專利名稱：定性定量用脫氧核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)參照物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種廣泛應(yīng)用于分子生物、基因研究的定性定量用脫氧核糖核酸(DNA)標(biāo)準(zhǔn)參照物的制備方法。
DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物由一系列大小不同的已知片段所組成。目前有三類商品化的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。第一類是由酵母基因直接酶解而得到，主要用于幾十至幾百kb以上的大分子定性。(見參考文獻(xiàn)1)第二類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物是通過酶解噬菌體DNA得到一系列大小不等的DNA片段，這些片段之間的差值不同，即從小分子量到大分子量DNA片段以非等差性質(zhì)增長。(見參考文獻(xiàn)2-4)第三類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物是由增長量相同的一系列大小不同的DNA片段組成，或者說其具有等差數(shù)列的特征。例如最常使用的1kb DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物和100bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物分別由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10kb和100、200，300，400，500，600，700，800，900，和1000bp片段組成。第三類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物使用起來十分方便，特別適用于臨床診斷。DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物除應(yīng)用于分子生物學(xué)方面的基礎(chǔ)研究外，目前其已愈來愈多的應(yīng)用于臨床診斷，其中包括使用PCR技術(shù)進(jìn)行多態(tài)測定和基因分析。
與第二類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物相比較，第三類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物更容易被使用者接受，因而很多制備這類新型DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的方法應(yīng)運(yùn)而生。這些方法采用三種不同的方案1)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶解或直接使用PCR產(chǎn)物；(見參考文獻(xiàn)5)2)對標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒進(jìn)行酶解；(見參考文獻(xiàn)6-8)3)對DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒不完全酶解，制備含有多倍數(shù)重復(fù)的DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)參照物。(見參考文獻(xiàn)9-11)例如一特定質(zhì)粒含有一種具有以下特征的插入片段a)此插入片段含有多個(gè)重復(fù)的100鹼基對的DNA片段；b)這些重復(fù)單位彼此相連通過PvuII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆在載體上。使用PvuII進(jìn)行不完全酶解產(chǎn)生一系列片段由100bp至1000bp遞增的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。
很顯然上述三類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。前二類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物制備簡單可用于定性分析，但用作尺度標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段的大小不容易記憶，因片段間不是均勻遞增的。并且在一些片段之間存在一段很大的空缺而無法對該區(qū)域進(jìn)行比較準(zhǔn)確的尺度定標(biāo)。第三類DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物使用方便但其制備較為復(fù)雜。更為嚴(yán)重的問題是其存在著一些技術(shù)上的固有缺陷1)在制備過程中當(dāng)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物片段不是來自單一的標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒時(shí)，片段之間不具備確定的比例，缺乏定量功能；2)在制備過程中當(dāng)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物片段是由不完全酶解法從單一標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒產(chǎn)生時(shí)，不同片段之間更無法提供確定的比例關(guān)系，依然缺乏定量功能；3)當(dāng)制備過程需要凝膠電泳純化時(shí)，這種制備過程增加了DNA雙鏈分子中產(chǎn)生單鏈斷裂的機(jī)會。同時(shí)也增加了制造成本；4)一些由不完全酶解產(chǎn)生的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物在凝膠電泳時(shí)所形成的帶，有時(shí)會因?yàn)槟承Ш胁煌笮〉腄NA分子而使帶形變寬甚至模糊。
本發(fā)明的目的是提供一種可以通過限制性內(nèi)切酶完全酶解而制備定性定量雙功能DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的方法。
根據(jù)本發(fā)明制備DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的重組DNA設(shè)計(jì)如下a、重組DNA含有一個(gè)或多個(gè)特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
