專利名稱：使用自衍生的抗原結(jié)合特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑改變b細(xì)胞病理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及免疫學(xué)和免疫治療學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及通過使用療法組合改變B細(xì)胞介導(dǎo)的病理，如B細(xì)胞惡性腫瘤和/或自身免疫病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
循環(huán)系統(tǒng)的癌癥幾種類型的癌癥起源于循環(huán)系統(tǒng)。主要類型包括白血病，骨髓和血液腫瘤；骨髓瘤，B細(xì)胞瘤；和淋巴瘤，起源于淋巴系統(tǒng)的癌癥?？梢詫⒘馨土鲞M(jìn)一步細(xì)分成一些組；臨床上最重要的淋巴瘤之一是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
非霍奇金淋巴瘤又形成不同組的癌癥。根據(jù)腫瘤分類的國際工作分類法(International Working Formulation for tumor classification)定義了這些淋巴瘤的三個(gè)寬泛類別低級、中級和高級。這些級別的淋巴瘤的侵襲性和對治療的反應(yīng)不同(Cheson等人，″Report of anInternational Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin′s Lymphomas，″J.Clin.Oncol.17(4)1244，1999)。低級淋巴瘤通常以淋巴結(jié)病存在，通常為無痛的或者生長緩慢。中等和高級疾病通常以具有大的結(jié)外腫瘤的更有侵襲性的癌癥存在?？傊?，根據(jù)癌癥發(fā)生率和死亡率這些淋巴瘤總計(jì)在美國占第五位，并且每年診斷約50,000個(gè)新病例。
還可以使用Ann Arbor分類系統(tǒng)對NHL患者分類I期——累及單個(gè)淋巴結(jié)區(qū)或者局部化累及單個(gè)淋巴外器官或部位。II期——累及膈膜同側(cè)的兩個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)區(qū)域，或者局部化累及單個(gè)相關(guān)的淋巴外器官或者部位和其局部淋巴結(jié)并累及或不累及膈膜同側(cè)的其它淋巴結(jié)區(qū)。III期——累及膈膜兩側(cè)的淋巴結(jié)區(qū)，可能伴隨著局部化累及淋巴外器官或者部位，累及脾臟，或者兩者。IV期——散布(多病灶)累及1個(gè)或多個(gè)淋巴外部位，累及或不累及相關(guān)的淋巴結(jié)或者獨(dú)立的淋巴外器官與遠(yuǎn)距離(非區(qū)域性的)淋巴結(jié)。在Ann Arbor系統(tǒng)中，成人NHL的I、II、III和IV期細(xì)分成A和B類，這取決于患者是否具有界限清楚的一般化癥狀(B)或者(A)。B命名涉及表現(xiàn)出下面的癥狀的患者診斷前6個(gè)月內(nèi)不能解釋的10％以上體重的減輕，不能解釋的高于38℃的發(fā)熱和濕透性盜汗。其他細(xì)節(jié)見TheInternational Non-Hodgkin′s Lymphoma Prognostic Factors ProjectA predictive model for aggressive non-Hodgkin′s lymphoma.New Eng.J.Med.329(14)987-994(1993)。
淋巴瘤和白血病的治療此類瘤性淋巴細(xì)胞增生性疾病，包括白血病和淋巴瘤，已經(jīng)成為許多藥物、手術(shù)和免疫學(xué)治療方案的焦點(diǎn)，所述治療方案取得了不同程度的成功。盡管在治療某些類型，特別如低級B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中取得了重要進(jìn)步，但是大多數(shù)患者在應(yīng)答當(dāng)前最好的可以利用的治療后復(fù)發(fā)?；颊咄ǔＲ允褂弥委焺┑慕M合開始細(xì)胞減少性化學(xué)治療，所述組合通過它們的首字母縮略詞表示(例如，MOPP指甲二氯二乙胺、長春新堿(Oncovin)、潑尼松和丙卡巴肼；CHOP指環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；CVP指環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；EPOCH指依托泊苷、潑尼松、長春新堿、環(huán)磷酰胺和多柔比星)。對于復(fù)發(fā)患者，最近批準(zhǔn)了新的療法；現(xiàn)在通常以抗-CD20單克隆抗體Rituxan或者類似抗體的形式用被動(dòng)免疫療法治療這類患者。該療法通常導(dǎo)致暫時(shí)緩解。
化學(xué)療法通常，淋巴瘤和白血病的第一輪治療是化學(xué)療法。在本領(lǐng)域中有許多化學(xué)療法可以用來治療B細(xì)胞和T細(xì)胞惡性腫瘤。通常，如前面討論的使用化學(xué)治療劑的組合，如CHOP、CVP和EPOCH。關(guān)于化學(xué)治療劑和它們的施用方法的詳細(xì)討論見Dorr等人，CancerChemotherapy Handbook，2dedition，Appleton &Lange(Connecticut，1994)，將其引用作為參考。化學(xué)治療方案的其他描述和方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
單克隆抗體最近研發(fā)的治療是使用針對在B細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的抗體治療B細(xì)胞淋巴瘤。CD20由于其在惡性B細(xì)胞表面上的高水平表達(dá)而成為B細(xì)胞淋巴瘤的吸引人的靶標(biāo)。此外，CD20抗原是治療的合理靶標(biāo)，因?yàn)?1)它不由腫瘤B細(xì)胞脫落，(2)它不被腫瘤B細(xì)胞內(nèi)化，和(3)它的表達(dá)不受調(diào)節(jié)。非患病組織上的CD20是早期前B細(xì)胞發(fā)育期間由B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗原并且在表面保持表達(dá)直到B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞。人們相信CD20分子調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化所需的B細(xì)胞活化過程中的步驟。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)抗-CD20抗體單獨(dú)或者聯(lián)合另一種抗體或者其他化學(xué)治療劑作為療法(見，例如，美國專利6,455,043B1，2002年9月24日出版)。食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)已經(jīng)批準(zhǔn)抗-CD20抗體Rituxan用于復(fù)發(fā)的和以前治療的低級非霍奇金淋巴瘤(NHL)。采用相關(guān)單克隆抗體Zevalin的療法也獲得批準(zhǔn)(見，例如，Witzig TE等人，″Randomized controlled trial of yttrium-90-labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy versus rituximabimmunotherapy for patients with relapsed or refractory low-grade，follicular，or transformed B-cell non-Hodgkin′s lymphoma，″J ClinOncol.(2002)May 15；20(10)2453-63)。另一種抗CD-20抗體Bexxar(托西莫單抗)最近由FDA批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞淋巴瘤。在臨床試驗(yàn)中用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的其他單克隆抗體包括Oncolym(針對HLA-Dr10蛋白質(zhì))、依帕珠單抗(針對CD22)，和抗CD52抗體((Campath/MabCampath)(阿侖單抗)。
盡管它們的作用機(jī)制仍然有爭論，但是抗-CD20單克隆抗體涉及通過誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生治療效果。凋亡允許身體在多種過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目，所述過程包括發(fā)育、分化和細(xì)胞更新。經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的一個(gè)特征性改變是與內(nèi)切核酸酶活性相關(guān)的DNA降解，當(dāng)通過凝膠電泳分辨時(shí)成梯狀外觀。其他特征性改變包括膜起泡和其他細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞皺縮和失去與鄰近細(xì)胞的接觸以及質(zhì)膜的改變。已經(jīng)鑒定了多種程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑，包括TGF-β、TNF、Fas配體、某些神經(jīng)遞質(zhì)、鈣、糖皮質(zhì)激素、細(xì)菌毒素、腫瘤抑制因子和化學(xué)治療劑，如順鉑、多柔比星、博來霉素、潑尼松等等。此外，通過物理損傷，如熱激、病毒感染、自由基和γ輻射；和毒素，如β-淀粉樣肽誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。
免疫療法除了上面的治療方法，已經(jīng)開發(fā)了基于刺激患者自身免疫系統(tǒng)治療B細(xì)胞癌癥的一些實(shí)驗(yàn)性療法。針對唯一由惡性B細(xì)胞產(chǎn)生的抗原開發(fā)基于免疫學(xué)的療法的最初嘗試包括直接從病理B細(xì)胞費(fèi)力地分離和純化獨(dú)特型(Id)蛋白質(zhì)。該技術(shù)首先用于小鼠模型系統(tǒng)，其使用針對這些分離的蛋白質(zhì)上獨(dú)特型決定簇的主動(dòng)免疫以提供對腫瘤生長的抗性(Daley等人，J.Immunol.120(5)1620-24，1978；Sakato等人，Microbiol.Immunol.23(9)927-31，1979)。在許多其他實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型中證實(shí)了這些結(jié)果(Stevenson等人，J.Immunol.130(2)970-03，1983；George等人，J.Immunol.141(6)2168-74，1988；和Kwak等人，Blood 76(11)2411-17，1990)。
將該想法和技術(shù)帶入臨床的首次嘗試勞動(dòng)強(qiáng)度非常大。這些首次嘗試使用針對從活組織檢查后的患者個(gè)體淋巴瘤中分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體。在一項(xiàng)研究中，Meeker和同事生產(chǎn)了小鼠單克隆抗獨(dú)特型抗體，其用于治療其中多數(shù)患者已經(jīng)經(jīng)歷常規(guī)淋巴瘤化學(xué)治療的一小組患者(Meeker等人，Blood 651349-63，1985)。然而，僅在約一半患者中得到了陽性結(jié)果。還注意到淋巴瘤細(xì)胞可以通過多種方式產(chǎn)生針對這種治療的抗性，所述方式為諸如(a)轉(zhuǎn)換細(xì)胞表面表達(dá)的抗體的類型(Meeker等人，N Engl J Med.3121658-65，1985)，或者(b)通過CDR2區(qū)中體細(xì)胞突變(Cleary等人，Cell 4497-106，1986)。從而，盡管該被動(dòng)免疫治療方法具有僅需要分離和純化在小鼠中產(chǎn)生抗體應(yīng)答所必需的相對小量的患者獨(dú)特型蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，但是它在治療淋巴瘤中的有用性仍然非常有限。
Kwak等人采用不同方法，使用從他們自身的獨(dú)特淋巴瘤純化的蛋白質(zhì)主動(dòng)免疫患者。該方法在后勤需求方面遇到困難，因?yàn)楸仨毞蛛x大量的獨(dú)特型蛋白質(zhì)(Kwak等人，N.Engl.J.Med.3271209-15，1992)。通過接種自體獨(dú)特型蛋白質(zhì)治療經(jīng)化學(xué)治療后具有最小或者沒有病變的患者。為了得到足夠量的用于接種的獨(dú)特型蛋白質(zhì)，將通過活組織檢查得到的淋巴瘤細(xì)胞與所建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系融合以促進(jìn)它們在組織培養(yǎng)中的生長，并通過層析法純化所分泌的獨(dú)特型蛋白質(zhì)。然而，由于巨大的勞力需求、技術(shù)障礙、需要相對大量的存活腫瘤細(xì)胞和昂貴的費(fèi)用，妨礙了該治療方法的大規(guī)模應(yīng)用。此外，最近出現(xiàn)的對哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)相關(guān)的病毒載量的關(guān)注要求在使用此類來源中更加謹(jǐn)慎。
在下面的文章中，Hsu等人報(bào)導(dǎo)了使用接種接合到匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)的獨(dú)特型治療B細(xì)胞淋巴瘤的上述臨床試驗(yàn)的I/II期結(jié)果(Hsu等人，Blood 893129-35，1997)。所得結(jié)果表明抗獨(dú)特型應(yīng)答的產(chǎn)生與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。與沒有產(chǎn)生免疫應(yīng)答的患者相比，產(chǎn)生抗獨(dú)特型細(xì)胞免疫應(yīng)答的所有患者無疾病發(fā)展的持續(xù)時(shí)間和總的存活時(shí)間顯著延長。為了治療每名患者，再次將通過活組織檢查得到的淋巴瘤細(xì)胞與所建立的細(xì)胞株融合以允許產(chǎn)生用來免疫典型患者的足夠蛋白質(zhì)。所得結(jié)果是有希望的，然而該過程太困難，普遍的或商業(yè)規(guī)模上應(yīng)用是不實(shí)際的。
