，它包含源自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖異構酶的雜合啟動子(NA2-tpi啟動子)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子序列(AMG終止子)、和構巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。pBANe6的修飾是如下進行的，即首先通過定點誘變從amdS選擇標記除去位于第2051、2722、和3397bp位的三個NcoI限制位點。所有改變設計為“沉默的”，使得amdS基因的實際蛋白質序列不改變。三個位點的清除是利用GeneEditor定點誘變試劑盒(Promega，Madison，WI)根據(jù)廠商的說明使用下面的引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)同時進行的AMDS3NcoMut(2050)5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQ ID NO3)AMDS2NcoMut(2721)5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQID NO4)AMDS1NcoMut(3396)5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQID NO5)然后將包含所有三種期望序列改變的質粒利用QuickChange誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)進行定點誘變，從而消除位于第1643位的AMG終止子末端的Nco I限制位點。使用下列引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)用于誘變用于誘變AMG終止子序列的上游引物5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQ ID NO6)用于誘變AMG終止子序列的下游引物5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO7)修飾pBANe6的最后一步是利用QuickChange誘變試劑盒和下列引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)在多接頭始端插入一個新的Nco I限制位點，從而產生pAILo1(附圖2)。
用于誘變NA2-tpi啟動子的上游引物5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO8)用于誘變NA2-tpi啟動子的下游引物5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQ ID NO9)用構巢曲霉PyrG基因替換pAILo1的amdS基因。將pBANelO(圖3)質粒用作PyrG基因源。分析pBANe10序列表明PyrG標記包含在Nsi I限制片段中，并且不含Nco I或Pac I限制位點。因為amdS的側翼也有Nsi I限制位點，所以用于轉換選擇標記的策略是進行Nsi I限制片段的簡單替換。用限制性內切酶Nsi I消化來自pAILo1和pBANe10的質粒DNA，并利用標準程序通過瓊脂糖凝膠電泳純化產物。將源自pBANe10的含有pyrG基因的Nsi I片段連接至pAILo1主鏈以替換包含amdS基因的原始Nsi I DNA片段。通過限制消化分析重組克隆以測定它們是否含有正確的插入片段和方向是否正確。選擇以反時針方向轉錄帶有PyrG基因的克隆。新的質粒稱為pAILo2(附圖4)。
實施例4GH3A家族β-葡糖苷酶基因的克隆和米曲霉表達載體的構建設計如下的兩條合成寡核苷酸引物從實施例2中所制備的基因組DNAPCR擴增編碼假定GH3A家族β-葡糖苷酶的煙曲霉基因。無需限制消化和連接，使用InFusion Cloning Kit(BD Biosciences，Palo Alto，CA)將片段直接克隆到表達載體pAILo2中。
正向引物5’-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3’(SEQ IDNO10)
反向引物5’-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3’(SEQ IDNO11)粗體字母代表編碼序列。剩余序列與pAILo2的插入位點是同源的。
將上述每種引物各50pmol用于終體積50μl的PCR反應，其中含有100ng煙曲霉基因組DNA、1×Pfx擴增緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1.5μl10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5個單位的Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1μl 50mM MgSO4、和2.5μl 10×pCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。擴增條件為94℃2分鐘，一個循環(huán)；每個循環(huán)94℃15秒、55℃30秒和68℃3分鐘30個循環(huán)。然后將加熱塊轉到4℃浸泡(soak)循環(huán)。
將反應產物在1.0％瓊脂糖凝膠上利用40mM Tris堿-20mM乙酸鈉-1mMEDTA二鈉(TAE)緩沖液進行分離，其中從凝膠上切下3kb產物帶，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)根據(jù)廠家的說明進行純化。
