專利名稱：遺傳多態(tài)性用于預(yù)測藥物誘導肝臟毒性的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及組織樣品的體外分析測試，并且更加具體而言涉及作為預(yù)測藥物誘導肝臟毒性發(fā)生有用的生物標志物的遺傳多態(tài)性分析。
相關(guān)領(lǐng)域描述由于糖尿病患者微脈管系統(tǒng)機能障礙而產(chǎn)生的失調(diào)之一是視網(wǎng)膜病變，其自身的臨床表現(xiàn)為視力障礙并且能夠?qū)е率?。糖尿病性視網(wǎng)膜病變特征為微動脈瘤、過度血管滲透性、視網(wǎng)膜無灌注區(qū)和視網(wǎng)膜新生血管形成。許多證據(jù)表明在高血糖水平與導致器官功能缺損的潛在損傷發(fā)展之間存在因果聯(lián)系。對于綜述見Way KJ等，Diabetic Medicine 18945-59(2001)。
高血糖癥效應(yīng)之一是二酰甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)信號轉(zhuǎn)導途徑的過度活化。糖尿病的細胞培養(yǎng)實驗和動物模型都證明在血管內(nèi)皮細胞中DAG和PKC的水平和活性過高。Koya D和King GL，Diabetes 47859-866(1998)；Ishii H等，JMol Med 7621-31(1998)和Way KJ等，TrendsPharmacol Sci 21181-7(2000)。許多PKC絲氨酸-蘇氨酸激酶異型體的活化依賴于DAG，即膜磷脂的裂解產(chǎn)物。PKC絲氨酸-蘇氨酸激酶的活化異型體之一是主要的異型體PKCβ，該異型體與糖尿病性視網(wǎng)膜病變相關(guān)。DAG一般通過激動劑刺激的膜磷脂水解產(chǎn)生，但是也能夠通過葡萄糖直接代謝作用從頭合成。Dunlop ME和Larkins RG，Biochem Biophys ResCommun 132467-73(1985)；Ishii H等，JMol Med 7621-31(1998)。作為對高血糖癥的反應(yīng)，DAG從頭合成大量增加，導致PKCβ的活化。IshiiH等，J Mol Med 7621-31(1998)。
DAG-PKC途徑持續(xù)活化的結(jié)果影響到血管功能的許多方面。刺激細胞因子活化和白細胞粘附；改變血流量和微血管收縮性；以及增加細胞外基質(zhì)合成，導致基膜變厚。由于上述改變視網(wǎng)膜微環(huán)境變得局部缺血。作為對局部缺血的反應(yīng)并且通過其它PKCβ依賴機制上調(diào)了一種新血管形成有效刺激物即血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。Aiello LP等，Diabetes 461473-80(1997)。
N-苯甲酰-星形孢菌素(PKC412)是PKC和重要VEGF受體KDR(包含激酶插入結(jié)構(gòu)域受體，也稱為VEGF-R2)的抑制劑。N-苯甲酰-星形孢菌素正在研發(fā)用于幾種指征，包括糖尿病黃斑水腫的治療。見美國專利號6,214,819。還可見美國專利申請20030119812、20030125343和20030153551。盡管N-苯甲酰-星形孢菌素治療是一種有前途的藥物治療，但其可導致出現(xiàn)包括肝臟毒性在內(nèi)的已知副作用。因此，在本領(lǐng)域中需要降低N-苯甲酰-星形孢菌素的副作用。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了用于確定處于發(fā)展成藥物誘導肝臟毒性危險的受試者的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基因組分析用于鑒定在星形孢菌素治療期間處于形成肝臟毒性危險的患者的途。在特定實施方案中，星形孢菌素治療包括施用N-苯甲酰-星形孢菌素用于治療糖尿病黃斑水腫。肝臟毒性的預(yù)測包括測定血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了確定用于這些患者的最佳治療策略的方法。
本發(fā)明還提供了用于在服藥之前預(yù)測肝臟毒性的臨床測定法、試劑盒和試劑。在一個實施方案中，試劑盒包含用于確定IL1A基因中遺傳多態(tài)性的試劑。在特定實施方案中，遺傳多態(tài)性位于IL1A基因的PG基因座ID 279。在PG基因座ID 279遺傳多態(tài)性的測定中，CC基因型(SEQ IDNO1)是預(yù)測具有較高肝臟毒性危險的生物標志，而CT基因型(SEQ IDNO1和2)和TT基因型(SEQ ID NO2)是預(yù)測具有較低肝臟毒性危險的生物標志。在另一個實施方案中，試劑盒包含用于確定IL1A基因中遺傳多態(tài)性的試劑。在特定實施方案中，遺傳多態(tài)性位于IL1A基因的PG基因座ID 302。在PG基因座ID 302遺傳多態(tài)性的測定中，GG基因型(SEQ IDNO3)是預(yù)測具有較高肝臟毒性危險的生物標志，而GT基因型(SEQ IDNO3和4)和TT基因型(SEQ ID NO4)是預(yù)測具有較低肝臟毒性危險的生物標志。
附圖簡述

圖1顯示AST/ALT(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)水平最大值對IL1A(白介素1-α；PG基因座ID 279)。散點圖顯示在臨床試驗中IL1A PG基因座ID 279基因型為CC或T(CT或TT)的受試者的(A)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平最大值，(B)AST MAX和正常值上限(ULN)的比值，(C)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平最大值，和(D)ALT MAX和ULN的比值。對于年齡為3-64歲的受試者天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為42U/L且對于年齡為65歲以及更大的受試者為55U/L，并且對于所有年齡的受試者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為48U/L。ULN用直線表示。
圖2顯示AST/ALT(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)水平最大值對IL1A(白介素1-α；PG基因座ID 302)。散點圖顯示在臨床試驗中IL1A PG基因座ID 302基因型為G或T(GT或TT)的受試者的(A)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平最大值，(B)AST MAX和ULN比值，(C)ALT水平最大值和(D)ALTMAX和ULN比值。對于年齡為3-64歲的受試者天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為42U/L且對于年齡為65歲和更大的受試者為55U/L，并且對于所有年齡的受試者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為48U/L。ULN用直線表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明有利地提供了在真正服藥之前確定患者在藥物治療期間是否將經(jīng)歷肝臟毒性的方法。因此本發(fā)明通過幫助臨床醫(yī)師(1)改變藥物劑量、(2)提供另外的或備選的合并用藥(concomitant medication)法或者(3)選擇對于該患者不開該藥物藥方而提供了對于患者更加安全的療法。
在N-苯甲酰-星形孢菌素的多中心、隨機、雙盲安慰劑對照控制劑量發(fā)現(xiàn)II期試驗中鑒定了相關(guān)遺傳多態(tài)性，該試驗在患有糖尿病黃斑水腫的受試者中進行。在受試者中評價了N-苯甲酰-星形孢菌素的安全性并且收集其它藥物代謝動力學信息。雖然N-苯甲酰-星形孢菌素顯示了良好的安全性，但是在登記進行臨床試驗的140名受試者中有9名受試者經(jīng)歷肝臟毒性，如通過肝臟轉(zhuǎn)氨酶比正常值上限(ULN)增加倍數(shù)所確定。如果在第3、4或5次隨訪時天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)比正常值上限成倍增加，則將受試者標記為經(jīng)歷過肝臟毒性。
在進行基因分型的7個基因的18個單核苷酸多態(tài)性(SNP)中，白介素1-α(IL1A)基因中2個單核苷酸多態(tài)性與第3、4或5次隨訪時所記錄的血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平最大值關(guān)聯(lián)。IL1A編碼在介導急性期反應(yīng)中起至關(guān)重要作用的炎性細胞因子。一個IL1A多態(tài)性位于IL1A的啟動子區(qū)域并且另一個為氨基酸位置114上絲氨酸至丙氨酸的替換。這些結(jié)果表明IL1A或在2q14上定位于其附近的基因內(nèi)的多態(tài)性直接參與N-苯甲酰-星形孢菌素施用后肝臟毒性的發(fā)病。
如文中所使用，當遺傳多態(tài)性與藥物誘導肝臟毒性的發(fā)展或者血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平上升顯著關(guān)聯(lián)時，IL1A遺傳基因座中的多態(tài)性是肝臟毒性“高”危險的“預(yù)示”。例如見下，在這里PG基因座ID 279位的CC基因型和PG基因座ID 302位的GG基因型預(yù)示具有肝臟毒性的高危險。如文中所使用，當遺傳多態(tài)性與缺乏肝臟毒性發(fā)展顯著關(guān)聯(lián)時，IL1A遺傳基因座中的多態(tài)性是肝臟毒性“低”危險的“預(yù)示”。例如見下，在這里PG基因座ID 279位的CT或TT基因型和PG基因座ID 302位的GT或TT基因型預(yù)示具有肝臟毒性的低危險。通過方差分析(ANOVA)或Fisher精確檢驗?zāi)軌驕y定顯著性(p值)。對某一IL1A遺傳位點中具有發(fā)展成肝臟毒性高危險的一個SNP多態(tài)性的確定和對該IL1A遺傳位點中具有發(fā)展成肝臟毒性低危險的另一個SNP多態(tài)性的確定可以結(jié)合起來以得到更高的確定精確性。對于PG基因座ID 279和302，IL1A多態(tài)性和血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平之間關(guān)聯(lián)的p值為0.0089和0.0097。
基于星形孢菌素衍生物的結(jié)構(gòu)相似性和在肝臟內(nèi)的作用方式，能夠合理地將這些結(jié)果外推至能夠預(yù)測在任意星形孢菌素衍生物施用之后患者的肝臟毒性。星形孢菌素衍生物是描述于美國專利號5,093,330中的那些。優(yōu)選的化合物是N-?；切捂呔丶捌淇伤幱名}，包括N-(2-氨基乙酰基)星形孢菌素；N-(3，5-二硝基苯甲酰基)-星形孢菌素；N-(3-羧基丙?；?星形孢菌素；N-(3-氟苯甲?；?-星形孢菌素；N-(3-硝基苯甲酰基)星形孢菌素；N-(4-羧基苯甲酰基)星形孢菌素；N-[(叔丁氧基羰基氨基)-乙?；鵠-星形孢菌素；N-丙氨酰星形孢菌素；N-苯甲酰星形孢菌素；N-羧甲基-星形孢菌素；N-乙基-星形孢菌素；N-甲基氨基硫代羰基星形孢菌素；N-苯氨羰基星形孢菌素；N-叔丁氧基羰基星形孢菌素和N-三氟乙酰基星形孢菌素。
而且，這些結(jié)果能夠推廣至在治療糖尿病黃斑水腫之外的其他疾病的患者中預(yù)測肝臟毒性。本發(fā)明的方法適用于脊椎動物受試者，具體而言是哺乳動物受試者，更加具體而言是人類受試者。本發(fā)明特別適用于糖尿病受試者。
使用血清酶水平測定法能夠?qū)崿F(xiàn)肝臟毒性診斷。指示肝臟功能障礙的血清酶測定法是醫(yī)學領(lǐng)域中那些技術(shù)人員眾所周知的并且是醫(yī)院實驗室中常規(guī)進行的測定法。對于肝臟毒性的定義基于血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平并用于實施例在該分析中使用的肝臟毒性定義是基于第3、4或5次隨訪時血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶超過正常值上限(ULN)的增加倍數(shù)。對于年齡為3-64歲的受試者血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為42U/L并且對于年齡為65歲及以上的受試者為55U/L；對于血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶正常值上限為48U/L(Smithkline Beecham臨床實驗室的參考警惕范圍)。雖然在第3、4或5次隨訪時任一種酶的升高均構(gòu)成肝臟毒性，但在未施用藥物時的隨后隨訪過程中的轉(zhuǎn)氨酶升高可以忽視。而且，在基線期(第2次隨訪)時肝臟功能測試結(jié)果升高的受試者不標記為經(jīng)歷肝臟毒性，而不管在施用藥物后他們的酶水平升高情況如何。9名受試者被標記為將經(jīng)歷肝臟毒性。他們當中有6名受試者同意進行臨床藥物遺傳學分析。
使用本領(lǐng)域眾所周知的各種技術(shù)可以在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平檢測攜帶多態(tài)性等位基因的個體。用于鑒定和檢測的策略描述于例如EP730,663、EP 717,113和PCT US 97/02102。本發(fā)明的方法可以包括檢測預(yù)先表征的多態(tài)性。即已經(jīng)確定了該位點存在的基因分型位置和多態(tài)性形式特性(見關(guān)于所檢查基因的討論)。該信息的可利用性允許設(shè)計多套探針用于已知多態(tài)形式的特異性鑒定。包含單核苷酸多態(tài)性的等位基因的鑒定可以包括從靶樣品擴增DNA。通過例如PCR能夠?qū)崿F(xiàn)擴增。通常見PCRTechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，(Erlich編，F(xiàn)reeman Press，New York，New York，1992)；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis等編，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)。通過各種方法能夠?qū)崿F(xiàn)特異性DNA序列中多態(tài)性的檢測，其中所述方法包括但不限于基于等位基因特異性限制性核酸內(nèi)切酶斷裂的限制性片段長度多態(tài)性檢測(Kan和Dozy，Lancet II910-912(1978))、與等位基因特異性探針(Wallace等，Nucl.Acids Res.63543-3557(1978))包括固定化寡核苷酸(Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866230-6234(1969))或寡核苷酸陣列(Maskos和Southern，Nucl.Acids Res.212269-2270(1993))雜交、等位基因特異PCR(Newton等，Nucl.Acids Res.172503-2516(1989))、錯配修復(fù)檢測(MRD)(Faham和Cox，Genome Res.5474-482(1995))、MutS蛋白質(zhì)結(jié)合(Wagner等，Nucl.Acids Res.233944-3948(1995))、變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Fisher和Lerman，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.801579-1583(1983))、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(Orita等，Genomics 5874-879(1983))、在錯配堿基對處的RNA酶斷裂(Myers等，Science 2301242(1985))、異源雙鏈體DNA的化學斷裂(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8Z4397-4401(1988))或酶學斷裂(Youil等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9287-91(1995))、基于等位基因特異性引物延伸的方法(Syvanen等，Genomics 8684-692(1990))、遺傳位元分析法(genetic bit analysis)(GBA)(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.224167-4175(1994))、寡核苷酸連接分析法(OLA)(Landegren等，Science 2411077(1988))、等位基因特異性連接鏈式反應(yīng)(LCR)(Barrany，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88189-193(1991))、缺口LCR(Abravaya等，Nucl.Acids Res.23675-682(1995))、使用本領(lǐng)域眾所周知的標準程序進行的放射性和/或熒光DNA測序和肽核酸(PNA)測定法(Orum等，Nucl.Acids Res.215332-5356(1993)；Thiede等，Nucl.Acids Res.24983-984(1996))。Sambrook J等的Molecular CloningALaboratory Manual，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York，2000)提供了另外的指導。
對于N-苯甲酰-星形孢菌素和相關(guān)星形孢菌素衍生物用途的指導在美國專利號5,744,460；5,827,846；6,018,042；6,153,599和6,214,819中提供，其中每一專利引用作為參考。對于N-苯甲酰-星形孢菌素相關(guān)星形孢菌素衍生物用于治療眼新血管形成疾病和降低視網(wǎng)膜內(nèi)毛細血管滲透性的指導在美國專利申請20030119812、20030125343和20030153551中提供，其中每一專利引用作為參考。
單核苷酸多態(tài)性.
