專利名稱：通過(guò)斷裂雙鏈脫氧核糖核酸進(jìn)行多元核酸分析的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求依據(jù)申請(qǐng)于2003年10月29日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/515,413而享有優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
常規(guī)的多元反向斑點(diǎn)雜交測(cè)定方案，用于檢測(cè)樣品中是否存在特定的等位基因，選擇雙鏈基因組DNA的位點(diǎn)時(shí)是首先使用多對(duì)正向引物和反向引物擴(kuò)增，通過(guò)酶切或磁分離等技術(shù)分出每個(gè)雙鏈擴(kuò)增子的指定鏈。只有余下的鏈，最好是標(biāo)記的，被與一組同源探針相接觸，斑點(diǎn)雜交或放置在具有底物的硝酸纖維膜上，或者被置于在為雜交分析準(zhǔn)備的編碼微粒上。雜交是典型的基于與俘獲靶或相應(yīng)探針相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物的存在的檢測(cè)。核酸測(cè)序允許通過(guò)被特定探針?lè)@的鏈的部分序列進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)檫@些俘獲探針和這些部分序列是互補(bǔ)的。
除去指定鏈?zhǔn)菫榱送ㄟ^(guò)消除鏈-鏈重退火過(guò)程以提高探針對(duì)于剩余鏈的俘獲效率，該過(guò)程與同源俘獲探針的退火相競(jìng)爭(zhēng)，否則在反應(yīng)過(guò)程中將不發(fā)生鏈選擇和消除。
鏈能通過(guò)消化而除去，其中被選中的要除去的鏈先使其磷酸化，再用消化酶如λ-endouclease酶，進(jìn)行酶消化被磷酸化的鏈。鏈還可以通過(guò)磁分離被除去。不論消化還是磁分離都會(huì)增加測(cè)定方案的成本和工作量。更好的備選方案會(huì)從擴(kuò)增子產(chǎn)生單鏈的片段，從而不必進(jìn)行消化或磁分離。
已知一些方法能從雙鏈DNA產(chǎn)生隨機(jī)長(zhǎng)度的單鏈片段。在傳統(tǒng)的Maxam and Gilbert測(cè)序法(A.Maxam and W.Gilbert，PNAS 74，p.560，1977)中，雙鏈DNA片段通過(guò)待排序的DNA種類的多元復(fù)制進(jìn)行選擇性的化學(xué)降解而產(chǎn)生。通過(guò)調(diào)節(jié)條件以產(chǎn)生所有可能長(zhǎng)度的片段；就是說(shuō)，長(zhǎng)度差異僅僅是一個(gè)堿基的片段也可以被分離出來(lái)。排序時(shí)，這些組分的順序與它們各自的末端堿基代表了最初DNA種類的序列。
E.Southern等人也從雙鏈DNA中生成了隨機(jī)大小的單鏈片段，以便于將DNA從帶有斑點(diǎn)印跡的瓊脂糖凝膠膜上轉(zhuǎn)移并通過(guò)DNA與寡核苷酸探針雜交而進(jìn)行進(jìn)一步分析，該法代表一種斑點(diǎn)印跡的形式。通過(guò)調(diào)節(jié)條件以產(chǎn)生足夠小的片段來(lái)將其在凝膠中的纏結(jié)降至最小。
迄今為止，還沒(méi)有使用擴(kuò)增子片段而不進(jìn)行為了用于反向斑點(diǎn)雜交分析方式的鏈消化和分離。因此，沒(méi)有跡象表明，對(duì)于多態(tài)性的多元分析(MAP)來(lái)說(shuō)，使用高度異源的靶片段的復(fù)雜混合物要優(yōu)于使用單個(gè)，或不多于幾個(gè)的靶序列。進(jìn)一步地，對(duì)于在MAP中使用片段，除非條件被恰當(dāng)調(diào)整，可以除去一些或全部多態(tài)位點(diǎn)，或誤標(biāo)記，但這些問(wèn)題和它們的解決方法都未被提及。