然后用InFusion克隆試劑盒將片段克隆到pAILo2表達載體中。用限制性核酸內切酶Nco I和Pac I消化載體(使用廠家規(guī)定的條件)。通過凝膠電泳和Qiaquick凝膠純化來純化片段。將基因片段和切割載體在反應中連接起來，產生表達質粒pEJG97(圖5)，其中GH3A家族β-葡糖苷酶基因的轉錄處于NA2-tpi啟動子的控制之下。連接反應液(50μl)含有1×InFusion緩沖液(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，1×BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，1μl Infusion酶(1∶10稀釋)(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，150ng經Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和50ng煙曲霉β-葡糖苷酶純化PCR產物。將反應液于室溫保溫30分鐘。用1μl反應液轉化大腸桿菌XL10Solopac Gold細胞(Stratagene，La Jolla，CA)。通過限制消化檢測含pEJG97質粒的大腸桿菌轉化子，并使用BioRobot 9600(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)制備質粒DNA。
實施例5編碼GH3A家族β-葡糖苷酶的煙曲霉基因組序列的鑒定使用Perkin-Elmer Applied Biosystems377XL型自動DNA測序儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)利用染料終止物化學法(Giesecke等人，1992，Journal of Virology Methods 3847-60)和引物步移策略對來自pEJG97的煙曲霉β-葡糖苷酶基因進行DNA測序。仔細檢查核苷酸序列信息的質量，并且借助PHRED/PHRAP軟件(University ofWashington，Seattle，WA)將所有序列互相比較。
基于對源自棘孢曲霉、黑曲霉、和川地曲霉(Aspergillus kawachii)同源基因的相似性，構建煙曲霉序列的基因模型。圖1A和1B顯示了核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)?；蚪M片段編碼863個氨基酸的多肽，由62、55、58、63、58、58、63、和51bp的8個內含子中斷?；虻模+C含量是54.3％，而成熟編碼區(qū)是53.65％。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 101-6)預測出19個殘基的信號肽。預測的成熟蛋白含有844個氨基酸，分子量91.7kDa。
通過Clustal W法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)用同一性表及后面的多重對比參數(shù)缺口罰分10和缺口長度罰分10來確定β-葡糖苷酶序列的比較對比。成對對比參數(shù)Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。對比表明推導的煙曲霉β-葡糖苷酶基因氨基酸序列與推導的棘孢曲霉(登記號P48825)、黑曲霉(O00089)、和川地曲霉(P87076)β-葡糖苷酶氨基酸序列享有78％、76％、和76％的同一性。
實施例6煙曲霉GH3A家族β-葡糖苷酶基因在米曲霉JAL250中的表達根據(jù)Christensen等人，1988，Bio/Technology 61419-1422中所描述的方法制備米曲霉Jal250原生質體。用5μg pEJG97(以及作為載體對照的pAILo2)轉化米曲霉JAL250。
用pEJG97轉化米曲霉Jal250獲得大約100個轉化子。將10個轉化子分離到單獨的PAD板上。
用5ml 0.01％吐溫20洗滌10個轉化子中5個的匯合PDA板，分別接種到125ml玻璃搖瓶中的25ml MDU2BP培養(yǎng)基中，并于34℃以250rpm進行培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，使用8-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)根據(jù)廠家的指示分析取自每種培養(yǎng)物的0.5μl上清液。培養(yǎng)物的SDS-PAGE圖譜表明某一轉化體(命名為轉化體1)具有大約130kDa的主帶。
用10ml 0.01％吐溫20洗滌轉化體1的匯合板(在PDA上生長)，并將其接種到裝有400ml MDU2BP培養(yǎng)基的2升Fernbach瓶中，以產生用于鑒定酶的培養(yǎng)液。第5天收獲燒瓶，并用0.22μm GP Express plus膜(Millipore，Bedford，MA)進行過濾。
實施例7pMJ09的構建使用如下所示的引物993429(反義)和993428(有義)通過PCR擴增源自瑞氏木霉RutC30基因組DNA的瑞氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶1基因(cbhl)終止子來構建載體pMJ04。反義引物設計成在5′端具有Pac I位點且在有義引物的5′端具有Spe I位點。
引物993429(反義)5’-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3’(SEQ ID NO12)引物993428(有義)5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO13)擴增反應液(50μl)含有1×ThermoPol反應緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因組DNA(用Qiagen，Chatsworth，CA的DNeasy Plant Maxi試劑盒分離)，0.3μM引物993429，0.3μM引物993428、和2U Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。將反應液在如下編程的Eppendorf Mastercycler 5333(Hamburg，Germany)中保溫30個循環(huán)，每個循環(huán)94℃30秒、55℃30秒、和72℃30秒(最后延伸15分鐘)。