人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)組成，其它的序列變異為短串聯(lián)重復(fù)(包括微衛(wèi)星序列)、長串聯(lián)重復(fù)(小衛(wèi)星序列)以及其它插入和缺失。SNP是在人類種群中以可覺察的頻率(即＞1％)出現(xiàn)2個交替堿基的位置。由于多態(tài)性的存在，SNP稱為“等位的”，物種中的一些成員可以具有未突變的序列(即最初“等位基因”)，而其它成員可以具有突變序列(即等位基因的變體或突變體)。在最簡單的例子中，僅存在一個突變序列，并且多態(tài)性稱為二對等位基因的多態(tài)性。交替突變的存在能夠產(chǎn)生三對等位基因多態(tài)性等等。SNP分布于整個基因組中并且改變基因功能的SNP可能是表型變異的直接促成者。由于其流行性和廣泛分布的特點，SNP有可能成為重要的工具用于定位參與人類疾病狀態(tài)的基因，見例如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，其公開了一項先導研究，其中將2,227個SNP在2.3兆堿基DNA區(qū)域上進行了作圖。
單核苷酸多態(tài)性和特定表型之間的關(guān)聯(lián)不表示或者要求SNP是表型的成因。相反，此種關(guān)聯(lián)僅可以表示該SNP定位于基因組上某位點附近，其中在所述的位點存在表型的決定因子，并且因此更有可能發(fā)現(xiàn)SNP與這些決定因子的關(guān)聯(lián)從而發(fā)現(xiàn)SNP與目的表型的關(guān)聯(lián)。因此，SNP與‘真正’功能變體處于連鎖不平衡(LD)。當基因組的2個不同位點處的等位基因的關(guān)聯(lián)比預(yù)期的更高時，則存在LD(也稱作等位基因關(guān)聯(lián)性)。
因此，由于其與引起特定表型的突變的接近，SNP可以作為具有價值的標志物。
與疾病關(guān)聯(lián)的SNP對其所定位的基因的功能也可以具有直接的影響。序列變體可以導致氨基酸改變或者可以改變外顯子-內(nèi)含子剪接，從而直接修飾相關(guān)蛋白質(zhì)，或者序列變體存在于調(diào)控區(qū)域，從而改變表達循環(huán)或mRNA穩(wěn)定性，見Nowotny P Current Opinions in Neurobiology 11637-641(2001)。
日益明顯，發(fā)展成許多共同病癥的危險性以及用于治療這些狀況的藥物的代謝基本上受到潛在基因組變異的影響，盡管任何一個變體的影響可能很小。
因此，SNP和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)表明(1)SNP在功能上決定表型或者，(2)在基因組上靠近SNP的位置存在引起表型的其它突變。第二種可能性是基于遺傳生物學。大的DNA片段是遺傳的并且彼此接近的標志物不可能在許多代不相關(guān)的個體中進行重組，即標志物是連鎖不平衡的(LD)。
SNP鑒定和表征.
許多不同的技術(shù)能夠用于鑒定和表征SNP，包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、通過變性高效液相色譜(DHPLC)的異源雙鏈體分析、直接DNA測序和計算機方法，見Shi MM，Clin Chem 47164-172(2001)。由于公共數(shù)據(jù)庫序列信息的豐富，可以使用計算機工具通過對獨立提交的特定基因的序列(cDNA或者基因組序列)進行比對在計算機上鑒定SNP。對通過實驗所獲得的SNP和通過計算機方法獲得的SNP進行比較顯示，在通過SNPFinder(http://Ipgws.nci.nih.gov82/perl/snp/snp_cgi.pl)發(fā)現(xiàn)的候選SNP中有55％的SNP也已經(jīng)通過實驗發(fā)現(xiàn)，見Cox等，Hum Mutat17141-150(2001)。然而，這些計算機方法僅能夠找到27％的真正SNP。
目前，最常見的SNP分型方法包括雜交、引物延伸和斷裂方法。這些方法的每一種必須與適當檢測系統(tǒng)相結(jié)合。檢測技術(shù)包括熒光偏振(見Chan X等，Genome Res 9492-499(1999))、焦磷酸鹽釋放的發(fā)光計檢測(焦磷酸測序)(見Ahmadiian A等，Anal Biochem 280103-10(2000))、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的裂解測定、DHPLC和質(zhì)譜法(見Shi MM，ClinChem 47164-172(2001)和美國專利號6,300,076B1)。檢測和表征SNP的其它方法是公開于美國專利號6,297,018B1和6,300,063B1的那些方法。上面參考文獻的公開在文中全部引用作為參考。
在特別優(yōu)選的實施方案中，通過所謂的INVADERTM技術(shù)(可以從Third Wave Technologies公司(Madison，Wisconsin，美國)獲得)能夠?qū)崿F(xiàn)多態(tài)性的檢測。在該測定法中，特異性上游“侵略者”寡核苷酸和部分重疊的下游探針當結(jié)合至互補DNA模板時一起形成特異結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)被裂解酶識別并在特異位點切割，并且這導致探針寡核苷酸5’側(cè)翼的釋放。然后該片段可以作為關(guān)于反應(yīng)混合物中所包含的合成二級靶標和二級熒光標記信號探針的“侵略者”寡核苷酸。這導致裂解酶對二級信號探針的特異裂解。當用能夠進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移的染料分子所標記的該二級探針被裂解時，則產(chǎn)生熒光信號。裂解酶對于重疊DNA序列或側(cè)翼所形成的結(jié)構(gòu)具有嚴格的要求，并且因此裂解酶能夠特異性檢測在下游DNA鏈上的緊鄰裂解位點上游的單個堿基對錯配。見Ryan D等，MolecularDiagnosis 4(2)135-144(1999)和Lyamichev V等，Nature Biotechnology17292-296(1999)，還可參見美國專利5,846,717和6,001,567(其公開在文中全部引用作為參考)。
在一些實施方案中，組合物包含2種或多種不同標記的基因分型寡核苷酸，其用于同時探測2種或多種多態(tài)性位點處的核苷酸。還可預(yù)見引物組合物包含2套或多套等位基因特異引物對以允許同時靶向并擴增包含多態(tài)性位點的2個或多個區(qū)域。
本發(fā)明的基因分型寡核苷酸還可以固定在固體表面例如微芯片、珠子或載玻片上或者在其上合成(見例如WO 98/20020和WO 98/20019)。此類固定化的基因分型寡核苷酸可以用于多種多態(tài)性檢測測定，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸測定。本發(fā)明的固定化基因分型寡核苷酸可以包含有序寡核苷酸陣列，其中所述陣列被設(shè)計成同時快速篩選DNA樣品中的多重基因的多態(tài)性。
本發(fā)明的等位基因特異寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸，或者優(yōu)選地具有3’次末端核苷酸，其與特定SNP的唯一一個核苷酸互補，從而僅僅當存在包含該核苷酸的等位基因時才能夠作為引物用于聚合酶介導的延伸。雜交至編碼鏈或非編碼鏈的等位基因特異寡核苷酸引物也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)能夠研發(fā)用于檢測基因多態(tài)性的ASO引物。
本發(fā)明的其它基因分型寡核苷酸與位于此處所鑒定新多態(tài)性位點之一的下游一個至幾個核苷酸的靶區(qū)域雜交。此類寡核苷酸用于聚合酶介導的引物延伸方法以檢測文中所敘述的新多態(tài)性之一，并且因此此類基因分型寡核苷酸在文中稱為“引物延伸寡核苷酸”。在一個優(yōu)選的實施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與緊鄰多態(tài)性位點的核苷酸互補的脫氧核苷酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少2種包裝于分開容器中的基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒還包含其他成分例如包裝于分開容器中的雜交緩沖液(在這里寡核苷酸將用作探針)。備選地，當寡核苷酸用于擴增靶區(qū)域時，試劑盒還包含包裝于分開容器中的聚合酶和反應(yīng)緩沖液，該反應(yīng)緩沖液對于聚合酶介導的引物延伸例如PCR是優(yōu)化的。
上述的寡核苷酸組合物和試劑盒可用于個體基因的基因分型和/或單體型分析方法。如文中所使用，術(shù)語“基因型”和“單體型”意思分別是包含存在于文中所描述的一個或多個新多態(tài)性位點的核苷酸對或核苷酸的基因型或單體型，并且還可以任選地包含存在于基因中一個或多個另外多態(tài)性位點的核苷酸對或核苷酸。另外的多態(tài)性位點可以是目前已知的多態(tài)性位點或者后來發(fā)現(xiàn)的位點。
基因分型方法的一個實施方案包括從個體分離包含個體中存在的2個拷貝基因或其片段的核酸混合物，和確定位于這2個拷貝中一個或多個多態(tài)性位點的核苷酸對以確定個體的基因型。如熟練的技術(shù)人員將容易理解，個體中基因的2個“拷貝”可以是相同的等位基因或者是不同的等位基因。在特別優(yōu)選的實施方案中，基因分型方法包括確定每個多態(tài)性位點的核苷酸對。
一般地，核酸混合物從取自個體的生物學樣品如血液樣品或組織樣品分離得到。適當?shù)慕M織樣品包括全血、精液、唾液、眼淚、尿液、排泄物、汗液、頰膜涂片、皮膚和毛發(fā)。核酸混合物可以由基因組DNA、mRNA或cDNA組成，并且在后兩種情況下生物學樣品必須是從表達該基因的器官獲得。此外，熟練技術(shù)人員應(yīng)當理解，mRNA或cDNA樣品不能用于檢測位于內(nèi)含子內(nèi)或者5’和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的多態(tài)性。如果基因片段是分離的，則其必須包含待進行基因分型的多態(tài)性位點。
單體型分析方法的一個實施方案包括從個體分離僅包含個體中存在的基因或其片段的2個拷貝之一的核酸分子和確定位于該拷貝中一個或多個多態(tài)性位點的核苷酸以確定個體的單體型。使用能夠分離2個拷貝基因或片段的任意方法可以分離核酸，方法包括但不限于上面所描述的用于制備同源基因的方法之一，其中體內(nèi)靶向克隆是優(yōu)選的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，任何單個克隆將僅提供個體中存在的兩個基因拷貝之一的單體型信息。如果單體型信息是個體的其它拷貝，則需要檢測其它克隆。一般地，為了使對個體基因兩個拷貝的單體型分析具有高于90％的可能性，至少要檢測5個克隆。在特別優(yōu)選的實施方案中，鑒定每個多態(tài)性位點處的核苷酸。
在優(yōu)選的實施方案中，通過鑒定個體中存在的每個拷貝基因中一個或多個多態(tài)性位點處的核苷酸的相位序列(phased sequence)確定個體的單體型對。在特別優(yōu)選的實施方案中，單體型分析方法包括鑒定基因每個拷貝中每個多態(tài)性位點處核苷酸的相位序列。當對基因的兩個拷貝進行單體型分析時，優(yōu)選地使用放置于分開容器中的每一拷貝基因開展鑒定步驟。然而，也應(yīng)該想象到，如果2個拷貝是用不同標簽標記的或者是分別可區(qū)別的或可辨別的，在某些情況下可以在同一容器中開展該方法。例如，如果基因的第一個和第二個拷貝分別用不同的第一種和第二種熒光染料標記并且用第三種不同的熒光染料標記的等位基因特異寡核苷酸用于測定多態(tài)性位點，則檢測第一種和第三種染料的組合將鑒定第一個基因拷貝中的多態(tài)性而檢測第二種和第三種染料的組合將鑒定第二個基因拷貝中的多態(tài)性。
在基因分型和單體型分析方法中，多態(tài)性位點處的核苷酸(或核苷酸對)的鑒定可以通過包含直接來自基因或其片段的一個或兩個拷貝的多態(tài)性位點的靶區(qū)域的擴增進行，并且通過常規(guī)方法確定擴增區(qū)域的序列。熟練技術(shù)人員應(yīng)該容易理解，在該位點為純合子的個體中多態(tài)性位點處將僅檢測到一種核苷酸，而如果該個體在該位點為雜合子則將檢測到2種不同的核苷酸。多態(tài)性可以直接鑒定，稱為肯定型鑒定，或者通過推斷鑒定，稱為否定型鑒定。例如，當在參照種群中SNP已知為鳥嘌呤和胞嘧啶，可以肯定地確定對于該位點為純合子的患病個體該位點為鳥嘌呤或胞嘧啶，如果個體在該位點為雜合子則位點為鳥嘌呤和胞嘧啶。備選地，該位點可以否定性地確定為不是鳥嘌呤(并且因此也不是胞嘧啶/胞嘧啶)或者不是胞嘧啶(并且因此也不是鳥嘌呤/鳥嘌呤)。