最近，Bendandi等人闡明患有濾泡性淋巴瘤的患者中獨(dú)特型、患者特異的免疫誘導(dǎo)緩解(Bendandi等人，Nat.Med.51171-77，1999)。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療后，使用伴有粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF；見下文)的患者特異的獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫完全臨床緩解的20名患者。在化學(xué)治療前、臨床緩解時(shí)和接種治療后進(jìn)行該淋巴瘤的轉(zhuǎn)移特征的分子分析。發(fā)現(xiàn)化學(xué)療法誘導(dǎo)的緩解后具有可檢測的轉(zhuǎn)移的11名患者中的8名患者在該接種后經(jīng)歷完全分子緩解。在20名患者的19名中發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的細(xì)胞毒性CD8+和CD4+T細(xì)胞。還檢測到腫瘤特異抗體，但是發(fā)現(xiàn)其不是緩解所需的。該研究再次使用由發(fā)現(xiàn)與患者的淋巴瘤有關(guān)的免疫球蛋白的完整可變區(qū)和恒定區(qū)組成并且由異雜交瘤(heterohybridoma)融合產(chǎn)生的獨(dú)特型蛋白質(zhì)。
研發(fā)針對B細(xì)胞介導(dǎo)的惡性腫瘤的更有效的治療方案的一種途徑是將抗-CD20療法與其他治療方法結(jié)合。此類聯(lián)合治療可以是其他抗體、其他化學(xué)治療劑或者針對一般性地刺激患者的免疫系統(tǒng)的治療。此類聯(lián)合治療之一是使用抗-CD20抗體聯(lián)合20(S)-喜樹堿，如在美國專利6,420,378B1中提出的(2002年7月16日出版)。其他此類聯(lián)合治療在2001年8月30日公布的轉(zhuǎn)讓給IDEC Pharmaceuticals Corp.的美國專利申請2001/0018041A1中提出(使用抗-CD20和抗-CD40L抗體)。這些聯(lián)合治療還可以用作除了低級的濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)之外的其他類型淋巴瘤的療法。
然而，不幸的是，癌癥患者在任何治療方案后經(jīng)常遇到疾病復(fù)發(fā)?？紤]到僅在1999年，在美國就預(yù)測有接近57,000個(gè)新的NHL病例，更有效或者額外的治療將是有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明的特征在于用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑(cytoreductiveagent)如抗-CD20抗體治療B-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病后不久，用獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫的令人驚奇的協(xié)同效果。從而，一方面，本發(fā)明的特征在于用聯(lián)合療法治療患者中B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，其包括同時(shí)期共同施用(1)特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑和(2)包含自體Id蛋白質(zhì)的免疫治療組合物。對于本發(fā)明，同時(shí)期共同施用指在先前治療開始時(shí)、期間或者結(jié)束時(shí)或者在先前治療結(jié)束后的三個(gè)月內(nèi)施用免疫治療組合物。
另一方面，本發(fā)明的特征在于用聯(lián)合療法治療患者中B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，其包括同時(shí)期共同施用(1)特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑和(2)免疫治療組合物，其中該免疫治療組合物已經(jīng)裝載在樹突狀細(xì)胞中從而該樹突狀細(xì)胞包含至少一部分自體Id蛋白質(zhì)。在該方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞是自體樹突狀細(xì)胞。在該方面可以以與樹突狀細(xì)胞相似的方式使用朗格漢斯細(xì)胞。
在不同的方面，本發(fā)明的特征在于改進(jìn)B細(xì)胞惡性腫瘤治療的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤治療包括施用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑并且其中所述改進(jìn)治療包括同時(shí)期共同施用自體Id蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞惡性腫瘤以前未經(jīng)治療，或者至少以前未經(jīng)化學(xué)治療劑治療。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，待治療的疾病選自復(fù)發(fā)的B細(xì)胞惡性腫瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(其中非霍奇金淋巴瘤是低級的、中級的或者高級的)、小淋巴細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性和小裂細(xì)胞為主性B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性和混合的小裂細(xì)胞和大細(xì)胞類型B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性和大細(xì)胞為主類型的B細(xì)胞淋巴瘤、彌散性小裂細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、彌散性混合的小和大細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、彌散性大細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、大細(xì)胞免疫母細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、淋巴母細(xì)胞性B細(xì)胞淋巴瘤、小型無分裂性伯基特和非伯基特型B細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)的淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性淋巴結(jié)病、單核細(xì)胞樣B-細(xì)胞淋巴瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤、慢性B細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞譜系的急性淋巴母細(xì)胞性白血病和B-細(xì)胞譜系的慢性淋巴母細(xì)胞性白血病。
在其他實(shí)施方案中，用自體Id蛋白質(zhì)進(jìn)行的同時(shí)期共同施用的治療在所述特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的最后施用的三個(gè)月內(nèi)、在所述特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的最后施用的二個(gè)月內(nèi)、在所述特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的最后施用的一個(gè)月內(nèi)，或者在所述特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的最后施用的一周內(nèi)開始。用自體Id蛋白質(zhì)進(jìn)行的同時(shí)期共同施用的治療也可以與細(xì)胞減少劑治療同時(shí)進(jìn)行或者在細(xì)胞減少劑治療的一周內(nèi)進(jìn)行。
在其他實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑是抗原結(jié)合性細(xì)胞減少劑。在這些實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合性細(xì)胞減少劑選自由抗-CD20抗體、抗-CD52抗體、抗-CD22抗體、抗-B7抗體、抗-CD19抗體、抗-CD32抗體、抗-CD33抗體、抗-CD64抗體、抗-CD16抗體、抗-CD86抗體、抗-CD156抗體組成的組。其他特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑也可以用于本發(fā)明。惡性免疫細(xì)胞如B細(xì)胞的細(xì)胞表面含有可以作為特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的配體的許多蛋白質(zhì)。本發(fā)明中也可以使用此類能夠結(jié)合惡性B細(xì)胞和導(dǎo)致細(xì)胞減少的特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑。
在其他實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生自體Id蛋白質(zhì)，其中可能的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、昆蟲或者其他宿主的細(xì)胞。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在昆蟲細(xì)胞系中重組產(chǎn)生自體Id蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(包括CHO細(xì)胞和BHK細(xì)胞)中重組產(chǎn)生自體Id蛋白質(zhì)。在其他更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，在細(xì)菌或者酵母細(xì)胞(包括釀酒酵母(S.cerevisiae))中重組生產(chǎn)自體Id蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，將Id蛋白質(zhì)以編碼Id蛋白質(zhì)的DNA分子，例如，DNA疫苗的形式遞送到患者。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，自體Id蛋白質(zhì)在施用前偶聯(lián)到KLH。
在相關(guān)方面，自體Id蛋白質(zhì)由開放閱讀框編碼，其中該開放閱讀框的一部分DNA序列從分離自待治療的患者的B細(xì)胞惡性腫瘤的核酸序列得到。在一個(gè)實(shí)施方案中，自體Id蛋白質(zhì)不包含全長抗體重鏈或者全長抗體輕鏈。在其他實(shí)施方案中，Id蛋白質(zhì)不包含全長抗體重鏈。在其他實(shí)施方案中，自體Id蛋白質(zhì)不包含全長抗體輕鏈。
在本發(fā)明的另一方面，用自體Id蛋白質(zhì)進(jìn)行的同時(shí)期共同施用的治療在特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑施用結(jié)束前開始并且其中使用自體Id蛋白質(zhì)和細(xì)胞減少劑的治療平行地繼續(xù)。從而，在自體Id蛋白質(zhì)的首次施用后繼續(xù)用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑治療，并且特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的施用和自體Id蛋白質(zhì)的施用在治療過程期間以間歇方式繼續(xù)進(jìn)行。
附圖簡述

圖1在化學(xué)治療后復(fù)發(fā)/頑固性濾泡性NHL患者中用Rituxan進(jìn)行的細(xì)胞減少后FavId治療。圖1顯示了與Witzig T.E.等人，″Randomized controlled trial of yttrium-90-labeled ibritumomabtiuxetan radioimmunotherapy versus rituximab immunotherapy forpatients with relapsed or refractory low-grade，follicular，ortransformedB-cell non-Hodgkin′s lymphoma，″J Clin Oncol.(2002)May 15；20(10)2453-63相比，根據(jù)實(shí)施例1中的資料的試驗(yàn)結(jié)果。該圖比較了用利妥昔單抗(rituximab)治療后通過FavIdTM治療的結(jié)果與如Witzig，等人中公布的僅用rituximab治療的結(jié)果。這些結(jié)果表明rituximab的單次療程后2個(gè)月開始用FavIdTM對化學(xué)治療復(fù)發(fā)/頑固性B細(xì)胞NHL患者的治療導(dǎo)致與僅用rituximab治療相比，疾病進(jìn)展時(shí)間顯著延長。
圖2在未經(jīng)治療的濾泡性NHL患者中用Rituxan進(jìn)行細(xì)胞減少后的FavId治療。圖2顯示了與Colombat P等人″Rituximab(anti-CD20monoclonal antibody)as single first-line therapy for patientswith follicular lymphoma with a low tumor burdenclinical andmolecular evaluation，″Blood(2001)97(1)101-106相比，根據(jù)實(shí)施例2中的資料的試驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果表明采用利妥昔單抗的單次療程后2個(gè)月接受FavIdTM治療的未經(jīng)治療的B細(xì)胞NHL患者與用Rituximab治療相比，疾病發(fā)展之前的時(shí)間顯著延長。