一種標(biāo)記擴(kuò)增子的常規(guī)方法是擴(kuò)增5’-端標(biāo)記的引物使其產(chǎn)生末端標(biāo)記的擴(kuò)增子。這種末端標(biāo)記方法需要標(biāo)記保持完整無(wú)損的鏈，因?yàn)椋跀嗔押?，只有一小部分含?-端的片段能被標(biāo)記。因此，當(dāng)擴(kuò)增子將被斷裂時(shí)，需要不同的標(biāo)記方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種用于核酸分析，特別是DNA多態(tài)性和突變的多元分析的方法。本方法產(chǎn)生了標(biāo)記片段和其非互補(bǔ)的反義片段的多樣性，因此適合多樣性和/或突變的雜交分析(或俘獲介導(dǎo)的延伸分析(capture-mediated elongation analysis))的重退火條件并不重要。這些片段的長(zhǎng)度分布在期望的范圍內(nèi)。短的片段可能是被選擇的切割位點(diǎn)，而那些足夠長(zhǎng)的片段可以用于片段間的識(shí)別分析，從統(tǒng)計(jì)概率看，大部分片段至少含有一個(gè)可以檢測(cè)的標(biāo)記核苷酸。也就是說(shuō)，當(dāng)條件被調(diào)整后，通過(guò)含有標(biāo)記核苷酸，生成標(biāo)記鏈的一個(gè)選擇性的線性密度的片段長(zhǎng)度分布。在另一實(shí)施方案中，大部分片段的長(zhǎng)度與同源俘獲探針的長(zhǎng)度相當(dāng)。
雙鏈DNA(或通過(guò)擴(kuò)增從雙鏈DNA得到的雙鏈擴(kuò)增子)在鏈上隨機(jī)分布的多個(gè)為了產(chǎn)生不完全互補(bǔ)的片段的位點(diǎn)被切割，然后轉(zhuǎn)化成一組有義和反義片段。這可以通過(guò)每個(gè)鏈上的相同堿基的簡(jiǎn)單切割完成。這些片段接著在退火條件下，被置于和某些期望的片段完全互補(bǔ)的探針相接觸。檢測(cè)到雜交后，并基于這些結(jié)果，樣品中特定寡核苷酸片段的存在或缺失能被確定。
本方法的優(yōu)點(diǎn)是(i)取消了后PCR(post-PCR)鏈選擇的步驟；(ii)通過(guò)選擇斷裂位點(diǎn)的密度而提高靶的俘獲效率，以產(chǎn)生具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)短的靶并表現(xiàn)出高效的親和力，其詳述于題為“使用固定俘獲探針進(jìn)行基因表達(dá)分析的優(yōu)化方法”(“Optimization of GeneExpression Analysis using Immobilized Capture Probes”)的同時(shí)待決的申請(qǐng)，申請(qǐng)于2004年10月28日，引作參考。
(iii)允許使用有義和反義俘獲探針對(duì)兩鏈上的多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)。這是有益于多元分析的設(shè)計(jì)的一方面，因?yàn)樗梢匀缙诖氖褂眠x擇性的結(jié)合在有義或反義鏈上的特定探針，以避免與非同源靶的交叉雜交。見例如美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)10/847,046，申請(qǐng)于2004年5月17日的“雜交介導(dǎo)多態(tài)性分析(hMAP)”(“Hybridization-Mediated Analysis ofPolymorphisms(hMAP))”，引作參考。此外，包含反義探針與相應(yīng)有義探針提高了俘獲效率，因?yàn)榉戳x探針從溶液中除掉了部分有義靶，因此進(jìn)一步降低了溶液中鏈重退火的程度。
在產(chǎn)生擴(kuò)增子的PCR擴(kuò)增中，一個(gè)片段能與最終識(shí)別雜交靶的標(biāo)記結(jié)合。此處需要注意的是在PCR中標(biāo)記必須以足夠大的機(jī)率被結(jié)合，以使得所有得到的片段有可能至少與某個(gè)標(biāo)記結(jié)合。因此，當(dāng)片段越短時(shí)，必然的，在每一片段上標(biāo)記的機(jī)率必須越高。
之后的樣品中雜交靶的雜交和鑒定是一個(gè)可選的步驟，可以使用俘獲介導(dǎo)的和延伸分析來(lái)檢驗(yàn)雜交結(jié)果的可靠性。在這一步驟中，設(shè)計(jì)了一套新的探針，它們中有些可能比用作雜交分析的最初的探針組短或與之互補(bǔ)。期望的靶上需要較短的探針，根據(jù)片段的長(zhǎng)度，將有超過(guò)一個(gè)的多態(tài)性位點(diǎn)(或與多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的序列)。為了在俘獲介導(dǎo)的延伸分析中得到一個(gè)可靠的結(jié)果，終端探針核苷酸必須與每個(gè)多態(tài)性核苷酸排列成直線(″SNP″)。見于美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)10/271,602，題為“通過(guò)并存診斷和酶介導(dǎo)檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)多元分析”(“Multiplexed Analysis ofPolymorphic Loci by Concurrent Interrogation and Enzyme-MediatedDetection”)，申請(qǐng)于2002年10月15日，引作參考。