此外，通過對文中未公開的多態(tài)性位點(其與目的多態(tài)性位點是連鎖不平衡的)進行基因分型可以間接鑒定存在于文中所公開的任意新多態(tài)性位點處的等位基因。如果在一個位點處存在的特定變體增強了第二個位點處另一個變體的可預(yù)測性，則兩個位點被稱為是連鎖不平衡的(見，StevensJC，Mol Diag 4309-317(1999))。與目前公開的多態(tài)性位點處于連鎖不平衡的多態(tài)性位點可以定位于基因區(qū)域內(nèi)或者文中未檢測到的其它基因組區(qū)域內(nèi)。通過(但不限于)上述用于鑒定多態(tài)性位點處等位基因的任意方法，可以對與文中所述新多態(tài)性位點處于連鎖不平衡的多態(tài)性位點進行基因分型。
使用任意寡核苷酸定向擴增方法可以擴增靶區(qū)域，所述方法包括但不限于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)(美國專利號4,965,188)、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)(Barany等，Proc Natl Acad Sci USA 88189-193(1991)；PCT專利申請WO 90/01069)和寡核苷酸連接測定法(OLA)(Landegren等，Science2411077-1080(1988))。在此類方法中用作引物或探針的寡核苷酸將與包含多態(tài)性位點或與多態(tài)性位點相鄰的核酸區(qū)域特異性雜交。一般地，寡核苷酸長度在10和35個核苷酸之間，并且長度優(yōu)選地在15和30個核苷酸之間。最優(yōu)選地，寡核苷酸長度為20-25個核苷酸。寡核苷酸的確切長度將取決于許多因素，這些因素是技術(shù)人員常規(guī)考慮和實踐的。
其它已知核酸擴增方法也可以用于擴增靶區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(美國專利號5,130,238；EP 329,822；美國專利號5,169,766、WO89/06700)和等溫法(Walker等，Proc Natl Acad Sci USA 89392-396(1992))。
靶區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性也可以通過使用本領(lǐng)域已知的幾種基于雜交的方法之一在擴增之前或之后測定。一般地，在開展此類方法時利用等位基因特異寡核苷酸。等位基因特異寡核苷酸可以用作帶有不同標記的探針對，其中探針對之一與靶序列的一個變體完全匹配而另一個探針與不同的變體完全匹配。在一些實施方案中，使用一套等位基因特異寡核苷酸或寡核苷酸對可以立刻檢測一個以上的多態(tài)性位點。優(yōu)選地，當與待檢測的每個多態(tài)性位點雜交時，則該套等位基因特異寡核苷酸或寡核苷酸對的成員相互之間的熔解溫度在5℃內(nèi)并且更加優(yōu)選地在2℃內(nèi)。
等位基因特異寡核苷酸與靶多聚核苷酸的雜交可以使用溶液中的兩種實體進行，或者可以把寡核苷酸或靶多聚核苷酸共價或非共價附著于固體支持物上進行此種雜交。附著可以是通過例如抗體-抗原相互作用、多聚L-Lys、鏈霉親和素或抗生物素蛋白-生物素、鹽橋、疏水相互作用、化學鍵、UV交聯(lián)烘烤等等間接進行。等位基因特異寡核苷酸可以在固體支持物上直接合成或者在合成之后附著于固體支持物上。適宜用于本發(fā)明檢測方法的固體支持物包括由硅、玻璃、塑料、紙等等制成的基質(zhì)，它們可以被制成如孔(如在96孔板中)、載玻片、薄片、膜、纖維、芯片、盤和珠的形狀?？梢詫⒐腆w支持物進行處理、包被或衍生以易于等位基因特異寡核苷酸或靶核酸的固定化。
個體基因的基因型或單體型的確定還可以通過將包含一個或兩個基因拷貝的核酸樣品與如WO 95/11995中所述核酸陣列和子陣列雜交進行。陣列將包含代表著在基因型或單體型中所包括的每一多態(tài)性位點的一組等位基因特異寡核苷酸。
對多態(tài)性的鑒定還可以使用錯配檢測技術(shù)進行，所述技術(shù)包括但不限于使用核糖核酸探針(Winter等，Proc Natl Acad Sci USA 827575(1985)；Meyers等，Science 2301242(1985))和識別核苷酸錯配的蛋白質(zhì)如大腸桿菌(E.coli)mutS蛋白質(zhì)(Modrich P.Ann Rev Genet 25229-253(1991))的RNA酶保護方法。備選地，可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等，Genomics 5874-879(1989)；Humphries等，在Molecular Diagnosisof Genetic Diseases，R.Elles編，第321-340頁(1996))或變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell等，Nucl Acids Res 182699-2706(1990)；Sheffield等，Proc Natl Acad Sci USA 86232-236(1989))鑒定變體等位基因。
聚合酶介導引物延伸方法也可以用于鑒定多態(tài)性。幾種此類方法已經(jīng)在專利和科學文獻中描述過并且包括“遺傳位元分析”方法(WO 92/15712)和連接酶/聚合酶介導的遺傳位元分析法(美國專利號5,679,524)。相關(guān)方法公開于WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676、美國專利號5,302,509和5,945,283。如美國專利號5,605,798中所描述，通過質(zhì)譜法可以檢測包含多態(tài)性的延伸的引物。另一種引物延伸方法是等位基因特異PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 178392(1989)；Ruafio等，Nucl Acids Res196877-6882(1991)；WO 93/22456；Turki等，J Clin Invest 951635-1641(1995))。此外，如WO 89/10414所描述，通過使用多套等位基因特異引物同時擴增核酸的多重區(qū)域可以研究多重多態(tài)性位點。
在優(yōu)選的實施方案中，測定了每一人種地理學群的單體型頻率數(shù)據(jù)以確定其是否與哈迪-溫伯格平衡相一致。哈迪-溫伯格平衡(D.L.Hartl等，Principles of Population Genomics，第三版，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997)假定發(fā)現(xiàn)單體型對H1/H2的頻率等于PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)(如果H1≠H2)和PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)(如果H1＝H2)。所觀察和所預(yù)測的單體型頻率之間的統(tǒng)計學上的顯著差異可以歸因于一種或多種因素，包括種群中明顯的近交、對基因的強選擇壓力、抽樣偏差和/或基因分型過程中的誤差。如果在人種地理學群中觀察到來自哈迪-溫伯格平衡的大的偏差，則可以增加該群個體數(shù)量以判斷偏差是否是由于抽樣偏差造成的。如果使用較大樣本量也沒有降低所觀察和所預(yù)測單體型對頻率之間的差異，那么可以考慮使用直接單體型分析方法例如CLASPER SystemTM技術(shù)(美國專利號5,866,404)、SMD或等位基因特異性長范圍PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 244841-4843(1996))對個體進行單體型分析。
在用于預(yù)測單體型對的該方法的一個實施方案中，指定步驟包括開展以下分析。首先，將每個可能的單體型對與參照種群中的單體型對進行比較。通常，參照種群中僅一個單體型對和可能的單體型對匹配，并且將該單體型對指定為個體的單體型對。偶爾，參照單體型對中僅一個單體型與個體可能的單體型對相一致，并且在此種情況下將該個體指定為包含該已知單體型和新單體型的單體型對，其中所述新單體型是通過從可能單體型對中扣除已知單體型得到的。在極少數(shù)情況下，參照種群中沒有一種單體型與可能單體型對相一致，或者備選地，多重參照單體型對與可能的單體型對相一致。在此類情況下，優(yōu)選使用直接分子單體型分析方法例如CLASPER SystemTM技術(shù)(美國專利號5,866,404)、SMD或等位基因特異長范圍PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 244841-4843(1996))對個體進行單體型分析。
本發(fā)明還提供了用于確定種群中基因型或單體型頻率的方法。該方法包括確定存在于種群中每個成員的基因的基因型或單體型對，其中基因型或單體型包含在基因中一個或多個多態(tài)性位點處檢測到的核苷酸對或核苷酸，以及計算在種群中發(fā)現(xiàn)的任意特定基因型或單體型的頻率。種群可以是參照種群、家族種群、相同性別種群、種群組、性狀種群(例如，出現(xiàn)目的性狀如對治療性治療具有醫(yī)學狀態(tài)或反應(yīng)的一群個體)。
在本發(fā)明的另一方面，在參照種群中發(fā)現(xiàn)的基因型和/或單體型頻率數(shù)據(jù)可以用于鑒定性狀和基因型或單體型之間關(guān)聯(lián)的方法中。性狀可以是任何可檢測的表型，其包括但不限于疾病易感性或者對治療的反應(yīng)。方法涉及從參照種群以及表現(xiàn)出性狀的種群得到目的基因型或單體型頻率數(shù)據(jù)。使用如上所述方法之一，對種群中的每一個體進行基因分型或單體型分析可以得到參照種群和性狀種群之一或兩者的頻率數(shù)據(jù)。性狀種群的單體型可以直接確定，或者備選地通過上述的預(yù)測基因型或單體型方法確定。
在另一個實施方案中，參照和/或性狀群體的頻率數(shù)據(jù)通過使用先前所確定的書面形式或電子形式的頻率數(shù)據(jù)得到。例如，頻率數(shù)據(jù)可以存在于通過計算機可進入的數(shù)據(jù)庫中。一旦得到頻率數(shù)據(jù)，可以比較參照種群和性狀種群中目的基因型或單體型頻率。在優(yōu)選實施方案中，對在種群中所觀察到的所有基因型和/或單體型頻率進行比較。如果基因的特定基因型或單體型在性狀種群中的頻率在統(tǒng)計學上顯著高于在參照種群中的頻率，則可以預(yù)測該性狀與基因型或單體型關(guān)聯(lián)。
在優(yōu)選實施方案中，通過使用具有Bonferoni校正的標準ANOVA檢驗和/或模擬基因型表型校正許多次的bootstrapping法開展統(tǒng)計學分析并計算顯著性數(shù)值。當分析多個多態(tài)性時，要對因子進行校正以便校正偶然發(fā)現(xiàn)的顯著性關(guān)聯(lián)。對于用于該發(fā)明方法的統(tǒng)計學方法見StatisticalMethods in Biology，第3版，Bailey NTJ，(Cambridge Univ.Press，1997)；Introduction to Computational Biology，Waterman MS(CRC Press，2000)和Bioinformatics，Baxevanis AD和Ouellette BFF編(John Wiley&Sons，Inc.，2001)。
在該方法的優(yōu)選實施方案中，目的性狀是患者對一些治療性治療所表現(xiàn)出的臨床反應(yīng)，例如對藥物靶向的反應(yīng)或者對治療性治療醫(yī)學狀況的反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，與目的基因型或單體型處于連鎖不平衡的可檢測的基因型或單體型可用作替代標志物。通過確定基因的特定基因型或單體型在種群(也證明存在潛在替代標志物基因型)中的頻率是否在統(tǒng)計學上顯著高于參照群體，預(yù)測標志物基因型是否與基因型或單體型關(guān)聯(lián)以及是否能夠用作取代基因型的替代標志物，來發(fā)現(xiàn)與基因型連鎖不平衡的基因型。
定義.