圖3未經(jīng)治療的濾泡NHL患者中用Rituxan進(jìn)行細(xì)胞減少伴隨FavId治療。圖3給出了利妥昔單抗的單次療程后用FavIdTM治療的益處與Hainsworth JD等人″Rituximab as First-Line and MaintenanceTherapy for Patients With Indolent Non-Hodgkin′s Lymphoma″J ClinOncol.(2002)October 15；204261-4267中給出的結(jié)果的比較。Hainsworth等人中的數(shù)據(jù)表明如圖3中指出的每6個(gè)月施用的利妥昔單抗方案的價(jià)值。這在本領(lǐng)域中已知為“維持Rituxan”療法，并且被普遍接受，與對患有無痛B細(xì)胞NHL的患者進(jìn)行Rituxan單次療程治療相比，導(dǎo)致疾病發(fā)展之前的時(shí)間延長?！熬S持Rituxan”代表對Colombat P等人結(jié)果的改進(jìn)。從而，來自實(shí)施例2的未經(jīng)治療的B-細(xì)胞NHL患者中rituximab加上FavIdTM的單次治療的結(jié)果與Hainsworth等人的數(shù)據(jù)的比較提示，如果FavIdTM與Hainsworth等人的維持療法結(jié)合，如果免疫系統(tǒng)的總體抑制不抵消FavId的益處，那么可能具有對所述患者的進(jìn)一步益處。該試驗(yàn)的方案在實(shí)施例8中給出。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征在于在特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑如抗-CD20抗體施用后不久用獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫的令人驚奇的組合。在以前的療法中，一種治療方案，如化學(xué)治療后接著是一定時(shí)期的恢復(fù)和緩解，之后復(fù)發(fā)迫使進(jìn)行下一輪治療。此外，如果預(yù)計(jì)使用獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫，那么在嘗試誘導(dǎo)免疫應(yīng)答前，治療醫(yī)生可能傾向于等待免疫系統(tǒng)從以前的治療恢復(fù)。如果用抗-CD20治療特異耗竭了該患者中的總體B細(xì)胞群體，那么將尤其是這樣的。立即或者同時(shí)期共同施用獨(dú)特型蛋白質(zhì)形式的免疫原將不誘導(dǎo)針對該獨(dú)特型蛋白質(zhì)的實(shí)質(zhì)性免疫應(yīng)答。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑如抗-CD20抗體例如利妥昔單抗治療后不久用獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫的令人驚奇的協(xié)同效果，盡管預(yù)計(jì)到耗竭免疫應(yīng)答的B細(xì)胞/抗體應(yīng)答臂(arm)。不被該理論或任意其他理論束縛，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是用特異結(jié)合劑減少細(xì)胞后不久用活性免疫治療劑治療導(dǎo)致強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，其主要依賴于T細(xì)胞來產(chǎn)生治療效果，其中所述免疫治療劑的目的靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)存在于所述細(xì)胞減少的群體內(nèi)。
本發(fā)明的特征還在于在重疊的時(shí)程內(nèi)施用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑和自體Id蛋白質(zhì)，其中在用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑治療結(jié)束前首次進(jìn)行自體Id蛋白質(zhì)的施用，并且用兩種活性劑的治療以協(xié)同方式繼續(xù)進(jìn)行。重疊時(shí)程的一個(gè)實(shí)施方案是當(dāng)特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑每6個(gè)月施用而自體Id蛋白質(zhì)每個(gè)月施用，但是不在施用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的同一個(gè)月內(nèi)。特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑還可以約每2周、約每3周、約每1個(gè)月、約每2個(gè)月、約每3個(gè)月、約每4個(gè)月或者約每6個(gè)月施用。自體Id蛋白質(zhì)可以約每兩周、約每3周、約每1個(gè)月、約每2個(gè)月、約每3個(gè)月、約每4個(gè)月、或者約每6個(gè)月施用。在一些實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑或者自體Id蛋白質(zhì)的施用時(shí)間表可以為另一種的施用所中斷。
使用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的組合治療具有其他優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)在癌的體積減小后，癌癥的免疫治療在殘余疾病背景中最可能有效。特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑療法后靶定Id蛋白質(zhì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在身體的別處沒有發(fā)現(xiàn)由患者的B細(xì)胞惡性腫瘤唯一表達(dá)的Id蛋白質(zhì)。因此，產(chǎn)生針對淋巴瘤的Id蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答將不會(huì)導(dǎo)致對正常組織的嚴(yán)重毒性。此外，使用Id蛋白質(zhì)作為免疫原引起的此類主動(dòng)免疫應(yīng)答將是長效的并且因此延緩或者預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。最后，主動(dòng)免疫應(yīng)答提供了比使用被動(dòng)抗體治療如使用利妥昔單抗或者類似治療劑所看到的更寬的免疫應(yīng)答。用Id蛋白質(zhì)免疫驅(qū)動(dòng)的該主動(dòng)免疫應(yīng)答能夠更好地中和腫瘤異質(zhì)性和B細(xì)胞惡性腫瘤的Id蛋白質(zhì)序列隨時(shí)間的突變性漂變。
定義術(shù)語“治療”指對受到異常狀況如B細(xì)胞惡性腫瘤折磨的生物體施用組合物，其中所述組合物的施用具有治療效果并且至少部分減輕或者消除所述異常狀況。注意所述治療不必提供完全治愈，并且如果改善或者消除了至少一種癥狀那么就認(rèn)為該治療是有效的。此外，治療不必提供醫(yī)學(xué)狀況或者其他異常狀況如B細(xì)胞惡性腫瘤的永久改善，盡管永久改善是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^殺死癌性細(xì)胞、促進(jìn)癌性細(xì)胞的殺死、抑制癌性細(xì)胞的生長和/或抑制癌轉(zhuǎn)移過程來進(jìn)行治療。
術(shù)語“患者”指在臨床背景下具有表明需要用治療劑治療的一種或多種特定癥狀的生物體。治療可以是在醫(yī)學(xué)界普遍接受的或者可以是實(shí)驗(yàn)性的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，包括動(dòng)物如狗、貓、豬、奶牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，患者是人。注意到在疾病發(fā)展(自發(fā)的或者在治療方案或者治療期間)過程期間，患者的診斷可以改變，不過，仍然認(rèn)為此類患者需要治療。
術(shù)語“治療效果”指導(dǎo)致或者促進(jìn)異常狀況(包括疾病或病癥)的因素的抑制或激活。治療效果在一定程度上減輕或者防止異常狀況的一種或多種癥狀。關(guān)于與本發(fā)明相關(guān)的異常狀況的治療，治療效果可以指一種或多種下面的(a)存在于特定部位或生物體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目的增加或者減少，如淋巴細(xì)胞的總體減少；(b)提高或者降低細(xì)胞遷移的能力；(c)增加或者減少細(xì)胞的增殖、生長和/或分化；(d)抑制(即，延緩或終止)或者加速細(xì)胞死亡，如增加淋巴瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡速率；(e)一定程度上減輕與異常狀況相關(guān)的一種或多種癥狀；(f)增強(qiáng)或者抑制受影響的細(xì)胞群體的功能，如激活T細(xì)胞。
本文所用術(shù)語“治療有效量”指活性化合物的量，所述量引起組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人體內(nèi)研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或者其他臨床醫(yī)生所尋求的生物學(xué)或者醫(yī)學(xué)應(yīng)答以便提供治療效果。
術(shù)語“異常狀況”指偏離生物體內(nèi)其正常功能的該生物體的細(xì)胞或組織中的功能，并且包括但不限于B細(xì)胞惡性腫瘤。異常狀況涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞功能或者細(xì)胞內(nèi)酶的活性。涉及細(xì)胞增殖性病癥的異常狀況包括癌如B細(xì)胞惡性腫瘤、B-細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞白血病、T細(xì)胞惡性腫瘤、T細(xì)胞淋巴瘤和T細(xì)胞白血病。涉及細(xì)胞存活的異常狀況指其中程序性細(xì)胞死亡(凋亡)途徑受到激活或取消的狀況。
術(shù)語“施用”(administration或administrating)指將化合物加入動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或者組織以便治療或者預(yù)防異常狀況或者B細(xì)胞惡性腫瘤的方法。當(dāng)本發(fā)明的組合物以活性劑的組合提供時(shí)，術(shù)語“施用”包括所述組合物與其他活性劑的順序或者同時(shí)導(dǎo)入。對于生物體內(nèi)包含的細(xì)胞，本領(lǐng)域存在許多施用化合物的技術(shù)?？梢酝ㄟ^任意常規(guī)途徑，包括注射或者隨時(shí)間逐漸輸注來施用治療組合物。取決于所施用的組合物，施用可以例如是經(jīng)口、經(jīng)肺、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或者經(jīng)皮施用。還可以通過從生物體分離或者取出細(xì)胞，將化合物施用于所分離或取出的細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞返回到所述生物體來對該生物體施用化合物。對于生物體外的細(xì)胞，在少數(shù)情況中對于生物體內(nèi)的細(xì)胞，本領(lǐng)域存在施用組合物的多種技術(shù)，包括(但不限于)細(xì)胞微注射技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)、孵育和載體技術(shù)。
術(shù)語“同時(shí)期共同施用”指在相連的時(shí)間施用兩種或多種治療方案，其中第二種治療方案可以在第一種治療方案結(jié)束時(shí)或者第一種治療方案結(jié)束后的最長3個(gè)月內(nèi)開始。從而，如果假定方案A在3月1日結(jié)束，那么同時(shí)期共同施用的方案B可以在同一年的3月1日到5月31日期間的某個(gè)時(shí)間開始。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，“同時(shí)期共同施用”指在特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑治療同時(shí)、期間或者結(jié)束后三個(gè)月內(nèi)開始使用自體Id蛋白質(zhì)的治療方案。在本發(fā)明方法中，自體Id蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞減少劑施用的同時(shí)、最后的特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑最后施用后一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、或者任意按周計(jì)的小間隔，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周內(nèi)施用。
在其他實(shí)施方案中，自體Id蛋白質(zhì)和細(xì)胞減少劑可以以重疊的方式施用，其中自體Id蛋白質(zhì)的施用在細(xì)胞減少劑的最后施用前開始，并且兩種治療劑的施用平行地繼續(xù)。從而，自體Id蛋白質(zhì)的施用可以接著是特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的施用，其接著是自體Id蛋白質(zhì)的施用；并且該重疊施用模式可以繼續(xù)。在一些實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑可以約每2周、約每3周、約每1個(gè)月、約每2個(gè)月、約每3個(gè)月、約每4個(gè)月或者約每6個(gè)月施用。自體Id蛋白質(zhì)可以約每2周、約每3周、約每1個(gè)月、每2個(gè)月約每3個(gè)月、約每4個(gè)月或者約每6個(gè)月施用。特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑或者自體Id蛋白質(zhì)的施用時(shí)間表可以為另一種的施用所中斷。特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑或者自體Id蛋白質(zhì)的施用不必按照規(guī)則的時(shí)間表并且可以以可變的間隔施用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案利用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案利用抗-CD20抗體。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案利用利妥昔單抗或者托西莫單抗。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第二種方案利用用獨(dú)特型蛋白質(zhì)治療。