另外，互補(bǔ)探針可被使用如果它有助于避免在組內(nèi)靶間的交叉雜交?；パa(bǔ)探針會(huì)與最初的探針組雜交的靶鏈的互補(bǔ)靶鏈(有義鏈或反義鏈)雜交。
俘獲介導(dǎo)的延伸分析期望提高分析結(jié)果的可靠性，因?yàn)閱为?dú)用雜交分析(只使用一組原始靶)，假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)在交叉雜交中產(chǎn)生。輔以俘獲介導(dǎo)的延伸分析，其結(jié)果可與雜交介導(dǎo)分析相比較，因此大大提高了可靠性。最后的對(duì)照步驟可以通過(guò)程序和軟件完成。
上述方法的有關(guān)附圖描述如下。


圖1所示為基因組DNA的PCR產(chǎn)物染色結(jié)果，在紫外光照射下，于瓊脂糖凝膠上可見。
圖2所示為標(biāo)記的組I和組II HLA PCR產(chǎn)物，它們已通過(guò)化學(xué)裂解和變性被處理成單鏈的DNA片段。
圖3A-3D圖示為使用本發(fā)明方法進(jìn)行雜交介導(dǎo)分析的步驟。
圖4圖示說(shuō)明了與一些與靶結(jié)合的強(qiáng)度與脫嘌呤時(shí)間的關(guān)系。
圖5A-5D圖示用本發(fā)明提出的方法進(jìn)行俘獲和延伸分析中包含的步驟。
圖6說(shuō)明滴定閾值與六種不同的有義探針的關(guān)系。
圖7所示為Pcut值為5％的所選DNA鏈的片段累積分布。
圖8所示為兩個(gè)不同區(qū)域不同長(zhǎng)度，但所選鏈中可裂鍵和不可裂鍵比率相同的DNA的存在概率。
具體實(shí)施例方式
為實(shí)現(xiàn)上述方法，一個(gè)雙鏈DNA樣品，如基因組DNA，被首先分離出來(lái)。某些部分，代表目標(biāo)位點(diǎn)，被通過(guò)PCR擴(kuò)增。之后，互補(bǔ)的有義和反義鏈能被放置于允許退火的條件下，或者，它們被置于能使互補(bǔ)鏈保持分離的凝膠中。在任一情況下，它們最終被退火成雙鏈DNA擴(kuò)增子。在下一步驟中，兩種互補(bǔ)鏈在非互補(bǔ)堿基對(duì)上裂解，以產(chǎn)生只能部分互補(bǔ)的有義和反義鏈。當(dāng)將完全互補(bǔ)鏈置于退火條件下與探針陣列接觸時(shí)，它們將相互退火，藉此完成探針退火并影響測(cè)定結(jié)果。
一個(gè)著名的在不互補(bǔ)的特定堿基上裂解有義和反義擴(kuò)增子鏈的方法是用鹽酸在擴(kuò)增子上隨機(jī)切割嘌呤堿基，從而對(duì)這些堿基脫嘌呤化。切割的雙鏈DNA接著被在堿性溶液中加熱變性，從而產(chǎn)生單鏈非互補(bǔ)的DNA片段。脫嘌呤的程度越大，脫嘌呤后得到的單鏈DNA片段的長(zhǎng)度就越短。
作為雙鏈DNA的PCR擴(kuò)增的一個(gè)步驟，最后鑒別與一組探針雜交的特定鏈的標(biāo)記是必要的。完成這步的一個(gè)方法是在PCR反應(yīng)混合物中加入標(biāo)記的脫氧核苷酸(或雙脫氧核苷酸)以在反應(yīng)中標(biāo)記每個(gè)擴(kuò)增子鏈。另一方法是在PCR中加入生物素化的堿基，這些堿基通過(guò)與熒光標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白偶聯(lián)被標(biāo)記。生物素化的胞嘧啶比腺嘌呤更優(yōu)選，因?yàn)橄汆堰试诿撪堰什襟E中將被脫嘌呤化，從而導(dǎo)致標(biāo)記的損失。如上所述，標(biāo)記的頻率必須足夠高，以保證當(dāng)想檢測(cè)甚至是最短的片段時(shí)，都已被加入標(biāo)記了。在PCR中標(biāo)記是有利于通過(guò)斷裂產(chǎn)生的單鏈DNA的，因?yàn)榉駝t在后PCR加工步驟中每個(gè)鏈將被分別標(biāo)記，這將是昂貴和費(fèi)時(shí)的。
作為另一個(gè)步驟，隨后的雜交反應(yīng)是在裂解的擴(kuò)增子上完成的，如上所述，其結(jié)果能夠被確認(rèn)或推翻從而提高俘獲介導(dǎo)的延伸分析的可靠性。如上所述，最初的組的俘獲介導(dǎo)的延伸反應(yīng)可以用短的或互補(bǔ)的探針完成。
下述實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明此處提出的方法。