如文中所使用，“醫(yī)學狀況”包括但不限于表現(xiàn)為一種或多種需要進行治療的生理和/或心理癥狀的任何狀況或疾病，并且還包括先前或最近鑒定的疾病和其它病癥。
如文中所使用，術(shù)語“臨床反應(yīng)”意思是指下列任何一種或全部反應(yīng)的定量測量、無反應(yīng)和不良反應(yīng)即副作用。
為了推導對治療的臨床反應(yīng)與基因型或單體型的相關(guān)性，獲得接受治療個體種群(以后稱作“臨床種群”)所表現(xiàn)出來的臨床反應(yīng)數(shù)據(jù)。該臨床數(shù)據(jù)可以通過分析已經(jīng)開展的臨床試驗的結(jié)果得到和/或通過設(shè)計和開展一個或多個新的臨床試驗得到。
如文中所使用，術(shù)語“臨床試驗”意思是指設(shè)計收集特定治療反應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的任何調(diào)查研究，其包括但不限于I期、II期和III期臨床試驗。使用標準方法定義患者種群和招募受試者。
優(yōu)選地將臨床種群中的個體按照目的醫(yī)學狀況的存在分級。這種潛在患者的分級采用標準身體檢查或一種或多種實驗室測試。備選地，對于在單體型對和疾病易感性或嚴重性之間具有強相關(guān)性的情況下，可以使用單體型分析對患者分級。
對試驗種群中每一個體進行目的治療性治療，并且使用一種或多種預(yù)先確定的標準測定每一個體對治療的反應(yīng)。應(yīng)到考慮到，在許多情況下試驗種群會表現(xiàn)出一系列反應(yīng)并且研究者會選擇由多種反應(yīng)構(gòu)成的反應(yīng)者組的數(shù)目(例如低、中、高)。此外，對試驗種群中的每一個體的基因進行基因分型和/或單體型分析，這可以在治療之前或之后進行。
在獲得臨床數(shù)據(jù)和多態(tài)性數(shù)據(jù)兩者之后，建立個體反應(yīng)和基因型或單體型含量(haplotype content)之間的相關(guān)性。相關(guān)性可以多種方式產(chǎn)生。在一種方法中，將個體通過其基因型或單體型(或單體型對)分組(也稱作多態(tài)性組)，然后計算每一多態(tài)性組成員所出現(xiàn)的臨床反應(yīng)的平均值和標準差。
然后分析這些結(jié)果以確定在多態(tài)性組之間所觀察到的任何臨床反應(yīng)變異是否具有統(tǒng)計學顯著性。所使用的統(tǒng)計學分析方法描述于L.D.Fisher和G.vanBelle，BiostatisticsA Methodology for the Health Sciences(Wiley-Interscience，New York，1993)。該分析還包括確定基因中哪一個多態(tài)性對表型差異的貢獻最明顯的回歸計算。
發(fā)現(xiàn)單體型含量和臨床反應(yīng)之間相關(guān)性的第二中方法使用基于錯誤最小化優(yōu)化算法的預(yù)測模型。許多可能的優(yōu)化算法之一是遺傳算法(R.Judson，“Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry”在Reviews inComputational Ch emistry，第10卷，第1-73頁，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd，編，VCH Publishers，New York，1997)。還可以使用模擬退火(Press等，“Numerical Recipes in CThe Art of Scientific Computing”，CambridgeUniversity Press(Cambridge)1992，第10章)、中性網(wǎng)絡(luò)(E.Rich和K.Knight，“Artificial Intelligence”，第2版，McGraw-Hill，New York，199l，第18章)、標準梯度下降方法(Press等，見上，第10章)或其它整體或局部優(yōu)化方法(見Judson中的討論，見上)。
也可以使用方差分析(ANOVA)技術(shù)分析相關(guān)性，以便確定臨床數(shù)據(jù)中的多少變異可以通過基因多態(tài)性位點的不同亞組進行解釋。ANOVA用于檢驗關(guān)于反應(yīng)變異是否由一種或多種所測定的性狀或變異引起或者是否與其相關(guān)的假設(shè)(Fisher和vanBelle，見上，第10章)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地從上述分析中構(gòu)建數(shù)學模型，所述模型能夠預(yù)測作為基因型或單體型含量函數(shù)的臨床反應(yīng)。
對臨床反應(yīng)與基因的基因型或單體型(或單體型對)之間關(guān)聯(lián)的鑒定是設(shè)計診斷方法的基礎(chǔ)，其中所述診斷方法用于確定這些個體中誰將會或?qū)⒉粫χ委煱l(fā)生反應(yīng)或者備選地誰將在低劑量發(fā)生反應(yīng)并且因此需要加強治療即使用更大劑量藥物治療。診斷方法可以采取幾種形式之一例如直接DNA測試(即對基因的一個或多個多態(tài)性位點進行基因分型或單體型分析)、血清學測試或者身體檢查測試。唯一需要的是，在診斷測試結(jié)果和與臨床反應(yīng)具有相關(guān)性的潛在基因型或單體型之間存在良好的相關(guān)性。在一個優(yōu)選的實施方案中，該診斷方法使用上述的預(yù)測單體型分析的方法。
計算機可以執(zhí)行本發(fā)明方法中涉及的任何或全部分析和數(shù)學操作。此外，計算機可以執(zhí)行能夠在顯示設(shè)備上顯示視圖(或屏幕)的程序，通過該程序在用戶和視圖間產(chǎn)生交互界面并分析與基因和其基因組變異相關(guān)的大量信息，包括染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、基因家族、基因表達數(shù)據(jù)、多態(tài)性數(shù)據(jù)、遺傳序列數(shù)據(jù)和臨床種群數(shù)據(jù)(例如關(guān)于一個或多個種群的人種地理學起源、臨床反應(yīng)、基因型和單體型數(shù)據(jù))。文中描述的多態(tài)性數(shù)據(jù)可以作為相關(guān)數(shù)據(jù)庫的部分儲存(例如Oracle數(shù)據(jù)庫的實例或者一組ASCII文本文件)。這些多態(tài)性數(shù)據(jù)可以儲存于計算機的硬盤驅(qū)動器上或者儲存于如CD-ROM或者計算機可取得的一種或多種其它儲存設(shè)備中。例如，數(shù)據(jù)可以儲存于借助于網(wǎng)絡(luò)可以與計算機通訊的一個或多個數(shù)據(jù)庫中。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了對個體基因型進行單體型分析和/或基因分型的方法、組合物和試劑盒。組合物包含寡核苷酸探針和引物，其中所述寡核苷酸探針和引物被設(shè)計成能夠與包含多態(tài)性位點或者與多態(tài)性位點臨近的一個和多個靶區(qū)域特異性雜交。用于確立文中所述新多態(tài)性位點在個體中的基因型和單體型的方法和組合物可以用于研究多態(tài)性對通過蛋白質(zhì)表達和功能所影響疾病的病因?qū)W的影響，研究藥物靶向的效率，預(yù)測個體對通過蛋白質(zhì)表達和功能所影響疾病的易感性以及預(yù)測個體對靶向該藥物基因產(chǎn)物的藥物的反應(yīng)。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定基因型和單體型與性狀之間關(guān)聯(lián)的方法。在優(yōu)選實施方案中，性狀是對疾病的易感性、疾病的嚴重性、疾病分期或者對藥物的反應(yīng)。此種方法可適用于研發(fā)用于所有藥物遺傳學應(yīng)用的診斷測試和治療性治療中，其中在所述藥物遺傳學應(yīng)用中潛在地存在基因型和治療結(jié)果(包括效率測定、PK測定的副作用測定)之間的關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明還提供了用于儲存和顯示所確定基因的多態(tài)性數(shù)據(jù)的計算機系統(tǒng)。計算機系統(tǒng)包括計算機處理單元、顯示器和包含多態(tài)性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。多態(tài)性數(shù)據(jù)包括在參照種群中的基因中所鑒定的多態(tài)性、基因型和單體型。在一個優(yōu)選實施方案中，計算機系統(tǒng)能夠產(chǎn)生展示單體型的顯示結(jié)果，其中單體型是根據(jù)其進化關(guān)系進行組織的。
在另一方面，本發(fā)明提供了SNP探針，該探針可以用于根據(jù)人的遺傳變異將人分類。根據(jù)本發(fā)明的SNP探針是能夠在常規(guī)等位基因區(qū)分測定法中區(qū)分SNP核酸等位基因的寡核苷酸。
如文中所使用，“SNP核酸”是包含這樣一種核苷酸的核酸序列，即核苷酸在個體或者個體組之間的同一核酸序列中是可變的，因此作為等位基因存在。此種SNP核酸長度優(yōu)選為大約15至大約500個核苷酸。SNP核酸可以是染色體的部分，或者可以是染色體部分的精確拷貝(例如通過PCR或者通過克隆將此種染色體部分擴增)。以后將SNP核酸簡單地稱作“SNP”。
根據(jù)本發(fā)明的SNP探針是與SNP核酸互補的寡核苷酸。
如文中所使用，術(shù)語“互補”意思是Watson和Crick意義上的寡核苷酸全長互補。
在某些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的寡核苷酸與SNP核酸的一個等位基因互補，而不與SNP核酸的任何其它等位基因互補。根據(jù)本發(fā)明該實施方案的寡核苷酸能夠以多種方式區(qū)分SNP核酸的等位基因。例如，在嚴格雜交條件下，適當長度的寡核苷酸會與SNP核酸的一個等位基因互補，但不與SNP核酸的任何其它等位基因互補。寡核苷酸可以是放射性標記的或者熒光標記的。備選地，適當長度的寡核苷酸可以用作PCR的引物，其中3’末端核苷酸與SNP核酸的一個等位基因互補，而不與任何其它等位基因互補。在該實施方案中，通過PCR的擴增反應(yīng)的有或無確定SNP核酸的單體型。
本發(fā)明的基因組片段和cDNA片段包含至少一種文中所鑒定的新的多態(tài)性位點，且長度至少10個核苷酸并且范圍可達基因全長。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的片段長度在100-3000個核苷酸之間、且更優(yōu)選在200-2000個核苷酸之間、并且最優(yōu)選在500-1000個核苷酸之間。
為了方便起見，在描述文中所鑒定多態(tài)性位點時提及的是基因的有意鏈。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公認的那樣，包含基因的核酸分子是互補的雙鏈分子，并且因此當提及有意鏈上的特定位點時同樣也提及了互補的反義鏈上的相應(yīng)位點。因此，提及的是任一條鏈上的同一多態(tài)性位點并且可以將寡核苷酸設(shè)計成能夠與包含多態(tài)性位點的靶區(qū)域任一條鏈特異性互補。因此，本發(fā)明還包括與文中所述基因組變體的有意鏈互補的單鏈多核苷酸。
在優(yōu)選實施方案中，此種試劑盒還包括DNA樣品收集工具。
具體而言，基因分型引物組合物包含至少兩套等位基因特異性引物對。優(yōu)選地，兩個基因分型寡核苷酸包裝在分開的容器里。
應(yīng)當理解，文中所述的本發(fā)明的方法一般還包括根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途。通常，本發(fā)明的方法可以間接體內(nèi)開展，并且此種間接體內(nèi)方法是本發(fā)明所特別期望的。同樣，在本發(fā)明的方法可能包括在人或動物身體實踐的步驟的情況下，僅包括不在人或動物身體中實踐的那些步驟的方法是本發(fā)明所特別期望的。
通過制備包含基因多態(tài)性變體的重組細胞和/或生物體(優(yōu)選重組動物)研究文中所鑒定多態(tài)性對表達的影響。如文中所使用，“表達”包括但不限于下列的一種或多種基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA；前體mRNA的剪接和其它加工以產(chǎn)生成熟mRNA；mRNA穩(wěn)定性；成熟mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯(包括密碼子選擇和tRNA可利用性)；以及翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其它修飾(如果需要產(chǎn)生正確表達和功能的話)。