特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑治療方案的一個(gè)實(shí)例是用抗-CD20單克隆抗體的療程。以與“同時(shí)期共同施用”相似的方式，本文中所用術(shù)語“共同治療”、“接近相連的治療”、“接近的施用治療”或者“暫時(shí)相連的治療”也可以指同時(shí)進(jìn)行或者以重疊方式進(jìn)行的兩種治療方案，或者使得在最后的凋亡劑的最后施用后3個(gè)月內(nèi)開始第二種治療方案。注意這些術(shù)語也指治療，其中如果兩個(gè)治療方案重疊，那么在第二種治療方案開始前第一種治療方案還沒有完成。
在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“同時(shí)期共同施用”可以指自體Id蛋白質(zhì)可以在特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的最后施用的同時(shí)、一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、或者任意按周計(jì)的小間隔，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周內(nèi)施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案利用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案利用抗-CD20抗體。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種方案包含利妥昔單抗或者托西莫單抗。在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑選自由抗-CD52抗體、抗-CD22抗體、抗-B7抗體、抗-CD19抗體、抗-CD32抗體、抗-CD16抗體、抗-CD86抗體和抗-CD156抗體組成的組。其他的特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑也可以用于本發(fā)明。惡性腫瘤細(xì)胞如B細(xì)胞的細(xì)胞表面含有可以作為特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的配體的許多蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中也可以使用能夠結(jié)合惡性B細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞減少的此類特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第二種方案利用使用獨(dú)特型蛋白質(zhì)的治療。
在另一實(shí)施方案中，自體Id蛋白質(zhì)和細(xì)胞減少劑可以以重疊的方式施用，其中自體Id蛋白質(zhì)的施用在細(xì)胞減少劑的最后施用前開始，但是在細(xì)胞減少劑的首次施用后，自體Id蛋白質(zhì)和細(xì)胞減少劑的施用平行地繼續(xù)。
術(shù)語“特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑”指這樣的細(xì)胞減少劑，其選擇性和特異結(jié)合它的可能是細(xì)胞表面抗原的指定靶標(biāo)，并由此通過殺死或者抑制靶定細(xì)胞的生長或者殺死靶細(xì)胞群體而導(dǎo)致細(xì)胞減少。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑”是抗原結(jié)合性細(xì)胞減少劑。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑是抗-CD20單克隆抗體，如利妥昔單抗。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑還可以是特異結(jié)合不同表面抗原如CD19、CD22、B7或者CD156的抗體。特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑可以是抗體，或者它可以是抗體的功能衍生物，如ScFv、駱駝科(camelid)抗體片段或者抗體的其他功能衍生物。細(xì)胞減少劑可以是凋亡劑。其他特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑是可能的。在本發(fā)明中也可以使用能夠結(jié)合一種以上細(xì)胞表面抗原的雙特異性抗體。此外，惡性免疫細(xì)胞如B細(xì)胞的細(xì)胞表面含有可以作為特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑的配體的許多蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中也可以使用能夠結(jié)合惡性B細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞減少的此類特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑。
術(shù)語“細(xì)胞減少劑”指減少細(xì)胞的靶群體中細(xì)胞數(shù)或者延緩細(xì)胞分裂的藥劑。細(xì)胞減少劑可以通過誘導(dǎo)凋亡起作用，但是其他機(jī)制也是可能的。
當(dāng)將本發(fā)明的化合物施用于受試者時(shí)，它們通常制成“組合物”。此類組合物通常是混合物并且可以常規(guī)地含有藥學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體和任選地其他治療劑。組合物可以包含載體蛋白質(zhì)如KLH和佐劑如KLH、BCG、鋁鹽和MF59(Singh和O′Hagen，Nat.Biotech 171075-81(1999))，以及刺激性核酸化合物如CpG寡核苷酸(見，例如，Jahrsdorfer B等人，J Leukoc Biol.69(1)81-8(2001)；Krieg AM等人，Trends Microbiol.6(1)23-7(1998))。組合物的組分可以共價(jià)結(jié)合自體Id蛋白質(zhì)。組合物可以包括細(xì)胞因子，如GM-CSF和MCP-3。可以通過任意常規(guī)途徑包括注射或者隨時(shí)間逐漸輸注施用治療組合物。取決于所施用的組合物，施用可以例如為經(jīng)口、經(jīng)肺、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或者經(jīng)皮施用。
本文所用術(shù)語“自體的”指來自所治療患者的免疫球蛋白可變區(qū)的氨基酸序列，或者編碼患者的免疫球蛋白可變區(qū)的基因的核酸序列。蛋白質(zhì)可以隨后體外合成，并且核酸序列可以在體外合成、操作和裝配，然而Id蛋白質(zhì)的可變區(qū)的序列在待治療患者中與患者惡性腫瘤有關(guān)，所述可變區(qū)序列來自患者的活組織檢查。用于獨(dú)特型蛋白質(zhì)的可變區(qū)和免疫球蛋白亞型的確切組合可以不由患者的惡性腫瘤表達(dá)，但是通常在人體中發(fā)現(xiàn)自體Id蛋白質(zhì)的恒定區(qū)并且可變區(qū)來自該患者。關(guān)于來自生物體的樹突狀細(xì)胞或者其他細(xì)胞，術(shù)語“自體的”具有其他意義。“自體的”細(xì)胞是從待治療的患者得到和/或分離。從而，從待治療的患者得到自體樹突狀細(xì)胞；在優(yōu)選實(shí)施方案中，自體樹突狀細(xì)胞與自體Id蛋白質(zhì)接觸然后施用返回到患者。
本文所用術(shù)語“Id蛋白質(zhì)”或者“自體Id蛋白質(zhì)”指來自給定患者的自體腫瘤來源的獨(dú)特型表面Ig，也稱作獨(dú)特型蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Id蛋白質(zhì)來自患者的B細(xì)胞腫瘤、患者的B細(xì)胞惡性腫瘤或者來自腫瘤或者惡性腫瘤的細(xì)胞。
術(shù)語“重組自體Id蛋白質(zhì)”指通過重組方法在患者體外合成的自體Id蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在昆蟲細(xì)胞中合成了重組自體Id蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在酵母或者細(xì)菌細(xì)胞中合成了重組自體Id蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成了重組自體Id蛋白質(zhì)。施用于患者的Id蛋白質(zhì)通常是嵌合蛋白質(zhì)，因?yàn)樽罱K序列來自患者和表達(dá)載體二者。有時(shí)重組自體Id蛋白質(zhì)的氨基酸序列與在患者中發(fā)現(xiàn)的Id蛋白質(zhì)相同。
本文所用術(shù)語“接觸”指將包含Id蛋白質(zhì)的溶液或者組合物與沐浴肽或者細(xì)胞的液體培養(yǎng)基加在一起。包含Id蛋白質(zhì)的溶液還可以包含用于促進(jìn)所述方法的細(xì)胞攝入Id蛋白質(zhì)的另一組分。通過利用遞送裝置如基于移液器的裝置或者基于注射器的裝置可以將包含受試化合物的溶液加到沐浴細(xì)胞的培養(yǎng)基。
本文所用術(shù)語“原代惡性腫瘤”指在開始用特異結(jié)合性細(xì)胞減少劑治療前還沒有通過化學(xué)療法治療的B細(xì)胞惡性腫瘤。類似地，術(shù)語“未治療的”指在經(jīng)歷通過本發(fā)明的治療前，還沒有經(jīng)歷B細(xì)胞惡性腫瘤治療的患者的B細(xì)胞惡性腫瘤。例如，此類患者還沒有經(jīng)歷化學(xué)治療過程。
本文所用術(shù)語“凋亡劑”是起始或者促進(jìn)細(xì)胞中凋亡或者程序性細(xì)胞死亡的化合物、藥物、毒素、組合物或者罕見地，生物學(xué)實(shí)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，其中起始或促進(jìn)凋亡的細(xì)胞是B細(xì)胞惡性腫瘤的細(xì)胞。代表性凋亡劑包括但不限于TNF-α、AIM I(見國際公布號WO97/33899)、AIM II(見國際公布號WO 97/34911)和Fas配體(Takahashi等人，Int.Immunol.，61567-1574(1994))、VEGI(見國際公布號WO 99/23105)。
本文所用術(shù)語“重組的”可以指通過首先轉(zhuǎn)錄，然后翻譯連接到不同于自然狀態(tài)下結(jié)合的其他DNA序列的DNA序列以產(chǎn)生化合物的方法。重組產(chǎn)物可以是例如肽、蛋白質(zhì)、酶、抗體、抗體片段、結(jié)合到調(diào)節(jié)元件的多肽、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、RNA分子和/或核酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組產(chǎn)物是獨(dú)特型蛋白質(zhì)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組產(chǎn)物是單克隆抗體。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組產(chǎn)物是抗體類似物。
該重組產(chǎn)物名單僅用于闡明的目的并且本發(fā)明可以涉及其他類型的重組產(chǎn)物。用作基因產(chǎn)物產(chǎn)生來源的DNA序列通常從不同于用于表達(dá)的生物體或細(xì)胞的另一種生物體或者細(xì)胞完整或部分地得到，然后將所述DNA序列連接到表達(dá)載體中以重組方式產(chǎn)生基因產(chǎn)物。注意如果首先分離人基因，然后將其插入到表達(dá)載體，然后返回到人細(xì)胞，可以在人細(xì)胞系中重組表達(dá)人基因。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在此處可互換使用并且以它們的常規(guī)意義使用，即氨基酸鏈。這些術(shù)語都不暗含任意固定長度或者長度范圍的氨基酸鏈。這些數(shù)據(jù)也不暗含或者排除多肽的翻譯后(或者合成后)修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等等，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他修飾，無論是天然發(fā)生的還是非天然發(fā)生的。多肽可以為完整蛋白質(zhì)或者氨基酸鏈的區(qū)域。蛋白質(zhì)可以包含一條以上的多肽。
術(shù)語“昆蟲細(xì)胞系“指來自昆蟲的細(xì)胞系。許多此類昆蟲細(xì)胞系易受到桿狀病毒的感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉此類細(xì)胞系和利用它們所需要的技術(shù)。昆蟲細(xì)胞系的代表性實(shí)例包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(sf9)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞系(見美國專利5,300,435和5,298,418)。
術(shù)語“粉紋夜蛾細(xì)胞”和“草地夜蛾”指通常與桿狀病毒表達(dá)載體組合使用的昆蟲細(xì)胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些細(xì)胞系和怎樣得到它們。
此處術(shù)語“載體”可以指DNA分子，另一種目的DNA分子如編碼Id蛋白質(zhì)的分子可以插入到所述載體的DNA中。載體類別的實(shí)例可以是質(zhì)粒、粘粒、病毒和細(xì)菌噬菌體(‘噬菌體’)。通常，設(shè)計(jì)載體以接受多種插入的DNA分子然后可以用于將目的DNA轉(zhuǎn)移或者傳遞到宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌、酵母、高級真核細(xì)胞)中?？梢曰诖迦氲腄NA分子的大小以及基于預(yù)期用途選擇載體。為了轉(zhuǎn)錄成RNA或者轉(zhuǎn)錄后翻譯以產(chǎn)生所編碼的多肽，可以選擇表達(dá)載體。為了保存或者鑒定特定DNA序列(例如cDNA文庫中的一種DNA序列)或者為了產(chǎn)生特定DNA序列的大量拷貝，可以選擇克隆載體，盡管表達(dá)載體也可以用于克隆或者保存。如果載體是病毒或者噬菌體，那么術(shù)語載體可以包括病毒或者噬菌體外殼。
