專利名稱：一種檢測凝血因子v基因多態(tài)性的試劑盒、方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種凝血因子V基因多態(tài)性的檢測試劑盒、方法和 用途。更具體的，本發(fā)明涉及通過聚合酶鏈式反應方法，提供一種分析編碼凝血因子V 基因的R506Q多態(tài)性位點基因型的試劑盒、方法和用途。
背景技術：
先天性血栓性疾病也稱遺傳性血栓形成傾向，是由于凝血，抗凝和纖溶系統(tǒng)某個環(huán) 節(jié)的特異性障礙而引起的一類疾病，以復發(fā)性靜脈血栓為主要臨床表現，大多屬先天遺 傳性，常首發(fā)于青少年時期。據西歐部分地區(qū)統(tǒng)計，發(fā)病率在20 / 100000以上，超出先 天性出血性疾病。
繼發(fā)于一些疾病的高凝狀態(tài)和血栓形成與原發(fā)于凝血、抗凝血機理缺陷的先天性血 栓性疾病不同，常表現為止血，抗血栓機理非特異性，多環(huán)節(jié)的變化，病因多數是復合 性的。生理或一些體外的因素也可導致高凝狀態(tài)，如高齡、妊娠、產后、劇烈運動、情 緒激動、寒冷、吸煙、高脂飲食、藥物(口服避孕藥)等。不少內科疾病引起的高凝狀 態(tài)和血栓形成包括①腫瘤；②自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎，Behcet
綜合征；③內分泌及代謝性疾病糖尿病、腎上腺皮質功能亢進；④腎臟疾病腎病綜 合征；⑤肝臟疾??；⑥心、腦血管疾病心絞痛、心肌梗塞、腦血栓、腦栓塞、短暫性 腦缺血、閉塞性脈管炎，原發(fā)性高血壓；⑦血液病彌散性血管內凝血、血栓性血小板 減少性紫癜、夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿、骨髓增生綜合征；⑧肺部疾病肺栓塞、慢性阻 塞性肺炎、成人呼吸困難綜合征；⑨高粘血癥白血病、紅細胞增多癥鐮形紅細胞病、 高免疫球蛋白血癥；⑩高脂血癥。
靜脈血栓形成(venous thrombosis ,VT)在發(fā)達國家年發(fā)病率1 %。，且隨年齡增長呈遞 增現象。兒童的發(fā)病率1/10萬，老年人接近l % 。靜脈血栓形成多發(fā)生在下肢深靜脈， 與其相關的主要并發(fā)癥是血栓后遺綜合征及致死性的肺動脈栓塞，發(fā)生率分別是20 % 及1% 2% 。我國尚缺乏大規(guī)模血栓流行病學的調査資料。從近些年我科收治的病人 來看，靜脈血栓形成是常見病、多發(fā)病。研究證明，凝血因子的基因多態(tài)性與血栓形成 密切相關。靜脈血栓是一種多因子疾病，既有遺傳因素，又有后天獲得的一些危險因素。 因子V和因子II (凝血酶原)是兩種最常見的影響家族性血栓形成傾向的因子，家族性 血栓形成傾向是一種威脅健康甚至造成死亡的疾病。用常規(guī)臨床檢測方法通常很難發(fā)現靜脈血栓，但是，對于有家族史以及有其他嚴重疾病的患者，通過遺傳預置篩査檢測有 關致病因子，可能是預防這類疾病的一種合適途徑。
凝血因子V (F V)是一單鏈糖蛋白，分子量為330kD ，主要在肝臟合成。F V基 因定位于染色體lq23，長約80kb ，有25個外顯子，其cDNA長6672bp,編碼含2224 個氨基酸的蛋白質。研究表明，F V基因第IO號外顯子第1691位上的G—A可引起高 凝狀態(tài)。此點突變使F V蛋白分子第506位的精氨酸變成了谷氨酰胺(Arg —Gin), 這種突變的蛋白分子稱為FV Q506或FV Leiden突變，該突變影響了蛋白C系統(tǒng)的抗 凝功能。上面提到506位Arg是APC滅活FV的第一個切割位點。Arg506 —Gin導致 APC滅活FV延長，這一結果使得FV對外源性APC產生抵抗而使APTT不能延長。 同時，突變的FV仍保持促凝活性，以及它滅活的延長使得凝血酶形成速度加快，凝血酶 的增加又反饋性激活FV、 F VII使得凝血與抗凝血平衡失調導致高凝狀態(tài)形成。
FV Leiden突變，使得凝血酶形成增加，抑制了纖溶過程，這表明FV Leiden突變的 患者不僅比正常人易形成血栓，且形成后血栓不易被溶解。FV Leiden突變在歐洲人口 中比例2 7 %。 VT病人中占20 50 %。 FV Leiden突變雜合子發(fā)生血栓的相對危險性 是正常人的7倍，而純合子高達80倍。
最常見的基因多態(tài)性為單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)，即同一物種不同個體間染色體 上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多 態(tài)性。傳統(tǒng)的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術，如DNA測序、限制性酶切片 段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定可靠的高通量的檢測凝血因子V基因型的試劑盒、方 法和用途。具體，包括了檢測凝血因子V基因的R506Q多態(tài)性位點基因型的試劑盒、方 法和用途。