b、每一要求長度的DNA片段是由PCR反應(yīng)制備或直接應(yīng)用天然基因中可利用的片段，各片段的鹼基數(shù)目均為一自然數(shù)基本定長的整數(shù)倍。這些片段通過亞克隆技術(shù)形成所需要的重組DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。
c、標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA的擴(kuò)增、純化，并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的完全酶解。
在標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA中一些特定的片段含有多于一個(gè)的拷貝數(shù)，這一設(shè)計(jì)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是用以增強(qiáng)某些片段在凝膠電泳時(shí)的亮度而便于識別；二是調(diào)整大小不同片段的亮度以達(dá)到肉眼能同時(shí)可見的要求。例如在100bp標(biāo)準(zhǔn)參照物中的100和500bp片段。
下面對本技術(shù)方案的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
重組DNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于質(zhì)粒、病毒、噬菌體、酵母、以及動植物品種研究和品種改良。例如，從質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法之一。已有專利發(fā)明闡述的修飾方案是使用標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒的整個(gè)序列制備DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，包括由單一長度基因的不同拷貝所形成的標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子，和不同長度的單一拷貝所形成的標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子。(見參考文獻(xiàn)11，12)此類發(fā)明雖在一定程度上簡化了制作工藝，但產(chǎn)品性能卻受到了影響。其中一項(xiàng)用于制造定性DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的專利存在有三方面缺陷1)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物片段不能提供定量信息，因?yàn)閺囊淮尾糠菝附庵亮硪淮尾糠菝附獾漠a(chǎn)物是不同的。2)某些單一DNA帶含有多種不同大小的DNA分子使其帶形變寬甚至模糊。3)不完全酶解過程不適于大規(guī)模工業(yè)化制備。(見參考文獻(xiàn)11)而另一項(xiàng)用于定量DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的專利則由于標(biāo)準(zhǔn)參照物的帶數(shù)僅6種且這些標(biāo)準(zhǔn)參照物的定量關(guān)系相差20倍之多很難同時(shí)顯現(xiàn)，因此雖有一定的定量作用，但作為DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的意義不大。(見參考文獻(xiàn)12)本發(fā)明是一種直接制備DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的方法，本發(fā)明制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物可同時(shí)提供定性、定量的信息。本方法的步驟包括標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA的設(shè)計(jì)；標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子擴(kuò)增、純化及限制性內(nèi)切酶的完全酶解。在標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA的設(shè)計(jì)時(shí)，當(dāng)天然DNA分子含有所選定的酶切位點(diǎn)而這些位點(diǎn)與片段定長不相符時(shí)，可對其進(jìn)行點(diǎn)突變，或采用部份片段的重組。對分子量較大的DNA，設(shè)計(jì)時(shí)可考慮使用六鹼基或八鹼基甚至更多鹼基的核酸內(nèi)切酶。保留重組DNA具有與天然DNA分子相同或相近的擴(kuò)增能力，是DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物設(shè)計(jì)時(shí)必需服從的第一基本原則。選用高效而廉價(jià)的核酸內(nèi)切酶，不是本發(fā)明的必需條件，卻對保證產(chǎn)品的質(zhì)量和成本效益，具有極大的影響。
從制造工藝上，本發(fā)明由于采用了新的設(shè)計(jì)原理，在DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子的設(shè)計(jì)時(shí)，既可控制各參照物分子的大小，又同時(shí)控制各參照物分子的拷貝數(shù)目，從而使產(chǎn)品達(dá)到了定性與定量的有機(jī)結(jié)合。本發(fā)明的另一優(yōu)勢是簡化了生產(chǎn)過程本發(fā)明使產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟簡化到了一步，即單一分子的完全酶解。而現(xiàn)有的方法一是多分子完全酶解之后再純化與混合調(diào)配，或者采用重復(fù)性極差的不完全酶解的方法。這是本發(fā)明與現(xiàn)有產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中與現(xiàn)有專利的最大區(qū)別。在純技術(shù)層面上，已有技術(shù)是基于對單一定長不同拷貝數(shù)的重組基因進(jìn)行不完全性酶解，或者是對單一拷貝不同定長的重組基因進(jìn)行完全酶解；本發(fā)明在設(shè)計(jì)上與已有方法和專利的區(qū)別和獨(dú)特之處，在于設(shè)計(jì)出不同定長不同拷貝數(shù)的重組基因單一分子以制造DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。