進(jìn)入細(xì)胞后，包括插入DNA的載體DNA的全部或者部分，可以整合到宿主細(xì)胞染色體中，或者載體可以保持在染色體外。保持在染色體外的那些載體通常能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的許多質(zhì)粒)。其他載體當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。
本文所用術(shù)語“表達(dá)載體”可以指DNA構(gòu)建體，其允許本領(lǐng)域技術(shù)人員將編碼通常是蛋白質(zhì)的目的基因產(chǎn)物的基因置于載體中特定位置，所選基因產(chǎn)物可以通過所選宿主細(xì)胞的機(jī)器從所述載體表達(dá)，或者通過體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。該類型的載體通常是質(zhì)粒，但是也可以使用其他形式的表達(dá)載體，如噬菌體載體和病毒載體(例如腺病毒、復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺伴隨病毒)。表達(dá)載體、對照序列、轉(zhuǎn)化方法等等的選擇取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型。本發(fā)明的表達(dá)載體可以使用p10啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子、蜜蜂蜂毒肽信號序列或者人堿性磷酸酶信號序列。此類表達(dá)載體可以以任意組合使用這些或者其他啟動(dòng)子或者信號序列。從而，p10啟動(dòng)子可以有效連接蜜蜂蜂毒肽信號序列或者人堿性磷酸酶信號序列，多角體蛋白啟動(dòng)子可以連接到蜜蜂蜂毒肽信號序列或者人堿性磷酸酶信號序列。相同啟動(dòng)子可以有效連接到表達(dá)載體中編碼嵌合蛋白質(zhì)的兩種基因。相同信號序列可以單獨(dú)地有效連接表達(dá)到載體中編碼嵌合蛋白質(zhì)的兩種基因。
術(shù)語“桿狀病毒表達(dá)載體”指DNA構(gòu)建體，其設(shè)計(jì)成當(dāng)用于桿狀病毒系統(tǒng)中時(shí)表達(dá)所插入的目的基因，所述表達(dá)通常在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行。設(shè)計(jì)成在桿狀病毒系統(tǒng)中起作用的任意可能的桿狀病毒或者表達(dá)載體可以用于本發(fā)明中。以類似的方式，術(shù)語“表達(dá)載體”是包括桿狀病毒表達(dá)載體的具體實(shí)施方案的一個(gè)類，但是“表達(dá)載體”可以在或還可以在除了昆蟲細(xì)胞系之外的細(xì)胞或者細(xì)胞系中發(fā)揮功能。
術(shù)語“開放閱讀框”或者“ORF”指編碼多肽的多核苷酸序列的區(qū)域。該區(qū)域可以代表編碼序列的一部分或者完整編碼序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，它指起始密碼子和終止密碼子之間的完整序列。
術(shù)語“來自患者”指從來自患者的血液或者組織樣品分離或者純化的遺傳物質(zhì)或者細(xì)胞。術(shù)語“來自B細(xì)胞惡性腫瘤”指從來自患者的B細(xì)胞惡性腫瘤的樣品分離或者純化的遺傳物質(zhì)。
術(shù)語“全長重鏈”指從患者的B細(xì)胞惡性腫瘤分離的完整cDNA分子或者完整重鏈免疫球蛋白多肽鏈的序列。全長重鏈可以是任意亞型的免疫球蛋白鏈。
術(shù)語“全長輕鏈”指從患者的B細(xì)胞惡性腫瘤分離的完整cDNA分子或者完整輕鏈免疫球蛋白多肽鏈的序列。此類全長輕鏈可以是κ或λ鏈。
術(shù)語“嵌合蛋白質(zhì)”指包含一條包含來自至少兩種不同蛋白質(zhì)的片段的多肽鏈的蛋白質(zhì)。嵌合蛋白質(zhì)的片段必須來自異源蛋白質(zhì)，即，嵌合多肽的所有片段不從與自然發(fā)生的相同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如用于本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)包括含有免疫球蛋白鏈的VH或VL區(qū)的部分，但是其中嵌合蛋白質(zhì)不包含如在VH或VL區(qū)的來源B細(xì)胞克隆中發(fā)現(xiàn)的那些鏈的完整C區(qū)。此外，VH或VL區(qū)可以不必包括完整可變區(qū)，但是包括足夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可變區(qū)。用于本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)還可以包括這樣的蛋白質(zhì)，其中天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的片段已經(jīng)用等價(jià)的天然或者非天然發(fā)生的片段替換。這包括將來自患者的IgG1恒定區(qū)用來自不同來源的IgG1恒定區(qū)替換，還包括免疫球蛋白恒定區(qū)，其中已經(jīng)將所述蛋白質(zhì)的片段用部分或完全人造的接頭、片段或者結(jié)構(gòu)域替換。然而，有時(shí)本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的基因或者編碼區(qū)可以與在患者中天然產(chǎn)生的免疫球蛋白的基因相同。嵌合蛋白質(zhì)的基因或者開放閱讀框可以由于一種或多種下面的理由而區(qū)別于天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的開放閱讀框(1)它將是來自患者的全長免疫球蛋白基因或者cDNA，或者免疫球蛋白基因或者cDNA的一些較小部分；(2)它將是與從患者分離的亞型不同的亞型；或者(3)編碼患者的IgG1恒定區(qū)的核酸序列將與用于表達(dá)載體的IgG1基因的部分不同；和/或(4)用于獨(dú)特型表達(dá)的基因?qū)⒉缓信c在B細(xì)胞惡性腫瘤中信使前mRNA中那些表達(dá)的內(nèi)含子相同的內(nèi)含子。嵌合蛋白質(zhì)還可以稱作“融合蛋白質(zhì)”。
術(shù)語“片段”或者“部分”用于表示來自多肽的氨基酸序列的多肽的部分，其長度小于它所來自的全長多肽的長度?？梢岳斫獯祟惼慰梢员Ａ籼烊欢嚯牡囊粋€(gè)或多個(gè)特征性部分。此類保留的特征的實(shí)例包括與對所述天然多肽特異的抗體或者其表位結(jié)合。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，術(shù)語“VH”和“VL”指免疫球蛋白分子的多肽鏈的可變區(qū)，或者編碼此類多肽鏈的核酸。可變區(qū)的確切序列不能預(yù)測并且必須通過分離所述序列(蛋白質(zhì)或基因)來確定。從特定患者分離的VH和VL區(qū)用于本發(fā)明中。κ或λ輕鏈的確切序列由輕鏈基因座的V區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排確定。(κ和λ基因座是分離和不同的)。重鏈的確切序列由重鏈基因座的V區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排確定?？勺儏^(qū)中額外的序列變異由重組過程期間的不精確性引起并且也由重組過程結(jié)束后的體細(xì)胞突變產(chǎn)生。術(shù)語“VH”和“VL”還指VH和VL區(qū)的部分或片段。VH或VL區(qū)的片段還包括所有或者基本上所有V區(qū)。術(shù)語“基本上全部”指完整可變區(qū)的約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％，或50％以下。所存在的VH或VL區(qū)的部分必須足夠允許嵌合分子在本發(fā)明中起作用。術(shù)語“VH”和“VL”還指此類多肽區(qū)的功能衍生物。
術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”指免疫球蛋白分子部分的所有或部分，其不由免疫球蛋白的可變區(qū)編碼。術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”還可以指編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列。免疫球蛋白恒定區(qū)包括片段CL、CH1、CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。免疫球蛋白類型包括IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈和κ或λ輕鏈或者其片段。任何免疫球蛋白恒定區(qū)片段可以用于嵌合Id蛋白質(zhì)。還可以使用免疫球蛋白恒定區(qū)片段的功能衍生物。
術(shù)語“IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE”指人類免疫球蛋白的類別和亞類。該術(shù)語可以指DNA序列、RNA序列或者蛋白質(zhì)的氨基酸序列。免疫球蛋白分子的類別和亞類由其重鏈確定。IgG和IgD是不同類別的免疫球蛋白；IgG1和IgG2是不同亞類的免疫球蛋白分子。術(shù)語“IgA”可以指IgA分子的任意亞類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，它指IgA1分子。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，它指IgA2分子。在一些實(shí)施方案中，所用的免疫球蛋白重鏈可以是含有來自第二種蛋白質(zhì)的氨基酸的嵌合蛋白質(zhì)。術(shù)語“IgGγ1”指與免疫球蛋白的IgG1類相關(guān)的重鏈。IgG1代表約66％人IgG免疫球蛋白(Roitt等人，Immunology，Mosby，St.Louis，pg.4.2，1993)。
術(shù)語“kappa恒定區(qū)”、“l(fā)ambda恒定區(qū)”、“κ恒定區(qū)”和“λ恒定區(qū)”指κ和λ輕鏈的恒定區(qū)，其在免疫系統(tǒng)發(fā)育期間保持恒定。所述術(shù)語可以指DNA序列、RNA序列或者蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白輕鏈的部分可以包含在含有來自一種或多種其他蛋白質(zhì)的氨基酸的嵌合蛋白質(zhì)中。
術(shù)語“分離”指將天然產(chǎn)生的核酸序列從其正常細(xì)胞環(huán)境取出。從而，所述序列可以在無細(xì)胞溶液中或者置于不同細(xì)胞環(huán)境中。該術(shù)語不暗含該序列是唯一存在的序列，而是它基本上無(至少約90-95％純)與其天然相關(guān)的非核苷酸材料，從而與分離的染色體相區(qū)別。而且，關(guān)于核酸使用術(shù)語“分離”指特定DNA或者RNA序列在目的溶液中占總DNA或者RNA的分?jǐn)?shù)顯著高于該序列在所來自的細(xì)胞中所占的分?jǐn)?shù)(2-5倍)。通過優(yōu)先減少所存在的其他DNA或者RNA的量，或者通過優(yōu)先增加特定DNA或者RNA序列的量，或者通過兩種方法的組合可以導(dǎo)致該富集。然而，應(yīng)該注意該“富集”不暗含不存在其他DNA或者RNA序列，而是目的序列的相對量顯著增加了。術(shù)語“顯著”用于表示增加的水平對于造成這種增加的人是有用的，并且通常指相對于其他核酸增加至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或以上。所述術(shù)語也不暗含沒有來自其他來源的DNA或者RNA。來自其他來源的DNA可以例如包含來自酵母或者細(xì)菌基因組或者克隆載體如pUC19的DNA。該術(shù)語與天然發(fā)生的事件如病毒感染或者腫瘤類型生長不同，在天然發(fā)生的事件中一種mRNA的水平可以相對于其他種類的mRNA天然增加。即該術(shù)語意在僅僅覆蓋有人介入以升高所希望的核酸的比例的那些情況。術(shù)語“分離”可以還包括通過本領(lǐng)域公知技術(shù)將RNA序列轉(zhuǎn)化成cDNA序列的步驟。
與天然環(huán)境中的相比，分離的DNA序列相對更純(與天然水平相比該水平應(yīng)該至少大2至5倍，例如，按照mg/ml)。從PCR得到的個(gè)別序列可以純化到電泳純。從該P(yáng)CR反應(yīng)得到的DNA分子可以從總DNA或者從總RNA得到。這些DNA序列可以是或不是天然發(fā)生的，但是優(yōu)選通過操作部分純化的天然發(fā)生的物質(zhì)(例如信使RNA(mRNA))得到。例如，從mRNA構(gòu)建cDNA文庫包括產(chǎn)生合成的物質(zhì)(cDNA)并且可通過從攜帶cDNA文庫的細(xì)胞克隆選擇從合成文庫分離純的個(gè)體cDNA克隆。包括從mRNA構(gòu)建cDNA文庫和分離不同cDNA克隆的該方法導(dǎo)致對天然信息約106倍純化。從而，特別預(yù)期純化至少1個(gè)數(shù)量級，優(yōu)選2個(gè)或3個(gè)數(shù)量級，更優(yōu)選4個(gè)或5個(gè)數(shù)量級。
術(shù)語“編碼基因”指編碼目的蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列。核酸序列可以是DNA或者RNA分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分子是DNA分子。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，分子是RNA分子。當(dāng)作為DNA分子存在時(shí)，它包含對于指導(dǎo)基因表達(dá)必需或者有幫助的序列。當(dāng)作為RNA分子存在時(shí)，它將包含指導(dǎo)宿主細(xì)胞的核糖體開始翻譯(例如起始密碼子ATG)和指導(dǎo)核糖體結(jié)束翻譯(例如，終止密碼子)的序列。起始密碼子和終止密碼子之間是開放閱讀框(ORF)。