為了制備本發(fā)明的重組細胞，將目的同源基因?qū)爰毎械妮d體上以致于同源基因仍然在染色體外。在此種情況下，基因可以通過細胞從染色體外位點表達。在優(yōu)選實施方案中，同源基因以這樣一種方式導入細胞，即同源基因與細胞中存在的內(nèi)源基因重組。此種重組需要發(fā)生雙重組事件，由此導致產(chǎn)生目的基因多態(tài)性。用于重組方式或者染色體外維持方式將基因?qū)氲妮d體是本領(lǐng)于公知的，并且適宜載體或載體構(gòu)建體可以用于本發(fā)明。將DNA導入細胞的方法如電穿孔、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀和病毒轉(zhuǎn)染是本領(lǐng)域公知的，因此對方法的選擇取決于技術(shù)實踐者的能力和偏好。
表達變體基因的重組生物體(即轉(zhuǎn)基因動物)可以使用本領(lǐng)域已知的標準方法制備。優(yōu)選地，將包含變體基因的構(gòu)建體導入非人動物或胚胎階段的動物祖先，其中胚胎階段即單細胞期或者一般不晚于大約8細胞期。攜帶本發(fā)明構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法產(chǎn)生。一種方法涉及將逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移入胚胎中，其中對逆轉(zhuǎn)錄病毒進行構(gòu)建以包含一種或多種絕緣子元件、目的基因或多個基因和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它成分以提供攜帶作為轉(zhuǎn)基因的所隔離基因的完整穿梭載體，見例如美國專利號5,610,053。另一種方法涉及向胚胎直接注射轉(zhuǎn)基因。第三種方法涉及胚胎干細胞的使用。
同源基因?qū)氲膭游锏膶嵗?但不限于)小鼠、大鼠、其它嚙齒類和非人靈長類(見“The Introduction of Foreign Genes into Mice”和文中所引用的文獻，在Recombinant DNA，J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski，和M.Zoller編；W.H.Freeman and Company，New York，第254-272頁)。穩(wěn)定表達人同源基因并且產(chǎn)生人蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物可以用作生物學模型用于研究與不正常表達和/或活性相關(guān)的疾病和用于篩選和測定降低這些疾病癥狀或影響的多種候選藥物、化合物或治療方案。
在實踐本發(fā)明中，使用了許多分子生物學、微生物學和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是眾所周知的并且分別解釋于例如“Current Protocolsin Molecular Biology”，第I-III卷，Ausubel編，(1997)；Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)；“DNA CloningAPractical Approach”，第I和II卷，Glover編，(1985)；“OligonucleotideSynthesis”，Gait編，(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”，Hames和Higgins編，(1985)；“Transcription and Translation”，Hames和Higgins編，(1984)；“Animal Cell Culture”，F(xiàn)reshney編，(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”，IRL Press(1986)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”；叢書，Methods in Enzymol.，Academic Press，Inc.(1984)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”，Miller和Calos編，Cold SpringHarbor Laboratory，NY(1987)；以及Methods in Enzymology，第154和155卷，Wu和Grossman和Wu編。
將在不同對照組中確定的基因表達產(chǎn)物的標準對照水平與所測量的特定患者基因表達產(chǎn)物的水平相比較。該基因表達產(chǎn)物可以是與特定基因型組相關(guān)的特征性mRNA或者該基因型組的多肽基因表達產(chǎn)物?；谒鶞y定水平與特定組對照水平的相似程度將患者分類并指定一特定基因型組。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，在得出該結(jié)論時會包括一定程度的不確定性。因此，對照組水平的標準差用于得出概率性的結(jié)論，并且本發(fā)明的方法可以適用于廣范圍的基于概率的基因分型組結(jié)論。因此，例如但非限定性地在一個實施方案中，如果所測定的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的2.5個標準差范圍內(nèi)，則該個體被指定為那個基因型組。在另一個實施方案中，如果所測定的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的2.0個標準差范圍內(nèi)，則該個體被指定為那個基因型組。仍然在另一個實施方案中，如果所測定的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的1.5個標準差范圍內(nèi)，則該個體被指定為那個基因型組。還在另一個實施方案中，如果所測定的基因表達產(chǎn)物水平落在任何對照組平均值的1.0或者更少個標準差范圍內(nèi)，則該個體被指定為那個基因型組。
因此，該方法許可得出具有多種程度可能性的結(jié)論，將特定患者放在哪一組以及對基因型組的這種指定將決定個體應(yīng)該被放入的危險性種類。
檢測和測定mRNA水平和基因表達產(chǎn)物多肽水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括核苷酸微陣列的使用和涉及質(zhì)譜和/或抗體檢測和定量技術(shù)的多肽檢測方法。還可見Human Molecular Genetics，第2版，TomStrachan和Andrew，Read John Wiley and Sons，Inc.Publication，NY，1999)。
此外，對體液或組織中基因表達產(chǎn)物多肽(蛋白質(zhì))濃度的檢測可以用于確定多態(tài)性存在與否，并且表達產(chǎn)物多肽的相對水平可以用于確定多態(tài)性是否存在于純化子狀態(tài)或者雜合子狀態(tài)并且因此是否存在于個體的危險性種類中。
如文中所使用，“醫(yī)學狀況”包括(但不限于)表現(xiàn)為一種或多種需要進行治療的生理和/或心理癥狀的任何狀況或疾病，并且還包括先前或最近鑒定的疾病和其它病癥。
如文中所使用，術(shù)語“多態(tài)性”意思是指在種群中以＞1％的頻率出現(xiàn)的任何序列變體。序列變體可以以顯著高于1％(例如5％或10％或更高)的頻率出現(xiàn)的序列變體。同樣，術(shù)語可以用于指在個體的多態(tài)性位點所觀察到的序列變體。多態(tài)性包括核苷酸替代、插入、缺失和微衛(wèi)星并且可能(但沒必要)導致產(chǎn)生基因表達或蛋白質(zhì)功能的可檢測的變化。
如文中所使用，術(shù)語“臨床反應(yīng)”意思是指下列任何一種或全部反應(yīng)的定量測量、無反應(yīng)和不良反應(yīng)即副作用。
如文中所使用，術(shù)語“等位基因”意思是指特定染色體位置(基因座)上特定形式的基因或DNA序列。
如文中所使用，術(shù)語“基因型”意思是指在個體的一對同源染色體上的基因座內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上所發(fā)現(xiàn)的核苷酸對的非定相5’-3’序列。如此處所使用，基因型包括全基因型和/或亞基因型。
如文中所使用，術(shù)語“多核苷酸”意思是指任何RNA或DNA，其可以是非修飾的或修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)域混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、單鏈和雙鏈區(qū)域混合的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，其中雜合分子為單鏈或更一般為雙鏈或者為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物。此外，多核苷酸指包含RNA或DNA或者RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語多核苷酸還包括包含一個和多個修飾堿基的DNA和RNA和為了穩(wěn)定性和其它原因?qū)χ麈溸M行修飾的DNA和RNA。
如文中所使用，術(shù)語“基因”意思是指包含用于調(diào)節(jié)RNA產(chǎn)物生物合成所有信息的DNA片段，其包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和控制表達的其它非翻譯區(qū)。
如文中所使用，術(shù)語“多肽”意思是指包含兩個或以上通過肽鍵或修飾肽鍵(肽電子等排物)彼此連接的氨基酸的多肽。多肽指短鏈的(一般稱作肽、糖肽或寡聚物)或者長鏈的(通常稱作蛋白質(zhì))。多肽可以包含編碼基因的20種氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通過天然加工如翻譯后加工修飾的氨基酸序列或者通過本領(lǐng)域眾所周知的化學修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此種修飾在基本教科書中有很好地描述，并且在專論以及在龐大的研究文獻中有更加詳細地描述。
如本文所使用，術(shù)語“多態(tài)性位點”意思是指基因座上的一個位置，其中發(fā)現(xiàn)該位置在種群具有至少兩種選擇性的序列，其中最常見序列的頻率不高于99％。
如文中所使用，術(shù)語“核苷酸對”意思是指在個體的2個拷貝染色體上的多態(tài)性位點發(fā)現(xiàn)的核苷酸。
如文中所使用，當應(yīng)用于基因座中兩個或多個多態(tài)性位點的核苷酸對序列時，術(shù)語“定相的”意思是指存在于已知基因座的單一拷貝上的這些多態(tài)性位點的核苷酸的組合。
為了推斷對治療的臨床反應(yīng)和基因型或單體型之間的相關(guān)性，有必要得到在接受治療的個體的群體(以后稱作“臨床群體”)所出現(xiàn)臨床反應(yīng)數(shù)據(jù)。該臨床數(shù)據(jù)可以通過分析已經(jīng)開展的臨床試驗的結(jié)果得到和/或通過設(shè)計和開展一個或多個新的臨床試驗得到。
如文中所使用，術(shù)語“臨床試驗”意思是指設(shè)計收集特定治療反應(yīng)臨床數(shù)據(jù)的任何調(diào)查研究，其包括但不限于I期、II期和III期臨床試驗。使用標準方法定義患者種群和招募受試者。
如文中所使用，術(shù)語“基因座”意思是指染色體或者DNA分子上對應(yīng)于基因或者物理或表型性狀的位置。
對試驗群體中的每一個體進行目的治療性治療，并且使用一種或多種預(yù)先確定的標準測定每一個體對治療的反應(yīng)。預(yù)期在許多情況下試驗種群會出現(xiàn)一系列反應(yīng)，并且研究者會選擇由多種反應(yīng)構(gòu)成的反應(yīng)者組的數(shù)目(例如低、中、高)。此外，對試驗種群中的每一個體的基因進行基因分型和/或單體型分析，這可以在治療之前或之后進行。
作為標志物的核酸和蛋白質(zhì)的檢測.