在1.0％瓊脂糖凝膠上利用40mM Tris堿-20mM乙酸鈉-1mM EDTA二鈉(TAE)緩沖液分離反應產物，由凝膠上切除229bp產物帶條，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)根據(jù)廠家的說明進行純化。
用Pac I和Spe I消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit(Roche，Indianapolis，IN)連接到經過相同限制性內切酶消化的pAILo1中，產生pMJ04(圖6)。
使用如下所示的引物993696(反義)和993695(有義)通過PCR擴增源自瑞氏木霉RutC30基因組DNA的瑞氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶1基因(cbhl)啟動子來構建載體pMJ06。反義引物設計成在有義引物的5′端具有Sal I位點且在反義引物的5′端具有Nco I位點。
引物993695(有義)5’-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3’(SEQ ID NO14)引物993696(反義)5’-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3’(SEQ ID NO15)擴增反應液(50μl)的組成為1×ThermoPol反應緩沖液，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因組DNA(用QIAGEN DNeasy Plant Maxi試劑盒制備)，0.3μM引物993696，0.3μM引物993695，和2U Vent聚合酶。將反應液在如下編程的Eppendorf Mastercycler 5333程序中保溫30個循環(huán)，每個循環(huán)94℃30秒，55℃30秒，和72℃60秒(最后延伸15分鐘)。
在1.0％瓊脂糖凝膠上利用TAE緩沖液分離反應產物，由凝膠上切除988bp產物條帶，并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit凝膠提取試劑盒根據(jù)廠家的說明進行純化。
用Nco I和Sal I消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit連接到經過相同限制性內切酶消化的pMJ04中，產生pMJ06(圖7)。
使用如下所示的引物993843(反義)和99344(有義)通過PCR擴增源自瑞氏木霉RutC30基因組DNA的瑞氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶1基因(cbhl)終止子來構建表達載體pMJ09。反義引物設計成在5′端具有Pac I位點和Spe I位點且在有義引物的5′端具有Pvu I位點。
引物993844(有義)5’-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3’(SEQ ID NO16)引物993843(反義)5’-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3’(SEQ ID NO17)擴增反應液(50μl)的組成為1×ThermoPol反應緩沖液，0.3mM dNTP，100ng瑞氏木霉RutC30基因組DNA(用QIAGEN DNeasy Plant Maxi試劑盒提取)，0.3μM引物993844，0.3μM引物993843，和2U Vent聚合酶。將反應液在如下編程的Eppendorf Mastercycler 5333程序中保溫30個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃30秒，55℃30秒，和72℃60秒(最后延伸15分鐘)。
在1.0％瓊脂糖凝膠上利用TAE緩沖液分離反應產物，從膠凝體中切除473bp產物條帶，并使用QIAGEN QIAquick凝膠提取試劑盒根據(jù)廠家的說明進行純化。
用Pvu I和Spe I消化得到的PCR片段，并利用Rapid Ligation Kit連接到經過Pac I和Spe I消化的pMJ06中，產生pMJ09(圖8)。
實施例8煙曲霉GH3A家族β-葡糖苷酶基因在瑞氏木霉中的表達設計如下所示的兩條合成寡核苷酸引物，用于PCR擴增源自實施例4中所述pEJG97的煙曲霉β-葡糖苷酶基因。無需限制消化和連接，使用InFusion Cloning Kit將片段克隆到表達載體pMJ09中。
正向引物5’-GGACTGCGCACCATGAGATTCGGTTGGCTC-3’(SEQ IDNO18)反向引物5’-TCGCCACGGAGCTTACTAGTAGACACGGGG-3’(SEQ IDNO19)粗體字母代表編碼序列。其余序列與pMJ09的插入位點是同源的。
上述每種引物各取50pmol用于PCR反應液(50μL)，其中含有100ngpEJG97DNA，1×Pfx擴增緩沖液(InVitrogen，Carlsbad，CA)，1.5μL 10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物，2.5個單位的Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，1μl 50mM MgSO4，和2.5μl 10×PCRxEnhancer溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。擴增條件為一個循環(huán)的94℃2分鐘；30個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃15秒，55℃30秒，和68℃3分鐘。然后將加熱塊轉到4℃浸泡循環(huán)。
在1.0％瓊脂糖凝膠上利用TAE緩沖液分離反應產物，從凝膠中切除3kb產物條帶，并使用QIAGEN QIAquick凝膠提取試劑盒根據(jù)廠家的說明進行純化。