術(shù)語“插入”指通過使用限制酶和連接酶操作DNA序列，其中目的DNA序列，由此通常是編碼目的基因的DNA序列可以摻入到另一核酸分子，通過將兩種分子用適宜的限制酶消化以產(chǎn)生相容的重疊然后使用連接酶將兩個(gè)分子連接在一起實(shí)現(xiàn)所述摻入。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉此類操作并且操作的實(shí)例可以見Sambrook等人(Sambrook，F(xiàn)ritsch，&Maniatis，″Molecular CloningA LaboratoryManual″，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)，將其完整內(nèi)容(包括插圖、附圖和表格)引入本文作為參考。
術(shù)語“允許...的表達(dá)”指將表達(dá)載體置于目的基因會(huì)表達(dá)的環(huán)境中。這通常指將表達(dá)載體插入到合適的細(xì)胞類型，其中基因表達(dá)必要的啟動(dòng)子和其他區(qū)域?qū)⒈凰拗骷?xì)胞的組分識別并且將導(dǎo)致目的基因的表達(dá)。表達(dá)通常由兩步組成轉(zhuǎn)錄和翻譯。還可以使用來自細(xì)胞的組分在體外進(jìn)行表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些技術(shù)，并且此類技術(shù)已由Sambrook等人(Sambrook，F(xiàn)ritsch，&Maniatis，″MolecularCloningA Laboratory Manual″，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，1989)給出。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)或多肽。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)產(chǎn)物是VH/IgGγ1、VL/Cκ、VL/Cλ或者VL/Igγ1。
術(shù)語“分泌信號序列”指指導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞輸出的肽序列或者核苷酸序列。當(dāng)該核苷酸序列在框內(nèi)翻譯成連接到所選多肽氨基末端的肽時(shí)，肽分泌信號序列將通過與宿主細(xì)胞的機(jī)器相互作用導(dǎo)致所選多肽的分泌。作為分泌過程的部分，該分泌信號序列將在目的多肽輸出后被切除，僅留下目的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，使用人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不限于這些分泌信號序列并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他分泌信號序列可以代替和添加到這些序列。
術(shù)語“啟動(dòng)子控制”指表達(dá)載體中DNA的排列，其中啟動(dòng)子置于目的基因的5’并且指導(dǎo)該DNA序列轉(zhuǎn)錄成mRNA分子。該mRNA分子然后可以由宿主細(xì)胞的機(jī)器翻譯。
術(shù)語“蛋白A”、“蛋白G”和“蛋白L”指能夠特異結(jié)合免疫球蛋白分子而不與抗原結(jié)合位點(diǎn)相互作用的特定細(xì)菌蛋白質(zhì)。蛋白A是從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分離的一種多肽，其結(jié)合免疫球蛋白分子的Fc區(qū)。蛋白G是對免疫球蛋白G(IgG)具有親和性的細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，其已經(jīng)從人G組鏈球菌菌株(G148)分離。蛋白L是厭氧細(xì)菌種大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)的一些菌株表達(dá)的免疫球蛋白輕鏈結(jié)合蛋白質(zhì)。
術(shù)語“有效連接”指DNA的排列，其中控制區(qū)如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子連接到所連接的目的DNA基因，從而引起目的基因的轉(zhuǎn)錄，并因此允許它的翻譯。術(shù)語“有效連接”還可以指編碼加工信號序列的DNA序列如分泌信號序列連接到編碼多肽的基因以形成單個(gè)開放閱讀框。轉(zhuǎn)錄和翻譯后，分泌信號序列可能引起所翻譯多肽的輸出。
術(shù)語“分離”涉及蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，指從它的正常細(xì)胞環(huán)境取出天然產(chǎn)生的多肽或者蛋白質(zhì)，或者指從表達(dá)系統(tǒng)的其他組分中取出在表達(dá)系統(tǒng)(如本文描述的桿狀病毒系統(tǒng))中合成的多肽或者蛋白質(zhì)。從而，多肽序列可以處于無細(xì)胞溶液中或者置于不同細(xì)胞環(huán)境中。該術(shù)語不暗示所述多肽序列是存在的唯一氨基酸鏈，而是它基本上無(至少約90-95％純)與其天然結(jié)合的非基于氨基酸的材料。
關(guān)于多肽使用術(shù)語“富集”指特定氨基酸序列占目的細(xì)胞或溶液中總氨基酸序列的分?jǐn)?shù)顯著高于占正常或病變細(xì)胞或者所述序列所來自的細(xì)胞中總氨基酸序列的分?jǐn)?shù)(2-5倍)。通過優(yōu)先減少所存在的其他氨基酸序列(或者其他材料)的量，或者通過優(yōu)先增加特定目的氨基酸序列的量，或者通過兩種方法的組合可以導(dǎo)致該富集。然而，應(yīng)該注意到該“富集”不暗含不存在其他氨基酸序列，而是目的序列的相對量顯著增加了。術(shù)語“顯著”在這里用于表示增加的水平對于造成這種增加的人是有用的，并且通常指相對于其他氨基酸序列增加約至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或以上。該術(shù)語不暗含沒有來自其他來源的氨基酸序列。氨基酸序列的其他來源可以例如包含酵母或者細(xì)菌基因組或者克隆載體如pUC19編碼的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基酸序列是上述嵌合蛋白質(zhì)。即該術(shù)語意在覆僅僅蓋有人介入以升高所希望的氨基酸序列的比例的那些情況出于某些目的，氨基酸序列為純化的形式也是有利的。術(shù)語“純化的”涉及多肽時(shí)不需要絕對純度(如同質(zhì)制備物)；相反，它代表序列比在天然環(huán)境中相對更純的含義。與天然水平相比，該水平應(yīng)該高至少2-5倍(例如按照mg/ml)。特別預(yù)期純化至少1個(gè)數(shù)量級，優(yōu)選2個(gè)或3個(gè)數(shù)量級，更優(yōu)選4個(gè)或5個(gè)數(shù)量級。物質(zhì)優(yōu)選在功能上的顯著水平上無污染物，例如，90％、95％或者99％純。
本文所用術(shù)語“化學(xué)治療劑”是用于在癌癥患者中引起治療效果的化合物、藥物、毒素或者組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。化學(xué)治療劑的多種可能在本文中列出并且這些和其他化學(xué)治療劑是本領(lǐng)域公知的。還可以利用的為生物技術(shù)治療劑，如利妥昔單抗和托西莫單抗。
本文所用術(shù)語“化學(xué)治療劑”還包括例如DNA-相互作用劑、抗代謝物、微管相互作用劑、激素治療劑和其他治療劑，如天冬酰胺酶或者羥基脲。化學(xué)治療劑可以分組成DNA-相互作用劑、抗代謝物、微管相互作用劑、激素治療劑和其他治療劑，如天冬酰胺酶或者羥基脲。每種類型的化學(xué)治療劑還可以進(jìn)一步細(xì)分。化學(xué)治療劑可以選自這些組的任一種但是不限于這些。
使用昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的患者的自身獨(dú)特型的免疫治療在歷史上，已經(jīng)詳細(xì)表征了循環(huán)系統(tǒng)細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞的表面抗原。該有利情況導(dǎo)致認(rèn)識到循環(huán)系統(tǒng)的許多癌癥具有克隆上獨(dú)特的表面抗原；特別地，B細(xì)胞腫瘤由表達(dá)一種抗體的大量產(chǎn)生的細(xì)胞組成，所述抗體作為獨(dú)特型蛋白質(zhì)出現(xiàn)在細(xì)胞表面上。這直接提示可以使用免疫系統(tǒng)的精確性而不是憑借化學(xué)療法的大量破壞來選擇性攻擊B細(xì)胞腫瘤。
導(dǎo)致僅識別和除去瘤性細(xì)胞而不傷害正常組織的免疫應(yīng)答的可能性代表治療癌癥的一種令人興奮的方法。如在上面的發(fā)明背景中看到的，已經(jīng)研發(fā)了完成該目的的不實(shí)際的方法。誘導(dǎo)此類免疫應(yīng)答需要識別獨(dú)特的腫瘤抗原并且將其作為免疫原呈遞。多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤起因于單個(gè)B細(xì)胞的克隆擴(kuò)充，從而每個(gè)B細(xì)胞都含有用于產(chǎn)生免疫球蛋白獨(dú)特型的獨(dú)特遺傳序列。因此，如果所述獨(dú)特型蛋白質(zhì)可以以足夠量產(chǎn)生，那么所述獨(dú)特型蛋白質(zhì)應(yīng)該作為任意B細(xì)胞惡性腫瘤(或者B細(xì)胞克隆疾病)的基于免疫的療法的理想靶標(biāo)。
為了實(shí)現(xiàn)該目的，必須鑒定每名患者的Id蛋白質(zhì)并且將其大量產(chǎn)生用作免疫中的抗原?？梢允褂梦锓N特異的構(gòu)架區(qū)的序列和PCR完成該鑒定。此外，該方法利用了B細(xì)胞腫瘤的相對克隆豐度。所述腫瘤細(xì)胞應(yīng)該是身體中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的最豐富的群體。從而，已經(jīng)開發(fā)了分離免疫療法所需的基因的部分的技術(shù)。一個(gè)實(shí)例見PCT申請PCT/US01/25204，其標(biāo)題為″Method and Composition for Alteringa B Cell Mediated Pathology″，在2002年2月21日公布為WO02/13862，將其完整內(nèi)容(包括圖、附圖和表格)引入作為參考。相應(yīng)的美國申請09/927,121已經(jīng)出版了核準(zhǔn)通知(Notice of Allowance)并且將出版美國專利。然而，可以使用允許足量產(chǎn)生所有或者部分Id蛋白質(zhì)以用于主動(dòng)免疫療法的任意適宜的技術(shù)。本領(lǐng)域有許多技術(shù)可以利用。
該主動(dòng)免疫療法避免了被動(dòng)免疫策略中所看到的突變逃避的現(xiàn)象并且可產(chǎn)生更寬的免疫應(yīng)答，從而識別可以隨時(shí)間產(chǎn)生的異質(zhì)腫瘤細(xì)胞群體。
分離基因后，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生獨(dú)特型蛋白質(zhì)。有多種技術(shù)可以利用；通常，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌、真核或者原核細(xì)胞體外產(chǎn)生抗體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生功能抗體，包括適宜的糖基化。細(xì)菌細(xì)胞更易生長并且可以生物工程化來產(chǎn)生抗體，然而，這樣所產(chǎn)生的抗體不被糖基化。其他真核細(xì)胞可以是內(nèi)源基因表達(dá)的宿主并且所產(chǎn)生的抗體被糖基化。在PCT公開WO02/13862中，Gold和Shopes闡明昆蟲細(xì)胞可以用于產(chǎn)生糖基化的獨(dú)特型蛋白質(zhì)，此外，這些獨(dú)特型蛋白質(zhì)可以用于引起免疫應(yīng)答。
用抗-CD20抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡如上面提到的，Rituxan是對在成熟B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的CD20抗體特異的單克隆抗體。盡管它的作用對于B細(xì)胞是特異的，但是它仍然攻擊患者B細(xì)胞的整個(gè)群體，而不是引起特異針對惡性B細(xì)胞的特異抗獨(dú)特型免疫應(yīng)答。
如果用獨(dú)特型蛋白質(zhì)免疫治療后的免疫刺激的功效(如Gold和Shopes所指出)完全或者很大程度上是由于抗體產(chǎn)生，那么用Rituxan治療后立即注射獨(dú)特型蛋白質(zhì)將是浪費(fèi)資源；該治療將喪失免疫系統(tǒng)的一臂。然而，令人驚奇地，利妥昔單抗治療后立即用Id蛋白質(zhì)免疫產(chǎn)生協(xié)同反應(yīng)所阻抑的B細(xì)胞群體導(dǎo)致對Id蛋白質(zhì)免疫的增強(qiáng)的應(yīng)答。不被該理論或者任何其他理論束縛，這提示本發(fā)明人，Id蛋白質(zhì)療法主要通過在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的(例如，T細(xì)胞)免疫應(yīng)答以改變B細(xì)胞介導(dǎo)的病理作用。
用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤的化學(xué)治療劑如本文所用的術(shù)語化學(xué)治療劑包括多種小分子，如DNA相互作用劑、抗代謝物、微管相互作用劑、激素活性劑和其他的，如天冬酰胺酶或者羥基脲?；瘜W(xué)治療劑可以選自下面組的任一種但是不限于這些組。
DNA相互作用劑包括但不限于烷基化劑如順鉑、環(huán)磷酰胺、六甲蜜胺；DNA鏈斷裂劑如博來霉素；嵌入性拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑例如放線菌素D和多柔比星；非嵌入性拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑如依托泊苷和替尼泊苷；以及DNA小溝結(jié)合劑plicamydin。
烷基化劑可以與細(xì)胞DNA、RNA或者蛋白質(zhì)分子，或者與更小的氨基酸、谷胱甘肽、或者類似的化學(xué)品形成共價(jià)化學(xué)加合物。典型的烷基化劑的實(shí)例包括但不限于氮芥(二氯乙基胺)如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、isofamide、甲二氯二乙胺、美法侖、尿嘧啶氮芥；氮丙啶如塞替派；甲磺酸酯(或者烷基酮磺酸酯)如白消安；亞硝基脲如卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星；鉑絡(luò)合物如順鉑、卡鉑；以及非典型的烷基化劑，如丙卡巴肼、達(dá)卡巴嗪和六甲蜜胺。