實(shí)施例1PCR擴(kuò)增在一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，從人類組織和細(xì)胞分離出的基因組DNA被用作模板。寡核苷酸旁測(cè)HLA組I和組II被用作為了特定位點(diǎn)和特定基因節(jié)段的擴(kuò)增的正向和反向引物。一對(duì)以上的引物能在PCR中被用于多對(duì)位點(diǎn)的擴(kuò)增。另外，引物可以包含在多態(tài)位點(diǎn)上引發(fā)基因組DNA的簡(jiǎn)并堿基。PCR依照一些眾所周知的方法完成。
優(yōu)選地，至少一種類型的配體標(biāo)記的脫氧核苷酸被加入到PCR反應(yīng)混合物中，以產(chǎn)生每個(gè)鏈都被標(biāo)記的擴(kuò)增子。配體可以是熒光染料或如生物素的分子，其能夠在反應(yīng)后與一個(gè)標(biāo)記偶聯(lián)。
PCR是通過(guò)使用一個(gè)程序化的溫?zé)嵫h(huán)器實(shí)現(xiàn)的。部分PCR產(chǎn)物和凝膠中作為標(biāo)記的DNA梯度序列在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上一起電泳。凝膠中的DNA被用溴化乙錠(ethedium bromide)染色，再顯影于紫外透照儀(transluminator)，以檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增子的完整性和產(chǎn)量。例如，位點(diǎn)A和B的外顯子2和外顯子3被用兩組引物在多元PCR中擴(kuò)增。DR位點(diǎn)的外顯子2被用一組引物擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物按照擴(kuò)增子的每20個(gè)堿基有一個(gè)以上的生物素酰核苷酸的密度被生物素?；诟麈溕稀CR產(chǎn)物的各等分部分在瓊脂糖凝膠上電泳，接著用溴化乙錠染色。被染色的PCR產(chǎn)物能在紫外照射下顯色于瓊脂糖凝膠上，見圖1。
實(shí)施例2后PCR樣品處理標(biāo)記組I和組II的PCR產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)裂解和變性處理成單鏈的DNA片段。簡(jiǎn)單的說(shuō)，正如眾所周知的，PCR產(chǎn)物被用鹽酸處理以脫嘌呤(例見M.H.Caruthers等人，基因工程中的規(guī)則和方法(in Genetic EngineeringPrinciple and Methods)，J.K.Setlow等人，編者(紐約Plenum出版社，1982))。雙鏈DNA在鹽酸存在下隨機(jī)的在嘌呤堿基，即腺嘌呤和鳥嘌呤上被切割。在堿性溶液中，帶切口的雙鏈DNA被在94℃加熱變性，致使生成單鏈DNA片段。脫嘌呤的程度直接關(guān)系到單鏈DNA片段的長(zhǎng)度。
組I和組II基因的PCR擴(kuò)增子的脫嘌呤作用被優(yōu)化以產(chǎn)生小的單鏈DNA片段，基于概率，這些片段一般包含至少一個(gè)生物素酰核苷酸。分散在聚丙烯酰胺凝膠上的裂解產(chǎn)物的長(zhǎng)度分布顯示，大多數(shù)的單鏈DNA片段有大約75個(gè)堿基長(zhǎng)。因此，根據(jù)實(shí)施例1描述的情況，每個(gè)DNA片段應(yīng)該包含大約兩個(gè)生物素酰核苷酸。
進(jìn)行了時(shí)程(time course)實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化脫嘌呤條件。B位點(diǎn)上外顯子2和3的生物素化的PCR產(chǎn)物用特定量的鹽酸培養(yǎng)并以階段增加的時(shí)間溫育在水浴中，接著加入氫氧化鈉并加熱變性?；瘜W(xué)裂解的PCR產(chǎn)物用8％尿素電泳測(cè)序以分離消化產(chǎn)物，接著用溴化乙錠染色。裂解產(chǎn)物在紫外透照儀(transluminator)上顯影，其指示了隨著脫嘌呤時(shí)間的增加，小的裂解產(chǎn)物的量也增加(圖2)。
實(shí)施例3在芯片上的雜交分析按實(shí)施例2中所述制備加工的PCR產(chǎn)物被加熱變性以得到大量的單鏈DNA片段。在變性后，樣品被在冰上進(jìn)行快速冷凍以保持DNA片段處于單鏈狀態(tài)。DNA樣品接著與雜交緩沖液混合以在芯片上雜交出互補(bǔ)的寡核苷酸探針，這些不同的探針類型各自被固定在不同的編碼微粒上，而編碼微粒被排列在固體底物上(“BeadChipTM”微珠芯片)。見于美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)10/204,799“使用專用隨機(jī)粒子陣列的多分析物分析”(“Multianalyte Molecular Analysis Using Application-Specific RandomParticle Arrays”)，申請(qǐng)于2002年8月23日，引作參考。