然后用Infusion克隆試劑盒將純化的3kb片段克隆到pMJ09中。用NcoI和Pac I消化載體。如上所述，通過凝膠電泳和Qiaquick凝膠純化來純化片段。在反應中將基因片段和消化載體連接起來，產生表達質粒pEJG107(圖9)，其中GH3A家族β-葡糖苷酶基因的轉錄處于瑞氏木霉cbhl啟動子的控制之下。所述連接液(50μl)的組成為1×InFusion緩沖液，1×BSA，1μlInfusion酶(1∶10稀釋)，100ng經Nco I和Pac I消化的pMJ09，和100ng煙曲霉β-葡糖苷酶純化PCR產物。將反應液于室溫保溫30分鐘。用1μl反應液轉化大腸桿菌電擊感受態(tài)SURE細胞(Stratagene，La Jolla，CA)。通過限制消化檢測含pEJG107質粒的大腸桿菌轉化體，并使用BioRobot 9600(QIAGEN公司，Chatsworth，CA)制備質粒DNA。
通過染料-終止物化學法(Giesecke等人，1992，Journal of VirologyMethods 3847-60)和引物步移策略利用Perkin-Elmer Applied Biosystems 377XL型自動DNA測序儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)對源自pEJG107的煙曲霉β-葡糖苷酶基因進行DNA測序。仔細檢查核苷酸序列信息的質量，并借助PHRED/PHRAP軟件(University ofWashington，Seattle，WA)將所有序列互相比較。
根據(jù)Christensen等人，1998，上文引文的方法來制備瑞氏木霉RutC30原生質體。用5μg pEJG107轉化瑞氏木霉RutC30。轉化產生大約100個轉化體。將60個轉化體分離到單獨的Cove/10mM尿苷板上，并于28℃保溫。
從60個轉化體中8個的板收集孢子，用無菌環(huán)刮取三次，并分別接種到裝在125ml玻璃搖瓶中的25ml CIM培養(yǎng)基中，并于28℃以250rpm進行培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，用7.5％Tris SDS-PAGE凝膠(Biorad，Hercules，CA)根據(jù)廠家的指示對取自各培養(yǎng)物的0.5μl上清液進行分析。培養(yǎng)物的SDS-PAGE圖譜表明其中一個轉化體(命名為轉化體1)具有大約130kDa的主帶。
實施例9煙曲霉β-葡糖苷酶的鑒定將如實施例6所述獲得的煙曲霉β-葡糖苷酶的3ml等分試樣用BioradEcono-Pac 10DG脫鹽柱(BioRad，Hercues，CA)脫鹽，在pH5.0的100mM檸檬酸鈉中產生大約4ml脫鹽培養(yǎng)液。然后用Amicon Centricon Plus-20(Biomax-5，5kD截留，PES膜)將脫鹽培養(yǎng)液濃縮至大約180μL，并用100mMpH5.0的檸檬酸鈉稀釋至大約500μl終體積。經過脫鹽、濃縮的培養(yǎng)液的BCA測定(Smith等，1985，Anal Biochem 15076-85)表明蛋白質濃度為1.00mg/ml。將第二個等分試樣也脫鹽以獲得更多的物質，其得到的結果類似。
濃縮脫鹽樣品的SDS-PAGE(BioRad Criterion 7.5％Tris-HCl)表明主帶為約130kD。從凝膠中切下130kD主帶，并進行N端氨基酸測序。
對來自脫鹽/濃縮培養(yǎng)液的煙曲霉β-葡糖苷酶評價在50℃、65℃和70℃的熱穩(wěn)定性。50℃和65℃的測定條件為100mM pH5.0的檸檬酸鈉，0.01％吐溫-20，4mM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷，[蛋白質]AfumGH3A＝6.9×10-6mg/ml，于50℃和65℃保溫。在0.5、1、2、3、3.75和24小時采集等分試樣。向每個等分試樣中加入1M pH10.0的碳酸鈉，并通過405nm吸光度來測定對硝基苯基陰離子的濃度。70℃的測定條件為100mM pH 5.0的檸檬酸鈉，0.01％吐溫-20，4mM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷，[蛋白質]＝5.6×10-6mg/ml。在0.25、0.5、1、2、4和5小時采集等分試樣。向每個等分試樣中加入1M pH10.0的碳酸鈉，并通過405nm吸光度來測定對硝基苯基陰離子的濃度。注意，上述每種蛋白質濃度指測定中的總蛋白質濃度，因為它們都是作為培養(yǎng)液而不是純化的酶來測定的。
圖10和11顯示了得到的結果。熱穩(wěn)定性定義為在對硝基苯基陰離子的適當轉化率(＜15％)之內給定時間間隔的線性反應動力學。雖然在4小時和24小時之間沒有時間點，但在50℃煙曲霉β-葡糖苷酶表現(xiàn)出在至少24小時內是穩(wěn)定的。在65℃時它表現(xiàn)出至少在3.75小時內是穩(wěn)定的，但此后穩(wěn)定性逐漸下降，在24小時對對硝基苯基陰離子的轉化率為65％。該轉化率是相當高的，因此除了可能的熱滅活之外，某些觀察到的轉化率下降可能是由于底物的消耗和/或產物的抑制。在70℃它好象可穩(wěn)定1小時，并且可相當?shù)胤€(wěn)定至2小時。
將含有源自如實施例6所述獲得的煙曲霉的GH3A家族β-葡糖苷酶的培養(yǎng)液首先脫鹽(BioRad Econo-Pac 10DG柱)并濃縮(Centricon Plus-20，Biomax-5，5kD截留)至0.92mg/ml的濃度(BCA測定)。然后，將它以0.037和0.0092μg/ml的總蛋白濃度與10mM纖維二糖在100mM pH5.0的檸檬酸鈉加0.01％吐溫-20中于65℃保溫。在0.5、1、2、3、4、6和19小時采集等分試樣。將等分試樣煮沸6分鐘以終止反應，并用Trinder測定(Sigma化學公司，St Louis，MO)和外部葡萄糖標準品測定葡萄糖濃度。圖12顯示了結果。在65℃在較少的蛋白質載量下(0.0092μg/ml)，β-葡糖苷酶似乎在6小時時維持其活性的90％，在19小時時為65％。在65℃β-葡糖苷酶似乎可適當穩(wěn)定至6小時。