抗生劑是以類似于抗生素作為天然產(chǎn)物的修飾物產(chǎn)生的一組藥物。抗生劑的實(shí)例包括但不限于生物還原烷化劑，如絲裂霉素C和DNA鏈斷裂劑，其包括例如博來霉素。其他抗生劑包括認(rèn)為作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑的化合物并且可以包括嵌入劑，如下面的安吖啶、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星(阿霉素)、伊達(dá)比星和米托蒽醌；以及非嵌入劑，如依托泊苷和替尼泊苷。其他類似的活性劑包括表柔比星和蒽二酮。
抗代謝物通常通過兩種主要機(jī)制之一干擾核酸的產(chǎn)生并從而干擾細(xì)胞生長。某些藥物抑制DNA合成前體脫氧核糖核苷三磷酸的產(chǎn)生，從而抑制DNA復(fù)制。這些化合物的實(shí)例為嘌呤或者嘧啶類似物，并且以合成代謝的核苷酸途徑摻入。這些類似物然后代替DNA或者RNA的正常對應(yīng)物。
用作化學(xué)治療劑的抗代謝物包括但不限于葉酸拮抗物如氨甲蝶呤和三甲曲沙；嘧啶拮抗物如氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、CB3717、阿扎胞苷、阿糖胞苷和氟尿嘧啶脫氧核苷；嘌呤拮抗物如巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、氟達(dá)拉濱、噴司他??；以及核糖核苷酸還原酶抑制劑，如羥基脲。其他抗代謝物包括噴司他丁、磷酸氟達(dá)拉濱、克拉屈濱(2-CDA)和吉西他濱。
其他活性劑包括羥基脲(其似乎主要通過抑制核糖核苷酸還原酶起作用)和天冬酰胺酶(將天冬酰胺轉(zhuǎn)化成天冬氨酸從而抑制蛋白質(zhì)合成的酶)。
植物來源的活性劑是來自植物或者為植物來源的活性劑的修飾物的一組藥物。植物來源的活性劑的實(shí)例包括但不限于長春花堿類(例如，長春新堿、長春堿、長春地辛、長春利定和長春瑞濱)、鬼臼毒素(例如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))和紫杉烷類(例如紫杉醇(泰素)和多西紫杉醇)。這些植物來源的活性劑的一些如一些長春花堿類和紫杉醇通過結(jié)合微管從而破壞有絲分裂作為抗有絲分裂劑。鬼臼毒素如依托泊苷被認(rèn)為通過干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶II，導(dǎo)致DNA鏈斷裂而抑制DNA合成。另一種植物來源的活性劑是20(S)-喜樹堿。
激素活性劑可用于治療癌癥和腫瘤并且適于激素敏感的腫瘤。此類活性劑通常來自天然來源。激素活性劑包括但不限于雌激素、結(jié)合型雌激素和乙炔基雌二醇和己烯雌酚、chlortrianisen和idenestrol；黃體酮如己酸羥孕酮、甲羥孕酮和甲地孕酮；和雄激素類如睪酮、丙酸睪酮；氟甲睪酮和甲睪酮。腎上腺皮質(zhì)激素來自天然腎上腺皮質(zhì)醇或者氫化可的松并且用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤。它們由于消炎益處以及能夠抑制有絲分裂和停止DNA合成而被使用。這些化合物包括，但不限于，潑尼松、地塞米松、甲潑尼龍和潑尼松龍。
其它的化學(xué)治療劑包括2-CDA、2’-deoxycofornycin、依托泊苷異環(huán)磷酰胺和蒽環(huán)霉素。
按類劃分的當(dāng)前可利用的化學(xué)治療劑并且包括所述活性劑可以治療的疾病的列表在美國專利6,608,096的表3中指出，已將該專利完整(包括插入、附圖和表)引用作為參考。
除了別的以外，化學(xué)治療劑的下面的組合用于治療B細(xì)胞和T細(xì)胞惡性腫瘤MOPP、ABVD、Ch1VPP、CABS、MOPP加上ABVD、MOPP加上ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP和EPOCH?；瘜W(xué)治療劑的其他代表性組合包括但不限于CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、CAMP、CMP；COP、CAP、(長春新堿、潑尼松、蒽環(huán)霉素、和環(huán)磷酰胺或天冬酰胺酶)；和(長春新堿、潑尼松、蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺和天冬酰胺酶)。關(guān)于化學(xué)治療劑的它們的施用方法的詳細(xì)討論見Dorr等人，Cancer Chemotherapy Handbook，2d edition，Appleton&Lange(Connecticut，1994)，將其引入本文作為參考?；瘜W(xué)治療方案的進(jìn)一步描述和方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
用于癌癥治療的其他活性劑包括生物技術(shù)劑，當(dāng)其單獨(dú)使用或者與化學(xué)療法和/或免疫療法聯(lián)合使用時(shí)引起癌癥/腫瘤消退。生物技術(shù)劑的實(shí)例包括但不限于免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子、針對腫瘤抗原的單克隆抗體和刺激免疫系統(tǒng)攻擊癌細(xì)胞的化合物。
所有細(xì)胞因子都具有免疫調(diào)節(jié)活性。一些細(xì)胞因子，尤其如白介素-2(IL-2，阿地白介素)和α-干擾素(IFN-α)已經(jīng)批準(zhǔn)用于治療具有某些形式癌癥的患者并且已經(jīng)表現(xiàn)出抗腫瘤活性。
IL-2是對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答重要的T細(xì)胞生長因子。IL-2對某些患者的選擇性抗腫瘤效應(yīng)可能是細(xì)胞介導(dǎo)的區(qū)分自身和非自身的免疫應(yīng)答的結(jié)果。IFN-α已經(jīng)表現(xiàn)出對實(shí)體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤的活性，并且后者似乎尤其敏感。用于本發(fā)明的其他細(xì)胞因子包括對紅細(xì)胞生成和免疫功能發(fā)揮控制的那些細(xì)胞因子。此類細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于紅細(xì)胞生成素(epoietin-α)、粒細(xì)胞-CSF(非格司亭)以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF，沙格司亭)。其他生物技術(shù)活性劑可以用于本發(fā)明，以提供針對B細(xì)胞惡性腫瘤的治療效果。此類免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于卡介苗、左旋咪唑和奧曲肽。
不被具體理論束縛，由于GM-CSF能夠在自體Id蛋白質(zhì)注射部位募集樹突狀細(xì)胞，所以GM-CSF對于本發(fā)明尤其有用。因此，在注射部位募集樹突狀細(xì)胞的其他活性劑也可以證明對本發(fā)明是有用的。
單克隆抗體治療針對存在于腫瘤細(xì)胞上的單克隆抗體已經(jīng)顯示為有效的治療劑。具體地，針對存在于惡性B細(xì)胞上的CD20抗原的單克隆抗體(“抗-CD20抗體”)已經(jīng)證明在B細(xì)胞惡性腫瘤的治療中是有效的。
例如，單克隆抗體RITUXAN(美羅華)是針對淋巴瘤細(xì)胞上CD20抗原(也稱作Bp35抗原)產(chǎn)生的并且選擇性耗竭正常和惡性CD20+前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞。RITUXAN經(jīng)常單獨(dú)用作治療劑治療具有復(fù)發(fā)或者頑固性低級或者濾泡性、CD20+、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的患者。用作癌癥中治療劑的單克隆抗體的另一實(shí)例是HERCEPTINTM(Trastruzumab)。HERCEPTINTM是針對發(fā)現(xiàn)在一些轉(zhuǎn)移性乳腺癌上過量表達(dá)的人表皮生長因子受體2(HER2)產(chǎn)生的。HER2蛋白質(zhì)的過量表達(dá)與更具侵襲性疾病和臨床中更差的預(yù)后有關(guān)。HERCEPTINTM用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者，其中所述乳腺癌的腫瘤過表達(dá)HER蛋白質(zhì)。
Rituxan被批準(zhǔn)用于治療具有復(fù)發(fā)或者頑固性低級或者濾泡性、CD20+、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的患者。在166名患者中的III期臨床的結(jié)果表明總應(yīng)答率為48％(6％完全應(yīng)答(CR))，所有治療的患者中疾病發(fā)展之前的時(shí)間中值為9個(gè)月，應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間中值為11.2個(gè)月[1.9到42.1+月](McLaughlin P等人，″Rituximab chimericanti-CD20monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphomahalf ofpatients respond to a four-dose treatment program，″J.Clin.Oncol.1998；16(8)2825-33))。FDA最近已經(jīng)將范圍擴(kuò)大到包括已經(jīng)對Rituxan的以前療程實(shí)現(xiàn)了客觀應(yīng)答的患者的再次治療。在多中心、單臂研究中，60名患者每周接受375mg/m2Rituxan，共四劑。(DavisT等人″Rituximab anti-CD20monoclonal antibody therapy in non-Hodgkin′s lymphomasafety and efficacy of re-treatment，″J.Clin.Oncol.2000；18(17)3135-43))。所有患者都具有復(fù)發(fā)的或者頑固性低級或者濾泡性B細(xì)胞NHL并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對Rituxan的以前療程的客觀臨床應(yīng)答。在該研究中，這60名患者中，55名接受他們的第二次Rituxan療程，3名患者接受他們的第三次Rituxan療程，2名患者接受他們的第二次和第三次Rituxan療程?？倯?yīng)答率(ORR)為38％(10％CR，28％部分應(yīng)答(PR))，計(jì)劃的應(yīng)答持續(xù)時(shí)間中值為15個(gè)月(范圍為3.0到25.1+月)。對于主要產(chǎn)生抗體應(yīng)答的疫苗，擔(dān)心與產(chǎn)生基于循環(huán)和組織B細(xì)胞的快速和持續(xù)(83％患者中治療后長達(dá)6-9個(gè)月)耗竭的Rituxan組合的免疫療法將鈍化任何抗體應(yīng)答。
另一種抗-CD20抗體Bexxar(托西莫單抗)最近已經(jīng)得到FDA批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞淋巴瘤(見例如美國專利6,565,827；6,287,537；6,090,365；6,015,542；5,843,398；和5,595,721)。處于臨床試驗(yàn)或者最近批準(zhǔn)的其他單克隆抗體療法包括Oncolym(針對HLA-Dr10蛋白質(zhì))、Zevalin、依帕珠單抗和抗-CD52抗體Campath/MabCampath(阿侖單抗)。
自體Id蛋白質(zhì)免疫療法本發(fā)明預(yù)期使用B細(xì)胞惡性腫瘤上的獨(dú)特抗原免疫球蛋白獨(dú)特型(Id)作為免疫治療。該Id含有來自位于恒定抗體結(jié)構(gòu)域中的可變免疫球蛋白重和輕區(qū)(VH和VL)的蛋白質(zhì)序列。
通過使用同種型蛋白質(zhì)作為免疫原，限定該獨(dú)特型的獨(dú)特決定簇可以通知免疫系統(tǒng)它們的存在和激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致所述獨(dú)特型基因最初從其克隆的B細(xì)胞惡性腫瘤的隨后識別和破壞。使用來自輕和重免疫球蛋白鏈的每個(gè)獨(dú)特亞族的5’末端的引物以及恒定區(qū)引物克隆編碼獨(dú)特型免疫球蛋白可變區(qū)的DNA序列。通常，該方法使用一些適宜的克隆技術(shù)之一，如PCR。這些恒定區(qū)引物聯(lián)合VH區(qū)的一種引物和VL區(qū)的一種引物，可以用于克隆可變區(qū)作為產(chǎn)生包含可變區(qū)和恒定區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)中的第一步。備選地，可以使用諸如5’RACE的技術(shù)。對于本文描述的研究，5’RACE用于克隆重和輕免疫球蛋白鏈的可變區(qū)以便產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。嵌合蛋白質(zhì)的實(shí)例包括VL/Cλ、VL/Cκ、VL/IgGγ1、VH/IgGγ1、VH/Cλ和VH/Cκ。嵌合蛋白質(zhì)從而包含來自患者的免疫球蛋白分子的可變區(qū)的一部分并且還包含來自不同于該患者的來源的恒定區(qū)的一部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈恒定區(qū)序列來自9F12細(xì)胞。然而，可以使用免疫球蛋白恒定區(qū)的其他來源。與使用現(xiàn)有系統(tǒng)產(chǎn)生獨(dú)特型蛋白質(zhì)相比，預(yù)計(jì)這些嵌合蛋白質(zhì)會(huì)更有效地產(chǎn)生并且將是用于免疫方案中的優(yōu)秀免疫原。
這種誘導(dǎo)主動(dòng)免疫治療的方法可以避免被動(dòng)免疫策略中所看到的突變逃避現(xiàn)象。這種療法具有產(chǎn)生更廣泛的免疫應(yīng)答并由此識別可以隨時(shí)間產(chǎn)生的異質(zhì)腫瘤細(xì)胞群的潛力。主動(dòng)免疫治療的困難在于使患者的免疫系統(tǒng)針對腫瘤表達(dá)的被感知的“自身抗原”起反應(yīng)。不像在B細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特型蛋白質(zhì)，腫瘤表達(dá)的許多抗原是弱免疫原。