為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案-應用凝血因子V基因多態(tài)性位點的特異性引物和探針對樣本DNA進行聚合酶鏈式 反應，同時進行熒光標記探針熒光信號的掃描判定基因型的一種檢測凝血因子V基因型 的試劑盒，該試劑盒包含檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點的基因特異性 引物和探針。
其中，檢測凝血因子V基因多態(tài)性位點的正向引物為5'-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3';反向引物為5，- CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3'。
檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點的野生型探針為VIC -GGCGAGGAATACAGGTAT -MGB;突變型探針為FAM - GGCGAGAAATACAGGTAT -MGB。
本發(fā)明提供的試劑盒，還可以含有PCR反應混合液和Taq DNA聚合酶等PCR應用 試劑。其中，PCR反應混合液含有100mMTris-HCl、 100mMKCl、 5.0uMMgCl2、 0.4mM dATP、 0.4mMdCTP、 0.4mM dGTP、 0.4mMdTTP; Taq DNA聚合酶的含量為1-10 U/ul， 優(yōu)選5U/ul。
本發(fā)明提供的試劑盒，還可以含有凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點野 生型和突變型的陽性對照。陽性對照選自基因組DNA、 RNA或者克隆到載體上的DNA片段， 其中載體為質粒載體。
同時，本發(fā)明還提供應用檢測凝血因子V基因的試劑盒檢測凝血因子V基因第506 位的R506Q多態(tài)性位點的方法。
其中，檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點的基因擴增程序為 94'C預變性5分鐘；94。C變性30秒，58'C退火30秒，72。C延伸60秒，35個循環(huán)； 72。C延伸5分鐘。
其中，檢測凝血因子V基因第506位的R506Q的正向引物為5，-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3，；反向引物為5，- CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3，。 檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點的野生型探針為VIC -GGCGAGGAATACAGGTAT -MGB;突變型探針為FAM - GGCGAGAAATACAGGTAT -MGB。
同時，本發(fā)明又提供檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點基因型的試 劑盒在預測血栓性疾病風險中的用途。其中，血栓性疾病包括靜脈血栓栓塞性疾病和動 脈血栓栓塞性疾病。
其中，檢測凝血因子V基因多態(tài)性位點的正向引物為5'-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3，；反向引物為5'- CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3'。 檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點的野生型探針為VIC -GGCGAGGAATACAGGTAT -MGB;突變型探針為FAM - GGCGAGAAATACAGGTAT -MGB。
在本發(fā)明提供的用途中，樣本為F5R506Q為純合突變型時，提示患血栓性疾病的風險高，應該提前進行生活干預和藥物干預，以延緩和減輕血栓形成的風險。樣本FVR506Q為 雜合型時，提示患血栓性疾病的風險較高，應該提前進行生活干預和藥物干預，以延緩和減 輕血栓形成的風險。當樣本FV R506Q為野生型時，發(fā)生血栓性疾病的風險較雜合型和變異 型較小，應該警惕，進行生活干預。
本發(fā)明檢測樣本基因型的步驟為
1. 樣本處理
樣本如果為DNA樣本，則需要測定樣本的濃度，并將樣本濃度調整至合適的范圍。 如果樣本為RNA則需要轉錄成為cDNA。
2. 配置PCR反應混合物PCR反應混合液2.5ul;
FV特異性引物+探針 H20: 6.5 ul;
總計10 Ul。
FV基因片段的擴增PCR反應程序如下
94'C預變性5分鐘；95。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸60秒，35個循環(huán)； 72'C延伸5分鐘。
3. 目的基因多態(tài)性熒光掃描和基因型判定
