專利名稱：萬壽菊素-3-o-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種采用高速逆流色譜法從外來入侵植物黃頂 菊提取物中分離制備出高純度單體萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法。
技術(shù)背景黃頂菊[,/"vm'a 6/(ie"船(L.) Kuntze]為菊禾斗堆心菊族黃頂菊屬 (F/"wWa) —年生草本植物，起源于南美洲。黃頂菊植株高大密集，種 子產(chǎn)量驚人，繁殖能力和適應性極強，可入侵農(nóng)田、路邊、荒地等多種 生境，并能通過化感作用抑制其它植物的生長，從而迅速占領生態(tài)位。 除原產(chǎn)地以外，黃頂菊在其他國家和地區(qū)均表現(xiàn)出入侵性，對生態(tài)環(huán)境 和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有極大威脅，是一種危險性極高的外來入侵植物。自2001 年在我國衡水湖畔首次發(fā)現(xiàn)以來，黃頂菊在河北、天津等地迅速蔓延。 從目前的防治經(jīng)驗來看，僅依靠傳統(tǒng)的人工鏟除和簡單的藥劑防治很難 達到理想的控制效果，因此，從化學生態(tài)學的角度闡明物種之間相互作 用的化學基礎，深層次揭示其入侵機理及對生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性的影 響，對于建立黃頂菊可持續(xù)發(fā)展的綜合防御和控制體系是必需也是迫切 的。另一方面，在研究治理措施的同時，若能進行深入研究，進一步開 發(fā)活性次生物質(zhì)及相應的醫(yī)藥和農(nóng)用功能，就可變廢為寶、變害為益， 為黃頂菊的綜合治理尋找到一條新的出路。文獻報道黃頂菊中主要活性物質(zhì)是黃酮類化合物，黃酮類化合物有廣泛的生理和藥理作用，如雙重 雌激素樣作用、消除活性氧自由基、抵抗生物氧化、抑制炎癥反應，調(diào) 節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)血脂、預防動脈硬化，防癌抗癌、抑制腫瘤、抑菌和 抗病毒、延緩衰老等作用。現(xiàn)有文獻報道采用柱層析及高效液相色譜的方法分離，經(jīng)反相硅膠柱，碳十八柱，及S印hadex LH-20柱從乙醇取后粗品分離獲得萬壽菊 素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷，或者經(jīng)反復多次硅膠柱分離獲得萬壽 菊素_3-0-葡萄糖苷和紫云英苷，工藝繁瑣，成本高，回收率低。逆 流色譜分離制備方法可以達到高純度，成本低，回收率高，優(yōu) 于傳統(tǒng)的柱層析及高效液相色譜分離方法在兩方面， 一方面沒 有固態(tài)支持體無不可逆吸附損失，另一方面粗品可以直接上柱。 由 于 高速逆 流色譜 (High-speed Count ercurrent Chromatography, HSCCC)是近些年發(fā)展起來的 一 種連續(xù)的無需 任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避 免了固態(tài)支持體或載體帶來的各種問題---樣品易被吸附、損耗 和變性，使用其它液相色譜法進行制備量分離時，其分配效率 會明顯降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離 量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。逆 流色譜儀能直接進大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達 到相當高的純度，甚至能直接接質(zhì)譜儀等儀器，己廣泛應用于 生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領域化學物質(zhì)的制備分離和純化。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是以乙醇提取的黃頂菊粗品為原料從含量僅為2. 1%的萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷經(jīng)高速逆流色譜 的方法得到純度95%以上的萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英 苷。本發(fā)明的方案是乙醇回流提取的黃頂菊粗品原料通過逆流 色譜法分離制備高純度萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷。選 擇溶劑的兩相組合，選用的兩相體系為含水溶劑體系。含水溶劑 體系由三個組分構(gòu)成，A組分是醚類、正構(gòu)垸烴或脂肪酯。B組分是乙 腈、脂肪醇或脂肪酮。C組分為水。正構(gòu)烷烴為正己烷、正庚烷、正戊垸。脂肪酯是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯或乙酸正丁酯。 脂肪醇或脂肪酮為甲醇、乙醇或丙酮。醚類是乙醚、石油醚或甲基叔丁基醚。采用含水溶劑體系，以上相為固定相，下相為流動相，在保 證上下相體積比小于1前提下，根據(jù)溶解度常數(shù)，在不破壞體 系平衡的情況下，調(diào)節(jié)A : B : C三組分的體積比30-10 : 1 : 30-10，經(jīng)過一次逆流分離得到萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云 英苷。實驗條件適合室溫15-30°C，室溫對分離效率影響不大。在 上述溫度范圍內(nèi)，室溫較高時，出峰時間略有提前，分離效率 變化不大，對萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷峰形無影響。首先按體積比將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖勻后靜 置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙 烯柱，柱容積為240mL， 8823A-UV紫夕卜檢測器，Yokogawa 3057 便攜式記錄儀。將黃頂菊粗提物溶解于流動相中待用。進樣前， 先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為500-1000 rpm，以 0. 5-3. OmL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)，待整個體系建立動態(tài) 平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，接收目標 成分，得到固體。用本方法提取的萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷其純 度可達到95%以上。適用于用各種型號的逆流色譜儀分離制備萬 壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷單體，能直接進大量粗提樣品 或合成混合物，分離結(jié)果能達到相當高的純度。
具體實施方式
實施例1:選取正己烷-乙醇-水在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃頂菊提取物(乙醇提取的黃頂菊原料)，首先按10 : 1 : 10體 積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待 平衡一段時間后，將上相和下相分開，取下相作為固定相，上 相作為流動相。采用半制備型高速逆流色譜儀，配有NS-1007 泵，20mL進樣閥，聚四氟乙烯柱，柱容積為240mL， 8823A-UV 紫外檢測器，Yokogawa 3057便攜式記錄儀。稱取400mg乙醇提取的黃頂菊原料溶解于20mL流動相中待用。進樣前，先用固定 相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為500rpm，以0.5 mL/min的流 速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥 進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，接收目標成分，其HPLC純度 達到96%左右。 實施例2:選取乙酸丁酯-甲醇-水在半制備型逆流色譜儀上來分離黃頂菊提取物。先按30: 1 : 30體積比將上述溶劑組分配置于分 液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下 相分開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備型 高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙烯 柱，柱容積為240mL， 8823A-UV紫夕卜檢測器，Yokogawa 3057便 攜式記錄儀。