為了使體外產(chǎn)生的獨(dú)特型蛋白質(zhì)適合具體患者，首先需要鑒定和分離編碼獨(dú)特抗原的基因，接著要有產(chǎn)生那些抗原的方法。這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的許多不同方法實(shí)現(xiàn)。例如，適于本發(fā)明需要的最近開發(fā)的方法使用新的桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)并且最近開發(fā)用于有效產(chǎn)生免疫治療的功能抗體(見例如PCT申請PCT/USO1/25203，標(biāo)題為″Method and Composition for Altering a T CellMediated Pathology″，在2002年2月21日公布為WO 02/13861，將其完整內(nèi)容(包括插圖、附圖和表格)引入作為參考)。
在WO 02/13861和WO 02/13862中描述的發(fā)明中，使用桿狀病毒載體在昆蟲中產(chǎn)生這些嵌合蛋白質(zhì)。所用的所述桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被證明是有效的，如通過有效產(chǎn)生來自許多患者的用于免疫治療的功能抗體和Id蛋白質(zhì)所證明。使用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)允許產(chǎn)生大量生物活性蛋白質(zhì)而無與在細(xì)菌中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)有關(guān)的許多缺點(diǎn)，并且還避免了使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞而新出現(xiàn)的問題。例如，將來自穩(wěn)定人細(xì)胞系9F12(ATCC#HB8177)的產(chǎn)生對破傷風(fēng)類毒素特異的人Igγ1/κ抗體的免疫球蛋白基因克隆到桿狀病毒二元啟動(dòng)子表達(dá)轉(zhuǎn)移載體是。在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生完整Igγ1/κ免疫球蛋白，其在SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)印跡中行為與哺乳動(dòng)物抗體相似。昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的該抗體被糖基化。所純化的Mab9F12和所純化的桿狀病毒表達(dá)的抗體的結(jié)合親和力經(jīng)測定相同并且產(chǎn)量水平經(jīng)測定為約5-10μg/ml。
從而，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抗體生產(chǎn)的極好的備選系統(tǒng)。使用桿狀病毒系統(tǒng)可能在真核細(xì)胞中高產(chǎn)率地產(chǎn)生(1-100mg/L)生物活性蛋白質(zhì)(Haseman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.873942-46，1990)。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)防止了當(dāng)在原核生物中過量表達(dá)重組蛋白質(zhì)時(shí)經(jīng)常遇到的溶解性問題。此外，昆蟲細(xì)胞含有翻譯后修飾機(jī)器，其負(fù)責(zé)真核細(xì)胞中正確的折疊、二硫鍵形成、糖基化、β-羥基化、脂肪酸?；?、異戊烯化、磷酸化和酰胺化，但是所述翻譯后修飾機(jī)器不存在于原核生物中。已經(jīng)證明了從桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生識別人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的功能性糖基化單克隆抗體(Nesbit，J.等人，Immunol.Methods，151201-208，1992)。該桿狀病毒產(chǎn)生的抗體經(jīng)證明介導(dǎo)ADCC；相比，細(xì)菌中產(chǎn)生的抗體不被糖基化，所以沒有可檢測到的ADCC活性。然而，昆蟲細(xì)胞重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)產(chǎn)生的糖基化與當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)時(shí)所連接的糖基化不同(見例如Altmann等人，Glycoconjugate J 16109-123(1999))。
方法自體Id可變蛋白質(zhì)的產(chǎn)生方法施用含有至少一種嵌合蛋白的組合物，所述嵌合蛋白具有來自患者的免疫球蛋白可變區(qū)的VH或VL區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。用于該組合物的VH或VL區(qū)與來自具有細(xì)胞介導(dǎo)的病理的患者的B細(xì)胞產(chǎn)生的特定免疫球蛋白相關(guān)。所述組合物可以含有兩種不同的嵌合蛋白質(zhì)。每種嵌合蛋白質(zhì)具有連接到免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分的來自患者的免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)的至少一部分。作為嵌合蛋白部分的VH和/或VL區(qū)與來自具有B細(xì)胞介導(dǎo)的病理的患者的B細(xì)胞的特定免疫球蛋白鏈相關(guān)。從而，含有患者來源的獨(dú)特VH和/或VL鏈的特定免疫球蛋白鏈可開發(fā)為治療性組合物。施用于患者的Id蛋白質(zhì)還可以是來自患者的完整VHCH加上VLCL，或者其部分。
用于上面的組合物和嵌合蛋白質(zhì)的免疫球蛋白恒定區(qū)可以來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE重鏈，和κ或λ輕鏈或者其部分。在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白質(zhì)僅含有免疫球蛋白區(qū)的VH和/或VL區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)。嵌合蛋白質(zhì)的實(shí)例包括VH-IgGλ1、VL-κ和VL-λ。在另一實(shí)施方案中，組合物含有兩種嵌合蛋白質(zhì)，它們每種各自含有VH和VL區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)。實(shí)例包括VH-IgGγ1和VL-κ、和VH-IgGγ1和VL-λ。
可以使用重組DNA技術(shù)和表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)。該方法包括下面的步驟(a)從具有B細(xì)胞介導(dǎo)的病理的患者的B細(xì)胞分離編碼免疫球蛋白鏈的VH或VL區(qū)的基因，(b)將編碼免疫球蛋白鏈的VH或VL區(qū)的分離的基因和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到表達(dá)載體中以允許表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)，(c)通過將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞并允許其表達(dá)產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)，以及(d)分離嵌合蛋白質(zhì)。產(chǎn)生嵌合蛋白質(zhì)的方法還包括將編碼免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)的基因和編碼另一免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到表達(dá)載體中以允許所述另一種嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
第一種嵌合蛋白質(zhì)可以包含完整VH區(qū)和免疫球蛋白IgGγ1的人恒定區(qū)(VH-IgGγ1)，第二種嵌合蛋白質(zhì)可以包含完整VL和人κ或λ恒定區(qū)(VL-CκVL-Cλ)。嵌合蛋白質(zhì)的一種或者兩種可以包含免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)的至少一部分，加上接頭區(qū)，和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
組合物可以含有單種嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)含有來自患者的B細(xì)胞的特定免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)。實(shí)例包括嵌合蛋白質(zhì)VH-IgGγ1、VL-κ、VL-λ、VL-IgGγ1、VH-κ和VH-λ。
用于表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體可以是桿狀病毒表達(dá)載體。嵌合蛋白質(zhì)可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。用于表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體可以是酵母表達(dá)載體。嵌合蛋白質(zhì)可以在酵母細(xì)胞中表達(dá)。用于表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。嵌合蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。用于表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體還可以是細(xì)菌表達(dá)載體。嵌合蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。
用于本發(fā)明方法的載體優(yōu)選含有兩個(gè)表達(dá)盒，每個(gè)具有啟動(dòng)子、分泌信號序列和嵌合蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒可以含有與蜜蜂蜂毒肽分泌信號連接的桿狀病毒AcNPV p10啟動(dòng)子。其他表達(dá)盒可以具有與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列連接的多角體蛋白啟動(dòng)子。還可以使用其他啟動(dòng)子和信號序列。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，信號序列為與從患者分離的VH和VL基因結(jié)合的內(nèi)源信號序列，或者參與抗體產(chǎn)生的其他信號序列。在桿狀病毒表達(dá)實(shí)施方案中，編碼免疫球蛋白鏈的VH或VL部分的基因和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因單獨(dú)和/或一起插入到桿狀病毒載體的上述表達(dá)盒中，以允許一種或兩種嵌合蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈如IgGγ1的恒定區(qū)與VH或者VL區(qū)受到多角體蛋白啟動(dòng)子的控制。與p10啟動(dòng)子一樣，多角體蛋白啟動(dòng)子可以有效連接蜜蜂蜂毒肽啟動(dòng)子或者人堿性磷酸酶啟動(dòng)子。
使用抗免疫球蛋白抗體或者Ig結(jié)合蛋白質(zhì)，如對于免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)使用蛋白A，對于κ輕鏈?zhǔn)褂玫鞍譒，和/或結(jié)合免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任一其他蛋白質(zhì)，通過親和層析柱純化所產(chǎn)生的嵌合蛋白質(zhì)。
嵌合蛋白質(zhì)可以共價(jià)偶聯(lián)載體蛋白質(zhì)，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。組合物還可以與細(xì)胞因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)或者趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP 3)一起施用于患者。因?yàn)楸景l(fā)明嵌合蛋白質(zhì)特別涉及來自具有B細(xì)胞介導(dǎo)的病理的患者的B細(xì)胞的特定免疫球蛋白，所以該組合物的施用誘導(dǎo)針對疾病特異獨(dú)特型的免疫應(yīng)答，其中涉及特定的VH或VL片段。本發(fā)明組合物的施用途徑包括但不限于經(jīng)口遞送、吸入遞送、注射遞送、經(jīng)皮遞送等等。
該技術(shù)利用了存在于卷入B細(xì)胞病理的B細(xì)胞表面上并且以患者特異方式產(chǎn)生的獨(dú)特細(xì)胞表面抗原。此類自體Id蛋白質(zhì)在將患者的免疫系統(tǒng)導(dǎo)向與給定患者中發(fā)現(xiàn)的病原性B細(xì)胞結(jié)合的獨(dú)特標(biāo)記中提供了精密的選擇性。
重組蛋白質(zhì)的桿狀病毒表達(dá)如上面討論的，使用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)已經(jīng)作為真核細(xì)胞中生物活性蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率生產(chǎn)(1-100mg/L)的極佳選擇。Nesbit和同事證明從桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生功能性糖基化單克隆抗體(Nesbit，J.，等人，Immunol.Methods 151201-208，1992)。此外，還證明了在桿狀病毒細(xì)胞中表達(dá)重組IgA，并且該IgA被正確地裝配成重鏈/輕鏈異二聚體、N-糖基化和分泌(Carayannopoulos等人，Proc.Natl.Acad.Sci.918348-52，1994，PCT
發(fā)明者D·P·戈德 申請人:法弗里爾公司