生物材料的保藏下列生物材料已按照布達佩斯條約保藏于農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心，北方區(qū)域研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，1815University Street，Peoria，Illinois，61604)，并給出下列登記號
保藏物 保藏號 保藏日期大腸桿菌TOP10(pEJG113) NRRL B-30695 2003-10-17該菌株已經在如下條件下進行保藏，即根據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C§122，確保在本專利申請的審查過程中由授權的專利與商標官員所指定的人員能夠獲得該培養(yǎng)物。所述保藏物是所述保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交本申請副本或其后代的國家中，根據(jù)外國專利法的要求可以提供上述保藏物。但是，應該理解的是可以獲得保藏物并不構成這樣的許可，即實施本發(fā)明侵害了由政府授予的專利權。
本文描述并要求的發(fā)明并不限于本文所公開的具體實施方案的范圍，因為這些實施方案意圖在于舉例說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的實施方案意圖包括在本發(fā)明的范圍內。當然，根據(jù)上文描述，除本文所顯示和描述的之外，對本發(fā)明的各種修改對本領域技術人員而言應是顯而易見的。這些修改也應包括在所附權利要求的范圍內。一旦出現(xiàn)沖突，將以包括定義在內的本公開為準。
本文引用了多份參考文獻，完整收入其公開書作為參考。
序列表<110>諾維信股份有限公司<120>具有β-葡糖苷酶活性的多肽和編碼所述多肽的核酸<130>10545.204-WO<150>60/515,482<151>2003-10-28<160>19<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3060<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>1atgagattcg gttggctcga ggtggccgct ctgacggccg cttctgtagc caatgcccag60gtttgtgatg ctttcccgtc attgtttcgg atatagttga caatagtcat ggaaataatc 120aggaattggc tttctctcca ccattctacc cttcgccttg ggctgatggc cagggagagt 180gggcagatgc ccatcgacgc gccgtcgaga tcgtttctca gatgacactg gcggagaagg 240ttaaccttac aacgggtact gggtgggttg cgactttttt gttgacagtg agctttcttc 300actgaccatc tacacagatg ggaaatggac cgatgcgtcg gtcaaaccgg cagcgttccc 360aggtaagctt gcaattctgc aacaacgtgc aagtgtagtt gctaaaacgc ggtggtgcag 420acttggtatc aactggggtc tttgtggcca ggattcccct ttgggtatcc gtttctgtga 480gctatacccg cggagtcttt cagtccttgt attatgtgct gatgattgtc tctgtatagc 540tgacctcaac tccgccttcc ctgctggtac taatgtcgcc gcgacatggg acaagacact 600cgcctacctt cgtggcaagg ccatgggtga ggaattcaac gacaagggcg tggacatttt 660gctggggcct gctgctggtc ctctcggcaa atacccggac ggcggcagaa tctgggaagg 720cttctctcct gatccggttc tcactggtgt acttttcgcc gaaactatca agggtatcca 780agacgcgggt gtgattgcta ctgccaagca ttacattctg aatgaacagg agcatttccg 840acaggttggc gaggcccagg gatatggtta caacatcacg gagacgatca gctccaacgt 900ggatgacaag accatgcacg agttgtacct ttggtgagta gttgacactg caaatgagga 960
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65 70 75 80Pro Arg Leu Gly Ile Asn Trp Gly Leu Cys Gly Gln Asp Ser Pro Leu85 90 95Gly Ile Arg Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn100 105 110Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala115 120 125Met Gly Glu Glu Phe Asn Asp Lys Gly Val Asp Ile Leu Leu Gly Pro130 135 140Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu145 150 155 160Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr165 170 175Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr180 185 