雜交條件和緩沖溶液的離子強(qiáng)度是技術(shù)上常規(guī)的。優(yōu)選地，為了具有快速有效的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，芯片雜交在一個(gè)溫度和濕度控制的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。見于美國(guó)專利申請(qǐng)“用于生物樣品的光學(xué)檢驗(yàn)的可控蒸發(fā)，溫度控制和包裝”(“Controlled Evaporation，Temperature Control and Packaging forOptical Inspection of Biological Samples”)，序號(hào)10/870,213，申請(qǐng)于2004年6月17日。
接著的雜交中，未結(jié)合標(biāo)記的DNA被通過(guò)充分洗滌除去。寡核苷酸與配體，如生物素，的結(jié)合強(qiáng)于熒光染料，分析芯片用含有與配體具有高親和力的熒光標(biāo)記分子的染色液培養(yǎng)。例如，可使用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白結(jié)合生物素標(biāo)記DNA片段。
如果存在有效的交叉雜交，標(biāo)記的DNA靶可被超過(guò)一類的探針?lè)@，并與微珠芯片上一類以上的編碼微粒有關(guān)。
如圖3所示，一個(gè)典型的hMAP微珠芯片分析有如下四個(gè)步驟步驟1，在標(biāo)記的dNTPs，如生物素化的dATP和生物素化的dCTP，存在下的基因組DNA的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的每個(gè)鏈都在PCR反應(yīng)中被標(biāo)記。步驟2，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物在鹽酸存在下脫嘌呤，接著在堿性溶液中加熱變性。步驟3，斷裂的單鏈DNA靶被用作微珠芯片分析的靶。步驟4，微珠上的俘獲靶被檢測(cè)到，通過(guò)用與標(biāo)記有高親和力的熒光標(biāo)記的配體培養(yǎng)，如用于檢測(cè)生物素化靶的Cy3軛合的鏈霉抗生素蛋白，接著被READ檢出(圖3)。
實(shí)施例2中描述的裂解DNA產(chǎn)品被用于微珠芯片hMAP分析。簡(jiǎn)要地說(shuō)，每一個(gè)脫嘌呤處理的產(chǎn)物，即那些從0，10，13，15，17，20，15和＞25分鐘脫嘌呤得到的結(jié)果，被用作hMAP微珠芯片分析中的一個(gè)靶。分析了各靶對(duì)于一系列序列特異的探針的雜交強(qiáng)度。如圖4所示，探針A和探針C的強(qiáng)度隨著脫嘌呤時(shí)間的增加而減少，這提示了脫嘌呤作用中，從長(zhǎng)DNA靶到小片段的裂解增加。然而，探針B，D，E和F的強(qiáng)度首先在部分脫嘌呤中增加，接著在進(jìn)一步脫嘌呤中降低，提示了部分裂解導(dǎo)致某些靶序列的釋放，它們是在長(zhǎng)鏈DNA中無(wú)法因?yàn)槠渌蛩兀绨械亩?jí)結(jié)構(gòu)得到的(圖4)。
實(shí)施例4CUSTOM微珠芯片的制備用于雜交介導(dǎo)分析的DNA寡核苷酸探針可以包含一個(gè)末端反應(yīng)基團(tuán)，一個(gè)內(nèi)部的間隔區(qū)分子，和與目標(biāo)靶DNA互補(bǔ)的核苷酸的一段序列。寡核苷酸探針可以與有義鏈或DNA分子的反義鏈互補(bǔ)?？傆幸粋€(gè)鏈被選擇以降低交叉雜交。
當(dāng)DNA寡核苷酸偶聯(lián)到顏色編碼的微粒上后，不同微粒被組合進(jìn)一個(gè)小管，其用于裝配排列在硅晶片(或微珠芯片)上的隨機(jī)平面排列的微珠。在HLA分子分型中，每個(gè)微珠芯片應(yīng)該包含用于特定組I和組II分子的特定位點(diǎn)的多個(gè)有義和反義探針。不同的位點(diǎn)的微珠芯片可被固定在一個(gè)用于雜交反應(yīng)的公共槽(common chamber)中。