在特定實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法通過原位形式和通過體外形式在生物樣品中測定了相當于標志物的mRNA的水平。術(shù)語“生物學樣品”旨在包括從受試者分離的組織、細胞、生物流體和其分離物以及受試者中的組織、細胞和流體。許多表達檢測方法使用分離的RNA。對于體外方法，不能對mRNA進行選擇分離的任何RNA分離技術(shù)可以用于從細胞中純化RNA。見例如Ausubel等編，Curr.Prot.Mol.Biol.，John Wiley &Sons，NY(1987-1999)。此外，大量的組織樣品可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)容易地處理，例如美國專利號4,843,155的一步RNA分離方法。
所分離的mRNA可以用于雜交或者擴增分析中，其中所述的雜交或者擴增分析包括(但不限于)Southern或Northern分析、PCR分析和探針陣列。檢測mRNA水平的一個優(yōu)選診斷方法包括將分離的mRNA與能夠同被檢測基因編碼的mRNA雜交的核酸分子(探針)接觸。核酸探針可以是全長cDNA或其部分，例如長度至少為7、15、30、50、100、250或500個核苷酸并且在嚴格條件下足以與編碼本發(fā)明標志物的mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸?？梢杂糜诒景l(fā)明診斷法中的其它適宜探針在文中進行了描述。mRNA與探針的雜交表示所述標志物被表達。
在一種形式中，mRNA被固定在固體表面并且與探針接觸，例如通過將mRNA在瓊脂糖凝膠上電泳并將mRNA從凝膠轉(zhuǎn)移至膜如硝酸纖維素膜上。在另一備選的形式中，mRNA被固定在固體表面并且與探針接觸，例如在Affymetrix基因芯片陣列上。技術(shù)人員可以容易地使已知mRNA檢測方法適用于檢測本發(fā)明標志物所編碼的mRNA水平。
用于確定樣品中本發(fā)明標志物的mRNA水平的備選方法包括核酸擴增方法，例如通過RT-PCR(Mullis，美國專利號No.4,683,202(1987)所述的實驗性實施方案；連接酶鏈反應(yīng)，Barany(1991)，見上；自動維持序列擴增，Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第1874-1878頁(1990)；轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第1173-1177頁(1989)；Q-β復(fù)制酶，Lizardi等，Biol.Technology，第6卷，第1197頁(1988)；滾環(huán)復(fù)制，美國專利號5,854,033(1988)；或者任何其它核酸擴增方法。接著使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測所擴增的分子。如果此種分子存在非常低的數(shù)量，則這些檢測方案對于核酸分子的檢測特別有用。如文中所使用，擴增引物定義為能夠與基因(分別為正鏈和負鏈，反之亦然)5’或3’區(qū)域退火并且在它們中間包含短區(qū)域的一對核酸分子。通常，擴增引物長度為大約10-30個核苷酸并且中間為長度大約50-200個核苷酸。在適當條件下和適當試劑中，此種引物允許包含以引物作為兩側(cè)的核苷酸序列的核酸分子擴增。
對于原位方法，mRNA沒有必要在檢測之前從細胞中分離。在此種方法中，使用已知的組織學方法制備/處理細胞或組織樣品。然后將樣品固定在支持物上(一般為載玻片)然后將其與能夠同編碼標志物的mRNA雜交的探針接觸。
作為對基于標志物的絕對表達水平得出結(jié)論的一種備選方法，結(jié)論是基于標志物的歸一化表達水平作出的。通過將其表達與不是標志物的基因(例如組成型表達的管家基因)的表達相比較對標志物的絕對表達水平進行校正，通過這種校正使表達水平歸一化。用于歸一化的適宜基因包括管家基因例如肌動蛋白基因或者上皮細胞特異基因。這種歸一化可以將一種樣品(例如患者樣品)的表達水平與另一種樣品相比較或者在來自不同來源的樣品之間進行比較。
備選地，表達水平也可以以相對表達水平提供。為了確定標志物的相對表達水平，在確定標志物在所述樣品中的表達水平之前，在10或更多、優(yōu)選50或更多個正常對疾病生物學樣品中確定標志物的表達水平。確定了在更大數(shù)量樣品中所測定的每一基因的平均表達水平，并且該水平用作標志物的基線表達水平。將在測試樣品中確定的標志物的表達水平(表達的絕對水平)除以所得到的該標志物的平均表達值。從而給出了相對表達水平。
優(yōu)選地，在基線值確定中使用的樣品可以來自沒有多態(tài)性的患者。對細胞來源的選擇取決于相對表達值的使用。使用正常組織中的表達值作為平均表達值則可以幫助確定所測定的標志物是否是特異的(對正常細胞)。此外，隨著更多數(shù)據(jù)的積累，平均表達值可以被修訂，只要改進的相對表達值是以所積累數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)即可。
多肽的檢測.
在本發(fā)明的另一個實施方案中，檢測了對應(yīng)于標志物的多肽。檢測本發(fā)明多肽的優(yōu)選試劑是能夠與對應(yīng)于本發(fā)明標志物的多肽結(jié)合的抗體，優(yōu)選具有可檢測標記的抗體。抗體可以是多克隆的，或者更加優(yōu)選地為單克隆的?？梢允褂猛暾目贵w或其片段，例如Fab或F(ab’)2。對于探針或抗體，術(shù)語“標記的”旨在包括通過向探針或抗體偶聯(lián)(例如物理交聯(lián))可檢測物質(zhì)而直接標記的探針或抗體以及通過與直接標記的另一試劑的反應(yīng)性而間接標記的探針或抗體。間接標記實例包括使用熒光標記的次級抗體對初級抗體的檢測和對用生物素進行末端標記的DNA探針的檢測，其中生物素進行標記使得可以用熒光標記鏈霉親和素檢測。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)可以個體中分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分離方法可以采用例如Harlow和Lane(1988)(見上)所描述的那些方法。
可以采用多種方式確定樣品是否包含與特定抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。此種方式的實例包括(但不限于)EIA、放射免疫測定(RIA)、Western印跡分析和ELISA。技術(shù)人員可以容易地將已知蛋白質(zhì)/抗體檢測方法用于確定細胞是否表達本發(fā)明的標志物以及在血液或其它身體組織中該特異多肽表達的相對濃度。
在一種方式中，抗體或抗體片段可以用于例如Western印跡或免疫熒光技術(shù)的方法中以便檢測所表達的蛋白質(zhì)。在此種用途中，一般優(yōu)選將抗體或蛋白質(zhì)固定在固體支持物上。適宜的固相支持物或載體包括能夠結(jié)合抗原或抗體的任何支持物。眾所周知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道結(jié)合抗體或抗原的許多其它適宜載體，并且能夠?qū)⒋祟愔С治镉糜诒景l(fā)明。例如，從患者細胞分離的蛋白質(zhì)可以進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并且固定在固相支持物如硝酸纖維素上。然后用適宜緩沖液洗滌支持物，接著用可檢測性標記的抗體處理。然后，用緩沖液第二次洗滌固相支持物以去除未結(jié)合的抗體。使用常規(guī)方法檢測固相支持物上結(jié)合標志物的數(shù)量并且將該測量轉(zhuǎn)換成血液或其它身體組織中的蛋白質(zhì)的水平或濃度。
本發(fā)明還包括檢測生物樣品中對應(yīng)于本發(fā)明標志物的多肽或核酸存在的試劑盒，其中所述的生物樣品例如包括(但不限于)血清、血漿、淋巴、囊內(nèi)液、尿、糞便、腦脊液、腹水或血液的任何體液以及身體組織活檢樣品。例如，試劑盒可以包含能夠檢測生物樣品中多肽或mRNA(編碼對應(yīng)于本發(fā)明標志物的多肽)的標記化合物或試劑以及測定樣品中多肽或mRNA數(shù)量的工具，例如結(jié)合多肽的抗體或者結(jié)合編碼多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探針。試劑盒還包括解釋使用試劑盒所獲得結(jié)果的說明書。
對于基于抗體的試劑盒，試劑盒可以包含例如1)結(jié)合對應(yīng)于本發(fā)明標志物的多肽的第一種抗體，例如附著于固體支持物上的抗體；和任選地2)結(jié)合多肽或者第一種抗體的并且綴合有可檢測標記的第二種不同抗體。
對于基于寡核苷酸的試劑盒，試劑盒可以包含例如1)與編碼對應(yīng)于本發(fā)明標志物的多肽的核酸序列雜交的寡核苷酸，例如可檢測性標記的寡核苷酸；或2)用于擴增對應(yīng)于本發(fā)明標志物的核酸分子的一對引物。
試劑盒還包含例如緩沖試劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還包含檢測可檢測標記所必需的組分，例如酶或底物。試劑盒還包含可以進行分析并與測試樣品相比較的對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒中的每一組分可以裝入單獨的容器中并且可以將所有多個容器以及用于解釋使用試劑盒開展分析所獲得結(jié)果的說明書放在一個包裝盒內(nèi)。
試劑盒.
本發(fā)明的試劑盒可以包含在試劑盒容器上或試劑盒容器內(nèi)的書面產(chǎn)品。書面產(chǎn)品描述了如何使用試劑盒所包含的試劑來確定患者在藥物治療過程中是否將經(jīng)歷肝臟毒性。在幾個實施方案中，可以根據(jù)本發(fā)明的方法使用試劑。在一個實施方案中，試劑是開展ILlA遺傳多態(tài)性的PCR分析的引物對。
實施例在臨床試驗中對肝臟毒性的臨床藥物遺傳學分析臨床藥物遺傳學分析參加者的人口統(tǒng)計學.
在臨床試驗中所登記的139名受試者中，83名受試者同意參加臨床試驗的臨床藥物遺傳學部分。這代表了參加臨床試驗的總?cè)藬?shù)的大約60％。從年齡、種族和性別觀點來看，臨床藥物遺傳學分析人群代表了臨床試驗組。而且，同意率對于試驗的每一組(安慰劑、50、100和150mg/天)是可比的，從而使臨床藥物遺傳學分析對于每一劑量組沒有偏差。與全部試驗人群相比臨床藥物遺傳學人群的人口統(tǒng)計學之間未觀察到統(tǒng)計學顯著差異。
表1 與全部臨床試驗樣品相比臨床藥物遺傳學樣品的分布
在獨立的試驗點收集來自每個患者的血液樣品并運送至Covance(Geneva，瑞士)，在那里使用PUREGENETM DNA分離試劑盒(D-50K)(Gentra，Minneapolis，MN)提取基因組DNA。
基因分型.