190Ile Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly195 200 205Tyr Gly Tyr Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys210 215 220Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala225 230 235 240Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr245 250 255Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu260 265 270Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala His His Ser Gly275 280 285Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile290 295 300Ser Phe Asp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser
305 310 315 320Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val325 330 335Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile340 345 350Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His355 360 365Ser Ala Val Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn370 375 380Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser385 390 395 400Thr Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu405 410 415Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly420 425 430Ala Asn Gly Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met435 440 445Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu450 455 460Gln Ala Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala465 470 475 480Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln485 490 495Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe500 505 510Ile Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp515 520 525Lys Asn Gly Glu Ala Val Ile Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn530 535 540Thr Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Arg Trp
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<211>30<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>18ggactgcgca ccatgagatt cggttggctc 30<210>19<211>30<212>DNA<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>19tcgccacgga gcttactagt agacacgggg 30
權利要求
1.選自下列的具有β-葡糖苷酶活性的分離多肽(a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸具有至少85％的同一性；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在至少高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交；和(c)在SEQ ID NO2第20至863位氨基酸的一個或多個氨基酸處含有保守替代、刪除、和/或插入的變體。
2.權利要求1的多肽，具有與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸至少85％同一性的氨基酸序列。
3.權利要求2的多肽，具有與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。
4.權利要求3的多肽，具有與SEQ ID NO2第20至863位氨基酸至少95％同一性的氨基酸序列。
5.權利要求1-4任一項的多肽，含有氨基酸序列SEQ ID NO2。
6.權利要求1-5任一項的多肽，由SEQ ID NO2或其具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。
7.權利要求6的多肽，其由SEQ ID NO2組成。
8.權利要求6的多肽，其由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸組成。
9.權利要求1的多肽，由如下多核苷酸編碼，該多核苷酸在至少高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交。