在ABI 7900儀器或者類似的儀器上掃描熒光類型，使用SDS軟件分析掃描結果。 根據陽性對照的掃描結果和熒光掃描結果判定樣本的基因型。
4. 個體發(fā)生血栓性疾病風險的預測
根據FVR506Q的基因型進行個體血栓形成危險的預測。具體的，如果基因型為FV R506Q純合突變型，則血栓形成的危險遠遠高于野生型。
本發(fā)明的生物樣品選自DNA樣本，RNA樣本以及人工合成的寡核苷酸樣本。 本發(fā)明所述試劑盒除了包含測定上述多態(tài)性位點所需要的特定引物之外，還包含運用
PCR擴增而進行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟悉這些常規(guī)
組件和檢測方法。
本發(fā)明提供的試劑盒可以具體地含有-1、 PCR反應試劑，具體包括
(1)引物，包括分別針對FV不同多態(tài)性位點的正向引物和反向引物，它們能擴增含有 FV基因特定突變位點的基因片斷；(2) 2xPCR反應混合液l.Oml[lOOmMTris-HCl， 100mMKCl,pH8.3 (20。C)]; 5.0uM MgCl2;各0.4mMdATP, dCTP， dGTP， dTTP， 無菌雙蒸水配制，pH 7.0;
(3) TaqDNA聚合酶(5U/ul); Taq酶保存緩沖液:20 mM Tris-HCl (pH 8.0),層mM KC1， O.lmMEDTA, lmMDTT， 0.5% NP40, 0.5% (v/v)， Tween20， 50%甘油；
(4) dNTP
(5) Mg2+
(6) PCR用水滅菌的雙蒸水或者注射用水。
2、 特異性的熒光標記的探針
探針5'端的標記熒光基團可以是FAM 、 ROX 、 TET 、 HEX 、 TAMRA 、 CY3 、 CY5 、 JOE 、 Texas red等中間的一種，3'端的標記基團可以是TAMRA， NFQ中的一種。
3、 標準品，包括陽性對照，即含有FVR506Q的野生型質粒DNA和突變型質粒DNA。 陰性對照經DNAaseI處理的雙蒸水。
本發(fā)明的優(yōu)點是以特異性引物5 ，- TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3' 、 5'-CTTGAAGGAAATGCCCCATTA-3，和探針VIC - GGCGAGGAATACAGGTAT-MGB 、 FAM -GGCGAGAAATACAGGTAT -MGB為核心，在制備通過PCR擴增生物核酸樣品檢測凝血 因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點基因型的試劑，并提供一種通過檢測PCR擴增 生物核酸樣品檢測凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性的試劑盒、試劑盒通過檢測 生物樣品確定該生物樣品凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性，以及通過檢測生物 樣品預測血栓性疾病發(fā)生風險的用途。
本發(fā)明PCR模板制備方法操作簡單，無需特殊設備，PCR擴增后采用檢測熒光信號 的方法直接檢測PCR產物從而得到基因型結果，不涉及到如電泳的污染和對于環(huán)境可能 造成的污染，而且大通量高效率，準確性高，特別適合臨床和科研的大規(guī)模人群使用,應 用廣泛。根據凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性結果對血栓性疾病發(fā)生風險進行 預測。本發(fā)明可以提前通過特定基因型的分析預測血栓性疾病發(fā)生的風險，從而可以提 前干預，指導臨床用藥，預防和提前干預影響血栓性疾病發(fā)生的因素，降低血栓性疾病 的發(fā)生率，減少醫(yī)療成本。
本發(fā)明特別針對凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性位點基因型設計了PCR擴 增引物和探針，與常規(guī)的擴增引物和探針相比較，擴增效率高、特異性好、省時，能夠 直接根據PCR產物的片段大小鑒定該位點的基因型，無需后續(xù)的檢測步驟和相應的試劑、 設備，有更好的使用價值。下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內容所作出的本 領域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式
實施例1
下面以凝血因子V基因第506位的R506Q陽性對照質粒為實施例對本發(fā)明做進一步的詳 細闡述。
1. 引物和模板
基因片段擴增使用下列引物
正向引物為5 ， - TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA -3 ，；
反向引物為5 ，- CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3 ，。
模板采用人類基因組DNA (編號AI011611，濃度15ng/nl)
2. 基因片段擴增 配置PCR擴增混合物