對位于7個基因中的總共18個基因座進行了基因分型。利用來自公共數(shù)據(jù)庫例如OMIM、SNP Consortium、Locus Link和dbSNP的信息以及來自Third Wave Technologies公司(TWT，Madison，WI)的信息設(shè)計了SNP測定法。對于在本試驗群體中不具有多態(tài)性的任何基因座不再進一步分析。使用Third Wave Technologies研發(fā)的Invader測定法按照制造商的說明對40-60ng基因組DNA進行基因分型。Lyamichev V等，NatBiotechnol 17292-6(1999)；Ryan D等，Mol Diagn 4135-449(1999)。
將本試驗中所研究的每個SNP指定為臨床藥物遺傳學(CPG)標識，稱為PG基因座ID。本試驗中所測定的全部SNP的列表以及其PG基因座ID和關(guān)于目的基因內(nèi)多態(tài)性位置的詳細內(nèi)容見表2。
表2 臨床藥物遺傳學分析中所檢查的基因列表
使用Third Wave Technologies的技術(shù)通過直接測定基因組DNA研究了ABCB1、CD14、IL1A和ORM1中的基因座。由于CYP2D6與CYP450家族基因具有高度序列同源性，所以在Invader測定法進行基因分型之前在三個部分對CYP2D6進行了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增以保證特異性。每個片段的引物序列和每一引物組所跨越的基因區(qū)域列于表3。包含20-60ng基因組DNA、0.5μl 10mM dNTP、2.5μl的帶有15mM MgCl2的10×PCR緩沖液I(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、2.5μl DMSO、0.5μl20μM CYP2D6-正向引物、0.5μl 20μM CYP2D6-反向引物和1.25U TaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)的25μl反應(yīng)液中產(chǎn)生每一擴增子。使用以下條件進行35輪擴增94℃，30秒；65℃，1分鐘；72℃，2分鐘。通過在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上分離5個隨機樣品以證實適當產(chǎn)物的擴增。在基因分型之前將擴增子以1∶10稀釋于TE(pH 8.0)中。
表3 用于擴增CYP2D6的引物
用于擴增CYP3A4基因的PCR在25μl反應(yīng)液中進行，反應(yīng)液包含15-30ng基因組DNA、0.4μl 10mM dNTP、2.5μl含15mM MgCl2的10×PCR緩沖液I(Applied Biosystems)、0.75μl 20μM CYP3A4-正向引物、0.75μl 20μM CYP3A4-反向引物和0.75U Taq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。使用以下條件進行30輪擴增94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，30秒。為了證實產(chǎn)生了適當產(chǎn)物，將5個樣品在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上進行分離并觀察片段大小。引物序列如下CYP3A4外顯子10F-(5’-TGGATGGCCCACATTCTCG-3’；SEQ IDNO11)，和CYP3A4外顯子10R-(5’-CTTCCTACATAGAGTCAGTG-3’；SEQ IDNO12)。將PCR產(chǎn)物用TE(pH 8.0)以1∶20稀釋，在384孔biplex板中使用稀釋液擴增PG基因座ID 2325的DNA。
限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析用于對NR1I2中的3個多態(tài)性基因座進行基因分型。首先在25μl反應(yīng)液中擴增NR1I2序列，反應(yīng)液包含15-30ng基因組DNA、0.4μl 10mM dNTP、2.5μl含15mM MgCl2的10×PCR緩沖液I(Applied Biosystems)、0.50μl 20μM NR1I2-正向引物、0.50μl 20μM NR1I2-反向引物和0.75U Taq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。用于每一測定的引物組的序列列于表4。使用以下條件進行35輪擴增94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒。將擴增子在含溴化乙錠的3％瓊脂糖凝膠上進行分離。
表4 NR1I2多態(tài)性的RFLP分析
用于對PCR產(chǎn)物進行RFLP分析的限制性內(nèi)切酶以及它們所產(chǎn)生的片段大小和所得到的等位基因判定列于表4。全部限制性內(nèi)切酶購自NewEngland Biolabs，Beverly，MA。反應(yīng)條件如下(1)使用2μl 10×緩沖液3(New England Biolabs)、8μl擴增DNA和2U BSMB1酶在20μl反應(yīng)液中進行BMSB1消化。將反應(yīng)混合物在55℃孵育4.5小時；(2)使用2μl 10×緩沖液3(New England Biolabs)、8μl擴增DNA和4U DdeI酶在20μl反應(yīng)液中進行DdeI消化。將反應(yīng)液在37℃孵育17小時；(3)除了使用10×緩沖液4(New England Biolabs)代替10×緩沖液3以外，如進行DdeI消化一樣進行HphI消化。將消化的DNA在含溴化乙錠的3％瓊脂糖凝膠上進行分離(10μl)并觀察條帶大小。
統(tǒng)計學分析.
方差分析(ANOVA)和Fisher精確檢驗用于基因型影響和肝臟毒性的分析。使用SAS 8.02軟件進行全部統(tǒng)計學分析。為了校正多重測試，使用了Bonferroni校正方法(見下)。
肝臟毒性和N-苯甲酰-星形孢菌素代謝.
檢測了在臨床試驗中肝臟毒性發(fā)生和所施用的N-苯甲酰-星形孢菌素劑量之間的關(guān)系。每個劑量組經(jīng)歷肝臟毒性的受試者百分比如下對于50mg/天的組為3％、對于100mg/天的組為8％并且施用150mg/天的那些受試者為14％。盡管大多數(shù)經(jīng)歷肝臟毒性的受試者施用了最高劑量的N-苯甲酰-星形孢菌素，但N-苯甲酰-星形孢菌素劑量和肝臟毒性之間的關(guān)聯(lián)不顯著(p＝0.09；Fisher精確檢驗)。
在臨床試驗中進行了藥物代謝動力學評價，但是由于N-苯甲酰-星形孢菌素的兩種主要代謝產(chǎn)物牢固地結(jié)合至血清蛋白質(zhì)α1-酸性糖蛋白(AGP)，所以在大多數(shù)受試者的血液中未檢測到這兩種主要代謝產(chǎn)物。AGP是主要在肝臟中合成的高度糖基化的蛋白質(zhì)并且具有急性期反應(yīng)蛋白質(zhì)的功能。Hochepied T等，Cytokine Growth Factor Rev 1425-34(2003)；IsrailiZH和Dayton PG，DrugMetRev 33161-235(2001)。進行了一項分析以判斷AGP水平與肝臟毒性發(fā)生是否相關(guān)。在第3-5次隨訪時的最高AGP水平用于本分析，并且包括了本臨床試驗中的全部參加者，而不僅僅是那些同意進行藥物遺傳學分析的參加者。在經(jīng)歷肝臟毒性的受試者中，AGP的平均最高濃度為109.7mg/dl，該值顯著高于不經(jīng)歷肝臟毒性的受試者的平均最高濃度87.8mg/dl(p＝0.046，ANOVA)。
AGP由在染色體9q31-34.1上緊密連鎖的ORM1和ORM2兩個基因編碼(Webb GC等，Cytogenet Cell Genet 4718-21(1998))。ORM1具有高度多肽性(Yuasa I等，Hum Genet 99393-8(1997))，并且在該試驗中檢查了ORM1中的三個SNP(PG基因座ID 1831，1832和1833)。在所檢查的三個ORM1基因座上的基因型與所檢測的血清AGP水平之間沒有關(guān)聯(lián)。見表5。
表5 ORM1 SNP與最大AGP水平?jīng)]有關(guān)聯(lián)
此外，在該分析中檢查的ORM1 SNP與肝臟毒性沒有關(guān)聯(lián)。見下表6。為了更全面地檢查肝臟毒性發(fā)生與CYP2D6、CYP3A4、ABCB1和NR1I2中的SNP之間可能的關(guān)聯(lián)，獨立檢查了每一個肝臟酶。在第3-5次隨訪時記錄最大血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶數(shù)值，并使用ANOVA進行分析。在助于N-苯甲酰-星形孢菌素代謝和分布的基因內(nèi)的SNP與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶最大升高之間沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。在最大丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平和ORM1多態(tài)性之間沒有顯著性關(guān)聯(lián)。
表6 肝臟毒性、ALT Max以及AST Max與位于6個不同基因中的17個SNP之間的關(guān)聯(lián)
總而言之，表5和表6中的數(shù)據(jù)未提供臨床試驗中所觀察到的肝臟毒性是不同方式暴露于N-苯甲酰-星形孢菌素的結(jié)果的證據(jù)。
然而，N-苯甲酰-星形孢菌素是由CYP3A4和CYP2D6代謝的，并且是ABCB1所編碼的p-糖蛋白泵的底物。CYP3A4的多態(tài)性不是很高，并且遺傳變體很難解釋蛋白質(zhì)功能的差異。Spurdle AB等，pharmacogenetics 12355-66(2002年7月)和內(nèi)部分析。而且，CYP3A4的轉(zhuǎn)錄是由孕甾烷X受體PXR調(diào)控的(Goodwin B等，Annu Rev Pharmacol Toxicol 421-23(2002))，孕甾烷X受體由稱為NR1I2的多態(tài)性基因編碼。因此，檢測了有助于N-苯甲酰-星形孢菌素代謝的以下基因中的多態(tài)性CYP2D6(PG基因座ID 31、211、212、213)；CYP3A4(PG基因座ID 2325)；NR1I2(PG基因座ID 2641、2642、2643)和ABCB1(PG基因座ID 181、1006、1045)。未發(fā)現(xiàn)臨床試驗中肝臟毒性的發(fā)生與在這四個基因中所研究的任意多態(tài)性相關(guān)聯(lián)。
與肝損傷的特異反應(yīng)性機制相關(guān)的肝臟毒性和基因.
在藥物研發(fā)的臨床階段期間所觀察到的肝臟毒性通常與暴露于藥物的水平關(guān)聯(lián)。然而，由于其肝內(nèi)環(huán)境中的某些物質(zhì)(例如中和自由基的細胞因子或酶水平)促進了化合物的毒性，一些受試者可能經(jīng)歷肝臟酶升高。肝臟毒性的這些機制稱為“特異反應(yīng)性”。由于肝臟毒性是相對極少的能夠受到多重信號途徑影響的事件，所以發(fā)現(xiàn)遺傳多態(tài)性和由特異反應(yīng)性機制所引起的肝臟毒性之間的關(guān)聯(lián)是極不可能的。
與炎癥反應(yīng)相關(guān)的肝臟毒性和基因.