10.權利要求1的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO2第20至863位氨基酸含有一個或多個氨基酸的保守替代、刪除、和/或插入的變體。
11.權利要求1的多肽，由質粒pEJG113所含多核苷酸編碼，其中質粒pEJG113包含于大腸桿菌NRRL B-30695中。
12.包含編碼權利要求1-11任一項的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
13.權利要求12的分離多核苷酸，在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一處突變，其中突變型核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸組成的多肽。
14.一種核酸構建體，包含可操作連接至一種或多種控制序列的權利要求12的多核苷酸，其中所述控制序列在表達宿主中指導所述多肽的生產。
15.包含權利要求14的核酸構建體的重組表達載體。
16.包含權利要求14的核酸構建體的重組宿主細胞。
17.生產權利要求1-11任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞在其野生型時能夠產生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
18.生產權利要求1-11任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下核酸構建體的宿主細胞，該核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。
19.生產親本細胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權利要求1-11任一項的多肽的核苷酸序列，所述破壞或缺失導致產生的多肽比親本細胞少的突變體。
20.通過權利要求19的方法生產的突變體細胞。
21.權利要求20的突變體細胞，它還包含編碼天然或異源蛋白的基因。
22.生產蛋白質的方法，包括(a)在有助于生產所述蛋白質的條件下培養(yǎng)權利要求21的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質。
23.一種分離的多核苷酸，其編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽，其通過(a)在高嚴謹條件下將一群DNA與(i)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸，(ii)SEQ ID NO1第58至2580位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸而獲得的。
24.生產具有突變型核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括(a)將至少一種突變導入SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中，其中突變型核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2第20至863位氨基酸組成的多肽；并(b)回收包含突變型核苷酸序列的多核苷酸。
25.通過權利要求24的方法生產的突變型多核苷酸。
26.生產多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的權利要求25的突變型多核苷酸的細胞；并(b)回收所述多肽。
27.包含編碼一種蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作連接至由SEQ ID NO1第1至58位核苷酸組成的編碼信號肽的核苷酸序列，其中所述基因對于第一和第二核苷酸序列而言是外源的。
28.包含權利要求27的核酸構建體的重組表達載體。
29.包含權利要求27的核酸構建體的重組宿主細胞。
30.生產蛋白質的方法，包括(a)在有助于生產所述蛋白質的條件下培養(yǎng)權利要求29的重組宿主細胞；并(b)回收所述蛋白質。
31.生產權利要求1-11任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于生產所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，該多核苷酸編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽；并(b)回收所述多肽。
32.包含權利要求1-11任一項的多肽和表面活性劑的洗滌劑組合物。
33.經過編碼權利要求1-11任一項的多肽的多核苷酸轉化的轉基因植物、部分植株或植物細胞。
34.降解含纖維素和半纖維素的生物量的方法，包括用有效量的權利要求1-11任一項的多肽處理生物量并回收經過降解的生物量。
35.權利要求34的方法，還包括用有效量的內切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶處理生物量。
36.降解含纖維素和半纖維素的生物量的方法，包括用權利要求29的宿主細胞處理生物量并回收經過降解的生物量。
37.權利要求36的方法，還包括用有效量的內切-1，4-β-葡聚糖酶和外切-1，4-β-D-葡聚糖酶處理生物量。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有β－葡糖苷酶活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體、和宿主細胞，以及生產和使用所述多肽的方法。
文檔編號C12N15/74GK1902310SQ200480039250
公開日2007年1月24日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權日2003年10月28日
發(fā)明者保羅·哈里斯, 伊麗莎白·戈萊特利 申請人:諾維信股份有限公司