實(shí)施例5俘獲介導(dǎo)的延伸分析如上所討論的，接著的雜交介導(dǎo)分析，其結(jié)果能用俘獲介導(dǎo)的延伸反應(yīng)確定或推翻。如圖5所示，一個(gè)用化學(xué)裂解的DNA靶的典型微珠芯片分析應(yīng)該有如下四個(gè)步驟步驟1，基因組DNA的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的每個(gè)鏈都在PCR反應(yīng)中被標(biāo)記。步驟2，標(biāo)記的PCR產(chǎn)品在鹽酸存在下脫嘌呤，接著在堿性溶液中加熱變性。步驟3，斷裂的單鏈DNA被作為靶用于雜交到序列特異的探針上，接著在熒光標(biāo)記的dNTPs，如Cy3標(biāo)記的dATP和dCTP存在下進(jìn)行延伸反應(yīng)。步驟4，靶模板被通過(guò)充分洗滌除去，繼之以延伸探針的READ測(cè)定(圖5)。
實(shí)施例6有義探針和反義探針的多元hMAP分析本發(fā)明描述的化學(xué)裂解的DNA靶能以這一形式被雜交，并用于HLA基因的分析。在這樣一個(gè)多元分析中，寡核苷酸探針可以包含與靶HLA子序列的有義鏈或反義鏈互補(bǔ)的俘獲序列。當(dāng)這種分析被用于篩選一組已知基因型的人類DNA樣品時(shí)，探針信號(hào)的陽(yáng)性信號(hào)比率(“信號(hào)率”)能被在樣品中被探針組的各個(gè)探針?biāo)_定。信號(hào)率的閾值可被任意設(shè)定，以識(shí)別探針和靶之間的“真正匹配”和“錯(cuò)配”。通過(guò)與那些靶DNA的互補(bǔ)鏈結(jié)合，在平板上加入反義探針能夠提高多元hMAP分析中有義探針的俘獲效率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)出在多元hMAP分析中加入反義探針沒(méi)有降低任何有義探針的俘獲效率，并且事實(shí)上當(dāng)反義探針被加入時(shí)，俘獲效率被提高了(結(jié)果未列出)。僅有義探針的分析被示于圖6。
實(shí)施例7DNA斷裂模型在本實(shí)施例中，DNA斷裂過(guò)程的兩個(gè)不同方面的模型被提出，即單鏈DNA(結(jié)構(gòu)已知的)的片段大小分布和在鏈后來(lái)的斷裂中DNA的特定序列的存在概率。此分析的值是雙重的。第一，它鑒別片段大小怎樣成為斷裂百分?jǐn)?shù)的一個(gè)函數(shù)。第二，通過(guò)模擬片段大小分布，提供了一種獨(dú)特的方法，以估計(jì)在目標(biāo)DNA鏈中的靶區(qū)的存在概率。這有與俘獲探針的設(shè)計(jì)有關(guān)的重要意義，因?yàn)橹挥挟?dāng)片段的成分包含完整無(wú)損的目標(biāo)子序列，或者那些片段探針-靶大量重疊時(shí)，能夠成功的退火到俘獲探針。具有小的相互重疊區(qū)的片段在發(fā)生檢測(cè)或延伸前變性。并且，因?yàn)槠未笮》植己秃心繕?biāo)未切區(qū)的鏈的百分?jǐn)?shù)都是實(shí)驗(yàn)可以得到的量，此方法提供了一種獨(dú)特的手段，用于匹配實(shí)驗(yàn)和模擬結(jié)果，并有可能定量模型中的重要參數(shù)。
為了模擬的目的，假設(shè)如上概括的斷裂實(shí)驗(yàn)過(guò)程產(chǎn)生隨機(jī)分布的多核苷酸片段。隨機(jī)斷裂意味著每個(gè)可裂解的核苷酸-核苷酸鍵有相等的被斷裂的概率，Pcut。此假設(shè)是合理的，因?yàn)閿嗔堰^(guò)程是基本公平的對(duì)于所有使用的A和G的片段，而不依賴于序列。另一假設(shè)是鍵的斷裂是獨(dú)立的，因此片段產(chǎn)生的順序不影響它們出現(xiàn)的概率。這些模擬由一個(gè)單鏈HLA B外顯子2擴(kuò)增子完成，其有268個(gè)堿基長(zhǎng)。序列被示于下(序列標(biāo)識(shí)號(hào)1)。
1GCTCCCACTC CATGAGGTAT TTCTACACCT CCGTGTCCCG GCCCGGCCGC51 GGGGAGCCCC GCTTCATCTC AGTGGGCTAC GTGGACGACA CCCAGTTCGT101 GAGGTTCGAC AGCGACGCCG CGAGTCCGAG AGAGGAGCCG CGGGCGCCGT151 GGATAGAGCA GGAGGGGCCG GAGTATTGGG CCGGAACACA CAGATCTACA201 AGGCCCAGGC ACAGACTGAC CGAGAGAGCC TGCGGAACCT GCGCGGCTAC251 TACAACCAGA GCGAGGCC方法1)給定參數(shù)(Pcut＝斷裂％)和鏈序列。
2)根據(jù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)可被斷裂和不可斷裂的鍵將序列分成微小的區(qū)域。斷裂的鍵的總數(shù)用nF表示。鄰近的無(wú)斷裂的鍵作為可斷裂鍵旁側(cè)的非斷裂區(qū)被集中起來(lái)。