在該試驗中檢測了在肝臟中能夠有助于急性期反應(yīng)的2個基因(CD14和IL1A)中的多態(tài)性。CD14調(diào)節(jié)炎性細胞因子從Kuppfer細胞的釋放(Jarvelainen HA等，Hepatology 331148-53(2001))而IL1A是對組織損傷試劑反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)物。Ramadori G和Christ B，Semin Liver Dis 19141-55(1999)。在該試驗中研究了IL1A中的2個多態(tài)性基因座(PG基因座ID 279和302)并且研究了CD14中的3個基因座(PG基因座ID 2641、2642和2643)。未發(fā)現(xiàn)在我們所研究的基因座和臨床試驗中總體肝臟毒性判別之間存在關(guān)聯(lián)。見表5。
其次，獨立地分析了IL1A和CD14中的SNP與每種肝臟酶升高的可能關(guān)聯(lián)。利用ANOVA發(fā)現(xiàn)，在第3次和第5次隨訪之間所記錄的最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶值與IL1A和CD14中目的基因座的基因型相關(guān)聯(lián)。未發(fā)現(xiàn)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和IL1A或CD14中的SNP之間的關(guān)聯(lián)。
然而，IL1A的2個SNP，即PG基因座ID 279和302都與第3、4或5次隨訪時所記錄的最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值關(guān)聯(lián)(p值分別為0.031和0.029)。已經(jīng)報道PG基因座ID 279與PG基因座ID 302處于連鎖不平衡，其中PG基因座ID 279為在IL1A啟動子中具有C→T轉(zhuǎn)換(GenBank登錄號X03833中的位置549)的基因座。Jouvenne P等，EurCytokine Netw1033-6(1999)。我們的發(fā)現(xiàn)強有力地支持這2個基因座之間的連鎖(99.99％)。PG基因座ID 302是外顯子5中的G→T堿基變化(GenBank登錄號X03833中的位置6282)，這導致由丙氨酸至絲氨酸的氨基酸替換。對于這些SNP的每一個，TT基因型是罕見的；僅2個個體的PG基因座ID 279和302為TT。為此，我們分析了TT純合子個體和GT(PG基因座ID 302)或CT(PG基因座ID 279)雜合子個體。因此，對于PG基因座ID 279，比較了具有CC基因型的受試者和在該基因座具有T(CT或TT)的受試者。對于PG基因座ID 279，CC個體的平均最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值為37.1U/L，而T(CT和TT)個體具有顯著較低的平均最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值23.1U/L(p＝0.0089，ANOVA)。同樣，對于PG基因座ID 302，比較了GG受試者和T(GT或TT)受試者。當使用該方法對數(shù)據(jù)進行分組時，發(fā)現(xiàn)每個基因座的基因型和肝臟毒性發(fā)生之間存在更強的關(guān)聯(lián)。對于PG基因座ID 302，GG個體具有平均最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平36.6U/L，該值顯著高于T(CT和TT)個體的平均最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平22.9U/L(p＝0.0097，ANOVA)。圖1和圖2中的散點圖顯示，當施用N-苯甲酰-星形孢菌素時，具有最高血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶值的受試者為在PG基因座ID 279上為CC的受試者和在PG基因座ID 302上為GG的受試者。
因為測試了多重SNP與在臨床試驗中肝臟毒性的相關(guān)性，因此用校正系數(shù)對這些結(jié)果進行校正。Bonferroni校正方法要求將p值用系數(shù)17(該試驗中所研究的多態(tài)性SNP的數(shù)目)進行校正。Bonferroni＝0.05/η＝0.05/17＝0.0029，這里η＝PCK412測試的數(shù)目(PCK412_number_of_tests)。使用該校正因子，具有p≥0.0029相關(guān)性的SNP是不顯著的。IL1A多態(tài)性和血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平之間的相關(guān)性p值為0.0089和0.0097。
總之，IL1A基因內(nèi)PG基因座279為CC和PG基因座302為GG的受試者在施用N-苯甲酰-星形孢菌素后更有可能經(jīng)歷血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高。雖然CC受試者的平均天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶最高值不超過正常值上限，數(shù)據(jù)的散點圖仍證明血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平超過正常值上限的幾乎全部受試者為在PG基因座ID 279上為CC(圖1)和在PG基因座ID 302上為GG(圖2)。
藥物誘導肝臟毒性通常以炎癥反應(yīng)為特征。Jaeschke H等，Toxicol Sci65166-76(2002)。已知白介素1蛋白質(zhì)家族具有多種生物學活性并且是感染和損傷反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。象其它促炎細胞因子一樣，IL1A誘導NF-κB活性，由此增加細胞因子誘導基因的轉(zhuǎn)錄。IL1A的效應(yīng)是通過誘導其它細胞因子介導的，所述細胞因子包括粒細胞集落形成刺激因子、腫瘤壞死因子α(TNF)、白介素6、白介素8和血小板衍生生長因子。Paul WE，F(xiàn)undamental Immunology，第4版(Lippingcott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1999)。值得注意的是，在小鼠模型中IL1A與TNF協(xié)同作用以誘導肝臟損傷。Nagakawa J等，Immunopharmacol Immunotoxicol13485-98(1991)。
除了與肝臟毒性相關(guān)以外，白介素1蛋白質(zhì)家族參與胰腺β細胞中胰島素分泌的誘導和細胞凋亡的刺激。Paul WE，F(xiàn)undamental Immunology，第4版(Lippingcott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1999)。由于臨床試驗參與者患有I型或II型糖尿病，因此這對于本試驗是恰當?shù)摹Ｔ谝葝u素依賴糖尿病(I型糖尿病)中自身免疫過程中，局部炎癥細胞產(chǎn)生的IL1可能有助于胰腺β細胞的破壞。Mandrup-Poulsen T等，Cytokine 5185-81(1993)。已經(jīng)顯示白介素1家族成員通過胰島誘導一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，并且文獻報告支持NO在糖尿病發(fā)展中的作用。而且，用IL1A處理胰腺β細胞樣細胞系RIN-5AH后4小時內(nèi)導致細胞凋亡和壞死。Vassiliadis S等，Mediators Inflamm 885-91(1999)。有趣的是，IL1A在RIN-5AH細胞中誘導PKC表達增加30％。因此，IL1A除了影響肝臟毒性外，它還影響N-苯甲酰-星形孢菌素在糖尿病患者中的有效性。
文中引用的全部文獻在此整體引用并為了所有目的以這樣一種程度作為參考，所述程度即好像每一單獨公開或?qū)＠驅(qū)＠暾埍惶禺惖睾蛦为毜刂付闉榱怂心康恼w引用作為參考。此外，文中引用的所有GenBank登錄號、Unigene Cluster號和蛋白質(zhì)登錄號在此整體引用并為了所有目的以這樣一種程度作為參考，所述程度即好像每一編號被特異地和單獨地指定為為了所有目的整體引用作為參考。
本發(fā)明不受該申請中所述的特定實施方案的限制，所述的實施方案旨在作為本發(fā)明各個方面的一個例子。在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下可以對該發(fā)明進行許多修改和改變，并且這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。根據(jù)前述描述和附圖，除了本文所列舉以外的本發(fā)明范圍內(nèi)的功能等效方法和設(shè)備對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此種修改和改變旨在處于后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅僅受后附權(quán)利要求以及與所授權(quán)的此種權(quán)利要求等效的全部范圍的限制。
序列表<110>諾瓦提斯公司(NOVARTIS AG)<120>遺傳多態(tài)性用于預(yù)測藥物誘導肝臟毒性的用途<130>DV/4-33390A<150>60/508,972<151>2003-10-06<160>18<170>用于Windows版本4.0的FastSEQ<210>1<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>變異<222>(1)...(20)<223>PG基因座ID 279；白介素1，α基因(X03833)位置541-560；位置549為″C″變體<221>變異<222>(9)...(0)<223>C<400>1aggcaacacc attgaaggct 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人<220>
<221>變異<222>(1)...(20)<223>PG基因座ID 279；白介素1，α基因(X03833)位置541-560；在位置549為″T″的變體<221>變異<222>(9)...(0)<223>T<400>2aggcaacatc attgaaggct 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人
<220>
<221>變異<222>(1)...(20)<223>PG基因座ID 302；白介素1，α基因(X03833)位置6270-6290；在位置6282為″G″的變體<221>變異<222>(12)...(0)<223>G<400>3agcctaggtc agcacctttt 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人<220>
<221>變異<222>(1)...(20)<223>PG基因座ID 302；白介素1，α基因(X03833)位置6270-6290；在位置6282為″T″的變體<221>變異<222>(12)...(0)<223>T<400>4agcctaggtc atcacctttt20<210>5<211>19<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(19)<223>PCR引物2D6L1F1<400>5ctgggctggg agcagcctc 19<210>6<211>23<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(23)<223>PCR引物2D6L1R1<400>6cactcgctgg cctgtttcat gtc23<210>7
<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(22)<223>PCR引物2D6L2F<400>7ctggaatccg gtgtcgaagt gg 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(20)<223>PCR引物2D6L2R2<400>8ctcggcccct gcactgtttc 20<210>9<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(22)<223>PCR引物2D6L3F<400>9gaggcaagaa ggagtgtcag gg 22<210>10<211>23<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(23)<223>PCR引物2D6L3R5B<400>10agtcctgtgg tgaggtgacg agg 23<210>11<211>19<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物
<222>(1)...(19)<223>PCR引物CYP3A4外顯子10F<400>11tggatggccc acattctcg 19<210>12<211>20<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(20)<223>PCR引物CYP3A4外顯子10R<400>12cttcctacat agagtcagtg 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(21)<223>PCR引物PXR 252 F<400>13ggacacagag tctgttcctg g 21<210>14<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(22)<223>PCR引物PXR 252 R<400>14gaagatgaag gattcctctg gg22<210>15<211>23<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(23)<223>PXR 11156 F<400>15gacaaggcta cgctgacaat cag 23
<210>16<211>24<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(24)<223>PXR 11156 R<400>16gcttgcgtat gtttctattt ccac 24<210>17<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(21)<223>PXR 24113 F<400>17cggagcaaag aacttaccac c 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人<220>
<221>結(jié)合引物<222>(1)...(21)<223>PXR 24113 R<400>18tgcaggacca gagagcatca g 2權(quán)利要求
1.N-苯甲酰-星形孢菌素在制造用于治療具有降低肝臟毒性的所選擇患者群體中糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物中的用途，其中患者群體是基于患者在預(yù)測肝臟毒性的IL1A遺傳基因座上的基因型選擇的。
2.預(yù)測受試者中肝臟毒性的方法，其包括步驟(a)獲得受試者在預(yù)測星形孢菌素衍生物施用后肝臟毒性的IL1A遺傳基因座上的基因型；和(b)確定在施用星形孢菌素衍生物之后受試者是否有肝臟毒性的危險。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中IL1A遺傳基因座是PG基因座ID 279。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中PG基因座ID 279上的CC基因型預(yù)測有肝臟毒性的高危險。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中PG基因座ID 279上的CT或TT基因型預(yù)測有肝臟毒性的低危險或平均水平危險。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中IL1A遺傳基因座是PG基因座ID 302。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中PG基因座ID 302上的GG基因型預(yù)測有肝臟毒性的高危險。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中PG基因座ID 302上的GT或TT基因型預(yù)測有肝臟毒性的低危險或平均水平危險。
9.使用星形孢菌素衍生物治療糖尿病狀況的改良方法，其包括步驟(a)獲得待治療受試者在預(yù)測星形孢菌素衍生物施用后肝臟毒性的IL1A遺傳基因座上的基因型；和(b)向受試者施用星形孢菌素衍生物。
10.選擇能夠入選確定星形孢菌素衍生物治療功效臨床試驗的受試者的方法，其包括步驟(a)獲得受試者在預(yù)測星形孢菌素衍生物施用后肝臟毒性的IL1A遺傳基因座上的基因型；和(b)然后(i)如果基因型預(yù)示具有肝臟毒性的低危險或平均水平危險，則在試驗中包括受試者；或者(ii)如果基因型預(yù)示具有肝臟毒性的高危險，則在試驗中不包括受試者。
11.用于預(yù)測肝臟毒性的試劑盒，其包括(a)檢測IL1A基因遺傳多肽性的試劑，其中所述的IL1A基因遺傳多肽性是星形孢菌素衍生物介導的肝臟毒性的標志物；(b)裝試劑的容器；和(c)在容器上和容器內(nèi)的書面產(chǎn)品，其用于描述生物標志物在預(yù)測星形孢菌素衍生物介導受試者肝臟毒性中的用途。
12.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中IL1A遺傳基因座是PG基因座ID 279。
13.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中IL1A遺傳基因座是PG基因座ID 302。
14.權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中試劑是一組引物對，其中所述的引物對與遺傳多態(tài)性任一側(cè)的多核苷酸雜交并且限定了跨越遺傳多態(tài)性的核苷酸區(qū)域。
全文摘要
IL1A或染色體2q14上位于IL1A附近的基因促進了肝臟毒性，如通過在N－苯甲酰－星形孢菌素治療黃斑水腫的過程中血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高所測定。因此，IL1A基因的遺傳多態(tài)性是預(yù)測星形孢菌素衍生物介導肝臟毒性的有用的生物標志物。
文檔編號C12Q1/68GK1882705SQ200480034418
公開日2006年12月20日 申請日期2004年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月6日
發(fā)明者K·麥卡洛, C·D·沃爾夫?qū)?申請人:諾瓦提斯公司