利用這一新的設(shè)計(jì)原理，可對質(zhì)粒、病毒、噬菌體、酵母以及其他天然基因進(jìn)行重組，以構(gòu)建不同定長不同拷貝數(shù)的重組基因DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物。這種不同定長不同拷貝數(shù)的重組基因DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物通過亞克隆技術(shù)制成之后，亞細(xì)胞生命分子尚需轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。對質(zhì)粒和噬菌體而言，擴(kuò)增時(shí)采用大腸桿菌；對重組病毒的擴(kuò)增采用真核細(xì)胞。本發(fā)明設(shè)計(jì)的重組基因DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，在酶解時(shí)只需完全消化即可。
相關(guān)術(shù)語描述重組基因指通過人工處理所得到的新的核酸分子。
質(zhì)粒天然存在于真核細(xì)胞中的一類環(huán)形DNA分子。
病毒寄生于真核細(xì)胞中的亞細(xì)胞生命形式，可以是DNA，也可以是RNA。
噬菌體寄生于原核細(xì)胞中的亞細(xì)胞生命形式。
酵母單細(xì)胞的真核生命。
限制性內(nèi)切酶對核酸分子的特定序列具有識別與裂解雙重功能的核酸酶，其辨認(rèn)位點(diǎn)兩端有至少多余一個(gè)以上的鹼基，也即非位于核酸分子的最末端。
實(shí)際應(yīng)用舉例1、100 bpDNA標(biāo)準(zhǔn)重組基因的設(shè)計(jì)此DNA標(biāo)準(zhǔn)重組基因以質(zhì)粒為工作對象，含有兩拷貝的100、30O、500bp片段及一拷貝的200、400、600、700、800、900、1000bp片段。這些特定大小的片段之間由限制性內(nèi)切酶Mfel位點(diǎn)隔開，此100bp標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒的總長度是6400bp。經(jīng)Mfel完全酶解后標(biāo)準(zhǔn)參照物含有十個(gè)大小不同的DNA片段從100bp至1000bp，以100bp逐步遞增。為更清楚的看到較小的DNA片段及便于識別100、300、500bpDNA片段使用雙拷貝強(qiáng)化。此100bp標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)粒以pBR322作為基本框架進(jìn)行改造。不同大小特定片段首先通過含有Mfel位點(diǎn)的引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)制備，PCR產(chǎn)物及載體進(jìn)而Mfel酶解并與載體連接。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中對菌落進(jìn)行篩選，選擇那些僅含有某一特定片段單拷貝的質(zhì)粒。選定質(zhì)粒進(jìn)一步不完全酶解及去磷酸化，進(jìn)而連上更多片段，重復(fù)這一連接反應(yīng)直到得到所有所需片段。這一連接策略已成為基因工程中的基本手段。轉(zhuǎn)化及限制性內(nèi)切酶的不完全和完全酶解反應(yīng)也同樣已廣泛應(yīng)用。
由于Mfel是一種高效率限制性內(nèi)切酶，該酶的完全酶解很容易在37℃下達(dá)到。Mfel完全酶解后在65℃下存放20分鐘使內(nèi)切酶失活。
此法制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物其包括的特定片段具有準(zhǔn)確的定量關(guān)系。由于目的不同，使用的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物具有不同大小的片段。通常情況下，低濃度的凝膠使用較高分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物片段，而高濃度的凝膠則需要較低分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物片段。多數(shù)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物都能適用于較寬的凝膠濃度范圍。
2、細(xì)胞程控死亡的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的制備細(xì)胞程控死亡在胚胎發(fā)育、退行性疾病如老年性癡呆和腫瘤的發(fā)生等諸方面具有十分重要的意義。細(xì)胞程控死亡檢測方法中最為可靠的方法是凝膠電泳時(shí)顯現(xiàn)的以等差遞增形式存在的染色體DNA降解產(chǎn)物。通常各降解產(chǎn)物之間相差160至200鹼基對。
利用本發(fā)明提供的方法制造了一種作為細(xì)胞程控死亡的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物其各帶所示大小依次為100、300、500、700、900和1000鹼基對。這一DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物提供了相鄰片段間200鹼基對的差距。同時(shí)又保障不可能與細(xì)胞程控死亡所降解的染色體DNA相混淆，因?yàn)楹笳咭?00、400、600、800鹼基的方式向上遞增。
與目前常規(guī)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物比較，以限制性內(nèi)切酶部份酶解方式所制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物可以100鹼基對之差遞增如100、200、300，100x(3＋n)，……；或以200鹼基對之差遞增如200、400、600，200x(3＋n)，……。這些DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物在凝膠電泳時(shí)容易與染色體DNA的降解產(chǎn)物相互混淆。而本發(fā)明所提供方法制備的細(xì)胞程控死亡標(biāo)準(zhǔn)參照物，既為每200鹼基對的差距提供了尺度標(biāo)準(zhǔn)，又可以100鹼基的奇數(shù)倍的方式遞增，從而避免了與通常以100鹼基的偶數(shù)倍遞增的染色體DNA降解產(chǎn)物相互混淆。故該細(xì)胞程控死亡DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物在細(xì)胞程控死亡的研究中具有獨(dú)特的作用。