3)創(chuàng)建一個(gè)N個(gè)序列的集合，每個(gè)序列包括nF區(qū)域(可斷裂的)。典型的N＝1000。
4)在0和1之間，產(chǎn)生均勻的隨機(jī)數(shù)的2矢量，R1和R2，每個(gè)的大小Ncut＝(nF*Pcut*N)/100，其中Ncut代表了集合中將要斷裂的鍵的總數(shù)。第一個(gè)矢量，在一個(gè)序列的切割點(diǎn)隨機(jī)確定。這樣，對(duì)于矢量R1，切割部位由求(nF*R1)的值計(jì)算。從第二個(gè)矢量，在被切割的集合中的特殊的復(fù)制由如下(N*R2)決定。因而，對(duì)于每個(gè)在序列上將要被操作的切口，其i(入射角)，產(chǎn)生兩個(gè)一組的數(shù)字(fi，ni)，其中ni表示將要產(chǎn)生的切口的復(fù)制數(shù)目，fi表示復(fù)制中切割的可斷裂鍵。然而，產(chǎn)生的每組(fi，ni)可能不是唯一的。因此，在實(shí)際操作中，某一特定復(fù)制中的特定的鍵可能被再次選中(revisit)。一旦一個(gè)給定的鍵被指定為斷裂的，定義該鍵位置的重復(fù)組(fi，ni)即被排除，無(wú)論它是否發(fā)生了(斷裂)。因此，事實(shí)上，在實(shí)驗(yàn)中，鍵斷裂的總數(shù)是ncut≤Ncut。
5)通過(guò)給定的片段大小的分布計(jì)算出斷裂的鍵或序列末端旁側(cè)的堿基(連接大量的可斷裂區(qū)和非斷裂區(qū))數(shù)目。
圖7表明選出的具有5％的Pcut值DNA鏈得到的片段的累積大小分布。該圖說(shuō)明了小的片段比大片段更普遍的存在(最終的片段混合物的50％由長(zhǎng)度小于～20個(gè)堿基的片段組成)。圖8表明在選出的DNA鏈中，兩種長(zhǎng)度不同但具有相同的可斷裂與不可斷裂鍵的機(jī)率的不同區(qū)域的存在概率。
應(yīng)該理解為，此處使用的術(shù)語(yǔ)，表示式和實(shí)施例僅作示范，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅在接著的權(quán)利要求書中被確定，并且包含權(quán)利要求的主題的所有等效表達(dá)。權(quán)利要求中的程序和方法的步驟可按任何順序進(jìn)行，包括權(quán)利要求書中采用的順序，在權(quán)利要求書中另有說(shuō)明的除外。
序列表<110>楊家成<120>通過(guò)斷裂雙鏈脫氧核糖核酸進(jìn)行多元核酸分析<130>FRGMNT<150>60/515,413<151>2003-10-29<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>268<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工擴(kuò)增子<400>1gctcccactc catgaggtat ttctacacct ccgtgtcccg gcccggccgc ggggagcccc 60gcttcatctc agtgggctac gtggacgaca cccagttcgt gaggttcgac agcgacgccg 120cgagtccgag agaggagccg cgggcgccgt ggatagagca ggaggggccg gagtattggg 180ccggaacaca cagatctaca aggcccaggc acagactgac cgagagagcc tgcggaacct 240gcgcggctac tacaaccaga gcgaggcc 268
權(quán)利要求
1.一種檢出雙鏈寡核苷酸樣品中的特定核苷酸序列的方法，包括在寡核苷酸鏈之間沒(méi)有匹配的位置切割雙鏈寡核苷酸，藉此產(chǎn)生不完全互補(bǔ)的有義和反義片段；將片段與一組單鏈寡核苷酸共同退火，其中，組中的單鏈寡核苷酸與片段或片段的子序列互補(bǔ)；并檢出單鏈寡核苷酸和片段間的雜交。