模板(1515ng/^d): 3^1; 10 XPCR buffer (-MgCl2): 50mMMgCl2: 0.3|J; lOmMdNTP: 0.2pl; 2(^M引物混合物0.2pl; 5U/nlTaq酶0.05)xh
無菌雙蒸水5.25^1;
Total: 10(xl。
PCR擴增條件為
94'C預變性5分鐘；94'C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸60秒，35個循環(huán)； 72t:延伸5分鐘。
3. PCR產物純化
1) .PCR產物行1.5M瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶位置，切膠稱重。
2) .采用德國MN公司Nucleospin Extract II膠純化試劑盒純化PCR產物，最終用40^1 洗提液洗脫。
4. AT克隆
采用Promega公司的pGEM—Teasy kit試劑盒進行AT克隆，按照說明書操作。配置連接體系 Teasy vector:
2X連接緩沖液5nl;
T4DNA連接酶
純化后的PCR產物 無菌雙蒸水2^1。 (C連接過夜。
5. 連接產物的轉化
1) .取5^1連接產物，加入100^1 DH5a感受態(tài)細菌，輕輕混勻冰上靜置20分鐘。
2) .將混合物在42。C循環(huán)水浴熱休克90秒，置于冰上2分鐘。
3) .混合物中加入lml37。C預溫的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩(180rpm)培養(yǎng)1小時。
4) .將200pl轉化產物涂于含有100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板(含lmo1/1 IPTG化l， 20mg/mlX-gal4(Vl)上，37。C倒置培養(yǎng)10h。
5) .從LB培養(yǎng)板上挑取白色菌落，接種于2ml含100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中， 37。C振蕩(250rpm)培養(yǎng)過夜。
6. 陽性質粒的鑒定
1) .陽性質粒的酶切鑒定
取lml菌液，堿裂解法小提質粒，加20W無菌雙蒸水溶解。用EcoRI進行酶切鑒定， 配制酶切體系10xbufferH: 1^1;
五coRI (12U4il): 0.3nl;
質粒1^1; 無菌雙蒸水7.7pl。 37'C水浴酶切2小時，酶切可以得到預計大小的酶切片段，證明序列正確。
2) .陽性質粒序列測定
由步驟1篩選得到的陽性克隆送交北京諾賽基因組研究中心進行基因序列測定，測序結
果顯示，陽性克隆序列和已知FV R506Q附近的基因序列完全一致，證明陽性質粒序列正確。
7. 陽性質粒大規(guī)模培養(yǎng)和純化
將篩選得到的陽性克隆接種1L LB培養(yǎng)基中，37X:搖床振蕩培養(yǎng)過夜后，采用堿裂解 法純化質粒。低溫(-2(TC)凍存。
實施例2下面以有家族性血栓形成傾向的個體的凝血酶原基因多態(tài)性基因型檢測過程為實施 例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
我們應用本試劑盒檢測IO個有家族性血栓形成傾向個體的凝血酶原基因基因型，流程
如下
1. 樣本處理
由于樣本為基因組DNA，采用紫外分光光度計檢測樣本的DNA濃度，并將DNA濃度稀釋 至30-100ng/ml
2. 配置凝血因子V基因的特異性PCR擴增混合液的配置
配置基因擴增混合液PCR反應混合液2.5ul;
特異性引物+探針lul;
H20: 6.5 ul;
總計10 Ul。
3. 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增特異性的凝血因子V基因片段
1) 將配制好的PCR反應混合物加入PCR反應管中。
2) 凝血因子V基因片段的擴增 按照下列條件擴增凝血因子V基因片段
94。C預變性5分鐘；94。C變性30秒，58。C退火30秒，72'C延伸60秒，35個循環(huán)； 72'C延伸5分鐘。
4. PCR反應結果的熒光掃描
將擴增后的PCR反應管放入ABI 7900HT熒光定量PCR中，使用SDS軟件掃描PCR反
應結果。
5. 樣本基因型的判定
根據熒光掃描結果進行樣本基因型判定的標準根據熒光掃描結果判定凝血因子V基因 第506位的R506Q多態(tài)性位點基因型。具體的基因型判定結果見表1。
具體的判定標準如下
如樣本在凝血因子v基因第506位的R506Q多態(tài)性為RR基因型，則判為野生型；如 樣本在凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性為RQ基因型，則判為雜合型；如樣本在 凝血因子V基因第506位的R506Q多態(tài)性為QQ基因型，則判為純合型。
6. 根據樣本基因型進行血栓性疾病風險的預測和提前干預。