本發(fā)明與已有方法比較具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果一、用完全酶解的方法取代了不完全酶解的過程。
二、由于本法可對不同定長、不同拷貝數(shù)的重組基因進(jìn)行完全性酶解。在設(shè)計(jì)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物時(shí)已控制了各片段的拷貝數(shù)，因而不同片段之間在其數(shù)量上具有準(zhǔn)確比例。
三、基于上述二中相同的原因本法制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物中多于一個(gè)拷貝的特定片段，其各個(gè)拷貝都來自同種DNA分子因此其分子量相同。
四、本法制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物中都含有特定強(qiáng)化的片段以便于識別。
五、采用本法制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物時(shí)，包括載體在內(nèi)的所有插入片段的長度，酶解后全部適用于定標(biāo)，而沒有定標(biāo)范圍之外的多余片段。
六、采用本法制備的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物時(shí)，可通過對最大及最小的片段的拷貝數(shù)的控制，使所有標(biāo)準(zhǔn)參照物片段都在肉眼可同時(shí)觀測的合理范圍之內(nèi)。
由于本法制備的產(chǎn)品具備上述的特征故而具備同時(shí)定性定量的功能。
參考文獻(xiàn)1New English Biolabs Inc.2001-01 Catalogue&technicalReferencep1192Promega.Life Science Catalog 2001p3.3New English Biolabs Inc.2001-01 Catalogue & technicalReferencep116-114Promega.Life Science Catalog 2001p4.7-4.95Gibco，Life Technologies Catalog and Reference Guide 2001p17.96New English Biolabs Inc.2001-01 Catalogue & technicalReferencep117Promega.Life Science Catalog 2001p4.8Gibco，Life Technologies Catalog and Reference Guide 2001p17.8-17.99Promega.Life Science Catalog 2001p4.4-4.10Gibco，Life Technologies Catalog and Reference Guide 2001p17.4 and p17.11US.Patent 5840512US.Patent 583420權(quán)利要求
1.一種對來源于質(zhì)粒、病毒、噬菌體、酵母的天然DNA分子進(jìn)行基因重組以制備定性定量用脫氧核糖核酸(DNA)標(biāo)準(zhǔn)參照物的方法，其特征在于，該重組DNA分子從限制性內(nèi)切酶辨認(rèn)位點(diǎn)來看是由多種不同定長片段的不同拷貝數(shù)所形成的重組分子，本發(fā)明包括以下幾個(gè)步驟a、制備含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子；b、將重組DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增；c、通過使用限制性內(nèi)切酶對重組DNA分子進(jìn)行完全酶解以制備不同大小的DNA片斷。
2.如權(quán)利要求1所述的制備定性定量用DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物方法，其特征在于，所用限制性內(nèi)切酶的酶解位點(diǎn)是一個(gè)或多于一個(gè)，最多不超過一百個(gè)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備定性定量用DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物方法，其特征在于，所用的限制性內(nèi)切酶是辨認(rèn)位點(diǎn)至少為四個(gè)鹼基的核酸酶。
4.如權(quán)利要求1所述的制備定性定量用DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物方法，其特征在于，任何相鄰酶切位點(diǎn)之間的片斷長度均等于設(shè)計(jì)時(shí)基本定長單位的整數(shù)倍。
5.如權(quán)利要求1所述的定性定量用DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，其特征在于，重組DNA分子含有限制性內(nèi)切酶消化后所產(chǎn)生的不同定長片段是具有不同拷貝數(shù)的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明利用限制性內(nèi)切酶完全酶解法制備定性定量用脫氧核糖核酸(DNA)標(biāo)準(zhǔn)參照物。這一目標(biāo)通過控制不同長度標(biāo)準(zhǔn)參照物片段和各個(gè)片段的不同拷貝數(shù)來達(dá)到。各不同片段的共同特征是其鹼基數(shù)目都等于基本定長的整數(shù)倍。這一標(biāo)準(zhǔn)參照物重組DNA分子通過擴(kuò)增和純化后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的完全消化。凝膠電泳時(shí)不同帶之間根據(jù)在DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物的設(shè)計(jì)時(shí)其在重組DNA分子中的拷貝數(shù)目的特異性而存在準(zhǔn)確的定量關(guān)系。
文檔編號C12N15/11GK1329172SQ01119959
公開日2002年1月2日 申請日期2001年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月4日
發(fā)明者張旭, 張佳, 李凱 申請人:張旭