稱取100mg乙醇提取的黃頂菊粗品溶解于20mL流 動相中待用，進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速 為1000rpm，以3.0mL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi) ，待整個體 系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖， 接收目標成分，其HPLC純度達到97%左右。 實施例3:取乙酸乙酯-甲醇-水組分在分析型逆流色譜儀上來分離黃頂菊提取物。首先按10 : 1 : 30體積比將上述溶劑組分配置于 分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和 下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備型高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙 烯柱，柱容積為240mL, 8823A-UV紫外檢測器，Yokogawa 3057 便攜式記錄儀。稱取400mg乙醇提取的黃頂菊粗品溶解于10mL 流動相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機 轉(zhuǎn)速為800rpm，以2. OmL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整 個體系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外 譜圖，接收目標成分，其HPLC純度達到96%以上。 實施例4:選取乙酸乙酯-乙腈-水在半制備型逆流色譜儀上來分離黃頂菊提取物，首先按30 : 1 : IO體積比將上述溶劑組分配置于分 液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下 相分開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備型高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙烯 柱，柱容積為240mL， 8823A-UV紫夕卜檢測器，Yokogawa 3057便 攜式記錄儀。稱取370mg乙醇提取的黃頂菊粗品溶解于20mL流 動相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn) 速為800rpm，以2. OmL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體 系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖， 接收目標成分，其HPLC純度達到97%左右。 實施例5:選取乙酸乙酯-乙醇-水在半制備型逆流色譜儀上來分離黃 頂菊提取物。首先按15 : 1 : 15體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和 下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備型高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙 烯柱，柱容積為240mL， 8823A-UV紫外檢測器，Yokogawa 3057 便攜式記錄儀。稱取360mg乙醇提取的黃頂菊溶解于20mL流動 相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速 為800rpm，以2. OmL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體 系建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖， 接收目標成分，其HPLC純度達到96%左右。 實施例6:選取乙酸異丙酯-乙腈-水在半制備型逆流色譜儀上來分離 黃頂菊提取物，首先按20 : 1 : 20體積比將上述溶劑組分配置于 分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和 下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備 型高速逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙 烯柱，柱容積為240mL， 8823A-UV紫夕卜檢測器，Yokogawa 3057 便攜式記錄儀。稱取365mg乙醇提取的黃頂菊溶解于20mL流動 相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速 為800rpm，以2. OmL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系 建立動態(tài)平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖， 得到黃色固體，其HPLC純度達到97%左右。 實施例7:選取石油醚-乙醇-水在半制備型逆流色譜儀上來分離黃頂菊提取物，首先按10 : 1 : IO體積比將上述溶劑組分配置于分液漏 斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分 開，取下相作為固定相，上相作為流動相。采用半制備型高速 逆流色譜儀，配有NS-1007泵，20mL進樣閥，聚四氟乙烯柱， 柱容積為240mL， 8823A-UV紫外檢測器，Yokogawa 3057便攜式 記錄儀。稱取300mg乙醇提取的黃頂菊溶解于20mL流動相中待 用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為800rpm， 以2.0mL/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài) 平衡后，由進樣閥進樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，得到黃色 固體，其HPLC純度達到97%左右。
權(quán)利要求
1.一種萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法，其特征在于它是采用逆流色譜法從植物黃頂菊乙醇回流提取物中分離制備高純度萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，其溶劑組分由三個組分構(gòu)成由醚類或正構(gòu)烷烴或脂肪酯、乙腈或脂肪醇或脂肪酮和水構(gòu)成，體積比依次為30-10∶1∶30-10。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種萬壽菊-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法，其特征在于正構(gòu)垸烴是正己垸、正庚垸或正戊垸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法，其特征在于脂肪醇或脂肪酮是甲醇、乙醇或丙酮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云 英苷的分離制備方法，其特征在于脂肪酯是乙酸乙酯、乙酸丙 酯、乙酸異丙酯或乙酸正丁酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種萬壽菊素-3-0-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法，其特征在于醚類是乙醚、石油醚或甲基叔丁基醚。
全文摘要
本發(fā)明涉及萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分離制備方法；它是采用逆流色譜法從植物黃頂菊乙醇回流提取物中分離制備高純度萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，其溶劑組分由三個組分構(gòu)成由醚類或正構(gòu)烷烴或脂肪酯、乙腈或脂肪醇或脂肪酮和水構(gòu)成，體積比依次為30-10∶1∶30-10；其適用于用各種型號的逆流色譜儀分離制備單體萬壽菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，能直接進大量粗品或合成混合物，分離純度能達到95％以上。
文檔編號B01D15/08GK101565437SQ20091008513
公開日2009年10月28日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者謝倩倩, 蕓 魏 申請人:北京化工大學