根據上述檢測結果，第8號樣本為F5 R506Q純合突變型，提示患血栓性疾病的風險高， 應該提前進行生活干預和藥物干預，以延緩和減輕血栓形成的風險。第6號樣本為FVR506Q雜合型，提示患血栓性疾病的風險較高，應該提前進行生活干 預和藥物干預，以延緩和減輕血栓形成的風險。
其余樣本為野生型，發(fā)生血栓性疾病的風險較雜合型和變異型較小，應該警惕，進行生 活干預。
表1. 10個待檢樣本的凝血因子V基因的基因型
樣本IDFV R506Q基因型
1RR野生型
2RR野生型
3RR野生型
4RR野生型
5RR野生型
6RQ雜合型
7RR野生型
8QQ純合型
9RR野生型
10RR野生型〈110>北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司 深圳奧薩醫(yī)藥有限公司
<120〉 一種檢測凝血因子V基因多態(tài)性的試劑盒、方法及用途
<160> 4
<170> Patentln version 3. 3
〈210> 1
〈211> 22
<212> ■ <213>人工合成
<400> 1
tgcccagtgc ttaacaagac ca 22
〈210> 2
<211> 21
<212> ■
<213〉 人工合成
<400〉 2
cttgaaggaa atgccccatt a 21
〈210〉 3
<211〉 18
<212> 腿 〈213〉人工合成ggcgaggaat acaggtat
<210> 4
<211> 18
<212> DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 4
ggcgagaaat acaggtat
說明書第11/11頁
18
18
權利要求
1.一種檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包含檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性的特異性引物、探針和檢測凝血因子V R506Q多態(tài)性位點的特異性引物、探針。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性位點的正向引物為5' - TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA _3，； 反向引物為5' - CTTGAAGGAAATGCCCCATTA -3'。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，檢測凝血因子V基因R506Q多態(tài)性位點的 野生型探針為VIC - GGCGAGGAATACAGGTAT -MGB;突變型探針為FAM - GGCGAGAAATACAGGTAT -MGB。
4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，含有PCR反應混合液和T叫DNA聚合酶。
5. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶的含量為1-10 U/ul， 優(yōu)選5U/ul。
6. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，含有凝血因子V基因R506Q多態(tài)性位點野生 型和突變型的陽性對照，。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照選自基因組DNA、 RNA或者 克隆到載體上的DNA片段。
8. 應用權利要求1-7所述的試劑盒檢測凝血因子V基因R506Q多態(tài)性位點的方法。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的檢測凝血因子V基因R506Q多態(tài)性位點 的基因擴增程序為94。C預變性5分鐘；94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸60秒，35個循環(huán)；72。C延 伸5分鐘。
10. 如權利要求1-7所述的試劑盒在預測血栓性疾病發(fā)生風險中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用PCR方法檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性的特異性引物、探針，特異性引物和探針在制備通過PCR擴增生物核酸樣品檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性的試劑中的用途、檢測凝血因子V R506Q基因多態(tài)性的試劑盒及試劑盒的用途。屬于醫(yī)藥領域。
文檔編號C12Q1/68GK101591701SQ200810113888
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權日2008年5月29日
發(fā)明者多 于, 張彥明, 徐希平, 燕 王 申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫(yī)藥有限公司