2.一種檢出雙鏈寡核苷酸樣品中的特定核苷酸序列的方法，包括擴(kuò)增樣品的區(qū)段以產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增子；在擴(kuò)增子鏈間沒(méi)有匹配的位置切割雙鏈擴(kuò)增子，藉此產(chǎn)生不完全互補(bǔ)的有義和反義片段；將片段與一組單鏈寡核苷酸共同退火，其中，組中的單鏈寡核苷酸與片段或片段的子序列互補(bǔ)；并檢出單鏈寡核苷酸和片段間的雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中單鏈寡核苷酸為DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中雙鏈寡核苷酸樣品為基因組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中雙鏈寡核苷酸樣品包括目標(biāo)基因位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中裂解通過(guò)其鏈上的嘌呤堿基與鹽酸隨機(jī)反應(yīng)脫嘌呤，并且熱變性產(chǎn)生單鏈DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中切割位點(diǎn)的選擇由控制鹽酸的pH、與鹽酸接觸的時(shí)間及反應(yīng)溫度來(lái)控制。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中標(biāo)記物在擴(kuò)增過(guò)程中被插入擴(kuò)增子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中加入標(biāo)記物為與生物素結(jié)合，生物素接著與標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白偶聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中被插入的生物素與dNTPs有關(guān)。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中熒光標(biāo)記的dNTPs或ddNTPs被插入擴(kuò)增子中。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中標(biāo)記頻率根據(jù)預(yù)計(jì)的片段長(zhǎng)度調(diào)整，在較短的片段被預(yù)計(jì)切割的位置，標(biāo)記的頻率增加。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中對(duì)片段長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整以產(chǎn)生與單鏈寡核苷酸長(zhǎng)度接近的片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中進(jìn)一步包括在合適條件下延伸單鏈寡核苷酸，并檢出單鏈寡核苷酸的延伸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中檢出特定的單鏈寡核苷酸和片段的雜交是基于是否所述的特定單鏈寡核苷酸存在延伸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括提供一組單鏈寡核苷酸探針的步驟，其中一些探針可比單鏈寡核苷酸短或與之互補(bǔ)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中進(jìn)一步包括在合適條件下延伸單鏈寡核苷酸探針，并檢出單鏈寡核苷酸探針的延伸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中進(jìn)一步包括比較單鏈寡核苷酸探針的延伸結(jié)果和單鏈寡核苷酸的延伸結(jié)果的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中比較是使用一個(gè)軟件程序自動(dòng)完成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用雙鏈DNA片段進(jìn)行核酸分析的方法，特別涉及多態(tài)性和突變的多元分析。本方法產(chǎn)生了標(biāo)記的有義片段和非互補(bǔ)的反義片段的多樣性，因此多態(tài)性和/或突變的雜交分析(或俘獲介導(dǎo)的延伸分析)的重退火條件并不是很重要。這些片段的長(zhǎng)度分布在期望的范圍內(nèi)。短的片段可能是被選擇的切割位點(diǎn)，而那些足夠長(zhǎng)的片段可以用于片段間的識(shí)別分析，從統(tǒng)計(jì)概率看，大部分片段至少含有一個(gè)可以檢測(cè)的標(biāo)記核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1882703SQ200480034210
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月29日
發(fā)明者楊家誠(chéng) 申請(qǐng)人:佰爾瑞溶液有限公司